MIKOTOXINOK - BIOMONITORING ÉS BIODETOXIFIKÁCIÓ

MIKOTOXINOK - BIOMONITORING ÉS BIODETOXIFIKÁCIÓ Dr Kriszt Balázs tanszékvezető, egyetemi docens Szent István Egyetem Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék 2012.11.28

A legjelentősebb mikotoxinok és az azokat termelő gombák Mikotoxin termelő gombák Aspergillus Gomba fajok A. flavus A. parasiticus A. nomius A. pseudotamarii Mikotoxinok Aflatoxin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) A. ochraceus Ochratoxin (Ochratoxin A) Fusarium Penicillium F. verticillioides (syn. F. moniliforme) F. proliferatum F. graminearum F. avenaceum F. culmorum F. poae F. acuminatum F. sambucinum F. sporotrichioides F. graminearum F. culmorum F. sporotrichioides P. verrucosum P. viridicatum Fumonisin (B 1, B 2, B 3 ) A tip usútrichothecenes T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxyscirpenol B tipusú Trichothecenes Nivalenol, Deoxynivalenol, fusarenon- X Zearalenone Ochratoxin (Ochratoxin A)

A mikotoxinok káros hatásai Mikotoxin Aflatoxin Ochratoxin Fumonisin Trichothecének Zearalenon Egészségügyi hatás Májbetegségek (hepatotoxikus, hepatokarcinogén hatás); karcinogén és teratogén hatások; bevérzések (bélcsatorna, vese); csökkent növekedési erély; immunszupresszió Vese toxikus; karcinogén; enyhe májkárosodás; enteritisz; teratogén hatás; rossz táplálékhasznosítás; csökkent növekedési erély; immunszupresszió Tüdő ödéma; lovaknál leukoencephalomalacia; ideg- és májtoxicitás; immunszupresszió Emésztési rendellenességek, csökkent súlygyarapodás; vérzések; ödéma; bőrkiütések; vérképzési zavarok; meddőség; lassú növekedés; immunszupresszió Ösztrogén hatás; vulva ödéma ;méh nagyobbodás; petefészek atrófia; emlőmirigyek nagyobbodása; meddőség; abortusz A háziállatok eltérő érzékenységet mutatnak a különböző mikotoxinokra: Aflatoxin - pulyka, DON, Zealarenon - sertés, juh, Fumonizin - ló

Mikotoxinok biotranszformációjára alkalmas mikroorganizmusok Mikroorganizmus Vizsgált mikotoxin Referencia Flavobacterium aurantiacum Aflatoxin Ciegler et al., 1966 Aspergillus flavus Hamid and Smith, 1987 Rhodococcus erythropolis Alberts et al. 2006 Rhodococcus pyridinivorans Cserháti et al. 2008 Trichosporon mycotoxinivorans Zearalenon Schatzmayr et al., 2006 Pseudomonas putida ZEA-1 Altahi and El-Deeb, 2009 Rhodococcus erythropolis Rood and Duvick, 1998 Norcardia globulera Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger Ochtratoxin A Vágvölgyi et al., 2005 Acinetobacter calcoaceticus Hwang and Draughon, 1994 Trichosporon mycotoxinivorans Schatzmayr et al., 2006 Exophiala pinifera Fumonizin Duvick et al., 1998 Rhinocladiella atrovirens Bacterium sp.atcc 55552 Comamonas sp. NCB 1492 Benedetti et al. 2006 Agrobacterium sp. Deoxynivalenol Shima et al., 1997 Eubacterium sp. BBSH797 Binder et al., 1998 Butyrvibrio fibrisolvens T-2 toxin Westlake et al., 1987 Selenomonas ruminantium Anaerovibrio lipolytica Westlake et al., 1987 Curtobacterium sp. Ueno et al., 1983

Aratás utáni mikotoxin szint csökkentési lehetőségek (takarmányadalékok) Toxin adszorpció: Lactobacillus-ok alkalmazása sejtfelszínen történő megkötésre Élesztőből preparált mannooligoszacharidok alkalmazása toxin megkötésre Toxinbontó mikrobák direkt alkalmazása: takarmányadalékkénti alkalmazás Nocardia corynebacteroides aflatoxinos csirketáp mentesítésre (Tejada-Castaneda et al. 2008) Nem specifikus enzimek : peroxidáz enzimek alkalmazása (nem specifikus enzim, 30-40%-os aflatoxin konverzió, igen nagy enzim igény - Das et al. 2000) A toxinbontás/inaktiválás kulcsenzimeinek izolálása és alkalmazása: Biomin Mycofix Plus Iránymutató a mikotoxin mentesítési eljárásokhoz (Jemme 1989) inaktiválja, a takarmányok elbontsa, mikotoxin-szennyezettségének eltávolítsa a toxint ne csökkentésére maradjon toxikus irányuló bomlástermék eljárások során nemcsak a mikotoxinok, hanem az eljárás során tápanyagtartalom ne változzon esetlegesen keletkező metabolitok, bomlási termék termékek technológiai biológiai jellemzői hatását is ne változzanak vizsgálni kell kerüljön (EFSA, 2010) többe mint a dekontaminálandó anyag

1. fázis: A MYCOSTOP projekt (NKTH, 2009.01.01-2011.09.30) biodegradációs-biomonitoring ágának célkitűzései Immunokémiai, analitikai és biomonitoring módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára, biológiai hatásuk elemzésére 2.fázis: mikotoxinok degradációjára alkalmas mikrobák keresése, molekuláris taxonómiai azonosítása (rhodococcus törzsek bioremediációs gyűjteményekből +referencia törzsek, minél szélesebb törzsgarnitúra ~215 törzs!) a toxindegradáció követése analitikai és ELISA rendszerekkel 3. fázis: biztonságos törzsek kiválasztása: olyan mikrobák szelekciója, melyek a bontás során nem termelnek citotoxikus, genotoxikus, EDC-hatású metabolitokat 4. fázis: mikotoxinbontó mikrobák alkalmazása hal, madár és emlős etetési tesztekben

1. fázis: Immunokémiai, analitikai módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára Monitoring módszerek gabonák mikotoxinok szennyezettségének vizsgálatára direkt ELISA (Toxi Watch-kit, SofFlow Ltd.) Flow citometria (Fungiplex-kit: Multiplex mikrogyöngy alapú flow citometriai analitikai kit a mikotoxin szennyezettség szimultán detektálására (Aflatoxin-B1, Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin-A, Fumonisin-B1) HPLC-FLD (Wessling Hungary Kft.) MS/MS (Szegedi Gabonakutató, Aflatoxin) indirekt Mikotoxinogén Aspergillus and Fusarium törzsek izolálása, tenyésztése és taxonómiai jellemzése A toxinogén törzsek real time PCR alapú meghatározása (DON, Tri13-gene)

Hazai gabonaminták mikotoxin szennyezettsége Minta Időpont Hely Mikotoxin szennyezettség µg/kg AB1 OTA FB1 T2 ZEA DON kukorica 10.01.20 12,4 <0,2 1020 <100 90 140 - árpa 10.01.20 Pomáz 1,5 3,4 310 <100 42 116 búza 10.08.25 Csongrád <0,1 <0,2 <50 <100 3420 <100 kukorica 10.03.25 Sárbogárd 89,2 106 6440 <100 1404 487 kukorica 10.07.06 Rétság <0,1 <0,2 <50 <100 <10 <100 Magyarországon izolált, aflatoxin B1 termelő Aspergillus flavus törzsek A gabonaminták 5%-a, ELISA tesztekkel vizsgálva, legalább egy mikotoxin esetén elérte a határértéket. Ezen minták 17%-a több mint két toxint tartalmazott a határérték felett. (2010)

1. fázis: Biomonitoring módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára A mikotoxinok biológiai hatásán alapuló monitoring rendszerek Citotoxicitás: Aliivibrio fischeri toxikológiai-teszt (AflatoxinB1, Zearalenon) Saccharomyces cerevisiae- biolumineszcencia alapú citotoxicitás teszt (BLYR) Genotoxicitás Escherichia coli SOS-Chromotest (AFB1) Hormonhatás Saccharomyces cerevisiae biolumineszcens alapú riporter rendszer (Zearalenon) Zebra dánió vitellogenin - ELISA és vitellogenin realtime-pcr rendszer

Miért az aflatoxin volt az első leírt mikotoxin és mi közük van ehhez a pulykáknak? 1. Aflatoxin inaktiválása átlagosan szenzitív háziállatokban: cytochromes AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH P450 (CYP) Glutation transzferáz 2. Aflatoxin inaktiválása pulykákban: AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH CYP 1A GST DNS-kötés, mutáció, toxicitás 1960 pulyka X-kór: az aflatoxin felfedezése

1. fázis: SOS-Chromo genotoxicitás teszt Tesztszervezet: E.coli PQ37 A teszt elve: Genotoxinok beindítják az SOS-repair rendszert (sfia) A tesztszervezet mutációs tulajdonsága: β-galaktozidáz strukrúrgénje (lacz) az sfia gén kontrollja alatt sfia indukció mértékével arányosan történik a lacz gén átírása Kolorimetriás mérés: A termelődő enzim megfelelő szubsztrát jelenlétében mérhető Metabolikus aktiválás indirekt hatás Eredmények kifejezése: Indukciós faktor: Genotoxikus aktivitás az egyes koncentrációszinteken IF >1,5 genotoxikus Határérték felett képes az AFB1 detektálására (5 ppb 78 ppb) Biodegradációs kísérletekben screening módszerként való alkalmazás

BLYES/BLYR hormonhatás elemzés Eukarióta tesztrendszert: Saccharomyces cerevisiae BLYES Ösztrogén hatás emelkedett biolumineszcenciát eredményez LOEC**=0,031 EC 50 *=0,99 BLYR* Citotoxikus hatás csökkent biolumineszcenciát eredményez (*Tennessee University által fejlesztett) Határértéknek megfelelően képes a ZEA kimutatására: 0,1 3 ppm 0,031 ppm Direkt élelmiszer és takarmány vizsgálat Biodegradációs kísérletekben screening módszerként való alkalmazás

1. fázis: Real Time PCR rendszer fejlesztése zearalenon hatásáára hím zebradánióban termelődő vitellogenin kimutatására Kezelés: 21 napos inkubálás akváriumban relatív vitellogenin szint 100 ng/l 17β-estradiol (pozitív kontroll) 5,9 ng/ml 1 mg/l Zearalenon 321844 ng/ml 10 µg/l Zearalenon 1127 ng/ml 0,1 µg/l Zearalenon 1 ng/ml A Real Time PCR-el kapott eredmények jól korrelálnak a korábbi ELISA módszerrel végzett mérések eredményeivel. Ezzel az ELISA teszten alapuló kimutatásnál egy jóval olcsóbb rendszert hoztunk létre, amelyben a relatív expresszió szintje jobban tükrözi a kezelésben szereplő ösztrogén hatású anyag koncentrációját A vitellogenin (kék)/ β-aktin (piros) duplex RealTime PCR reakciók eredménye (VIC és TAMRA Taqman próbák)

2. fázis.: Mikotoxin-bontó mikrobák keresése Vizsgált toxinok: Aflatoxin-B1, Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin, Fumonisin Bontási kísérlet 215 tesztelt mikroba törzs 2-4 ppm toxin, 3 napos inkubáció, folyékony tápoldat Toxin monitoring 24 órás mintavétel Bontási rendszerek értékelése: ELISA (SoftFlow) és HPLC (Wessling)

2. fázis: Rhodococcus törzsek mikotoxin-bontó képességének vizsgálata Zearalenon Ochratoxin T2-toxin Aflatoxin B1 Soft Flow Wessling Soft Flow Wessling Soft Flow Wessling Soft Flow Wessling AflatoxinB1 Faj strain % % % % % % % % R. erythropolis Ak-35 0 3 0-89 99 100 R. globerulus AK-36 0 1 0-90 99 100 R. pyridinivorans AK-37 61 67 22-0 98 99 OchratoxinA R. pyridinivorans K408 87 98 42-34 99 99 R. aetherivorans AK 44 55 39 29-69 94 94 R. rhodochrous ATTC 12 26 0-95 96 99 R. erythropolis DSM 4306 17 2-95 95 100 R. erythropolis DSM 743 11 0-96 70 70 Zealarenon R. coprophilus N774 38 0-95 55 57 R. ruber N361 58 2-62 45 45 R. gluberulus N58 56 4-95 45 45 R. erythropolis NI1 60 69 1-88 95 99 99 H 3 C CH 3 CH 3 O O H 3 C O O H O CH 3 H T-2 toxin O O H O O CH 3 Nyolc fajba tartozó, 32 rhodococcus törzset vizsgáltunk A R. erythropolis NI1 törzs egyszerre három különböző mikotoxin bontására is képes: Zearalenon, T-2 és Aflatoxin-B1

2. fázis: Nem Rhodococcus törzsek mikotoxin-degradációs képessége (28 törzs) nemzetség fajok Zea Ochra T2 AFB1 Pseudomonas 6 1 0 0 6 Streptomyces 5 1 0 3 4 Chryseobacterium 3 0 0 0 3 Cupriavidus 2 0 2 1 2 Pseudoxanthomonas 2 2 0 1 2 Paracoccus 2 0 0 0 2 Microbacterium 2 0 0 2 2 Raoultella 1 0 0 0 0 Serratia 1 0 0 0 1 Sphingopyxis 1 0 1 0 1 Ochrobactrum 1 0 0 0 1 Gordonia 1 0 0 0 1 Arthrobacter 1 0 0 0 1 piros: >95% degradáció (Cupriavidus basiliensis Őr16: 99%!) sárga: >66% degradációáció

Kontroll N361 N58 AK 37 AK 42 K14 K2 UA58 ZV6 TN5 NZS9 TN4 GD2A N11 NZS6 J4 H4 AK36 KÖ5 ZS1 K404 ATTC 12674 EL1 FEH28 GD2B BRB1AB AK35 K408 K406 K402 K405 K403C DN1 NI2 Biolumineszcencia gátlás (%) <50% bontás Genotoxicitás IF>3 Citotoxicitás: Gátlás >50% 150 3. fázis :Aflatoxin-B1 degradációra képes mikrobák szelekciója kombinált toxikológiai profil alapján 50-90% bontás Genotoxicitás IF>1,5 Citotoxicitás nem tapasztaltunk (K14, UA58, ZV6, TN5) >90% bontás További biodetoxifikációs eljárásokhoz leginkább alkalmas: Rhodococcus sp. NI2 Pseudomonas sp. DN1 Genotoxicitás megszűnt (NI2, K403C, DN1) Citotoxicitás nem tapasztaltunk (NI2, K402, ZS1, FEH28, DN1, KÖ5) Krifaton et al (2012): Analysis of aflatoxin-b1-degrading microbes by use of a combined toxicityprofiling <20% method. Mutation 50-90% research 2011;726(1):1-7. Degradációs potenciál >90% 4,5 100 50 0-50 -100-150 3,5 2,5 1,5 0,5-0,5-1,5-2,5-3,5-4,5 Indukciós Faktor IF > 1,5 genotoxikus A. fischeri teszt (10 h) Az AFB1 degradációs kísérletbe vont mikroszervezetek toxinbontásából származó minták A. fischeri teszt (15 h) SOS-Chromo teszt

3. fázis: Zealarenon degradációra képes, minimális maradék EDC hatást mutató mikrobák szelekciója BLYES-teszttel HPLC 26,24 27,12 54,70 61,14 75,95 86,96 87,85 90,93 93,63 98,20 98,20 98,53 ELISA 19,92 30,64 54,60 63,02 70,93 82,69 85,39 93,00 93,02 78,89 97,70 92,99 HPLC-ELISA: 0,88 ELISA teszt keresztreakciók (Soft Flow) További biodetoxifikációs eljárásokhoz leginkább alkalmas: Rhodococcus sp. K402, K404 Streptomyces sp. K14 Jó (50-90) zearalanon (138 %) α-zearalenol (91%) β-zearalenol (21%) α-zearalanol (69%) β-zearalanol (6%) Krifaton et al (2012): Application of a yeast estrogen reporter system for screening zearalenone degrading microbe, J. Haz.Mat (subm)

Uterus tomeg/testtomeg 3. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel OECD Guideline 440 (Uterotrophic Bioassay in Rodents) 18 napos (választás előtti) nőstény Wistar patkányok (MTA-KOKI Orvosi Géntech. Részleg) Marker: uterus tömege I. ZEARALENON DÓZIS-HATÁS VIZSGÁLAT Normált uterus tömeg kontroll: tiszta olivaolaj E2: 17 -ösztradiol (pozitív kontroll) 0,04 mg/kg bw Zearalenon több dózisban 0,1 ; 1 ; 5 ; 10 mg/kg bw Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: -E2 -Zearalenon 5 mg/kg ; 10 mg/kg 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 *** *** *** CON ZON 0,1 mg/kg ZON 1 mg/kg ZON 5 mg/kg ZON 10 mg/kg E2 *A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással.

Uterus tomege/testtomeg 3. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel II. BIODEGRADÁCIÓ-VIZSGÁLAT: kontroll: LB tápoldat LB tápoldat + 5 ppm zearalenon Biodegradáció: R. pyridinivorans K408 (5 nap inkubáció, 28 C-on, 180 rpm aeráció) Eredmények: Zearalenon bontási hatékonyság (HPLC-analitika) alapján a 87% Normált uterus tömeg 3 ** 2,5 2 CON 1,5 Bontott ZON ZON 1 0,5 0 A Zea-biodegradáció követése BLYES-teszttel A BLYES rendszerben a bioluminescencia az ötödik napra 84%-al csökkent a hígítatlan rendszerben Szignifikáns hatás uterus tömegére: Zearalenon kontroll *A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással. Kriszt etal 2012: A New Zearalenone Biodegradation Strategy Using Non-Pathogenic Rhodococcus pyridinivorans K408 Strain PloS one 2012;7(9):e43608.

4. fázis: Etetési tesztek aflatoxin tartalmú és biodetoxifikált kukoricával Kontaminált takarmány AFB1 konc beállítása: 0,93ppm Kontroll AFB1: 0,0 ppm Biodetoxifikált takarmány AFB1: 0,17ppm Aspergillus flavus ZT80 ~10ppm AFB1 termelés R. pyridinivorans AK37 Szilárd fázisú fermentáció, 40% nedvességtartalom, 4 nap inkubáció 28 C-on

4. fázis: Brojlercsirke etetési teszt Takarmány Tettömeg (g) Elhullás start 3. hét Kontrol 50 590 1/30 AFB1 tartalmú (0,93ppm) Biodetoxifikált (0,17ppm) 50 454 4/30 50 582 1/30 *a vörös szín szignifikáns különbséget jelez (P 0,05) Brojler csirkék állapota az etetési kísérlet végén. *Balra az Aflatoxinos takarmányon, jobbra a biodetoxifikációval kezelt takarmányon nevelt csirkék láthatóak. A tömegkülönbségen kívül szembeötlő az egészségi állapotban, fittségben, a csüd és a taraj színbeli különbözőségében megnyilvánuló eltérés a biodetoxifikált takarmányt fogyasztó állat javára.

4. fázis: Ponty etetési teszt Takarmány Elhullás Kontroll 1: kukorica 0% Kontroll 2: kukorica + baktérium 0% AB1 tartalmú kukorica 20± 8%* Biodetoxifikált kukorica 2± 2% Májról készült szövettani metszetek fényképei A: Kontroll kukorica tiszta B: Kontroll kukorica+ bakt C: Kezelt Aflatoxin B1+ bakt D: Aflatoxin B1 AFB1 (felül) és biodetoxifikált kukorica (alul) mintával etetett pontyok húsfelszínéről készült felvétel

Aflatoxin B1 termelő Aspergillus flavus törzsek magyarországi megjelenésének igazolása tandem MS és genotoxicitás vizsgálatokkal *MS/MS és ion-kromatogram képek az A. flavus ZT55 aflatoxinjáról A=aflatoxin B2, B= aflatoxin B1 (Szegedi Egyetem Microbiológia Tanszéke, Gabonakutató Nonprofit Kft, Szeged) Dobolyi et al. (2011): Identification of aflatoxin producing Aspergillus flavus strains originated from maize kernels. Növényvédelem, 47(4):125-133. Aspergillus törzsek által fertőzött kukoricaminták

(5.fázis) További célkitűzések: az Aflatoxin és a Zearalenon metabolizmusának kutatása Sikeres de novo genom projektet indítottunk az Aflatoxin és zearalenon bontó R. pyridinivorans AK37 törzsünkből (genom méret 5,27 Mbp) Aflatoxin és pchratoxin Cupriavidus basilensis ŐR 16 törzsünkből (genom méret 8,55 Mbp) A japán AIST intézettel közösen transzpozon mutagenezis könyvtárat készítünk e törzsből, majd a null-mutánsok keresését SOS-Chromotest-el és BLYES rendszerrel végezzük. A kulcs gének azonosítása után mód nyílhat az enzimek expressziójára és egy potenciális mikotoxin detoxifikáló takarmány adalék kifejlesztésére is Cserháti et al (2012): De novo genome project of Cupriavidus basilensis OR16 J Bacteriol. 194(8):2109-10 Kriszt et al (2012): De Novo Genome Project of the Aromatic Degrader Rhodococcus pyridinivorans Strain AK37., J Bacteriol 194: (5) pp. 1247-1248.

Köszönöm a figyelmet!