Alapfogalmak I. Immunhisztokémia: Az immunhisztokémia módszerével szöveti antigének, vagy félantigének (haptének) detektálhatók in situ, specifikus antigén-antitest kötés alapján. Elsősorban fehérjék és ezek szénhidrátokkal és lipidekkel alkotott molekulái lokalizációjának meghatározásának eszköze. Mikroszkópos vizsgálat: fluorokrómok segítségével Immunhisztokémia - immuncitokémia
Alapfogalmak II. Antigén: az immunrendszerre specifikusan ható sajátként vagy idegenként felismert struktúrák, molekulák összessége. Heterogén megjelenés Partikulált, szolubilis forma (fehérje, poliszacharid, gyenge mértékben nukleinsav vagy ezek összetett formái) Epitop (antigéndetermináns): A természetes antigének nagy része bonyolult összetételű makromolekula specifikus immunválasz kiváltására alkalmas szerkezeti és molekuláris elemekkel. Szekvenciális epitop: egyedi aminosav, monoszacharid sorrend Konformációs epitop: másodlagos, harmadlagos térszerkezeti mintázat Rejtett epitop: csak denaturáció hatására válnak láthatóvá Felismerő szervezet szempontjából az antigén lehet: Xenoantigén: más fajból származó Alloantigén: ugyanazon faj más egyedéből származó Autoantigén: saját antigén
Alapfogalmak III. Az immunrendszer antigénfelismerő molekulái: B limfociták felszinén levő B sejt receptor B sejtek által termelt szolubilisen előforduló antitestek T sejtek felszínén előforduló receptorok Antitest: immunglobulin molekulák; az immunválasz részei, amelyek antigén hatására B limfocitákban és a belőlük átalakult plazmasejtekben termelődnek Alapegység: két nehéz, két könnyű lánc A nehéz lánc alapján elkülöníthető: IgG, IgD, IgE, IgM, IgA N terminális régió nagy variabilitású Könnyű lánc: khí, lamda Izotípus: azonos osztályba és alosztályba tartozó ellenanyagok Hipervariábilis régiók epitopok illeszkedése
Alapfogalmak IV. Monoklonális antitest: azonos specificitású ellenanyag molekulák, egyetlen B-sejtből származó sejtvonal termeli egyetlen epitóp felismerésére képesek Y Y Y Y Antigén Poliklonális antitest: több, eltérő specificitású ellenanyag keveréke, több B-sejt klón termékei egy adott antigén eltérő epitópjait ismerik fel Y Y Y Y Antigén Immunizálás: Megfelelő állat kiválasztása Monoklonális antitest egér, patkány Poliklonális antitest nyúl, birka, kecske Az antitesteket az immunizált állatok szérumából nyerik ki
Monoklonális antitest előállítás Hybridóma technika: Lehetővé teszi kezdetben korlátozott osztódási képességű, de specifikus immunológiai tulajdonsággal rendelkező sejt korlátlan ideig való in vitro fenntartását. A módszer alapja, hogy aktivált immunsejteket in vitro B sejt/plazmasejt eredetű tumorsejtekkel fúzionáltatunk. Myeloma sejt Plazma sejt Korlátlan osztódás Ellenanyag termelés Hybridóma sejt Megfelelő antitest-termelő hibrid kultúrák kiválasztása Tesztelés: ELISA Klónozás: az antitesttermelő sejtek higítása monoklón xxx x x x x x x x x
Alapfogalmak V. Elsődleges antitest: ellenanyagok, amelyek a megcélzott antigénnel közvetlenül képesek kapcsolódni Lehet: monoklonális, poliklonális, módosítatlan, kémiailag módosított Másodlagos antitest: olyan antitest, amelynek a célmolekulája egy elsődleges antitest (immunglobulin, ami csak akkor viselkedik antigénként egy szervezetben, ha más fajból származik) Lehet: monoklonális, poliklonális, szinte mindig módosított!!! Harmadlagos antitest: érzékenység, technikai kérdés
Az immunhisztokémia során használt módszerek típusai Direkt módszer egyszerűség Indirekt módszer nagyobb érzékenység Jelzés Szekunder ellenanyagok Primer ellenanyag Antigén
Indirekt módszerek I. Enzim-antienzim rendszer PAP peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Primer ellenanyag Szekunder ellenanyagok Antigén
Indirekt módszerek II. Biotin-avidin rendszerrel kombinált módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni ABC Avidin-enzim komplexek avidin biotin enzimcomplexek Biotin-enzim komplex Biotinált ellenanyag Avidin Antigén
Immunhisztokémia lépései FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta FAGYASZTÁS Festés előtti metszet
Immunhisztokémia lépései X Enzim Avidin Biotin másodlagos antitest elsődleges antitest antigén Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet
Immunhisztokémia lépései Fixálás: A minta átjárható legyen és az antigén determinánsok ne károsodjanak (paraformaldehid, glutáraldehid) (szövetmintától függő)-később lesz szó róla Metszetelőkészítés, beágyazás, rögzítés Antigénfeltárás: A formaldehid alapú fixálás során a fehérjék természetes konformációját irreverzibilisen megváltoztató keresztkötések létesülhetnek, amely révén az antigén epitópok az antitestek számára hozzáférhetetlenné válhatnak. Blokkolás: az antitest és a metszet között nemcsak antigénspecifikus kötődések jöhetnek létre, így a nem-specifikus kötőhelyeket nagy koncentrációjú indifferens fehérjével telítenünk kell. Elsődleges antitesttel történő inkubálás Primer antitest kötődés kimutatása Kiértékelés
Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására és tulajdonságainak vizsgálatára alkalmas. Az aktiválás utáni különböző időpontokban befagyasztható a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei Sok, legalább 10 6 sejt szükséges a vizsgálathoz
Western blot Az első lépés a gélelektroforézis. A minta fehérjéit a gélen moláris tömegük alapján választják el, általában SDS-PAGE-et, azaz nátrium-hidroszulfát-poliakrilamidgél-elektroforézist használnak. A gélen több sáv van, így a minták párhuzamosan vizsgálhatók. Transzfer: Elektroforézis gél vékony és törékeny, ezért nehéz lenne véghezvinni a fehérjék kimutatásához szükséges minden lépést rajta. Emiatt transzferálják nitrocellulóz membránra vagy PVDF-re a gél tartalmát. Ez maga a blottolás folyamata. A membránnak fehérje kötő részei vannak, melyek nem specifikusak, minden fehérjét azonos valószínűséggel kötnek. Blokkolás: A membránt aztán blokkolják, hogy megakadályozzák a nem specifikus fehérje kölcsönhatásokat a membrán és az antitest fehérjék között. Az antitestet, amely felismeri a vizsgált fehérjét, a membránon inkubálják. Miután átöblítettük a membránt a nem kötött antitestek kimosása érdekében, a másodlagos antitestekkel is inkubáljuk azt. Ez kötődik az elsődleges antitesthez, és általában más állattal termeltetik. Mivel a primer antitest a vizsgálni kívánt fehérjét, a szekunder a primer antitestet ismeri fel, így a folt jelenléte a membránon egyértelműen utal a fehérje jelenlétére is. Méretekre is következtethetünk, ha rendelkezünk egy fehérje méret markerrel.
Anode - Cathode + + -
Western blot
Felerősített kemilumineszcencia módszer H 2 O 2 jelenlétében a luminol a peroxidaz enzim által katalizált oxidációs folyamat során gerjesztődik, majd emittál egy fotont, és visszakerül az alapállapotba Ez a foton detektálható filmen vagy kameraval. a fényemisszió felerősíthető fenolgyűrűs vegyületek jelenlétében (6- hydroxybenzothiazole) Kitapasztott Fehérje Fab Elsődleges antitest torma peroxidaz H 2 O 2 luminol h Epitope a protein felszínén Másodlagos antitest H 2 O luminol erősítő Detektor Forrás az előadáshoz: http://www.google.hu/#sclient=psy-ab&hl=hu&source=hp&q=immunhisztok%c3%a9mia+ppt&pbx=1&oq=immunhisztok% C3%A9mia+ppt&aq=f&aqi=&aql=&gs_sm=e&gs_upl=5151l5546l1l5867l3l2l1l0l0l1l235l392l0.1.1l3l0&bav=on.2,or.r_gc.r_pw.,cf.osb&fp=79ac2067a3de8763&biw=1366&bih=667