Fénymikroszkópos festési eljárások

Átírás

1 Fénymikroszkópos festési eljárások Vitális festékek A vitalis festékek képesek az élő sejteket, szervezeteket megfesteni, anélkül, hogy azokban (jelentős) kárt okoznának. Gyakran alkalmazott vitalis festékek: Neutrálvörös Metilénkék

2 Neutrálvörös Savas közegben pirosas, lúgosban sárgás színt ad, egyben ph indikátor is. Átcsapási pontja miatt nevezik neutrálvörösnek. A festett készítményt fénymikroszkóppal vizsgáljuk. Hematodium paraziták kimutatása neutral vörössel. Gyorsan felveszik a festéket, még a granulocyták halványak maradnak. programs/crustacean/research/hematodinium/ diagnosis_hematodinium/index.php

3 Metilénkék festés: Metilénkékkel festett betokozódott bacilusok egér lép szövetben. Meric és mtsai International J.of Infectious Diseases (2009) 13, e456 e458

4 Hagyományos szövettani festések A nem specifikus festékek többféle struktúrát megfestenek a sejtben Kémhatás alapján: bázikus festékek (hematoxilin, toluidinkék, metilénkék): liláskék szín negatív töltésű molekulákhoz (nukleinsavakhoz, fehérjék karboxil-csoportjához) kötődnek, sejtmagot, riboszómákat, endoplazmatikus retikulumot festik savas festékek (eozin, fukszin, orange C) rózsaszín vagy vöröses szín jól kötődnek a fehérjék pozitív töltésű végéhez, citoplazmát, a mitokondriumokat és a kollagén rostokat festik neutrális festékek (szudánvörös, szudánfekete) nem hordoznak kifejezett töltéseket, a hidrofób komponensek, pl lipidek festésére alkalmasak.

5 Cél: Egyes sejtalkotók eltérő mértékben, színre színeződnek: ezek arányát, alakját és az ebben bekövetkezett változásokat könnyebb így tanulmányozni. 1. Morfológia tanulmányozása: hematoxylin eozin festés, azán festés, különböző fém impregnációk 2. Funkcionális elváltozásokat feltáró vizsgálatok: Alcián-kék/PAS: mucin termelés detektálása, von Kossa Ca2+ lerakódás vizsgálata, Lucol: mielinizáció vizsgálata 3. Bakteriális, gombás fertőzések kimutatása: Gram festés, ezüst imptregnáció

6 Szövettani metszetek készítésének folyamata: Vitális festések: Élő sejtek által felvehető színes, vagy ultraibolya fényben fluoreszkáló anyagokat (pl. neutrál vörös, tripánkék, akridin oranzs stb.) alkalmazunk a sejtek egyes részleteinek láthatóvá tételére. Thecamoeba: Bekebelezett algák filamentjei neutrál vörössel megfestve

7 Fénymikroszkópos festés: Elvi alapja az, hogy a különböző színű vegyületek meghatározott sejt, illetve szövetkomponensekhez kötődnek, mégpedig az esetek egy részében specifikusan. LÉPÉSEI: I. ELŐKÉSZÍTÉS: 1. Rögzítés, fixálás: Amikor a szervezetből eltávolítunk egy szövet darabot akkor a sérült felületen, később O 2 hiány miatt rengeteg enzim aktiválódik amelyek elindítják sejt autolízisét (degradálódását, sejtalkotók felszívódását). A) sejttenyészet készítése: nagy számú hasonló sejt előállítása céljából B) fagyasztás: fehérje, lipid DNS, RNS izolálásához, immunohisztokémiához.

8 C) fixálás: szobahőmérsékleten eltartható metszetek későbbi vizsgálatokhoz. 2.) Kimosás: a rögzítőszer eltávolítása vízzel, vagy egyéb oldószerrel. 3.) Víztelenítés (dehidrálás): 4.) Beágyazás: 5.) Metszetkészítés: 6.) A metszetek festése: A fenti procedura az első lépéstől az utolsóig kompromisszumok sorozata, mivel a vizsgálandó anyag mindvégig olyan reagensekkel kerül közvetlen kontaktusba, melyek nem közömbösek számára. Tökéletes, minden kívánalomnak megfelelő rögzítő, beágyazó, és víztelenítő anyagok nincsenek, ezért a végső cél érdekében az adott reagens néhány hátrányos tulajdonságával mindig meg kell alkudnunk. Ezért a sikeres eredmény elérése érdekében fontos a nagyszámú tapasztalati (irodalmi) adat figyelembe vétele.

9 Festések: Alcián kék festés: Kationos festék glukoz-aminoglikánok kimutatására. Kombinálható hematoxilin eozin, illetve van Gieson festéssel. Jellemzők: sejtmag: fekete vagy szürke poliszacharidok: kék, kékes

10 Azán festés: (Azokarmin Anilin kék). Ez esetben előbb az azokárminnal magfestést, majd az ún. Mallory oldattal (anilin kék+orange G) kötőszöveti és plazmafestést végzünk. Jellemzők: a magok, a vörösvérsejtek és a nyálka kárminpiros, a kötőszövet kollagén rostjai kék vagy sárga Tengerimalac bőr: epidermisz réteg: piros, elhalt sejtek elénkpiros homogén réteget alkotnak. Irha: kollagén rostok miatt kék, fibroblasztok sejtmagjai illetve a kapillárisok látszanak pirosan benne.

11 Kezelt és kezeletlen csoport tüdő szövetének vizsgálata azán festéssel. A kezelés hatására megváltozott kollagén mennyiségét mutatták ki. A Normál kontrol, B Kóros C Kóros állapot kezelés után D Normál kontrol kezelés után E Kóros állapot placebo kezeléssel

12 Hematoxilin és Eozin festés (H&E) Hematoxilinnal előbb bazofil festést végzünk. Ekkor a DNS-t és RNS-t tartalmazó sejtkomponensek és ha jelen vannak a savanyú mukopoliszacharidok festődnek. Ezután vizes eozinnal közel semleges ph mellett általános, ún. plazmafestést végzünk. A mag és a riboszóma tömegek (pl. durva felszínű ER) a felvett hematoxilintól lilásbarnára, míg a többi anyagok rózsaszínűre (eozin vörösre) színeződnek. Sejtmag: fekete, kék durva felszínű endoplazmatikus retikulum: sötétlila citoplazma: rózsaszín, vöröses

13 Trichrome (három színű) festés: Leggyakrabban kötőszövetek festésére használták. A megjelenő három szín: bazofil struktúrák (sejtmag) ált kék, citoplazma, izom, vörösvértestek, keratin: piros, kollagén: kék vagy zöld. A magfesték hematoxilin: kékre, feketére, azán: pirosak a magok. Gömöri-féle gyors eljárás: Sejtmag: szürkés kék Kollagén: zöld, kékes-zöld Izom: piros vörösvérsejt: piros

14 Fém-impregnációs eljárások: Általában bizonytalan, hogy pontosan mi festődik. A Camillo Golgi által először alkalmazott, az Ag+ redukálásán alapuló ezüstimpregnáció során barnásfekete csapadék képződik az idegsejtben, így kirajzólódik a neuronok sejttestje és nyúlványredszere is. Idegrendszerben sejtek morfológiájának vizsgálatához elterjedt technika, pont azért mert nem minden sejt festődik vele, ezért a megfestődött sejtek jól elkülönülnek. Számtalan változata ismert. Embrioban neurofilamentumok kialakulása: Agimpregnáció Golgi festés:

15 von Kossa festés: Metszetet 2%-os AgNO3 oldattal kezeljük és 1-1.5h-ra erős lámpa (100Watt-os halogén lámpa) elé helyezzük. Ca2+ lerakódás helyén fekete csapadék. Vesében Ca lerakódások kimutatása von Kossa festéssel.

16 A PAS (Periodic Acid Schiff) reakció Szintén a hagyományos szövettani festések közé tartozik a perjódsav-schiff-reakció (PAS-reakció), ami a makromolekuláris glikoproteinek szénhidrát komponenseket festi püspöklila színűre. A reakcióban használt perjódsav (HJO4) szelektíve oxidálja az 1,2 glikol, az 1 hidroxi 2 amino, az 1 hidroxi 2 alkilamino és az 1 hidroxi 2 keto csoportokat, továbbá a telítetlen zsírsavakat. Ezek közül legfontosabb az 1,2 glikol csoporttal (pl. a heparinban és a porc alapállományának chondroitin szulfátjában.

17 PAS tüdő Alcián kék és hematoxili eozin festés: Mucint szekretáló tumor:

18 Immuncitokémiai eljárások Az utóbbi évben egyre nagyobb teret hódít Bevezetése Pepe (1961) nevéhez fűződik. A módszer segítségével egyes specifikus fehérjemolekulák struktúrán belüli helye adható meg normális vagy kísérletes körülmények között. Immunológiai és hagyományos szövettani módszereket kombináljuk. Szöveti antigének, vagy fél-antigének detektálása: fehérjék és ezek szénhidrátokkal (glükoproteinek) és lipidekkel (lipoproteinek) alkotott molekulái. Antigén antitest reakció elvén alapul, az antitesthez fény vagy elektronmikroszkóppal, illetve esetenként mindkettővel is észlelhető anyag kapcsolható.

19 Főbb alkalmazási területek Sejtcsoportok azonosítása, jellemzése anatómiában Gyulladásos infiltrátumok, a vesebetegségek, a degeneratív betegségek jellemzésére Fertőző ágensek kimutatása Daganatpatológia daganatok differenciációjának megállapítása alcsoportba sorolása nyirokcsomóáttétek azonosítása, prognózis megítélése, terápia alkalmazhatósága terápiás terv kialakítása egyes kórokozók kimutatása

20 Monoklonális antitest: Egyetlen antigén determináns szekvenciához, vagy konformációhoz kötődik. A monoklonális antitesteket antigén-aktivált B-sejtek és myeloma sejtek fúziójából kialakuló monoklonális hibridoma sejtvonalak segítségével termelik. Egy ilyen klón (és az általa termelt antitest elnevezése) a kifejlesztő laboratóriumban szokásos kódok alapján történhet (pl. BerH2: Berlin - Hodgkin -2). A monoklonális antitestek legtöbbször egér sejtekből származnak, de ismeretesek patkány, illetve újabban nyúl monoklonális antitestek is. A monoklonális antitestek alkalmazásra kerülhetnek ascites (hasűrbe oltott hibridoma) folyadék, hibrodoma szövetkultúra tápfolyadéka ( felülúszója ), vagy tisztított immunglobulin formájában. Előnye: ha sikerül igazán specifikus régió ellen létrehozni, akkor aspecifikus reakciók létrejöttének esélye kicsi. Megfelelő secunder antitestekkel igen nagy erősítés valósítható meg. Hátránya: nagyon érzékeny az egyetlen epitop konformációjára (fixáláskor létrejött deformációk az epitopban nagyon leronthatják a jelölődés hatásfokát). Specifitás ellenőrzésére nagyon oda kell figyelni, esetleges keresztreakcióval eddig számításba nem vett egyéb populáció jelölődhet.

21 Poliklonális antitestek: Immunizálás után nyert teljes, vagy tisztított szérumot jelentenek, és legtöbbször több/számos antigén determinánshoz kötődnek ugyanabban az időben. A poliklonalis antitesteket leginkább nyúlban és kecskében termelik, de alkalmazásra kerülhetnek birka, tengeri malac, szamár, ló antiszérumok is. Előnye: olcsóbb, kevésbé érzékeny a fixálás pontos körülményeire. Hátránya: nagyobb a háttérfestődés: poliklonális antitest eptopjainak egy része egyéb általunk nem vizsgált fehérjben is előfordulhat.

22 Parvalbumin neuronok human cortexben Tüdőben influenza vírussal fertőzött sejtek kimutatása

23 Dupla festés: Alkaline foszfatáz festés piros és barna színnel jelölt antitestekkel. Tripla festés: piros: CD20: B sejt marker, fekete: Fox P3: T sejt marker, barna: CD3 kifejlett T sejt markere.

24 Fluorescens festések: A kettős vagy többjelöléses vizsgálatoknál nagyon fontos, hogy az egyik anyag jelölése ne fedje el a másik anyagét, ezért legjobb, ha különböző színű fluoreszcens festékeket alkalmazunk. Így ha az egyik molekulát piros, a másikat zöld szín jelzi, kolokalizáció (együttes előfordulás) esetén sárga színt látunk a fluoreszcens mikroszkópban. A fluoreszcens vizsgálatokban ma már egyre elterjedtebb a konfokális lézer szkenning mikroszkóp használata, mely a minta egy adott mélységében készít képet, így biztosítja, hogy ne lássunk hamis kolokalizációt az egyes síkok egymásra vetülése miatt.

25 Parvalbumin: zöld CRF: piros

26

27 Feladatok 1. Melyik felvétel ábrázol hematoxylin és eozin festést? 2. Melyik felvétel ábrázol PAS festést? 3. Melyik kép ábrázol trichrome festést? 4. Melyik felvétel ábrázol fémimpregnációval készült metszetet? 5. Mely felvételek van immunhisztokémiai eljárással megfestett metszet? 6. Melyik képen van többszörös immunhisztokémiai festés?