Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben. Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Szigeti Tamás János (WESSLING Hungary Kft.

Átírás

1 Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Szigeti Tamás János (WESSLING Hungary Kft.)

2 Bevezető statisztikák

3 Aflatoxin vizsgálati igények (db) Összesen: db aflatoxin vizsgálat

4 Aflatoxin vizsgálati igények (db)

5 Aflatoxin vizsgálati igények (db)

6 Aflatoxin M1 vizsgálati igények (db)

7 Aflatoxin M1 vizsgálati igények (havi db)

8 Aspergillus flavus telepek kukoricaszemen

9 Penészgombák Az elmúlt évezred utolsó évtizedeiben fordult a figyelem a mikroszkópikus gombák toxinjai felé. A takarmánynövényeket és élelmiszereket fertőző gombák közül több faj olyan biokémiai szisztémával rendelkezik, amely a gombára ható környezeti hatásokra adott válaszként toxikus vegyületet állít elő (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Claviceps). Az élelmiszerbiztonsági RASFF riasztások között a legtöbb mikotoxinszennyezettség miatt történt:

10 RASFF riasztások 2006-ban (MÉBIH adat) 700 riasztás mikotoxinok miatt

11 RASFF riasztás tejek: aflatoxin M1 tartalma Date Pro-duct type Reference Notification type Controll type Notified by rigin Subject Distribution Category Week Dátum Kódszám Termék típus Bejelent.tí pus Ellenőrz.tí pus Bejelentő Származás Tárgy Ért.helye Kategória Hét food information for followup company's own check Slovenia Hungary Aflatoxins (Tot. = 0,074 μg/kg - ppb) in raw chilled milk from Hungary Slovenia milk and milk products food information for attention company's own check Italy Hungary Aflatoxins (Tot. = 0,095 μg/kg - ppb) in raw milk from Hungary Italy milk and milk products food information for followup company's own check Italy Hungary Aflatoxins (M1: 0,072 μg/l) in raw milk from Hungary Italy milk and milk products food information for attention company's own check Italy Slovenia Aflatoxins (M1: 0,183 μg/kg - ppb) in raw milk from Slovenia Italy milk and milk products food alert company s own check Italy Hungary Slovakia Aflatoxins (M1 = 0,03; 0,45; 0,43 μg/kg ppb) in fresh raw milk from Hungary, via the Slovak Republic Italy Slovakia milk and milk products 38

12 1960: Anglia, pulykák X betegsége

13 1960: Anglia, pulykák X betegsége

14 Gerald Wogan és George Hermann Büchi 1960/1963 GB/USA Gerald Wogan: a vegyületet azonosította George H. Büchi: az A. flavus gombát ismerte fel > pulyka és kacsa pusztulása mogyorótól

15 Vizsgálatok ( ) G. Wogan a brazíliai földimogyoróból UV-fényben fluoreszkáló vegyületet talált. Az erősen mérgező földimogyoróból G. H Büchi fonalas gombát is izolált, amely táptalajon termelte az ismeretlen anyagot: Aspergilus flavus (magyarul: kannapenész )

16 Aspergillus konidiumtartók 10 7 spóra/cm 2 Aspergillus sp.

17 Néhány nemzetség és faj Aspergillus (flavus, ochraceus, niger, viridicatum) toxinok: Aflatoxinok (B1, B2, G1, G2, M1, M2) chratoxin-a, ochratoxin-b, ochratoxin-c Patulin Penicillium (chrysogenum, brevicompactum) toxinok chratoxin-a Patulin Fusarium (graminearum, culmorum) toxinok Zearalenon (F-2 toxin) Nivalenol Deoxinivalenol (DN) T2-toxin Fusarium moniliforme toxinja Fumonizinek Alternaria alternata toxinok Alternariol Altertoxin 1

18 Mikotoxinok meghatározása A mikotoxinok a gombák, elsősorban a penészgombák extracellulárisan kiválasztódó másodlagos anyagcseretermékei. E vegyületek a melegvérűeket főként enterálisan károsítják. Némelyek közülük antibiotikus hatásúak. A kalaposgombák toxinjai nem tartoznak az ún. mikotoxinok közé!

19 Mikotoxinok csoportba-sorolása Az eddig leírt nagyszámú toxin és gombafaj miatt nehéz a csoportosítás. Az egy nemzetségbe tartozó gombák különböző toxinokat termelnek, és fordítva, taxonómiailag távol álló fajok képesek azonos toxinokat előállítani. Rendszerezési lehetőségek: 1. Kémiai szerkezet alapján 2. Magasabbrendűekre gyakorolt farmakológiai hatás alapján 3. Bioszintézisük alapján (nem teljeskörű)

20 Furanofuránok - aflatoxinok Aflatoxin-csoport: szubsztituált kumarin-származékok - aflatoxin B1 - aflatoxin G1 - aflatoxin M1 - aflatoxin B2 - aflatoxin G2 - aflatoxin M2 - aflatoxin B3 Aspergillus flavus, Asp. parasiticus B1, G1, M1 : 7,8-dihidrofurano(2,3-b)furán B2, G2, M2: 2,3,7,8-tetrahidrofurano(2,3-b)furán

21 Kumarin régóta ismert íz- és aromaanyag Fahéj (ceyloni, cassiai) Szagos müge (szeszipari alkalmazás) Brazil tölgy Somkóró

22 Aflatoxin B1 Alattomos, kifejezetten toxikus vegyület CH 3

23 Aflatoxin B1 (szubsztituált kumarinok) Kumarin-váz CH 3

24 Aflatoxin B2 (szubsztituált kumarinok) Hiányzik egy kettőskötés CH 3

25 Aflatoxin G1 (szubsztituált kumarinok) CH 3

26 Aflatoxin G2 (szubsztituált kumarinok) CH 3

27 Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok) Mitokondriális citokróm P450: AFB1 AFM1 (15-30 perc) AFM1 AFB1

28 Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok) H CH 3

29 Az Aspergillus fajok toxintermelési jellemzői - SZAPRDÁS: széles hőmérsékleti intervallumban - TXINTERMELÉS: - Valószínűsége: 6-75 % (változó adatok) - Vízaktivitás - ptimális hőmérsékletek: - 20 o C körül: aflatoxin G1-30 o C körül: aflatoxin B1 - Hazai klíma? - Maximális koncentráció: a fertőzést követő 2 héten belül - TXINTERMELÉST TÁMGATÓ SZUBSZTRÁTK: - Szacharóz - Glükóz - (NH 4 ) 2 S 4 Zn,

30 Az aflatoxinok biológiai hatása (B1 és M1) - ÉRZÉKENY FAJK: kacsa, pulyka, egér, tengerimalac, patkány, - TLERÁNS FAJ: juhok - TÜNETEK: étvágytalanság, tömegvesztés, elhullás, krónikusan karcinóma kialakulása; - KÓRBNCTAN: májkárosodások (elhalás, daganatok; egy kóreset: napi 100 g sózott mogyoró veszélyes lehet ) - ADI-ÉRTÉK: 5 ng/ttkg/nap (kb ng/fő) (FDA adat) - LD 50 -ÉRTÉK (patkányoknál ip): 6 mg/ttkg 18 mg/ttkg

31 Az aflatoxinok biológiai hatása (AFB1, AFM1) T.D.Phillips 1, E. Afriyie-Gyawu 1, J.Williams 2, H.Huebner 1, N.A. Ankrah 3, D.fori-Adjei 3, P.Jolly 4, N.Johnson 1, J.Taylor 1, A. Marroquin- Cardona 1, l.xu 5, l.tang 5, & J.S.Wang 5: : Reducing human exposure to aflatoxin through the use of clay: A review. Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): Department of VIBS-MS 4458, Texas A&M University, Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine, College Station, TX 77843, USA, 2 Peanut Collaborative Research Support Program, University of Georgia,Griffin, GA, USA, 3 School of Public Health, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana,Legon, Accra, Ghana, 4 Epidemiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA, and 5 Instituteof Environmental/Human Health, Texas Tech University, Box 41163, TTU/TIEHH, Lubbock, TX , USA A cikk az alábbi oldalon található: (Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): 133)

32 Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj

33 Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj Az aflatoxin B1 molekulái (vörös színnel) a DNSláncba interkalálódnak. Interkalálódott aflatoxin B1 [d(atc AFB GAT). d(atcgat) és d(at AFB G-CAT) 2 ]

34 Aspergilloma a tüdőben (a gomba belégzése) Az Aspergillus spóráinak belégzése következtében gombatelepek alakulhatnak ki a tüdő hörgőiben.

35 VM 64/2012. (VII. 3.) VM rendelet Takarmány mg/kg 0,02 0,01 0,005 0,02

36 A Bizottság 165/2010/EU rendelete Tej µg/kg 0,050 0,025 0,025

37 Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg (50 ng/kg)

38 Analitikai lehetőségek

39 Amit mérni kell (néhány század ppb) 1 ppb = 1 gramm/1000 tonna 1 ppb = 1 µg/kg 1 ppb 1 µg/liter Számottevő mérési bizonytalanság!

40 Méréstechnika, analitikai lépések 1. Mintaaprítás, extrakció 2. Immunkromatográfiás tisztítás 3. Származékképzés 4. Műszeres mérés: 1. HPLC/DAD kis érzékenység nagyobb pontosság 2. HPLC/FLD nagyobb érzékenység és pontosság 3. ELISA nagy érzékenységű, kevésbé pontos 5. Értékelés 6. Vizsgálati jegyzőkönyv Mindezek mellett: Kalibráció, pontosság Görbeillesztés, línearitás Ismételhetőség, reprodukálhatóság Visszanyerés vizsgálata Alsó méréshatár ellenőrzése

41 Immunkromatográfiás oszloptisztítás Extraktum

42 Immunkromatográfiás oszloptisztítás Mosás Eluálás

43 Kromatográfiás elválasztás és detektálás A vizsgálat eredménye: 1. toxin µg/kg 2. toxin µg/kg 3. toxin µg/kg Kromatogram Kolonna

44 Fluorimetriás detektálás származékképzéssel Gerjesztő hullámhossz Mérési hullámhossz Norm. 40 l Ex = 373 nm l Em = 435 nm nm HPLC-FLD: nagy érzékenység, precíz konfirmálás

45 A mérőberendezés Agilent 1100 HPLC-FLD

46 Mérési eredményeink 2006 óta aflatoxin mérés

47 Aflatoxin standardek kromatogramja B, G B1 G1 G2 B2 Aflatoxin standard, G1: 12,5 ng/ml, B1: 12,5 ng/ml, G2: 3,75 ng/ml, B2: 3,75 ng/ml

48 Minta extraktumának kromatogramja (B, G) B1 G1 G2 B2

49 Aflatoxin_M Aflatoxin M1 kromatogramok (tej vizsgálata) FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX \ D) LU FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX \ D) LU FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX \ D) LU ,02 µg/kg <0,02 µg/kg <0,02 µg/kg Area: Area: Area: Aflatoxin M1 min min min

50 Aflatoxin M1 kalibrációs görbéje A re a A fla to x in _ M 1, F L D 1 A A re a = *A m t + 0 R e l. R e s % (1 ): C o rre la tio n : A m o u n t[n g / m l]

51 Aflatoxin B1 gyakorisága takarmányokban >20 µg/kg 7 db minta

52 Aflatoxin M1 gyakoriság összes tejtermékben LQ alatt 351 db minta 0,05 µg/kg aflatoxin M1 (19 db minta)

53 Aflatoxin M1 gyakoriság 482 db tejtermékben Aflatoxin M1 gyakorisága 482 db tej- és tejtermék-mintában <LQ nélkül > 50 µg/kg minták: 50 db (15,2%)

54 Tejek aflatoxin M1 tartalma (>LQ = 0,01 µg/kg) µg/kg 70 db <0,05 µg/kg (21,3%) 50 db 0,05 µg/kg (15,2%)

55 Köszönöm megtisztelő figyelmüket! Külön köszönet illeti a WESSLING Hungary Kft. Élelmiszerbiztonsági Üzletága Laboratóriumának munkatársait.