Molekuláris genetikai vizsgáló módszerek az immundefektusok diagnosztikájában
Primer immundefektusok A primer immundeficiencia ritka, veleszületett, monogénes öröklődésű immunhiányos állapot. Családi halmozódást mutathatnak. A génhiba következménye: az immunsejtek számbeli és/vagy funkcionális csökkenése
Vizsgált gének száma 100 2004-2015 között 80 62 69 69 60 42 47 49 40 34 34 26 20 19 0 2004-2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Vizsgált gének száma BETEGSÉG GÉNEK SZÁMA PID 59 LSD 4 Egyéb 6 Összeses 69
1400 Elvégzett genetikai vizsgálatok száma 2004-2015 között 1200 1000 800 PID genes Other genes Total 733 816 761 960 1208 1132 1046 992 1012 926 845 1232 649 630 600 489 482 556 400 347 357 272 200 184 184 61 61 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Elvégzett genetikai vizsgálatok száma 2004-2015 között BETEGSÉGEK VIZSGÁLATOK SZÁMA PID 1012 Egyéb 220 Összesen 1232 Prenatalis vizsgálat 35
GENETIKA = ÖRÖKLÉSTAN - a gének, - az öröklődés, - az élőlények variációjának tudománya 1819 Festetics Imre az öröklődés számos szabályszerűségét megfogalmazása 1865 Gregor Mendel genetikai törvények, kersztezés 1903 Kromoszóma felfedezése 1913 A kromoszómák lineárisan rendezett gének sorát tartalmazzák 1927 A génekben lejátszódó fizikai változásokat mutációnak nevezik 1941 A gének kódolják a fehérjét.
1944 Elősször izolálják a genetikai anyagot, a DNS-t 1953 James D. Watson és Francis Crick DNS szerkezetének a megismerése 1983 Kary Banks Mullis polimeráz láncreakciót (PCR-t) DNS sokszorosítása 1989 Francis Collins és Lap-Chee Tsui Az első gén szekvenálása (CFTR fehérje, cisztikus fibrózis) 2003. 04.01. A Humán Genom Projekt sikeres befejezése a genom 99%-nak szekvenálása GÉNTERÁPIA
Örökítő anyag A kromoszómák génekből épülnek fel 23 pár kromoszóma A T A gének DNS-ből állnak A DNS nukleotidokból épül fel C A A C G T T G
DNS Éretlen RNS Érett RNS Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 5 CAP Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 3 PolyA Fehérje
MUTÁCIÓ Örökítő anyag megváltozása Kromoszóma számbeli és méretbeli megváltozása Gén bázissorendjének a megváltozás Funkció vesztés Funkció nyerés Káros Hasznos (Leiden-mutáció, véralvadás zavara)
Öröklődés típusai X-kromoszómához kötött XX XY XX XX XY XY Autoszómális domináns Autoszómális recesszív DE NOVO
MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLAT JELENTŐSÉGE Klinikai diagnózis megerősítése Korai diagnózis felállítása Időben elkezdett, megfelelő terápia a beteg életminősége javul, jobb prognosztika Családtagok vizsgálata Családfa készítése Öröklődés menetének megismerése Hordozó állapot felderítése Családtervezés segítése
MÓDSZEREK DNS izolálás Amplifikációs PCR Szekvenálási PCR DNS szekvenálás Kiértékelés adatbázis segítségével 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Btk Gén elhelyezkedése: X -kromoszóma; Xq21,3-Xq22 Mérete: 37,5 kb Exonok száma: 19 (18 kódoló) Gene Cards GC0XM100491
I. II. BTK, 16 exon c.1573 C>T p.r525x I/1 II/1 II/2 G C T C G A A G C T T G A A G C T C G C T T G A A G A A G C T T G A A G C T Kontroll C G A A 1 PH TH SH3 SH2 SH1 659 1 PH TH SH3 SH2 SH1 525
Azonosított genetikai eltérések Csendes mutáció (C>A TCC TCA szerin szerin) Polimorfizmus (SNP) Ismert mutáció (irodalom, adatbázisok alapján) Új mutáció patogenitást igazolni kell
Patogenitás igazolása Nonsense mutáció, deléció, inszerció önmagában elegendő Splicing mutáció, missense mutáció további vizsgálatokat igényel Geneteikai eltérés jelenléte az egészséges populációban Mutáció helyzete Fehérje jelenléte Fehérje funkciója Sejtes vizsgálatok
MUTÁCIÓ HELYE 1 PH TH SH3 SH2 SH1 659 Lindvall et al., 2005. 10 Fenilalanin Tirozin AMINÓSAVAK TULAJDONSÁGA apoláros hidrofób poláros hidrofil AMINÓSAV KONZERVÁLTSÁGA patkány egér human csimpánz csirke 10 Lindvall et al., 2005.
Relative SH2D1A expression Gén kifejeződése 1 0,8 0,6 1 0,62 Kontroll Anya Beteg 0,4 0,2 0 0
Western-blot 70 kda C WT G245D C WT F570L ά-flag 41,7 kda 40 µg 40 µg 40 µg 150 µg 40 µg 40 µg 40 µg 150 µg ACTIN
Relatív enzimaktivitás (%) SMPD1 enzimaktivitása és fehérje fél-életidő vizsgálat Szubsztrát: 2-N-Hexadecanoylamin-4-nitrophenolphosphorylcholine 15 mm / reakció
Percentage of cells (%) IL-17+ and IL-22+ T sejtek 4,5 4 3,5 3 Kontroll Beteg 2,5 2 1,5 1 0,5 0 CD3+/IL-17+ CD3+/IL-22+ CD4+/IL-17+ CD4+/IL-22+
Kontroll 257 I. APS1 (AIRE) AIRE, 6. exon c.769c>t p.r257x m/vt C T 257 m/vt C T 257 II. m/vt C T m/vt C T m/m 257 257 257 p.arg257stop Mark Saltis et al.,2008
SÚLYOS KOMBINÁLT IMMUNDEFICIENCIA IL2RG gene c.295insa V99fsX11 I. II. Kontroll Beteg1 (II/1) Beteg 2 (II/2) Anya (I/1) insa insa insa prenatal
Molekuláris genetikai vizsgálat fontossága A mutáció analízise elengedhetetlen a pontos diagnózishoz Családtagok szűrése hordozó állapot felderítése korai diagnózis a tünetek megjelenése előtt prenatalis vizsgálat Időben elkezdett, megfelelő terápia Betegek állapota, életminősége és a betegség prognosztikája javul