1 Ritka betegségek diagnosztikája 2009. október 1. Bókay délután Dr. Jávorszky Eszter SE I. Gyermekklinika, Budapest
2 Ritka betegségek diagnosztikája: Lehetőségek Metabolit szintő vizsgálat Enzim aktivitás mérés kis molekulák mőszeres analitikai meghatározása sok metabolit egy mérésbıl nem ad végsı diagnózist Genetika Klinikum, tünetek egy betegségnél is akár több mint 1000 mutáció legnehezebben kivitelezhetı végsı diagnózist ad rendkívül változatos, egy betegségen belül is! legkisebb a jelentısége a diagnózis felállításában nem ad végsı diagnózist
3 Metabolit szintű vizsgálat Tünetek megjelenése elıtt újszülöttkori tömegszőrés limitált a vizsgált betegségek száma Tünetek megjelenése után cél: betegségcsoport megtalálása metabolit vizsgálatok sorozata
4 Minták Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: idısebb>48 h Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Település: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: Utca/út és házszám: SORSZÁM fiatalabb<48 h Beküldı intézet kódja: Beküldı orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: g Táplálás: anyatej <32gest. hét tápszer transzfúzió Elérhetıség (telefonszám): SORSZÁM parenteralis VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szőrés: Transzfúzió idıpontja: Irányítószám: postai úton: távolság nem akadály! csökkent mintatérfogat (újszülöttek!) fertızés kockázata minimális (HIV!!) mintakezelés egyszerő, high-throuput egyszerő tárolás szőrıpapíros vérminta dried blood sample:dbs Lyukasztás géppel tömegszőrés: átlagosan 2-300 minta/nap minden vérmintából 4 lyuk 4 különbözı plate-be
5 Újszülöttkori tömegszűrés: 3 betegség fotometriás (Elisa reader) szőrése: hipotireózis biotinidáz defektus galaktozémia 2007 október 1.-tıl tandem szőrés 23 veleszületett anyagcsere betegség beszárított szőrıpapíros vérmintából Összesen 26 anyagcsere betegség Nyugat-magyaroszági régió: 57 ezer újszülött
6 Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok egy mérés rengeteg információ Aminosav profil Gly, Ala, Val, Pip, Leu/Ile, Orn, Gln/Lys, Met, Phe, Arg, Glu, Asp, Cit, Tyr Szemi-kvantitativ (Phe, Tyr, Leu kivételével) Szőrés és follow-up (pl.pku betegek) Acil-karnitin profil C0, C2, C3, C4, C5, C5:1, C5-OH, C6, C8, C3DC, C4DC, C5DC, C10, C10:1, C10:2, C12, C14, C14:1, C14:2, C14-OH, C16:1, C16, C18, C18:1, C18:2, C18- OH, C20:2, C20:3 Szemi kvantitativ! Szőrés és follow-up
7 Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok aminosav profil aminosav anyagcserezavarok +NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 8.4e4 cps. +NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 8.4e4 cps. 8.4e4 172.3 8.4e4 172.3 8.0e4 8.0e4 7.5e4 7.5e4 7.0e4 7.0e4 6.5e4 6.5e4 6.0e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.5e4 2.0e4 2.0e4 1.5e4 1.5e4 1.0e4 1.0e4 1.9e4 1.9e4 1.8e4 1.8e4 1.7e4 1.7e4 1.6e4 1.6e4 1.5e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 5000.0 4000.0 4000.0 3000.0 3000.0 2000.0 2000.0 1000.0 1000.0 fenilketonuria jávorfaszörp betegség (MSUD) tirozinémia I és II argininoszukcinát szintáz és liáz hiány homocisztinuria nonketotikus hiperglicinémia 146.3 ureaciklus zavarok 186.3 188.2 162.3 162.3 228.3 228.3 mitokondriális 191.2 191.2 defektusok 150.3 150.3 174.3 174.3 222.2 5000.0 173.2 222.2 160.0 173.2 160.0 212.3 238.3 5000.0 158.2 189.2 212.3 238.3 158.2 189.2 176.2 244.1 176.2 244.1 134.3 192.3 227.3 227.3 134.3 192.3 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 organikus m/z, amu m/z, amu acilkarnitin aciduriák profil +Prec (85.00): b-ketotioláz zsírsav oxidáció Exp 1, 0.139 0.416 min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff hiány (Turbo Spray) +Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to 0.416 min fromsample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) 260.4 2.1e4 260.4 2.1e4 glutársav rövid szénláncú acidémia (SCAD) (GA-I) Max. 2.1e4 cps. Max. 2.1e4 cps. 2.0e4 2.0e4 izovaleriánsav közép szénláncú(mcad) acidémia (IVA) hosszú szénláncú hidroxiacil(lchad) acidémia metilmalonsav (MMA) nagyon hosszú szénláncú 218.4 propionsav (VLCAD) acidémia (PA) 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA többszörös (MADD vagy 227.2 459.4 liáz GAII) hiány (HMG) 456.5 263.3 3-metil-krotonil-CoA karnitin palmitoil transzferáz karboxiláz hiány I és hiány II (CPT-I (MCC) és CPT-II) többszörös karboxiláz hiány (MCD) 274.4277.5 274.4277.5 311.5 karnitin 347.4 437.4 202.4 transzport zavara 437.4 482.3 482.3 202.4 221.3 221.3 (CT) 219.3 219.3 484.6 484.6 291.4 291.4 358.3 358.3 243.6 480.3 243.6 480.3 205.3 302.0 341.3 264.5 288.3 457.9 205.3 302.0 341.3 264.5 288.3 457.9 369.5 404.4 374.4 428.4 369.5 404.4 374.4 428.4 438.9 306.4 389.7 237.1 336.7 275.4 497.7 510.5 306.4 389.7 237.1 336.7 438.9 275.4 497.7 510.5 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 m/z, amu m/z, amu
8 Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok: eredmények értelmezése, határértékek A diagnózishoz általában több paramétert használunk fel: Pl. fenilketonuria esetében fenilalanin fenilalanin/tirozin A határértékek: saját magunk számoljuk statisztika alapján percentilis függvény (50 ezer fıs populációra számolva) CDC ajánlások 99,9% gyakoriság koncentráció
9 Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok: gyakoriság-koncentráció függvény 50 ezer fő (C8-karnitin: MCAD; C4-karnitin:SCAD) C 8 -k a rn itin 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 C8-karnitin gyakorisága (db) 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 C 4 -k a rn itin C 8 -k a rn itin 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 C4-karnitin gyakorisága (db) 0 0 0,0,0 0,1,1 0,2,2 0,3,3 0,4,4 0,5 0,6,6 0,7,7 0,8,8 0,9,9 1,0,0 k o n c e n trá c ió ió (u (u m o l/l) l/l)
10 Tandem alapú további diagnosztika beszárított vércseppből Galaktóz-1-foszfát Szűrésre is alkalmas Jelenleg 2nd tier tesztként használatos Konjugált epesavak Glicin és taurin konjugált epesavak negativ ESI-MS/MS meghatározása Szűrés hepatobiliáris megbetegedésekre Szukcinilaceton Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: idısebb>48 h Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Település: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: Utca/út és házszám: SORSZÁM fiatalabb<48 h Beküldı intézet kódja: Beküldı orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: g Táplálás: anyatej <32gest. hét tápszer transzfúzió Elérhetıség (telefonszám): SORSZÁM parenteralis VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szőrés: Transzfúzió idıpontja: Irányítószám:
11 Diagnosztikai séma Beszárított vércsepp tandem tömegspektrometri t megspektrometriás s vizsgálata Pozitivitás esetében Vizelet szerves sav vizsgálat Pozitivitás esetében Enzimaktivitás mérés Leírt mutáci ció esetében Mutáci ció analízis
12 Megerősítő vizsgálat: vizelet szerves sav Évente ~1200 mérés differenciál diagnosztika utánkövetés Abundance TIC: NagyBoglarka.D\data.ms 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 1. vizelet 2. szérum 3. liquor 300000 200000 100000 Time--> 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 A szerves savak kémiai meghatározása és biokémiai kiértékelése
13 GC-MS módszerek egy mérés rengeteg információ Szerves sav profil Több mint 200 kis molekulatömegű metabolikus komponens szemi-kvantitatív meghatározása (nem csak karbonsavak) Zsírsav profil Zsírsavak kvantitatív meghatározása Szteroid profil Koleszterin és más szteroidok kvantitatív meghatározása
14 GC-MS módszerek mitokondriális defektusok Abundance zsírsav oxidáció TIC: NagyBoglarka.D\data.ms 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 aminosav anyagcsere zavarok 900000 800000 700000 600000 500000 laktát, piruvát peroxiszomális defektusok 400000 szukcinilaceton, acil-glicinek, nagyon fumársav, koleszterin dikarbonsavak 300000 orotsav hosszú ketoglutársav származékok szénláncú ketosavak zsírsavak 200000 100000 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 ureaciklus zavarok Time--> trikarbonsav ciklus szteroid és koleszterin szintézis zavarok
15 HPLC-MS módszerek Acil-karnitin kromatográfia Szérum vagy alvadásgátolt teljes vér Pentafluoro-phenacyl származékképzés Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás ESI-MS/MS módszerrel ~ 80 acil-karnitin kvantitatív mghatározása Aminosav kromatográfia Szérum, vizelet vagy liquor Ioncsere alapú extrakció, majd alkilálás Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás pozitív ion ESI-MS/MS módszerrel 24 aminosav kvantitatív meghatározása Cisztein és homocisztein meghatározása (szabad SH tart. A.sav) Szérum, vizelet vagy liquor Minta redukciója DTT-vel vagy TCEP-pel Elválasztás cianopropil oszlopon, detektálás pozitiv ion ESI-vel Kvantitativ meghatározási módszer
16 A leggyakoribb ritka 1.: hipotireózis tömegszőrés része: gyakorisága kb.: 1:2-3000 csökkent tiroxin szint TSH szint megemelkedik TSH elúciója Veleszületett hipotireózis: késıbb is jelentkezhet!! színképzés fontos a tüneti felismerés FT4 és TSH szintek meghatározása klasszikus laboratóriumi módszerekkel
idısebb>48 h fiatalabb<48 h <32gest. hét transzfúzió 17 A leggyakoribb ritka 2.: cisztás fibrózis - Magyarországon a becsült gyakorisága 1:5000 nem része az újszülötkori tömegszőrésnek tünetek megjelenése utáni vizsgálat verejték teszt genetikai vizsgálatok: több mint 1000 mutáció! -Nyugat-Európa és USA: tömegszőrés vércseppbıl immunoreaktív tripszinogén szint meghatározása pozitivitás esetén a leggyakoribb mutációk ugyanabból a vércseppbıl Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Település: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: Utca/út és házszám: SORSZÁM Beküldı intézet kódja: Beküldı orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: g Táplálás: anyatej tápszer Elérhetıség (telefonszám): SORSZÁM parenteralis VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szőrés: Transzfúzió idıpontja: Irányítószám:
idısebb>48 h fiatalabb<48 h <32gest. hét transzfúzió 18 A leggyakoribb ritka 3.: kongenitális adrenalis hiperplazia (CAH) - Magyarországon a becsült gyakorisága 1:10-15 000 nem része az újszülötkori tömegszőrésnek tünetek megjelenése utáni vizsgálat szérum 17-hidroxi-progeszteron vizsgálat részletes mellékvese funkció vizsgálat (indokolt estben citogenetika) -Nyugat-Európa és USA: tömegszőrés vércseppbıl 17-hidroxi-progeszteron szint meghatározása pozitivitás esetén a vércsepp szteroid profil GCMS-sel Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Település: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: Utca/út és házszám: SORSZÁM Beküldı intézet kódja: Beküldı orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: g Táplálás: anyatej tápszer Elérhetıség (telefonszám): SORSZÁM parenteralis VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szőrés: Transzfúzió idıpontja: Irányítószám:
19 A leggyakoribb ritka 4.: fenilketonuria (PKU) -tömegszőrés része: Magyarországon a gyakorisága 1:10 000 fenilalanin-4-hidroxiláz fenilalanin OH tirozin metanol tandem tömegspektrométer +NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 8.4e4 cps. +NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 8.4e4 cps. 172.3 8.4e4 172.3 8.4e4 8.0e4 8.0e4 7.5e4 7.5e4 7.0e4 7.0e4 6.5e4 6.5e4 6.0e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.5e4 146.3 2.0e4 2.0e4 186.3 188.2 1.5e4 1.5e4 162.3 162.3 228.3 228.3 191.2 191.2 1.0e4 1.0e4 150.3 174.3 150.3 174.3 222.2 173.2 222.2 5000.0 173.2 160.0 212.3 238.3 5000.0 158.2 160.0 189.2 212.3 238.3 176.2 176.2 244.1 244.1 158.2 189.2 134.3 192.3 227.3 227.3 134.3 192.3 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 m/z, amu m/z, amu
A leggyakoribb ritka 5.: rövid és közép szénláncú zsírsav oxidációs zavar (SCAD és MCAD) -tömegszőrés része: Magyarországon az összesített gyakorisága 1:8000 20 rövid vagy közép szénláncú Acil-KoA dehidrogenáz metanol tandem tömegspektrométer +Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to 0.416 min fromsample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 2.1e4 cps. +Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to 0.416 min fromsample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 2.1e4 cps. 260.4 2.1e4 260.4 2.1e4 2.0e4 2.0e4 1.9e4 1.9e4 1.8e4 1.8e4 1.7e4 1.7e4 1.6e4 1.6e4 1.5e4 1.5e4 1.4e4 1.4e4 1.3e4 218.4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 6000.0 5000.0 5000.0 227.2 263.3 459.4 456.5 274.4277.5 274.4277.5 291.4 311.5 311.5 482.3 482.3 4000.0 4000.0 347.4 437.4 437.4 202.4 202.4 3000.0 3000.0 221.3 221.3 484.6 484.6 291.4 358.3 2000.0 358.3 219.3 2000.0 219.3 243.6 480.3 243.6 480.3 205.3 302.0 341.3 264.5 288.3 457.9 205.3 302.0 341.3 264.5 288.3 457.9 1000.0 369.5 404.4 374.4 428.4 1000.0 369.5 404.4 374.4 428.4 438.9 306.4 389.7 237.1 336.7 275.4 497.7 510.5 306.4 389.7 237.1 336.7 438.9 275.4 497.7 510.5 280 500 520 200 220 240 260 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 m/z, amu m/z, amu
21 Enzimaktivitás meghatározása ritka anyagcsere betegségek esetében nem a klasszikus laboratóriumi enzim meghatározás! biokatalizátorok
Enzimaktivitás meghatározása Hagyományosan: Leukocita (EDTA vérbıl izolálva) Limfocita (EDTA vérbıl izolálva) Fibroblaszt (bır biopszia) Májsejtek (májbiopszia) Probléma: a minták gyorsan tönkremennek! Sejtek izolálása Enzimaktivitás mérés
23 Enzimaktivitás 2.: tárolási betegségek EDTA vér Leukocita/limfocita homogenizátum Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Beküldı intézet kódja: Beküldı orvos pecsétszáma: Gyermek utóneve/i: Születési dátum: Születési súly: Terhességi hét: g Tejtáplálás kezdete: Táplálás: SORSZÁM VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szőrés: parenteralis Transzfúzió idıpontja: Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Elérhetıség (telefonszám): Irányítószám: Település: Utca/út és házszám: 3 mm-es vércsepp SORSZÁM anyatej idısebb>48 h fiatalabb<48 h <32gest. hét tápszer transzfúzió inkubálás 4-metilumberrilferil-alfa-D-glükopiranozid szubsztrát fluoreszcens mérés
24 Enzimaktivitás 1.: biotinidáz defektus -tömegszőrés része: Magyarországon a becsült gyakorisága 1:20 000 biocitin biotinidáz enzim biotin (H vagy B7 vitamin) lizin 37 C
25 Genetikai vizsgálatok anyagcsere szőrı laboratóriumok hálózat egy-két betegségcsoport leggyakoribb mutációk szekvenálás
26 A jövı? rengeteg ritka betegség? negatív a metabolit vizsgálat eredménye kóros metabolit nincs a könnyen vizsgálható tartományban peptid, fehérje, szénhidrát, egyéb nagyobb molekula. mőszeres analitika (tömegspektrometria!) fejlıdése lehetıség a metabolit vizsgálatok kiszélesítésére
27 Köszönöm a figyelmet! KÖSZ SZÖNÖM A FIGYELMET!