Gyógyszerkészítmények hatóanyagtartalmának meghatározása nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával csatolt tömegspektrometriával Gyakorlatvezető: Nász Szilárd szilard.nasz@ekol.chem.elte.hu 1
TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés... 4 1.1. A folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria kapcsolata... 4 1.2. A HPLC és a tömegspektrometria csatolásának fő problematikája... 5 1.3. Tömegspektrométer felépítése... 5 1.3.1. Az ionforrás... 6 1.3.2. Porlasztásos technikák... 6 1.3.3. Analizátorok... 8 1.3.3.1. Kvadrupól analizátor... 9 1.3.4. Detektorok... 9 1.3.5. Adatfeldolgozó rendszer... 10 1.4. Tandem tömegspektrometria... 11 1.4.1. Technikák... 12 1.4.1.1. Termékion analízis (Product ion scan)... 13 1.4.1.2. Szülőion analízis (Precurson ion scan)... 13 1.4.1.3. Állandó semleges tömegvesztés (Constant-neutral loss scan)... 13 1.4.1.4. Kiválasztott ionfolyamat követés (Selective Reaction Monitoring). 13 2. Gyakorlati rész... 14 2.1. Mérési feladat... 16 2.1.1. Kalibrációs oldatsorozat készítése... 17 2.1.2. Mintaelőkészítés... 18 2.1.3. Kromatográfiás körülmények... 19 2.1.4. Tömegspektrometriás paraméterek... 19 2
MRM átmenetek... 20 2.2. Elvégzendő feladatok... 20 2.3. Jegyzőkönyv... 20 3
1. Irodalmi áttekintés 1.1. A folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria kapcsolata A legtöbb analitika során a vizsgálandó vegyületek egy komplex rendszer részét képezik. A kromatográfiás technika szerepe, hogy biztosítsa a kérdéses vegyületek elválasztását, így lehetővé téve azok minőségi és mennyiségi meghatározását. Kvalitatív oldalról tekintve a folyadékkromatográfia egyik hátránya, hogy bizonyos esetekben nem képes egy keverék komponenseinek egyértelmű azonosítására még akkor sem, ha a komponensek megfelelő elválasztása megtörtént. Az azonosítás a referencia anyag és az ismeretlen vegyület retenciós tulajdonságainak összehasonlításán alapul, azonban a retenciós tulajdonságok esetleges egyezése esetén sem mondhatjuk ki teljes bizonyossággal, hogy a két vegyület ugyanaz. Ráadásul az analitikus rendelkezésére álló legkülönbözőbb kromatográfiás körülmények ellenére sem lehetséges mindig megvalósítani a komponensek teljes elválasztását az ún. alapvonalelválasztást, így a vegyületek pontos és precíz minőségi meghatározása gátolt lehet. A tömegspektrometriás detektálás előnye, hogy a vizsgálandó vegyületekről a retenciós idő mellett szerkezeti információt is szolgáltathat. A legtöbb vegyület tömegspektruma elegendően specifikus, hogy lehetővé tegye az azonosítást. Ha a kérdéses vegyület egy keverék részét alkotja, akkor a kapott tömegspektrumban a keverékben található minden vegyület bizonyos számú ionja megtalálható lesz, így az azonosítás csak nehézkesen valósítható meg. Kis koncentrációban jelen lévő komponens esetén akár teljeséggel lehetetlenné is válhat. A két technika kombinálása lehetővé teszi azon vegyületek megbízhatóbb minőségi és mennyiségi meghatározását. 4
1.2. A HPLC 1 és a tömegspektrometria csatolásának fő problematikája Két fő inkompatibilitási probléma merül fel folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria között. Az első, hogy a folyadékkromatográfiás elválasztás során alkalmazott eluens (mozgófázis) nagy hányadban tartalmazhat vizet, amit az elválasztás során tipikusan 1 ml/perc áramlási sebesség mellett áramoltatnak, míg a tömegspektrométer 10-6 torr (1,3 10-4 Pa) vákuum alatt működik. Az eluens elpárologtatása hatalmas térfogat-növekedést okozna, valamint a széles skáláról választható eluensek fizikai tulajdonságai is jelentősen eltérnek. Következésképpen nem lehet a mozgófázist közvetlenül a tömegspektrométer nagyvákuum térbe juttatni, ebből kifolyólag fontos funkciója a legtöbb ionforrásnak az eluens jelentős részének eltávolítása. A másik probléma, hogy a vegyületek egy nagy hányada, melyeket folyadékkromatográfiával elválaszthatunk, viszonylag kevésbé illékonyak és/vagy hőérzékenyek. Így nem ionizálhatóak, a gázkromatográfiában elterjedt elektron ütközéses ionizációval és kémiai ionizációval sem. 1.3. Tömegspektrométer felépítése A tömegspektrométer olyan berendezés, melyben semleges részecskékből ionokat állítunk elő, majd az ionokat tömeg/töltés (m/z) szerint szétválasztjuk. A berendezés az alábbi részegységekből épül fel: Mintabeeresztő rendszer Ionforrás Analizátor Detektor Adatfeldolgozó rendszer A tömegspektrométer analizátor és detektor részében nagyvákuum van, ennek oka, hogy az előállított ionok atmoszférikus nyomáson könnyen elnyelődnének az egymással illetve egyéb gázmolekulákkal történő ütközések miatt. Atmoszférikus nyomáson a közepes szabad úthossz 10-8 m, így nem valószínű, hogy az ionok elérnék a detektort. Mivel a közepes szabad úthossz fordítottan arányos a nyomással, a nyomás 10-5 1 High Performance Liquid Chromatography 5
mbar értékre való csökkentésével a közepes szabad úthossz megnövelhető 12 m-re. Az alkalmazott nyomástartomány alapján kétféle vákuumról beszélhetünk: elővákuumtartomány (p > 10-3 mbar) és nagyvákuum-tartomány (10-10 mbar < p < 10-5 mbar). 1.3.1. Az ionforrás A későbbiekben tárgyalt tömeganalizátorok működéséből következik, hogy a feladatukat csak akkor tudják ellátni, ha az analizátor terébe jutott ionok jól meghatározott helyről indulnak. Ha a molekulát ionizáljuk, a képződő iont összetartó erők a molekulához képest jelentősen gyengülnek, hiszen a kémiai kötést biztosító elektronok száma változik ún. destruktív ionképzés. Ilyenkor valószínűbb a fragmentálódás. Az ionok addíciójával képződött adduktok elektronszerkezete viszont nem változik meg jelentősen a molekula elektronszerkezetéhez képest, így ezeknél az ionok képződése lágyabb folyamat eredménye (lágyionizáció). 1.3.2. Porlasztásos technikák A porlasztásos technikák elsősorban a folyadékkromatográfiás módszereknek köszönhetik elterjedésüket. Közös jellemzőjük, hogy a mintát valamilyen oldószerben feloldják majd az oldatot elporlasztják. Így e technikák kézenfekvő módon kapcsolhatók össze a folyadékkromatográffal. Az idők során többféle porlasztásos technikát dolgoztak ki, melyek porlasztási és ionizációs módszerei jelentősen különböznek. A ma legelterjedtebben alkalmazott ESI 2 és APCI 3 ionforrásban interfészben az ionizáció atmoszférikus nyomáson történik (API 4 ), és csak a képződő ionokat juttatjuk a tömegspektrométer vákuumterébe. Egy API interfész 4 részre bontható: (1) spray a folyadék bejuttatására; (2) az interfész atmoszférikus nyomású része, ahol az ionok keletkeznek: elektrospray ionizációval (ESI), atmoszférikus kémiai ionizációval (APCI) vagy más technikával; (3) ionmintázó egység; (4) atmoszférikus nyomás vákuum interfész. 2 Electrospray Ionization Elektrospray ionizáció 3 Atmospheric Pressure Chemical Ionization Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció 4 Atmospheric Pressure Ionization 6
Az LC-MS 5 interfész működési elve a következő. Az analitikai oszlopról érkező eluenst beporlasztják az interfész atmoszférikus nyomású térrészébe. A porlasztás végezhető pneumatikus módon, mint a fűtött APCI interfészben vagy egy erős elektromos tér segítségével, mint az ESI esetében. Létezik még pneumatikusan rásegített ESI interfész is, amit turboionspraynek neveznek. Utóbbit egyre többször alkalmazzák a hagyományos ESI-vel szemben, mert nagyobb áramlási sebesség mellett is használható. Az aeroszolból gázfázisú ionokat hoznak létre az alkalmazott interfésznek megfelelő mechanizmus szerint. Az ionokat, együtt az oldószergőzökkel és a szárítógázként alkalmazott nitrogénnel, egy kis nyíláson keresztül megmintázzák. A minta, azaz a gázkeverék, így egy kisebb nyomású térbe kerül (10-100 Pa), ahol nagy sebességgel kitágul. A kitágult gáz belsejében a vizsgálandó ionok és nagyobb tömeggel rendelkező (semleges) anyagok találhatók. A kitágult gáz magját egy mintavevő kúp (skimmer) segítségével egy alacsonyabb nyomású (0,1-1 Pa) térrészbe vezetik. Ez a térrész tartalmazza az ionoptikát, melynek segítségével optimálisan lehet a vizsgálandó ionokat fókuszálni és bejuttatni a tömeganalizátorba (<10-3 Pa). Az ESI és az APCI interfész tulajdonképpen csak a folyadékcseppek előállítására használt módszerekben és az ionizáció mechanizmusában különbözik egymástól. Mind a két interfész lágyionizációt valósít meg, ezért ha strukturális információra van szükség, akkor az egyik lehetséges megoldás a tandem tömegspektrométer alkalmazása. Az ESI esetében az eluens egy kapillárison keresztül kerül beporlasztásra. A kapillárissal szemben levő elektródra néhány ezer voltos feszültséget kapcsolnak. A folyadék a kapillárist elhagyva apró, nagy felületi töltéssel rendelkező cseppekre szakad szét, melyek az interfész atmoszférikus régiójában az ellenelektród felé haladva folyamatosan oldószert veszítenek, deszolvatálódnak. Az ionizációs térbe kontrolált hőmérsékletű szárítógázt vezetnek (általában N 2 -t), hogy a cseppek beszárítását elősegítsék. Az oldószer elpárolgása során a csepp felületi töltése egyre nő. Egy bizonyos cseppméret elérésekor, mikor a felületi töltések közötti taszítás nagyobb, mint a cseppet összetartó erők, a csepp szétrobban (Coulomb robbanás). A csepp szétrobbanásakor egy nagyobb és több kisebb csepp keletkezik, melyek az eredeti csepp töltésének nagy részét szállítják. A Coulomb robbanások addig folyatatódnak, míg már csak egy ion lesz a 5 Liquid Chromatography Mass Spectrometry 7
cseppben s ebből az oldószer elpárolgása révén jön létre a vizsgálandó ion. Az elektrospray interfész segítségével poláris és ionos vegyületek tömegspektrumait tudjuk felvenni. Mivel az ionizáció közvetlenül az eluensből történik hőérzékeny vegyületek is vizsgálhatók. Az APCI technika, kisebb polaritású, ionosan nem disszociálló molekulák vizsgálatára alkalmazható. A forrás felépítése az ESI-hez hasonló, de a kapillárist egy másik cső is körülveszi, melyben gáz áramlik az eluens porlasztása végett. Az ionok előállításához egy elektródtüskére néhány ezer voltos feszültséget kapcsolnak, amitől az atmoszférikus térben koronakisülés keletkezik. A kisülés során az elpárologtatott oldószer gázmolekulái ionizálódnak, melyek egy kémiai ionizációs folyamat során ionizálják a vizsgálandó vegyületet. 1.3.3. Analizátorok A tömegspektrum az adott vegyület ionizációja során keletkező ionok intenzitásának m/z függvényében történő ábrázolása. Az ionok megfelelő módon történő előállítását követően a különböző m/z értékkel rendelkező ionokat el kell választani és a relatív intenzitásukat meg kell határozni. Több analizátor létezik az ionok elválasztására a tömegspektrometriás technikákban. Meg kell említeni az analizátorok közös és fontos tulajdonságát, mely meghatározza analitikai teljesítőképességüket. A felbontás fogalommal az analitikai tudomány nagyon sok területén lehet találkozni. Definíció szerint két egymáshoz közel eső jel közötti különbségtétel képességét fejezi ki. A tömegspektrometriában ezek a jelek az ionok m/z arányai, s a felbontást matematikailag az alábbi képlet írja le: R m/ m ahol, R a felbontás számértéke, m (Da) a mérni kívánt m/z érték és Δm a különbség (Da) a mérni kívánt ion és az elválasztandó ion között. 8
1.3.3.1. Kvadrupól analizátor A kvadrupól analizátor alapvetően egy tömegszűrő, amely az ionokat a kiválasztott m/z értéknek megfelelően engedi át. A kvadrupól analizátorban kizárólag elektromos mezőt használunk az ionok m/z érték szerinti szeparálásához. Alapvetően négy, egy négyzet négy csúcsának megfelelően elrendezett párhuzamos fémrúdból áll. Ezek a fém rudak az analizátor pólusai. A két-két szembelevő rúdra, +(U+Vcos( t)), illetve -(U+Vcos( t)) potenciált kapcsolunk, ahol U állandó potenciálérték, Vcos( t) pedig egy V amplitúdójú és frekvenciájú rádiófrekvenciás jel. A detektorba csak azok az ionok jutnak el, amelyek végig tudnak haladni a négy rúd közötti térben anélkül, hogy az elektródként viselkedő rudak valamelyikéhez csapódnának. Felbontóképessége a fém rudak hosszának növelésével nő, míg a fém rudak keresztmetszetének növelése az érzékenységet, csökkentése pedig a mérhető ionok m/z tartományát növeli. 1.3.4. Detektorok A tömegspektrometriai detektorok feladata az analizátoron áthaladó ionok minél nagyobb hatásfokú kimutatása. Ahhoz, hogy a detektor jelét hagyományos eszközökkel erősíteni tudjuk, sok nagyságrendnyi áramerősítést kell elérni. Ugyanakkor ahhoz, hogy az egyes mért ioncsúcsok relatív intenzitása megegyezzen a megfelelő ionok mennyiségi arányával, az erősített jelnek a becsapódó ionok számával arányosnak kell lennie. A detektorok legfontosabb tulajdonsága tehát az erősítés, ami végső soron az érzékenységet határozza meg. Az elektronsokszorozó több, egyre növekvő pozitív potenciálú fémlemezből (Cu- Be), ún. dinódákból áll. Ha nagysebességű elektronok vagy más ionok ütköznek megfelelő anyagú fémlemezbe, akkor a fémlemezből szekunder elektronok lépnek ki a növekvő potenciál irányába. A szekunder elektronok száma függ az elektród anyagától. A sokszorozó teljes erősítése egy dinóda sokszorozásának a dinódák számán vett hatványa. Egy olyan elektronsokszorozóval, ami 6-7 dinódát tartalmaz 10 6-10 7 -szeres erősítést lehet elérni. 9
A dinódás elektronsokszorozó továbbfejlesztett változata az ún. csatorna-elektronsokszorozó (Channeltron CEM 6 ). A detektor jelen esetben egy szigetelő kerámiacsőre felpárologtatott nagy ellenállású félvezetőrétegből áll, melyre 2-3 kv feszültéséget kapcsolnak. A becsapódó ionok és elektronok itt is szekunder elektronokat váltanak ki, s az ebből származik a szintén 6-7 nagyságrendnyi erősítés. 1.3.5. Adatfeldolgozó rendszer A detektort elhagyó jeleket elektronikus formában dolgozzák fel. A mára egyeduralkodó számítógépes adatfeldolgozás révén a primer (nyers) adatok helyett az emberi értékelést könnyítő módon feldolgozott spektrumokat nyerünk. A számítógépes rendszer feladata három fő csoportra bontható: tömegspektrométer vezérlése; adatok fogadása és tárolása; a tárolt adatok feldolgozása, az analitikai információ kinyerése. Fontos még az adatfeldolgozás szempontjából a spektrumok felvételi sebessége. Ahhoz ugyanis, hogy egy kromatográfiás csúcsban megjelenő alkotóról annyi tömegspektrumot készíthessünk, amelyek integrált ionáram intenzitása a kromatográfiás csúcsot reprodukálhatóan visszaadja, legalább 10 mintát kell venni, azaz egy csúcsról legalább 10 tömegspektrumot kell felvenni. Ez azt jelenti, hogy egy 4-5 s alatt eluálódó csúcs esetében 0,4-0,5 másodpercenként kell tömegspektrumot készíteni. Egy kromatogram elkészülése során felvett spektrumok mért ionáram összegeinek eredményeként kapjuk az ún. teljes ionáram kromatogramot (TIC 7 ), amely lényegében egy univerzális ionizációs detektor által mért kromatogrammal egyenértékű, de minden molekulát szelektíven érzékelő jelsorozat. Hasonló fontossággal bír az ionkromatogram 6 Channel Electron Multiplier 7 Total Ion Chromatogram 10
(XIC 8 ), mikor egy-egy ioncsúcs intenzitását az idő függvényében ábrázolunk. Az ionkromatogramnak a mennyiségi kiértékelés során van létjogosultsága. 1.4. Tandem tömegspektrometria Az igazi előnye a tömegspektrometriás technikáknak, hogy a vizsgálandó komponens molekulatömegének megadása mellett adatokat is biztosít a komponens szerkezetét illetően. A legelterjedtebben alkalmazott ionizációk LC-MS esetén lágy ionizációk, így elsődlegesen molekuláris specieszeket kapunk kis fragmentációval. Azonban csak a molekulatömeg ismerete nem elég ahhoz, hogy egy szerkezetet azonosítsunk, ezért fontos, hogy a struktúrára jellemző információk is a rendelkezésünkre álljanak. A tandem tömegspektrometriának pontos, elfogadott definíciója nincs. Általában azokat a módszereket soroljuk ide, melyekkel gázfázisú fragmentációs folyamatokban anyaion-leányion kapcsolat határozható meg. Az ionizáció tömeganalízis során izolált iont újabb reakcióba visszük (fragmentáljuk) és az így nyert termékionokat m/z érték szerint újra szétválasztjuk. Az ionizáció, tömeganalizálás és detektálás időigénye több nagyságrenddel kisebb, mint egy kromatográfiás csúcs elúciója, ezért egy csúcs elúciós ideje alatt is többször végigpásztázhatjuk (SCAN) az általunk választott tömegtartományt. Ez a detektor egyik adatgyűjtési módja. Ebben az esetben az analizátor elektonikája a kvadrupól megfelelő fémtesteire a kiindulási m/z-nek megfelelő szinusz-potenciált generál, majd a szinuszpotenciál mértékét megfelelően lépteti ahhoz, hogy egyesével növelje az analizátor m/z áteresztését, s így végigpásztázzuk egyesével az általunk meghatározott tömegtartományt (pl. 100-500 amu) A detektor másik adatgyűjtési módszere a szelektív ion monitorálás (SIM) üzemmód. Ebben az esetben ismernünk kell a merni kívánt molekulák jellemző fragmenseit a korábbi SCAN felvételek alapján. MSD detektálásnál vegyület teljes elválasztása nem szükséges abban az esetben, ha a jellemző ionjaik különbözőek. 8 Extracted Ion Chromatogram 11
Az ún. hármas kvadrupól készülék két darab analizátoregységet tartalmaz (1.ábra). A két kvadrupól analizátor (Q1 és Q3) között egy ütközési cella található (Q 2 ). Mind a két kvadrupól analizátor szabályozható úgy, hogy csak bizonyos m/z értékkel rendelkező egyedi ionokat illetve egy bizonyos tartományt engedjen át a kívánt analitikai cél érdekében. Tömeg szelektív szűrő (Q1) Tömeg szelektív szűrő (Q3) Lencse 1 és 2 a Ütközési Cella HED Detektor Rotációs pumpa Turbo pumpa Turbo pumpa Turbo pumpa 1. ábra, Hármas-kvadrupól rendszer felépítése 1.4.1. Technikák Az MS/MS spektrum az anyaion-leányion meghatározását jelenti. A kapcsolat meghatározására számos lehetőség van, s a legtöbb változat készüléktípustól függetlenül megvalósítható. Hármas kvadrupól esetén az alábbi lehetőségeink vannak. 12
1.4.1.1. Termékion analízis (Product ion scan) Az első analizátorral (Q 1 ) kiválasztjuk a vizsgálandó anyaiont, majd fragmentáljuk az ütközési cellában (Q 2 ) és a második analizátor (Q 3 ) futtatásával felvesszük a leányionok tömegspektrumát. A kapott spektrumok az anyaiont jellemzik, így a szerkezet-meghatározáshoz nagymértékben hozzájárulnak. 1.4.1.2. Szülőion analízis (Precurson ion scan) A második analizátor (Q 3 ) úgy van beállítva, hogy csak egy adott leányiont engedjen át. Az első analizátor futtatásával azon anyaionok detektálható, melyek a kiválasztott leányionra bomlanak. A módszer használatos speciális fragmentációs folyamatok felderítésénél és egyes analitikai feladatok megoldásnál. Ezzel a módszerrel egy anyagkeverékben jelenlévő homológ vegyületek mutathatók ki, egy közös fragmensük detektálásával. 1.4.1.3. Állandó semleges tömegvesztés (Constant-neutral loss scan) Mind a két analizátor pásztáz egy bizonyos tömegtartományt. Attól függően, hogy a két analizátor között milyen kapcsolat van, különböző fragmensek mutathatók ki. A gyakorlatban legelterjedtebb az adott semleges rész elvesztésének kimutatása. A második analizátor (Q 3 ) egy meghatározott tömegszámmal kisebb értékre áll be (pl. 18- cal), mint az első analizátor (Q 1 ). Így azok az ionok adnak csak jelet, melyek az ütközési cellában, jelen esetben 18-as tömegű részecske (például H 2 O) kilépésével bomlanak. 1.4.1.4. Kiválasztott ionfolyamat követés (Selective Reaction Monitoring) Egyik analizátor sincs pásztázó üzemmódban. Az első analizátor (Q 1 ) csak egy kiválasztott anyaiont enged át, míg a második analizátor (Q 3 ) az anyaion fragmentálódásából keletkező adott leányiont enged csak át. Ezt a metodikát legtöbbször kromatográfiával kombinálva alkalmazzák, igen kis mennyiségben jelenlevő vegyületek 13
kvantitatív meghatározására. A kapott eredmény hasonló a GC-MS 9 -ek esetében alkalmazott SIM 10 módszerhez. Gyakorlatban a leginkább használt MS/MS metodika. A módszernek van egy másik elnevezése, Multiple Reaction Monitoring (MRM), mikor párhuzamosan több tömegátmenetet vizsgálunk. Több vizsgálandó vegyület szimultán meghatározása esetén használják. Az alábbi táblázat a két kvadrupól állapotát mutatja a különböző üzemmódokban. Üzemmód Q1 Q3 Product ion scan SIM SCAN Precurson ion scan SCAN SIM Constant-neutral loss scan SCAN SCAN Selective Reaction Monitoring SIM SIM Table 1, Q1 és Q3 a különböző üzemmódokban 2. Gyakorlati rész A gyulladásos betegségek kezelésére kifejlesztett gyógyszerek egyre nagyobb teret hódítanak manapság. A viszonylag egyszerű használat és gyors hatás miatt terjedtek el világszerte. Elsősorban gyógyszer és kenőcs formájában forgalmazott termékek. Problémát okoz, hogy gyógyszer formában, az emberi szervezetből kiürülés útján, míg a kenőcs formában alkalmazott gyulladáscsökkentők pedig lemosás után a szennyvizekbe, illetve a felszíni vizekbe kerülnek. A problémát fokozza, hogy a nem megfelelő hulladékkezelés által is ugyanígy bekerülhetnek a vizeinkbe. A felszíni víztisztító bázisok ezeknek a komponenseknek a tisztítására jelenleg nincsenek felkészülve, így a háztartásokba eljutó 9 Gas Chromatography Mass Spectrometry 10 Selected Ion Monitoring Kiválasztott ionfigyelés 14
vizek tartalmazhatnak gyulladáscsökkentőket. Az általunk vizsgált gyulladáscsökkentők a Diclofenac, Naproxen, Ketoprofen, és Ibuprofen. A molekulák minimum egy aromás gyűrűt, és egy karbonsavrészt tartalmaznak, kémiai tulajdonságaikban nagymértékben hasonlítanak egymáshoz. Mind a 4 komponens a nem-szteroid gyulladáscsökkentők családjába tartozik. Kémiailag nem szteránvázasak, hatásukat nem a szteroid hormonok receptorain fejtik ki. Gyulladáscsökkentő hatásuk mellett általában lázcsökkentő hatással is rendelkeznek. Lázcsökkentő hatásukat a központi idegrendszer hőközpontjának bénításával fejtik ki, melynek hatására csak a kórosan magas testhőmérséklet csökken. Diclofenac Összegképlet: C 14 H 10 Cl 2 NNaO 2 Molekulatömeg: 318.13 g/mol Naproxen Összegképlet: C 14 H 14 O 3 Molekulatömeg: 230.26 g/mol Olvadáspont: 153-154 C 15
Ketoprofen Összegképlet: C 16 H 14 O 3 Molekulatömeg: 254.28 g/mol Oldhatóság vízben: 0.3 g/ml @ ph 7.0 Ibuprofen Összegképlet: C 13 H 18 O 2 Molekulatömeg: 206.28 g/mol Olvadáspont: 75-77 C 2.1. Mérési feladat A gyakorlat célja különböző gyógyhatású készítmények hatóanyagtartalmának meghatározása nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával. A vegyületek azonosítása a mintaoldatban lévő komponensek retenciós idejének és a megfelelő standardanyagok retenciós idejének összehasonlítása mellett tömeg/töltés alapján MRM üzemmódban történik. A mennyiségi meghatározást pedig egy háromszorosan deuterált belső standard segítségével végezzük. 16
2.1.1. Kalibrációs oldatsorozat készítése A törzsoldatokat az alábbi táblázat szerint kell elkészíteni. A komponenseket analitikai pontossággal mérjük be, majd a bemért komponenseket 70 ml metanollal oldjuk és a lombikokat 5 percre ultrahangfürdőbe helyezzük. Ezután metanollal jelre állítsuk a lombikokat és homogenizáljuk a tartalmukat. A törzsoldatokat használat után helyezzük hűtőbe. Komponens Bemérés / [mg] Végtérfogat / [ml] Koncentráció* / [mg/ml] diclofenac 200 100 2 naproxen 200 100 2 ketoprofen 200 100 2 ibuprofen 200 100 2 ibuprofen-d3 200 100 2 A hatóanyagok mennyiségi meghatározására ötpontos kalibrációt készítünk A törzsoldatokból 1-1 ml-t bemérünk egy 100 ml-es lombikba (kivéve az ISTD-t, azzal egyedi higítást készítünk ugyanígy), majd jelre állítjuk metanollal. Ezt követően ezzel a 20 µg/ml koncentrációjú kalibrációs mixel dolgozunk tovább. A kalibrációs oldatok elkészítéséhez az alábbi táblázat nyújt segítséget. Az ISTD-vel mindegyik kalibrációs szintet 200 ng/ml koncentrációra adalékoljuk (100 µl 20 µg/ml-s ISTD). Pipettázzunk a lombikokba a mix megadott mennyiségét, majd 1:1 Millipore(nagytisztaságú víz): metanollal állítsuk jelre a lombikokat, végül homogenizáljuk a tartalmukat. Ezután pipettázzunk 1 ml-t a kalibrációs oldatokból 1,5 ml-es fiolába, majd kupakoljuk le a fiolákat. 17
Kalibrációs pont V / [µl] V ISTD / [µl] c* kiindulási / [µg/ml] V(lombik) / [ml] c (MIX)* / [ng/ml] I 400 100 20 10 800 II 300 100 20 10 600 III 200 100 20 10 400 IV 100 100 20 10 200 V 50 100 20 10 100 Figyelem! A *-gal jelölt koncentrációk névleges koncentrációk, a pontos koncentrációk a megfelelő törzsoldat bemérésekből számítandóak! 2.1.2. Mintaelőkészítés 1 db tablettát elporítunk, majd beleteszünk egy 100 ml-es mérőlombikba és először feloldjuk 70 ml metanollal. Néhány percre ultrahangos fűrdőbe helyezzük, majd jelre állítjuk metanollal. Ebből az oldatból 10000-szeres higítást készítünk 1:1 Millipore: metanollal a rendelkezésünkre álló lombikokban. Az utolsó higítást úgy végezzük el, hogy ezt az oldatot már 200 ng/ml-re adalékoljuk belső standarddal. Szűrjük le a mintát egy 0,45 µm pórusméretű szűrőn. Pipettázzunk 1 ml-t a mintaoldatokból 1,5 ml-es fiolába. 18
2.1.3. Kromatográfiás körülmények Készülék Oszlop Eluens Áramlási sebesség 1200 RRLC ZORBAX 3.5 µm Eclipse XDB-C18 4,6 x 50 mm A: Millipore víz - 45% B: Acetonitril - 55 % 500 µl/min Injektálási térfogat 3.0 µl 2.1.4. Tömegspektrometriás paraméterek Készülék Ionization Capillary Nebulizer P Drying Gas Agilent 6410B QQQ ESI (Negative) 4000 V 40 psi 10 L/min Gas Temp 350 C Fragmentor (70 100) V Collision (0 10) V (N 2 ) Adatfeldolgozás LC MassHunter 19
MRM átmenetek Diclofenac 294>250 Ibuprofen 205>161 Ibuprofen-D3 208>164 Ketorpofen 253>209 Naproxen 229>170 2.2. Elvégzendő feladatok HPLC-s rendszer üzembehelyezése és a kromatográfiás körülmények beállítása; Kalibrációs oldatsorozat elkészítése; Vizsgálati minták előkészítése (2db); Vizsgálati minták és a kalibrációs sorozat kromatografálása: Kalibrációs pontok felvétele 5 koncentráció szinten; Mintánként 3 db injektálás; Kromatogramok kiértékelése szoftveresen; 2.3. Jegyzőkönyv A mérés tömör leírása; A kinyomtatott kromatogramok csatolása; Mérés folyamata, körülmények; Kalibrációs adatok számítása (Excel vagy Origin): egyenes egyenlete, regressziós koefficiens értéke komponensenkét; Vizsgálati minta komponenseinek minőségi és mennyiségi meghatározása átlagképzéssel és RSD% számításával mg/tablettára vonatkoztatva; 20