60 Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények Aminonftol enntiomerek ngyhtékonyságú folydékkromtográfiás vizsgált: A hőmérséklet htás királis elválsztásr ARANYI Anit, * PATAJ Zoltán, ILISZ István és PÉTER Antl Szegedi Tudományegyetem Szervetlen és Anlitiki Kémii Tnszék, Dóm tér 7, 6720 Szeged, Mgyrország 1. Bevezetés A mi modern nlitiki kémi egyik legfontosbb feldt királis vegyületek, különösen biológii és gyógyszerészeti jelentőséggel bíró nygok enntiomerjeinek elválsztás. H egy rcém gyógyszermolekul királisn szelektív élő szervezetbe kerül, nnk enntiomerjei különbözhetnek biológii hsznosíthtóság, megoszlás, metbolizmus, kiürülés vgy htás típusábn és mértékében. Ilyen például penicillmin (S) enntiomer formáj, mely kiváló ízületi gyulldáscsökkentő htónyg, míg (R) enntiomer párj toxikus (1. ábr). A poliszchrid lpú kolonnák királis állófázisként történő lklmzásánk ngy hgyomány vn folydékkromtográfiábn. A mikrokristályos cellulóz-tricetát lklmzás (MCTA) - mint váz nélküli polimer szelektor z 1970- es évekre nyúlik vissz. Npjinkbn mkropórusos szilikgélre felvitt poliszchrid szármzékokt hsználnk, melyeknek jobb mechniki stbilitás. A 2. ábrán láthtó, hogy glükóz egységek három széntomjánk OHcsoportját módosítv, különböző kölcsönhtásr lklms észter és krbmát csoportokt építhetünk be molekuláb. 1. Ábr. Penicillmin. Érthető tehát, hogy sztereoizomer keveréket gyógyszerhtónygként csk indokolt esetben lehet forglomb hozni. Npjinkr szbályozás olynnyir szigorodott, hogyh rcemát htónygot kívánunk bevezetni, kkor mindkét enntiomerre, és rcemátr is el kell végeznünk z összes kliniki és toxikológii vizsgáltot. Így egyértelmű, hogy rcemát forglomb hoztl többletkidássl jár, tehát fejlesztések már már kizárólg enntiomer tiszt vegyületek irányáb folynk. 1 A királis vegyületek izomerjeinek elválsztásár több lehetőség dódik, melyek közül kristályosítás (rezolválás), kromtográfi különböző fjtáit, és kpilláris elektroforézist lklmzzák leggykrbbn. A folydékkromtográfi mozgó-, illetve z állófázisok egyszerű változttás révén (igen sok eltérő jellegű állófázis kphtó npjinkbn kereskedelmi forglombn) királis vegyületek elemzésének leggykrbbn lklmzott nlitiki módszere. Bármilyen kromtográfiás módszernél z elválsztás úgy történik, hogy vizsgált vegyület időlegesen disztereomer párt képez z állófázis vgy mozgófázis optikilg ktív komponensével. 2 2. Poliszchrid lpú királis szelektorok * Főszerző. Tel.: +36 (62) 34-3656; fx: +36 (62) 54-4340; e-mil: rnyi@chem.u-szeged.hu 2. Ábr. A különböző cellulóz lpú kolonnák szerkezete, Chirlcel OJ; Lux Cellulose-3 b, Chirlcel OD, Kromsil CelluCot, Lux Cellulose-1, RegisCell, Nucleocel Delt, Eurocel 01; c, Chirlpk IC; d, Chirlcel OZ; Lux Cellulose-4 e, Lux Cellulose-2; Az ilyen állófázisokt Dicel (Tokió, Jpán) cég tervezte és hozt először forglomb, de z utóbbi években számos új cég jelentkezett hsonló típusú kolonnákkl. Ezek z állófázisok hordozó szilikgél minőségében, z milóz és cellulóz lánc polimerizációs fokábn, és z állófázishoz vló rögzítés módjábn jelentősen különbözhetnek egymástól, ezért szelektivitásukbn is jelentős különbségek jelentkezhetnek. H polimerek csk fizikilg kötöttek z állófázis felületén, kkor hordozóról vló lemosás lehetősége mitt nem lklmzhtó minden oldószer. Ezáltl jelentős előrehldást jelentett kémiilg kötött poliszchrid fázisok bevezetése. A szilikgélhez történő kémii kötés lehetővé teszi mozgófázisként szób jöhető oldószerek minőségének kiterjesztését z úgynevezett nem-stndrd oldószerekre, például diklórmetán, kloroform, tetrhidrofurán, dioxán, stb. Érdemes zt is megemlíteni, hogy ezek fázisok mnpság fordított fázisú rendszerként is lklmzhtók, 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények 61 zonbn tudnunk kell, hogy fázisok közötti váltássl némi htékonyság csökkenést tpsztlhtunk. A poliszchrid lpú királis állófázisok optiki szelektivitás három fő szerkezeti tuljdonságból tevődik össze: * molekuláris kirlitás: mely glükóz csoportokon elhelyezkedő kirlitáscentrumoknk tuljdoníthtó, * konformációs kirlitás: mely szénhidrátlánc lináris (cellulóz lpú), vgy helikális (milóz lpú) konformációs szerkezetének tuljdoníthtó, és * szuprmolekuláris kirlitás: mely szomszédos polimerláncok királis rendezettségéből dódik. A poliszchrid állófázisok esetében z izomerekkel π- sv π-bázis, dipól-dipól és hidrogénhids kölcsönhtások lkulhtnk ki. Mindemellett fontos szerepet játszht ngyobb terjedelmű romás oldlláncok sztérikus htás is. A merev, viszonylg ngy térkitöltésű romás szubsztituensek ebben z esetben felületen helyezkednek el, és jelentősen befolyásolják H-híd kötés kilkulását, ugynis z mélyen elrejtett szénlánc mentén. A π-π kölcsönhtás számos királis állófázisnál játszik döntő szerepet. H z romás részen elektronküldő, vgy elektronhiányos csoport vn szubsztituensként, kkor két romás gyűrű között kölcsönhtás lkulht ki. Az állófázist, melynél elektron hiány vn, nevezhetjük z áltlános sv-bázis elmélet értelmében Lewis svnk, melynél z elektronsűrűség megnövekszik Lewis bázisnk. A vizsgálndó vegyületeknél áltlábn z romás gyűrű elektron hiányos vgy elektron többlete vn, ez z lpj, hogy egy elektron hiányos romás rész és egy elektron többlettel rendelkező enntiomer között π sv -π bázis kölcsönhtás lkulht ki. A krbmát és észter funkciós csoportok stbilizálják molekul-szelektor komplexet, illetve erősítik π-π kölcsönhtást. A poliszchrid állófázisoknk ezt z áltlános kötésmechnizmusát IR és NMR mérések is látámsztják. 3 3. A hőmérséklet királis kromtográfiás elválsztásr gykorolt htásánk rövid irodlmi áttekintése A kromtográfiás prméterek hőmérséklet függésének vizsgált királis kromtográfiás retenciós mechnizmus feltérképezésének egyik lehetséges módj is lehet. Ennek során kpott termodinmiki dtok ugyn egyensúlyi rendszerekre igzk - mely nem feltétlen teljesül kromtográfiás folymtok dinmikus rendszereire - zonbn megfelelő becslést tudnk nyújtni z elválsztási folymtok értelmezésénél. Egy, termodinmikából ismert összefüggés kpcsoltot teremt stndrd szbdentlpi változás és z egyensúlyi állndó (mi kromtográfiás retenció esetén megoszlási hánydos) között, miközben z dott komponens z egyik fázisból másikb kerül: RT ln K = -ΔG o (1) H megvizsgáljuk két enntiomer stndrd szbdentlpi változásánk különbségét, következtetéseket tudunk levonni mechnizmusról: ΔG 2 -ΔG 1 =Δ(ΔG ) (2) A már ismert Gibbs-Helmholtz formulát (1), z előző egyenletbe behelyettesítve következő összefüggéshez jutunk: -Δ(ΔG )=RT ln (k 2 / ) (3) A és k 2 két enntiomer retenciós fktorát jelöli, ezáltl z α elválsztási tényező két enntiomer csúcs egymáshoz viszonyított helyzetét dj meg. Az elválsztási tényezőt behelyettesítve z előző egyenletbe következő kifejezést kpjuk: -Δ(ΔG o )=RT ln α (4) Ismerjük még stndrd szbdentlpi változás különbségének definícióját is Gibbs-függvényből: Δ(ΔG ) = Δ(ΔH )- TΔ(ΔS ) (5) Így ln α egyszerűsítések után kifejezhető következő formulávl, melyet kromtográfiábn hsználtos vnt Hoff egyenletnek is hívunk: ( H ) ( S ) ln = + (6) RT R Tehát z egyenlet szerint ln α-t 1/T függvényében ábrázolv egyenest kpunk, melynek meredeksége Δ(ΔH )/R, tengelymetszete, pedig Δ(ΔS )/R. A királis kromtográfiábn vnt Hoff ábrázolások gykrn eltérnek z egyenestől, mi felület inhomogén jellegére utl és vegyes retenciós mechnizmust feltételez. 4,5 Rádásul egy királis molekul retenciój nemkirális és királis kölcsönhtások eredménye, melyek rány jelentősen változht kromtográfiás körülményekkel. H Δ(ΔH) és Δ(ΔS) értéke negtív, folymt entlpivezérelt, mint legtöbb esetben. A másodikként eluálódó enntiomer stbilisbb komplexet képez szelektorrl, mint z elsőként eluálódó, kedvezőtlen entrópitgot eredményezve. Az elválsztási tényező csökken hőmérséklet emelkedésével. H z elválsztás hőmérséklete eléri zt pontot (T iso ) hol z entlpi tgot z entrópi tg kiegyenlíti, ezen hőmérsékleten α = 1,0, zz két enntiomer együtt eluálódik. T iso számíthtó z lnk vs 1/T egyenesekből. A T iso hőmérséklet felett folymt entrópivezérelt és fordított elúciós sorrend figyelhető meg. Az elválsztási fktor növekszik hőmérséklet emelkedésével, együtt kolonn htékonyságánk növekedésével. Ez két kedvező htás teszi z entrópivezérelt elválsztásokt különlegessé. A T iso hőmérséklet létét elsőként Koppenhoefer nd Byer vlószínűsítette. 6 Az első közvetlen kísérleti bizonyíték Gil- Av és mtsi. 7 vlmint Schurig és mtsi. 8 gázkromtográfiás munkáiból ismert. A folydékkromtográfiábn lklmzhtó szűk hőmérséklet trtomány mitt z entrópivezérelt királis elválsztás és z elúciós sorrend változás hőmérséklettel csk ritkán figyelhető meg. Az elúciós sorrend változás mellet lpvonlr történő elválsztás kis és ngy hőmérsékleten 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
62 Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények 3. Ábr. Az minonftol enntiomerek szerkezete: : (1) 1-{N-(1-fenilmetil)[1-fenil(minometil)]}-nftlin-2-ol; (2) 1-{N-(1-nftilmetil)[1- fenil(minometil)]}-nftlin-2-ol; (3) 1-{N-(1-piridin-2-ilmetil)[1-fenil(minometil)]}-nftlin-2-ol; (4) 1-{N-(1-piridin-3-ilmetil)[1-fenil(minometil)]}- nftlin-2-ol; (5) 1-{N-(1-piridin-4-ilmetil)[1-fenil(minometil)]}-nftlin-2-ol. szintén ritkán volt észlelhető. Egyedül Fulde és Frhm 9 szotlol enntiomerek elválsztás esetén Cellubiohydrolse- I-típusú kolonnán figyeltek meg lpvonlr történő ( >1,5) elválsztást mind kis mind ngy hőmérsékleteken. Yo és mtsi 10 tpsztlt szerint z izo-enntioszelektív hőmérséklet (T iso ) környékén nem mindig sikerül elválsztni z enntiomer vegyületpárt. A szerzők ezt úgynevezett hőmérséklet indukált láthttln régió -nk nevezték ( temperture-induced blind zone ) mely néhány tíz fok hőmérséklet trtományr terjed ki. 4. A hőmérséklet htás z minonftol enntiomerek királis kromtográfiás elválsztásár A vizsgált öt minonftol nlóg szerkezeti képletét 3. ábrán tüntettük fel. Ezek z nygok két kirlitáscentrumot trtlmznk, így következő konfigurációjú sztereoizomerek léteznek: 1S,1S () 1R,1R, (b) és 1R,1S (c)- 1S,1R (d). A Chn-Ingold-Prelog szbály következtében 3 vegyület konfigurációj nitrogén orto helyzete mitt megváltozik- 1R,1S ()- 1S,1R (b); 1S,1S (c) 1R,1R, (d). Az 1S,1S és 1R,1R vlmint z 1S,1R és 1R,1S konfigurációk enntiomer viszonybn, míg konfigurációk többi párosításábn ezek sztereoizomerek disztereomer viszonybn állnk egymássl. A diszteromerek elvileg királis környezetben is elválszthtók, viszont fent említett enntimer párok elválsztásához feltétlenül királis környezet szükséges. A hőmérséklet kromtográfiás prméterekre gykorolt htását Lux Cellulose-1 oszlopon vizsgáltuk, mind z öt minonftol nlóg esetén 5 o C 40 o C trtománybn, 2c-2d enntiomerpár esetén -5 o C 80 o C hőmérséklet trtománybn is (1. Táblázt). Egy dott eluens összetételnél - heptán/2-proh/dea= 90/10/0,1 (v/v/v) - hőmérséklet emelkedésével retenciós fktor minden áltlunk vizsgált nygnál csökkent. Ez nnk tuljdoníthtó, hogy ngyobb hőmérsékleten rendszer belső energiáj ngyobb, ezáltl vegyületek hőmozgás nő, így könnyebben legyőzik z állófázissl kilkított kölcsönhtásokt. A szelektivitás illetve felbontás hőmérséklet emelkedésével retenciós fktorrl párhuzmosn csökkent A heptán/2-proh/dea=90/10/0,1 (v/v/v) eluens összetételnél kivételt képezett 2c-2d nlóg, melyre -5 o C 15 o C trtománybn szelektivitás és felbontás először csökkent, mjd 70 o C után kismértékben nőtt hőmérséklet emelkedésével (1. Táblázt). Az elválsztást kísérő stndrd entlpi, stndrd entrópi és stndrd szbdentlpi változás értékeit vnt Hoff egyenlet segítségével grfikus úton htároztuk meg, hol ΔH /R z egyenes meredekségével, míg ΔS /R+lnφ tengelymetszettel egyezik meg. A hőmérsékletfüggésből számolt termodinmiki dtokt 2. Tábláztbn foglltuk össze. A ΔH és ΔS * (ΔS * =ΔS +R lnφ) értékek minden vegyületnél negtívnk dódtk. A kilkuló kölcsönhtások stndrd entlpiváltozás szempontjából kedvezményezettek, de stndrd entrópiváltozás szempontjából már nem. A negtív stndrd entrópi rendezettség növekedését fejezi ki ( molekul több ponton kötődik z állófázishoz) de ezt stndrd entlpiváltozás mértéke meghldt, így stndrd szbdentlpi változás is negtívnk dódott (kivétel 3c- 3d enntiomerjei, hol nem tpsztltunk elválást). A 2. Táblázt dti lpján másodikként eluálódott enntiomer esetében ΔH értékek negtívbbk, mint z elsőként eluálódott enntiomeré, zz másodikként eluálódó komponens kölcsönhtás z állófázissl energetikilg kedvezőbb. Az entrópi értékeket tekintve ngyobb ΔS * értékek zt jelentik, hogy jobbn 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények 63 vissztrtott enntiomer jóvl stbilbb átmeneti komplexet képez z állófázissl, mozgásábn erősebben korlátozott. 1. Táblázt. (folyttás) Az elsőként eluálódó enntiomer retenciós fktor ( ), z elválsztási tényező (α) és felbontás ( ) változás minonftol nlógok esetén különböző hőmérsékleten 1. Táblázt. Az elsőként eluálódó enntiomer retenciós fktor ( ), z elválsztási tényező (α) és felbontás ( ) változás minonftol nlógok esetén különböző hőmérsékleten Mint Eluens, α, Hőmérséklet ( C) -5 0 50 60 70 80 Hőmérséklet ( C) Mint Eluens, α, 5 10 15 20 30 40 1,80 1,67 0,69 0,60 0,50 0,43 α 1,16 1,15 1,00 1,00 1,05 1,12 1,22 1,10 1,04 0,95 0,78 0,66 1,75 1,60 0,00 0,00 0,37 0,44 1,1b α 1,39 1,32 1,27 1,25 1,17 1,12-2,97 1,47 - - - 3,43 2,73 2,48 2,25 1,33 0,99 b α - 1,13 1,15 - - - 1,48 1,33 1,23 1,10 0,92 0,74-1,90 1,90 - - - 1c,1d 2,2b 3,3b 3c,3d 4,4b 4c,4d 5,5b 5c,5d b α 1,29 1,28 1,27 1,26 1,24 1,23 2,86 2,79 2,77 2,26 2,21 2,14 2,69 2,23 2,09 1,77 1,50 1,23 α 1,76 1,68 1,65 1,54 1,52 1,41 5,14 5,12 4,97 4,70 4,49 4,08 1,51 1,33 1,17 1,16 0,98 0,82 α 1,12 1,06 1,00 1,00 1,00 1,00 1,54 0,78 0,00 0,00 0,00 0,00 2,89 2,48-2,23 1,99 1,70 α 1,09 1,08-1,00 1,03 1,09 1,16 0,93-0,00 0,60 1,18 0,81 0,75 0,68 0,63 0,54 0,47 α 1,22 1,20 1,18 1,17 1,15 1,13 1,88 1,49 1,38 1,24 1,00 0,84 1,61 1,43 1,27 1,16 0,98 0,82 α 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,50 3,30 3,13 2,91 2,52 2,16 α 2,07 1,99 1,93 1,85 1,74 1,65 7,66 7,64 7,61 7,58 7,53 7,35 6,16 5,62 5,15 4,65 3,84 3,17 α 1,40 1,37 1,35 1,32 1,27 1,23 4,11 4,08 4,05 3,96 3,84 3,33 8,06 7,50 6,95 6,57 5,45 4,78 α 1,17 1,16 1,15 1,13 1,11 1,09 1,79 1,76 1,74 1,67 1,64 1,06 8,92 8,28 7,48 6,82 5,92 5,01 α 1,88 1,83 1,79 1,75 1,69 1,60 9,66 7,66 7,10 7,04 7,00 6,60 Kolonn, Lux Cellulose-1; Eluens,, heptán/2-proh/dea=90/10/0,1 (v/v/v), b, heptán/ /2-PrOH/DEA=98/2/0,1 (v/v/v); ármlási sebesség, 0,5 ml/perc; detektálás 230 nm. Kolonn, Lux Cellulose-1; Eluens,, heptán/2-proh/dea=90/10/0,1 (v/v/v), b, heptán/2-proh/dea=98/2/0,1 (v/v/v); ármlási sebesség, 0,5 ml/perc; detektálás 230 nm A két enntiomerre vontkozó entlpi- és entrópiváltozás különbségeket tekintve, 4-4b kölcsönhtás Lux Cellulose-1 állófázissl legngyobb Δ(ΔH ) értéket eredményezte, míg 1c-1d enntiomerpárr legkisebb Δ(ΔH ) dódott. A Δ(ΔS ) értéke 2-2b és 4-4b nlógok esetén volt legngyobb (2. Táblázt). A Δ(ΔS ) értékét ngyrészt z állófázishoz kötött két enntiomerre vontkozó szbdsági fokok különbsége vlmint z állófázishoz vló kötődés során felszbduló oldószer molekulák szám htározz meg. A Δ(ΔG ) 298 értéke zt sugllj (2. Táblázt), hogy 2-2b (nftilgyűrűt trtlmzó nlóg) és 4-4b és z 5c-5d nlógok (piridil-csoportot trtlmzó enntiomerpár hol N-tom 3 vgy 4 helyzetben vn) igen htékonyn kötődnek szelektorhoz. A heptán/2-proh/dea=90/10/0,1 (v/v/v) eluens összetételnél 2. Táblázt dti lpján számoltuk T iso hőmérsékletet, hol z enntioszelektivítás megszűnik és z elúciós sorrend megfordul. A legtöbb esetben T iso hőmérséklet jóvl meghldt szobhőmérsékletet; entlpivezérelt elválszást tpsztlunk. A 2c-2d enntiomerpárr T iso hőmérséklet 38 C (4.A. ábr, 2. Táblázt). -5 C-tól kezdődően α csökkent hőmérséklet emelésével mjd T iso hőmérséklet közelében, egy trtománybn elválsztást nem tpsztltunk. Tovább emelve hőmérsékletet zonbn α újr nőtt. A 2c-2d minonftol nlóg esetében heptán/2-proh/dea=90/10/ 0,1 (v/v/v) eluens összetételnél ez trtomány 20 C és 60 C között volt (4.A. ábr). H megnézzük 2. Tábláztbn szereplő Δ(ΔH o ) és Δ(ΔS o ) értékeket, láthtjuk, hogy negtívk, vgyi z elválsztásoknál z entlpiváltozás dominál. A 2c-2d nlóg esetén zonbn T iso hőmérséklet ltt negtív, T iso hőmérséklet felett pedig pozitív értékeket kpunk. H elérjük T ison hőmérsékletet z entlpi hozzájárulást z entrópi változás kompenzálj. Ekkor z α=1 tehát két enntiomer nem válszthtó el. A T iso hőmérséklet feletti trtománybn zonbn folymtot z entrópiváltozás htározz meg, z enntiomerek újr elválszthtók, z elúciós sorrend pedig megfordul. Ezt jelenséget muttj z 5.A. ábr. 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
64 Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények 2. Táblázt. Termodinmiki prméterek, ΔH, ΔS *, Δ(ΔH ), Δ(ΔS ), Δ(ΔG ), korrelációs koefficiens (R 2 ) és T iso hőmérsékletnértékei Lux Cellulose-1 kolonnán. Mint Eluens Sztereoizomer -ΔH (kj mol -1 ) -ΔS * (J mol -1 K -1 ) Korr. koeff. (R 2 ) -Δ(ΔH ) (kj mol -1 ) -Δ(ΔS ) (J mol -1 K -1 ) -Δ(ΔG ) 298K (kj mol -1 ) T iso ( C) 1 b(1) 14,0 48,2 0,9955 (2) 17,0 56,9 0,9991 c(1) 14,1 47,2 0,9961 d(2) 15,1 48,8 0,9966 3,0 8,7 0,5 80 1,0 1,6 0,5 373 (1) 15,6 48,1 0,9911 b(2) 20,0 59,1 0,9904 4,3 11,0 1,0 121 2 c(1) * 12,6* 41,8* 0,9970 d(2) * 14,6* 48,3* 0,9997 2,0*/-2,0** 6,5*/-6,5** >0,2* (273K) 0,1** (323K) 38 b c(1)* 8,1* 20,8* 0,9908 d(2)* 11,8* 33,5* 0,9965 3,7*/-3,7** 12,7*/-12,7** >0,2* (273K) 0,4** (323K) 22 3 b(1) 11,4 42,8 0,9997 (2) 13,0 46,8 0,9995 c(1) 13,8 45,8 0,9988 d(2) 13,8 45,8 0,9988 1,6 4,0 0,4 117 - - - - 4 b(1) 10,0 25,4 0,9980 (2) 14,7 36,3 0,9987 c(1) 13,8 34,3 0,9903 d(2) 16,6 41,5 0,9964 4,7 10,8 1,5 160 2,8 7,2 0,7 114 5 b(1) 11,0 22,0 0,9947 (2) 12,5 26,1 0,9963 d(1) 12,0 24,7 0,9983 c(2) 15,1 30,8 0,9984 1,5 4,1 0,3 93 3,2 6,1 1,4 244 Kolonn, Lux Cellulose-1; mozgófázis,, heptán/2-proh/dea=90/10/0,1 (v/v/v), b, heptán/2-proh /DEA=98/2/0,1 (v/v/v); (1) és (2), elsőként és másodikként eluálódó enntiomer; ármlási sebesség, 0,5 ml/perc; detektálás 230 nm; ΔS * = ΔS +R ln Φ hol Φ fázisrány; R 2, ln k -1/T függvény korrelációs koefficiense. A vizsgált hőmérséklettrtomány: 5 C - 40 C; 2c-d esetén: -5 C - 80 C; * T iso hőmérséklet ltt; ** T iso hőmérséklet felett. Az 4.A. ábrán és 4. Tábláztbn bemuttott dtok lpján z említett enntiomerek vizsgált hőmérséklet trtománybn kis felbontássl, rövid időkülönbséggel eluálódtk, így retenciós idők szórásából dódón z elúciós sorrend egyértelmű meghtározás is kétséges. Heptán/2- PrOH/DEA=98/2/0,1 (v/v/v) eluens összetételnél különböző hőmérsékleteken megismételve 2c-2d enntiomerpár elválsztását mind kis, mind ngy hőmérsékleten szelektivitás (és felbontás) jelentősen jvult és hőmérséklet indukált láthttln régió jelentősen szűkült (4.B. ábr). A rcém mintához 2c enntiomert keverve csúcsterületek rányából egyértelműen bizonyíthtó volt z elúciós sorrend változás T iso hőmérséklet környezetében. A heptán/2-proh/dea=98/2/0,1 (v/v/v) eluens összetételnél kivitelezett mérésekkel újbb példán bizonyítottuk, hogy lehetséges z enntiomerek lpvonlr történő elválsztás mind z entlpi-, mind z entrópivezérelt hőmérséklet trtománybn. Ezen mérésekhez trtozó kromtogrmokt 5. ábrán muttjuk be. Összegezve z eredményeket kijelenthető, hogy z intermolekuláris kölcsönhtások kilkulás z állófázis és mintvegyületek között energi felszbdulásávl jár, ezek kölcsönhtások áltlábn exotermek, és megfelelő entrópiváltozások bizonyos eseteket kivéve - negtívk. Köszönetnyilvánítás A. A. köszönetét fejezi ki Fülöp Ferenc kdémikusnk és Sztmári Istvánnk (SZTE, Gyógyszerkémii Intézet) minták rendelkezésünkre bocsátásáért, vlmint GenLb kft-nek (Phenomenex, Torrnce, USA) Lux királis kolonnákért. A munk TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV- 2012-0052 támogtásávl készült. 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények 65 Hivtkozások 1. Hollósi, M. Lczkó, I. Mjer, Zs. A sztereokémi és kiroptiki spektroszkópi lpji, Nemzeti Tnkönyvkidó Rt: Budpest, 2004. 2. Fekete, J. Folydékkromtográfi, Jáv-98 Kft: Budpest, 2003. 3. Piette, V., Lmmerhofer, M., Lindner, W., Crommen, J. J. Chromtogr. A 2003, 987, 421-427. 4. Fornstedt,T., Sjonz, P., Guichon, G. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1254-1264. 5. Fornstedt, T., Sjonz, P., Guichon, G. Chirlity 1998, 10, 375-381. 6. Koppenhoefer, B., Byer, E., Chromtogrphi 1984, 19, 123-130. 7. Wtbe, K., Chrles, R., Gil-Av, E. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1989, 28, 192-194. 8. Schurig, V., Betschinger, F. Chem. Rev. 1992, 92, 873-888. 9. Fulde, K., Frhm, A.W. J. Chromtogr. A 1999, 858, 33-43. 10. Yo, B.; Zhn, F.; Yu, G.; Chen, Z.; Fn, W.; Zeng, X.; Zeng, Q.; Weng, W. J. Chromtogr. A 2009, 1216, 5429-5435. Aminonphthol enntioseprtion by high performnce liquid chromtogrphy: The effect of temperture on chirl seprtion 1. Introduction The seprtion of enntiomers of chirl compounds by chromtogrphy methods nd relted techniques is one of the most importnt tsks in modern nlyticl chemistry, especilly in the nlysis of compounds of biologicl nd phrmceuticl interest. 4. Ábr. A 2 minonftol nlóg c-d enntiomerjeinek lnk értékei 1/T függvényében; Kolonn, Lux Cellulose-1; eluens, A, heptán/2-proh/ DEA=90/10/0,1 (v/v/v), B, heptán/2-proh/dea=98/2/0,1 (v/v/v); ármlási sebesség, 0,5 ml/perc; detektálás 230 nm. On moleculr level of living orgnisms, chirlity is n importnt property of the building blocks of life, such s mino cids nd sugrs, nd therefore peptides, nd proteins. In biologicl systems, these biomolecules exist in only one of the possible enntiomeric forms nd disply different responses to one of pir of enntiomers of drugs, grochemicls, food dditives, frgrnces, etc. Accordingly chirlity is lso mjor concern in the phrmceuticl industry. When the enntiomers of drug re dministered into chirl selective living system, these enntiomers often exhibit 5. Ábr. A hőmérséklet htásár bekövetkező elúciós csere; Kolonn: Lux Cellulose-1, eluens, heptán/2-proh/dea=98/2/0,1 (v/v/v); ármlási sebesség, 0,5 ml/perc; detektálás, 230 nm; hőmérséklet, 0-50ºC. 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.
66 Mgyr Kémii Folyóirt - Közlemények differences in distribution, metbolic nd excretion behvior, nd ction. The differences in biologicl properties of enntiomers rise from the differences in protein trnsport nd binding, the kinetics of their metbolism nd their stbility in the environment. As result, the phrmceuticl industry hs rised its emphsis on the genertion of enntiomericlly pure compounds in the serch for sfer nd more effective drugs. The US Food nd Drug Administrtion (FDA) hs required evlution of ech enntiomer in the development of stereoisomeric drugs. There re severl possibilities for the preprtion of pure enntiomers, e.g. using enntioselective synthetic routes or the seprtion of enntiomers fter the preprtion of rcemic mixtures. The chromtogrphic processes ply n importnt prt not only in the production of the enntiomers, but lso in the qulity control of the chirl products. The present pper describes norml-phse HPLC methods for the enntioseprtion of new rcemic 1-(phenylethylmino)methyl- 2-nphthol or 1-(nphthylethylmino)methyl-2-nphthol nlogs possessing two chirl centers (Fig. 4). These HPLC methods rely on the use of recently commercilized polyscchride-bsed chirl CSP: tris-(3,5-dimethylphenyl)-crbmoylted cellulose (Lux Cellulose-1). In chromtogrphic enntioseprtions, the vnt Hoff plot shows the reltionship between the chromtogrphic dt nd the column temperture. This reltionship is useful in order to study the retention mechnism. The vnt Hoff plots often devite from linerity, possibly s result of the inhomogeneity of the CSP surfce, leding to mixed retention mechnism. Additionlly, there re both chirl nd chirl contributions to retention tht cn vry with wide vriety of experimentl prmeters. If Δ(ΔH) nd Δ(ΔS) vlues re both negtive, the enntioseprtion is enthlpiclly driven, s in the common cse. The second-eluted enntiomer forms more stble complex with the selector thn does the first-eluted enntiomer, with more unfvorble entropy for enntioseprtion. The seprtion fctor decreses with incresing temperture. When the column temperture reches point referred to s the enntioselective temperture (T iso ), the enthlpy contribution is wholly compensted by the entropy term. At this point α = 1.0, nd the two enntiomers coelute. T iso cn be clculted from ln k vs 1/T curves. Above T iso, the enntioseprtion is entropiclly driven, nd reversl of the elution sequence for pir of enntiomers is observed. The seprtion fctor increses with incresing temperture in this domin, nd the column efficiency increses concurrently. These two fetures mke entropiclly driven enntioseprtion especilly ttrctive. 2. Results In order to investigte the effects of temperture on the chromtogrphic prmeters, vrible-temperture study ws crried out Lux Cellulose-1 column, usully over the temperture rnge 5-40 C (Tble 1). A comprison of the retention fctors in Tble 1 revels tht ll of the recorded vlues decresed with incresing temperture (similr tendencies were mesured t other mobile phse compositions). In most cses n increse of the seprtion temperture lowered the seprtion fctor, α, nd the resolution,, while for 1,1b nd t high temperture increse, in α nd were observed. The second-eluting enntiomers hve more negtive ΔS * vlues, nd it is likely tht they hve fewer degrees of freedom on the CSP, i.e. they re held t more points or re less ble to move or rotte. It is widely ccepted tht both enntiomers undergo the sme nonspecific interctions, wheres the more strongly retined one is subject to dditionl stereospecific interctions. The differences in the chnges in enthlpy nd entropy, Δ(ΔH ) nd Δ(ΔS ), re presented in Tble 2. The interctions of 4,4b on the Lux Cellulose-1 were chrcterized by the highest negtive Δ(ΔH ) vlue, while 1c,1d exhibited the lest negtive Δ(ΔH ). The dt were used to clculte the temperture, T iso, t which the enntioselectivity blnced out nd the elution sequence chnged (Tble 2). In most cses, T iso ws considerbly higher thn room temperture; enthlpiclly driven enntioseprtion ws obtined. For, T iso ws 38 C (Fig. 4). From -5 C, α decresed with incresing temperture; then fter domin where no seprtion occurred, α incresed with incresing temperture (Tble 2). In domin round the isoenntioselective temperture, enntioseprtion could not be obtined. This domin my be referred to s temperture-induced blind zone in chirl recognition 10. A temperture-induced blind zone ws similrly observed for 1,1b in the temperture rnge 60-90 C (Tble 2). The essence of this phenomenon is enthlpy-entropy compenstion. Outside the blind zone, enthlpiclly- or entropiclly-driven enntioseprtion cn be observed. Frther wy from the blind zone, better moleculr recognition should be obtined nd the elution sequence lso chnges, s cn be seen in the cse of with chnge of the column temperture (Fig. 5). The elution sequence ws determined in ll cses, but no generl rule could be found. 120. évfolym, 2-3. szám, 2014.