01/2008:1635 GLUCAGONUM HUMANUM Humán glükagon C 153 H 225 N 43 O 49 S M r 3483 DEFINÍCIÓ A humán glükagon 29 aminosavból álló polipeptid; szerkezete megegyezik az emberi hasnyálmirígy α-sejtjei által termelt a májban lévő glikogén lebomlását gyorsító, és ezáltal a vércukorszintet emelő hormon szerkezetével. Tartalom: 92,5 105,0% (vízmentes anyagra). ELŐÁLLÍTÁS A humán glükagont rekombináns DNS (rdns) technológián alapuló módszerrel nyerik. A termék kifejlesztése során bizonyítani kell, hogy a gyártási folyamat eredményeképpen nyert termék biológiai aktivitása megfelelő, validált biológiai értékmeghatározással megállapítva legalább 1 NE/mg. Gazdasejt eredetű fehérje. A követelményt az illetékes hatóság állapítja meg. Gazdasejt eredetű és vektor eredetű DNS. A követelményt az illetékes hatóság állapítja meg. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por.
Oldékonyság: vízben és a legtöbb szerves oldószerben gyakorlatilag nem oldódik; híg ásványi savak és híg lúgok oldják. AZONOSÍTÁS A. Peptidtérkép-vizsgálat. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldat 200 μl-ét 800 μl R 0,1 M ammóniumkarbonát tompítóoldattal (ph 10,3) elegyítjük (hígított törzsoldat). R peptidtérkép-vizsgálatra szánt α-kimotripszinből R 0,1 M ammóniumkarbonát tompítóoldattal (ph 10,3) 2 mg/ml töménységű oldatot készítünk, és ezen oldat 25 μl-ét a hígított törzsoldathoz mérjük. Az így nyert oldatot lezárt üvegcsében 2 órán át 37 o C-on tartjuk. Ezután az üvegcsét kiemeljük a temperáló közegből, és a reakciót 120 μl R tömény ecetsav azonnali hozzáadásával leállítjuk. Összehasonlító oldat. CRS humán glükagonból R 0,1 M ammónium-karbonát tompítóoldat (ph 10,3) felhasználásával 1 mg/ml töménységű oldatot készítünk (hígított törzsoldat). A továbbiakban a vizsgálati oldat készítésére előírtak szerint járunk el. Oszlop: méretei: l = 0,05 m, Ø = 4 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (5 μm). Mozgófázis: A-mozgófázis: 500 μl R trifluorecetsav és 1000 ml R víz elegye; B-mozgófázis: 500 μl R trifluorecetsavat 600 ml R vízmentes etanollal elegyítünk, és az elegyhez 400 ml R vizet adunk. Idő (perc) 0-35 35-45 A-mozgófázis 100 53 53 0 B-mozgófázis 0 47 47 100
45-46 46-75 0 100 100 100 0 0 Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 215 nm-en. Egyensúly beállítása: az A-mozgófázissal, legalább 15 percen át. Injektálás: 20 μl. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatográfiás profilja feleljen meg az összehasonlító oldat kromatográfiás profiljának. B. A tartalmi meghatározás során nyert kromatogramokat értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós ideje egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós idejével. VIZSGÁLATOK Dezamidált glükagon. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 1,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. A vizsgálandó anyagból 0,1 M sósavval 1,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2 órára 60 o C-os szárítószekrénybe helyezzük. A bomlás lezajlása után a ph-t 1 M nátrium-hidroxid oldattal haladéktalanul 2,5-re állítjuk be. Oszlop: anyaga: üveg; méretei: l = 0,05 m, Ø = 5 mm; állófázis: R2 anioncserélő gyanta.
Mozgófázis: A-mozgófázis: 1000 ml R trometamol hidroklorid tompítóoldat (ph 8,3) és 1000 ml R vízmentes etanol elegye; B-mozgófázis: 29,2 g R nátrium-kloridot 1000 ml R trometamol hidroklorid tompítóoldatban (ph 8,3) oldunk; az oldathoz 1000 ml R vízmentes etanolt elegyítünk. Idő (perc) 0-4 4 30 30 34 34 38 38 40 40 60 A-mozgófázis 100 100 78 78 45 45 20 20 100 100 B-mozgófázis 0 0 22 22 55 55 80 80 0 0 Áramlási sebesség: 0,6 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 230 nm-en. Egyensúly beállítása: az A-mozgófázissal, legalább 15 percig. Injektálás: 60 μl. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: retenciós idő: glükagon kb. 10 perc; a négy dezamidált forma 15 40 perc; csúcsfelbontás: alapvonalelválás a négy dezamidált forma és a glükagon között. Követelmény: a négy dezamidált forma: együttes mennyiségük legfeljebb 0,5%, a 15 és 40 perc között eluálódó csúcsokból számolva. Rokon fehérjék. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk.
2,8 M karbamid oldat. 16,8 g R karbamidot 100 ml R vízben oldunk.. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 0,5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2-8 o C-on tartjuk. Összehasonlító oldat. Egy üvegcse CRS humán glükagonból 0,01 M sósavval 0,5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2-8 o C-on tartjuk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. 10 mg vizsgálandó anyagot 20 ml 2,8 M karbamid oldatban oldunk. Az oldatot 2 órán át 50 o C-on tartjuk. Lehűtés után az oldat ph-ját 1 M sósavval 2,2-re állítjuk be. Az oldatot 2-8 o C-on tartjuk, és 2 órán belül felhasználjuk, vagy 15 o C alatt tároljuk, és felhasználás előtt felolvasztjuk, majd 0,22 μm-es szűrőn megszűrjük. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; állófázis: 30 nm pórusméretű, R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm); hőmérséklet: 45 o C. Mozgófázis: A-mozgófázis: 13,6 g R kálium-dihidrogén-foszfátot 400 ml R vízben oldunk. Az oldathoz, miután ph-ját R tömény foszforsavval 2,5-re állítottuk be (2.2.3), 100 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilt elegyítünk; B-mozgófázis: R kromatográfiás célra szánt acetonitril R víz (40+60 V/V); Idő (perc) 0-23 23 29 29 30 30 31 31 75 A-mozgófázis 57 57 10 10 10 57 57 B-mozgófázis 43 43 90 90 90 43 43 Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc.
Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Injektálás: 50 μl; vizsgálati oldat és csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. Relatív retenció a glükagonra (retenciós ideje kb. 20 perc) vonatkoztatva: karbamoilglükagon kb. 1,1. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: csúcsfelbontás: legalább 2,0, a glükagon és a karbamoilglükagon között. Követelmény: összes szennyező: legfeljebb 2,5%. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 10%. Az anyag 50 mg-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 10 NE/mg. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29), a Rokon fehérjék vizsgálatban előírtak szerint, a következő módosítással. Injektálás: vizsgálati oldat és összehasonlító oldat. A humán glükagon C 153 H 225 N 43 O 49 S-tartalmát a CRS humán glükagon deklarált C 153 H 225 N 43 O 49 S-tartalma alapján számoljuk ki. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől védve, 15 o C alatti hőmérsékleten.