Doktori értekezés tézisei Az asztma (és atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) genomikai vizsgálatai; különös tekintettel a hisztamin immunmodulációjára Kozma Tibor Gergely Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu, 19. sz. program Programvezeto: Prof. Falus András Témavezeto: Dr. Szalai Csaba Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Budapest, 2004.
1 Bevezetés Az allergiás megbetegedések gyakorisága az utóbbi évtizedekben jelentosen emelkedett, különösen a fejlett országokban. Az asztma a légutak krónikus gyulladásos betegsége, amely reverzibilis légúti obstrukcióval, és légúti túlérzékenységgel (AHR) jár. Az antigén a légutakban igen sokféle gyulladásos sejt közremuködésével, eozinofil granulociták, B sejtek, hízósejtek, aktivált T (CD4+) sejtek révén fejti ki hatását. Bár a pontos mechanizmus még mindig ismeretlen, a sejtek közötti komplex kölcsönhatások vezetnek az asztma pathogenezisében fontos citokinek és egyéb gyulladásos mediátorok termeléséhez. Az AEDS (atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) klinikai képe ugyan eltér az asztmáétól, hiszen a diagnózisul is szolgáló legfobb tünete a bor ekcémás lézió ja, pathomechanizmusa mégis több lényeges ponton hasonlít az asztmához: magas az allergén specifikus IgE szint, és emelkedett a gyulladás helyére bevándorolt eozinofil granulociták száma. Mindkét betegség kialakulásának fo irányítójaként egyre inkább a T sejteket teszik felelossé. Kialakulásukért elsosorban a Th2 sejtek felelosek, de a késobbi, krónikussá váló stádiumban az infiltrálódó Th1 sejtek okozzák a tünetek súlyosbodását. Az allergia multifaktoriális betegség, kialakulásában mind genetikai, mind környezeti tényezok szerepet játszanak. Genetikai tényezok lehetnek az immunválaszt és az IgE termelést (azaz atópiát) és/vagy hatást szabályozó gének polimorfizmusai, míg a környezeti tényezok a különféle allergénekkel való találkozás. 2
A hisztamin az allergiás válasz egyik fo effektor molekulája. Részt vesz a légúti simaizomzat kontrahálásában, a microvaskuláris permeabilitás növelésében. Az asztmásoknak magasabb a szérum hisztamin koncentrációja, mint a nem asztmás egyéneknek. Az allergén-provokálás utáni emelkedett plazma hisztamin szint, pedig együtt jár a bronhiális obstrukcióval. In vitro kísérletek szerint számos alapveto, az immunrendszer muködésének egészére ható szerepe van a hisztaminnak: pl. hatással van a dendritikus sejtek és makrofágok érésére. Azonban még mindig nem ismert, hogy in vivo hogyan befolyásolja az asztma kialakulását. Az in vitro rendszerekben kapott eredmények a kísérleti körülmények, és az alkalmazott sejtek függvényében meglehetosen ellentmondásosak. Pedig az asztma késoi fázisában megnyilvánuló hatásai valószínuleg inkább az immunrendszert szabályozó, mintsem az effektor funkciók révén jutnak érvényre. A hisztamin receptorok átfedo, de sokszor ellentétes szerepe miatt, a receptorok blokkolásával nem lehet teljesen megszüntetni a hisztamin összes hatás át. Erre utal, hogy az antihisztaminok sem elég hatásosak az asztma kezelésében. Korábbi kísérletek, amelyeket hízósejt hiányos egereken végeztek, egyenesen azt sugallják, hogy a késoi asztmás fázisban a hisztaminnak nincs is komoly szerepe: a hisztamin legfobb forrásainak számító hízósejtek nélkül is kifejlodött a légúti gyulladás és késoi AHR. Célkituzések Az allergiás megbetegedések közül az asztma és az AEDS vizsgálatát tuztük ki célul. Azt a kutattuk magyar gyermekek körében, hogy a TNF-?, a RANTES, vagy az MCP-1 promoterében már felfedezett polimorfizmusok, amelyek ezeknek a molekuláknak a szintjét befolyásolják a szervezetben, kapcsolatba hozhatók-e az allergiával, vagy az asztmával, illetve a betegek 3
valamely vizsgált klinikai/biológiai jellemzojével. A RANTES és MCP-1 ugyanazon polimorfizmusait az AEDS-ben szenvedokben is megvizsgáltuk. Hasonló jellegu kutatásokat végeztünk továbbá az Fc?RI (nagy affinitású IgE receptor), valamint a CCR5 kódoló szakaszában leírt polimorfizmusok kapcsán is. Az elobbi egy aminosav cserét idéz elo a molekula? láncában, az utóbbi egy 32 bázispárnyi delécióval jár. A PhD munkám második felében azokról a kísérletekrol írok, amelyekben a hisztamin késoi asztmás fázis ban betöltött hatásait vizsgáltuk in vivo körülmények között. Kutatásainkat olyan egereken (HDC KO egerek) végeztük, melyek képtelenek muködoképes hisztidin -dekarboxiláz (HDC) expresszióra, ezért hiányzik belolük az endogén hisztamin. Célunk annak kiderítése volt, hogy szerepet játszik-e a hisztamin a késoi asztmás válasz kialakulásában és, ha igen, akkor milyen molekuláris mechanizmusok állhatnak a folyamat hátterében. Ehhez a HDC KO egereknek az allergizálás utáni (asztmára jellemzo) fenotípusát, és az asztmában valószínuleg szerepet játszó citokin és kemokin expressziós profilját hasonlítottuk össze az allergizált vad típusú állatokéval, illetve a placeboval kezelt csoportokkal. 2 Kísérleti módszerek 2.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatainak módszerei A vizsgálatba bevont személyek: Vizsgálatainkat Budapesten élo nem allergiás; allergiás, de a vizsgált allergiás betegség tüneteit nem mutató; valamint az adott allergiás betegségben szenvedo, 18 éven aluli egyéneken végeztük. Némely vizsgálathoz szükséges volt az asztmások súlyossági 4
kategóriába sorolására, melyhez a GINA (Global Initiative on Asthma) ajánlását vettük alapul. Laboratóriumi paraméterek (vér össz fehérvérsejt- és eozinofil granulocitaszám, szérum össz- és allergén specifikus-ige szint) meghatározása DNS izolálás Polimorfizmusok azonosítása PCR-RFLP -vel (kivétel CCR5? 32 kimutatás) 2.2 Az asztma állatkísérletes modellezésénél alkalmazott módszerek A kísérleti állatok: A kísérleteket 6-8 hetes nostény, BALB/c hisztidin dekarboxiláz "génkiütött" (HDC KO) és vad genotípusú (WT) egereken végeztük. Kísérleti protokoll: Az allergizálásra szánt állatokat a kísérlet megkezdésekor (0. nap), és a 14. napon szisztémásan, i.p. szenzitizáltuk ovalbumin (OVA) és alumínium hidroxid adjuváns szuszpenzió keverékével, majd a 28., 29., 30. napon 20 percig 1%-os OVA aeroszolt inhaláltattunk velük. A 31. nap megmértük az AHR-t. A 32. napon, 5 órával egy 20 perces, 5% -os OVA aeroszol provokáció után, az egereket elaltattuk, és szerveiket különféle vizsgálatokra tettük el. A kontroll csoportok a szisztémás, és a lokális szenzitizálások során csupán az allergén, ill. az adjuváns oldására is szolgáló puffert kapták. 29 0 14 28 30 32 i.p. OVA+ i.p. OVA+ OVA inhaláció Al(OH) 3 Al(OH) 3 1 % 5 % 5
Légúti túlérzékenység mérése: Az AHR-rel arányos relatív Penh-et (enhanced pause) nem altatott állatok egész testpletizmográfiás vizsgálatával mértük. Tüdo-szövettani vizsgálat Tüdomosó folyadék (BAL) citológiai vizsgálata: A BAL-ból meghatároztuk az össz leukocita számot, a morfológiai jegyek alapján elkülönítheto sejtek elofordulásának arányát, valamint a T és B limfociták, ill. NK sejtek arányát. Szérum össz- és allergén specifikus-ige mennyiségének mérése Citokinek és kemokinek génexpressziójának meghatározása tüdoszövetbol: A tüdobol RNS-t izoláltunk. Az azonos csoportokba tartozó állatok mintáit (azonos mennyiségu RNS alapján) egyesítettük; majd Super Array-vel (macro array) megmértük a különféle citokinek és kemokinek relatív RNS mennyiségét. Az INF-? és IL-4 fehérje mennyiségének meghatározása tüdoszövetbol: A szöveteket homogenizáltunk, majd a felülúszóból gyárilag optimalizált szendvics ELISA-val meghatároztuk az INF-? és IL-4 mennyiségét, amit mintáink összfehérje tartalmához viszonyítottunk. 6
3 Eredmények 3.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatai Kísérleteinkben nem tudtunk kapcsoltságot kimutatni a RANTES ( 28G és 403A), vagy a TNF-? ( 308A) promoterének egyik vizsgált polimorfizmusa és az asztma vagy allergia kockázata között a Budapesten élo asztmás gyermekek körében. Nem találtunk továbbá összefüggést a polimorfizmusok és a betegek vizsgált klinikai vagy biológiai jellemzoi között sem. A CCR5 kódoló szakaszában leírt deléció (? 32), valamint a Fc?RI? láncának polimorfizmusa (+541C) nem függött össze az asztmával vagy allergia kozkázatával. A CCR5-tel kapcsolatos megfigyeléseink összhangban állnak Mitchell és mtsai. eredményeivel, viszont ellentmondanak Hall és mtsai.-nak. Az MCP-1 promoterében vizsgált A 2518G polimorfizmus kapcsolatba hozható az asztmával. A 2518G allél frekvenciája nagyobb az asztmásokban mind a kontroll (p<0,001, OR=2,0 [95% CI: 1,4-2,6]), mind pedig nem-asztmás allergiás (p<0,001, OR=2,0 [95% CI: 1,4-2,9]) egyénekhez képest. Az öröklodésmenet típusának feltárásához megvizsgáltuk, hogy a homozigóta mutáns, illetve a heterozigóta allélkombinációk milyen gyakorisággal fordulnak elo az asztmás, és a kontroll populációban. Mindkét genotípus elofordulási gyakorisága esetén szignifikáns különbséget találtunk a két csoport között. A heterozigóta genotípusnál az OR: 2,4 (1,6-7
3,6) (p<0,001) (a gyakoriság 46,3 % az asztmás, 29,7 % a kontroll csoportban), homozigóta mutáns genotípusnál az OR: 2,7 (1,4-5,5) (p<0,001) (a gyakoriság 11,3 % az asztmás, 6,3 % a kontroll csoportban). Az OR értékek hasonlósága azt jelzi, hogy egyik genotípus sem fokozza jobban a betegség kialakulásának kockázatát. Ez arra utal, hogy az autoszómán található MCP-1 2518-as polimorfizmus domináns módon befolyásolhatja az asztma kialakulását. Eredményeink arra is utalnak, hogy az MCP-1 2518G polimorfizmus az atópia esélyét nem növeli. A G allél frekvenciája hasonlóan alacsony volt a nem-asztmás allergiás és a kontroll csoportokban, ill. a nem-atópiás asztmások körében hasonlóan magas, mint az atópiás asztmásokban. Az MCP-1 2518G polimorfizmus vizsgálata során megállapítottuk, hogy ez a polimorfiuzmus kapcsolatba hozható a vér eozinofil granulocita százalékos összetételével, valamint ez eozinofil sejtszámmal. Az eozinofilek mennyisége a G/G homozigótákban volt a legmagasabb, az A/A homozigótákban pedig a legalacsonyabb. Az A/G heterozgóta allélokat hordozó betegekben az eozinofil sejtszám két homozigóta csoport közötti volt. Ha az asztmásokat betegségük súlyossága szerint alcsoportokra osztottuk, az egyes csoportok között a G allél elofordulási gyakorisága a betegség súlyosbodásával párhuzamosan emelkedett. Az MCP-1 2518G allél és az asztma súlyossága közötti kapcsolat további megerosítése érdekében azt is megvizs gáltuk, hogy a különbözo genotípusú asztmások milyen súlyossági kategóriákba sorolhatók. A homozigóta G/G genotípussal rendelkezok között többen (p=0,003) szenvedtek mérsékelt perzisztáló (55,6 %), mint intermittáló (5,6 %) súlyosságú asztmában. A homozigóta A/A allélt hordozók között fordított volt a helyzet. Ezen eredmények arra 8
utalnak, hogy az MCP-1 2518G allél befolyásolja mind a vér eozinofil mennyiségét, mind az asztma súlyosságát. Feltételezheto azonban, hogy az eozinofil sejtszám növekedése nem kizárólagosan a mutációnak, hanem a betegség súlyosbodását eloidézo egyéb tényezoknek is köszönheto. Erre utal, hogy az egyes betegségkategóriák közötti átlag eozinofil sejtszám a genotípustól függetlenül is változott. Meg kell említenünk továbbá, hogy G allélt hordozó nem-asztmás allergiás betegekben is emelkedett számú eozinofil granulocita volt kimutatható. Nickel és mtsai. eredményei szerint a RANTES 403A allél nagyobb gyakorisággal fordul elo az AEDS-es, mint az egészséges emberek körében. Az MCP-1 2518G allél hordozása pedig elobb ismertetett eredményeink szerint összefügghet az asztmával. Mivel az asztma pathomechanizmusa sok ponton átfed az AEDS-ével, megvizsgáltuk, hogy ezek a polimorfizmusok kapcsolatba hozhatók-e vele. Kísérleteink szerint egyik allél sem fordul elo eltéro gyakorisággal az AEDS-ben szenvedokben, mint a kontrollokban, vagy a nem-aeds-es allergiások körében. 9
3.2 Az asztma állatkísérletes modellezése Az egyhónapos szenzitizálás után 1 nappal a belélegeztetett egyre nagyobb koncentrációjú metakolin (MCh) egyre jelentosebb nagyságú az AHR-rel szorosan összefüggo relatív Penh értéket idézett elo az allergénnel kezelt állatokban, míg a placeboval kezelt WT és KO csoportok Penh értékei MCh hatására csak enyhe növekedést mutattak. A szenzitizált WT állatok csoportja jóval érzékenyebben reagált a szenzitizált KO egereknél: a 25 mg/ml koncentrációjú MCh belélegeztetésénél a különbség közöttük statisztikailag szignifikáns (p<0,001) volt. Bár a szenzitizált KO állatok relatív Penh értékei a szenzitizált WT és a placeboval kezelt csoportok Penh-jei közé estek, válaszgörbéjük a kontroll egerek görbéitol statisztikailag nem különül el. A különféle csoportokba tartozó egerek tüdometszeteinek szövettani képei megerosítik a légzésfunkciós eredményeket. A placeboval kezelt csoportokban nem lehetett kimutatni kóros elváltozásra utaló jeleket. Azonban a szenzitizálás és provokáció utáni WT állatok tüdejében sok helyen peribronhiálisan és különösen jelentos mértékben perivaszkulárisan nagyszámú eozinofil granulocita, limfocita és hízósejtbol álló beszurodés volt megfigyelheto. Ezek a tüdo allergiás gyulladására utalnak. A kezelt KO állatok tüdoszövettani képei leginkább a kontroll állatokéhoz hasonlítottak, bár a csoport néhány tagjánál ritkán, és viszonylag kis kiterjedésben megfigyelhetok voltak az asztmára jellemezo szövettani jegyek is. A szövettani mintákkal összhangban, a szenzitizálás és provokáció utáni HDC KO egerek tüdejében kevesebb (p<0,001) eozinofil granulocita volt egy mikroszkópos látótérben, mint WT társaikéban. 10
A BAL-ból preparált sejtek fénymikroszkópos képei alapján megállapíthatjuk, hogy a legnépesebb sejtpopulációt a makrofágok alkották az összes állatcsoportban. Az allergizálás azonban jelentosen emelte a gyulladásos sejtek számát. Míg a WT állatoknál a kezelés mind a háromféle morfológiai jegyek alapján elkülönített sejttípus számbeli növekedésére szignifikáns hatást fejtett ki (az eozinofil granulocitáknál: p<0,001, a neutrofil granulocitáknál és a limfocitáknál: p<0,05), a KO állatokban egyik sejtféleség száma sem emelkedett szignifikánsan. A kezelés utáni állatcsoportokat összehasonlítva: a WT állatok BAL-jában több gyulladásos sejt volt jelen, mint KO társaikban. A különbség a granulociták esetén volt statisztikailag kimutatható (p<0,05), de a limfocitáknál is jelentosnek mutatkozott. Mivel az asztma kialakulásának fo irányítójának a limfocitákat tartják, megvizsgáltuk a különféle limfocita szubpopulációkat. A legnagyobb arányban a CD3+ T sejtek voltak jelen, de mellettük b220+ B sejtek is kimutathatók voltak. Bár mérési eredményeink nem bizonyító erejuek, mivel az egyik markerrel jelölt sejtek elofordulási gyakorisága között sincs szignifikáns különbség az állatcsoportok között, feltételezhetoen a CD3+ T sejtek a felelosek a limfocita szám eltérésekért. Az allergiás immunválaszban a szervezet IgE izotípusú ellenanyagot termel az allergén ellen, amely megfigyelheto volt kísérleti rendszerünkben is: az allergizálás az allergén specifikus IgE mennyiségét a kimutathatósági határ alatti tartományról (placeboval kezelt csoportok) a jól mérheto értékekre növelte. Azonban nemcsak a kezelés, hanem a genotípus is markánsan befolyásolta az említett ellenanyag szintjét: a WT állatok széruma szignifikánsan több OVA specifikus IgE-t tartalmazott, mint a HDC KO-ké (p<0,001). 11
Azt, hogy a HDC KO egerekben miért gyengébbek a késoi asztmás tünetek, mint WT társaikban, a tüdo génexpressziós vizsgálataival elemeztük. A vizsgált 23-23-féle citokin és kemokin közül 15-féle citokin és 14-féle kemokin expresszóját tudtuk értelmezni. A mérési eredményekbol levont fontosabb következtetéseket a következo rész tartalmazza. A különbözo csoportba tartozó állatok tüdejébol az INF-? és az IL-4 RNS expressziója nem volt megbízhatóan mérheto. Mivel ezek az immunpolarizációs viszonyok kialakításában dönto fontosságúak, fehérjeszintu vizsgálatukat is elvégeztük. Megállapíthatjuk, hogy a kezeletlen állatok tüdejében közel egyforma mennyiségu az INF-?. Az allergizálás hatására az INF-? szintje megemelkedett a WT állatokban (p=0,02), a KO-kban viszont továbbra is alapszinten maradt. Az IL-4 mind a kontroll (p=0,02), mind a kezelt (p=0,04) egércsoport esetén kisebb koncentrációban volt jelen a KO állatok tüdejében, mint a WT egerekben. Az allergizálás hatására mindkét csoportban emelkedett (WT: p=0,004, KO p<0,001) mennyisége. 12
4 Fontosabb új megállapítások 4.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatai során nyert új megállapítások 1 Nem találtunk kapcsolatot az allergia, ill. asztma; valamint a RANTES C 28G, G 403A; a CCR5? 32, a TNF-? G 308A, vagy az Fc?RI T+541C polimorfizmusok között. Továbbá nem tudtunk kimutatni kapcsolatot a polimorfizmusok és a betegek vizsgált klinikai, vagy biológiai jellemzoi között sem. 2 Az MCP-1 2518G allél gyakoribb a vizsgált asztmás gyermekek körében, mint a kontroll csoportban, ezért valószínuleg összefügghet vele. Az említett autoszómán található allél domináns öröklodésmenetet mutat. 3 Az MCP-1 G allél hordozás összefügg a vér eozinofil granulocita mennyiséggel és az asztma súlyosságával egyaránt. 4 A RANTES 28G, vagy 403 A allélekhez hasonlóan az MCP-1 2518G sem gyakoribb az AEDS-ben (ill. allergiában) szenvedokben. 13
4.2 Az asztma állatkísérletes modellezése során nyert új megállapítások 1 A hisztamin hiánya önmagában nem akadályozza meg, de jelentosen csökkenti az asztma késoi fázisában a légúti túlérzékenységet és az allergiás gyulladást állatkísérletes rendszerben. 2 Az allergizálás hatására az egerek tüdomosó folyadékában gyulladásos sejtek jelentek meg. A HDC KO állatok tüdomosó folyadékában szignifikánsan kevesebb volt a granulocita, mint WT társaikéba. A limfociták számában is megfigyelheto csökkenésért a CD3+ T sejtek lehetnek felelosek a KO állatokban. 3 A HDC KO egerek allergén specifikus IgE termelo képessége gyenge. Ez hozzájárulhat a hízósejt függo folyamatok gyengítéséhez. 4 A KO állatok citokin és kemokin expressziós profilja, valamint INF-? és IL-4 fehérje szintje jelentosen eltér a WT állatokétól, mely alátámasztja, hogy valóban az immunrendszer komplex megváltozása lehet a KO állatok csökkent allergiás válaszának alapja. Ennek fobb okai a következok lehetnek:? A hisztamin hiánya kedvez a Th1 irányú immunpolarizációnak, és ezáltal védhet az asztma kialakulásával szemben. 14
? A legmarkánsabb génexpressziós különbségeket az asztma korai fázisában bekapcsolódó proinflammatorikus citokinekben lehetett kimutatni a kétféle genotípusú egércsoport között: a TNF-? -ban, az IL-1-ben (? és? ) és az IL-6-ban. A proinflammatorikus citokinek alacsonyabb expressziója a HDC KO egerekben az asztma kialakulásának további fázis ait is nagyban befolyásolhatja a citokinek eros kölcsönhatásai miatt.? Az immunsejtek érésére és kemotaxisára ható mediátorok közül többnek az expressziója is megváltozott a hisztamin hiányának következtében. A legjellegzetesebbek közülük az eozinofil granulocitákra ható IL-5 és eotaxin, amelyek a KO állatok csökkent allergiás gyulladásának direkt magyarázatául szolgálnak.? A HDC KO állatokban az asztma eltéro pathomechanizmussal alakulhat ki, mint az azonos törzshöz tartozó WT egerekben. 15
5 Megjelent publikációk 5.1 Az értekezés körében megjelent publikációk 1 Kozma G T, Losonczy G, Keszei M, Komlósi Z, Buzás E, Pállinger É, Appel J, Szabó T, Magyar P, Falus A, Szalai C. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyperresponsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol. 2003; 15(8):963-73. IF: 3.595 2 Falus A, Kozma G T, Wiener Z, Hegyesi H, Pós Z, Szalai C, Buzás E. A hisztamin, mint a th2 irányú immunreguláció része; Posztgenomikus kilátások a metabolomika irányában. Magyar Tudomány (Immunológia) 2003/04 3 Nagy A, Kozma G T, Bojszkó Á, Krikovszky D, Falus A, Szalai C. No association between asthma or allergy and the CCR5Delta 32 mutation. Arch Dis Child. 2002; 86(6): 426. IF: 2.095 4 Kozma G T, Falus A, Bojszko Á, Krikovszky D, Szabó T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic eczema/dermatitis syndrome and polymorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy. 2002; 57(2): 160-63. IF: 3.666 5 Szalai C, Kozma G T, Nagy A, Bojszkó A, Falus A. Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok. Orv Hetil. 2002; 143(8): 381-90. Markusovszky díj 2003. 6 Szalai C, Kozma G T, Nagy A, Bojszkó A, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108(3): 375-81. IF: 6.28 Az értekezés körében megjelent publikációk összes IF-a: 15,638 5.2 Nem az értekezés körében megjelent publikációk 7 Nagy A, Kozma G T, Keszei M, Treszl A, Falus A, Szalai C. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. J Allergy Clin Immunol. 2003 Oct; 112(4): 729-34. IF: 6.282 A publikációk összes IF: 21,144 16
6 Köszönetnyilvánítás Mindenek elott hálás szívvel köszönök mindent, amit nem tudok megköszönni: Teremtomnek, Feleségemnek és Szüleimnek. Köszönöm Prof. Falus András programvezetomnek és Dr. Szalai Csaba témavezetomnek a megelolegezett bizalmat, amellyel munkám kezdete óta megajándékoztak; a kutatási területet, amelyben dolgozhattam; munkám szakszeru elméleti és gyakorlati irányítását; és mindazt a felbecsülhetetlen szakmai és emberi segítséget, amely végigkísérte együttes munkánkat. Köszönöm a S. E. Genetikai-, Sejt és Immunbiológiai Intézetének dolgozóinak és PhD hallgatóinak, hogy önzetlenül segítettek. Hálás vagyok Dr. Buzás Editnek, Dr. Pállinger Évának és Keszei Mártonnak, akik odaadóan segítették kutatómunkámat. Köszönöm a Heim Pál Gyermekkórház Központi Laboratóriumának dolgozóinak, Dr. Szabó Teréznek, hogy befogadtak, és igazi munkatársukként kezeltek. Köszönöm Prof. Losonczy Györgynek, hogy lehetové tette számomra az S. E. Pulmonológiáján az állatkísérleteket, és felbecsülhetetlen elméleti és gyakorlati segítséggel támogatta munkám. Külön köszönöm, hogy lehetové tette számomra a 2002-es ERS-en való részvételt. Köszönöm az S. E. Pulmonológiai Intézetében dolgozók segítségét, Dr. Appel Juditnak és Bornemissza Berilnek a szövettani vizsgálatait. Köszönöm Dr. Vásárhelyi Barnának és Prof. Tulassay Tivadarnak, hogy támogatták és segítették dolgozatom elkészítését. 17