Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés és validálása a MANGFOOD projekt keretében Szántó-Egész Réka 1, Mohr Anita 1, Sipos Rita 1, Dallmann Klára 1, Ujhelyi Gabriella 2, Koppányné Szabó Erika 2, Jánosi Anna 2, Zsolnai Attila 3, Egerszegi István 3, Anton István 3, Tóth Gábor 4, Molnár János 1, Stéger Viktor 4, Marincs Ferenc 4, Tóth Péter 5, Rátky József 3, Szigeti Tamás 6, Micsinai Adrienn 1 1 Biomi Biotechnológai Szolgáltató Kft. 2 Központi Környezet- és Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 3 Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet 4 Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont 5 Olmos és Tóth Kft. 6 WESSLING Hungary Kft.
A projekt céljai: Elsődleges cél: - Egy diagnosztikai rendszer kifejlesztése és validálása mangalica minőségi és mennyiségi kimutatására élelmiszeripari termékekből Másodlagos cél: -Mangalica biobank kiépítése -A mangalica állomány széleskörű genomikai feltérképezése -Genetikai markerek keresése -A zsír kémiai összetételének vizsgálata -Az élelmiszer-ipar számára hasznos információk gyűjtése
MANGFOOD konzorcium Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet Központi Élelmiszertudományi Kutatóintézet Olmos és Tóth Kft. WESSLING Hungary Kft. Biomi Kft.
Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés
Genomszekvenálási adatok Több száz ígéretes lókusz Primerek tervezése az SNP-kre elsődleges PCR szűrés Sanger szekvenálások 1 db mangalica specifikus gén 13 db sertés specifikus referenciagén Markergén PCR szűrés 1 db referenciagén V1 Referenciagén V2 Referenciagén
Specifitás vizsgálat Vizsgált minták Markergén Referenciagén mangalica sertés pozitív pozitív F1 keresztezett egyedek (mangalica x egyéb sertés) pozitív pozitív nem mangalica sertés negatív pozitív vaddisznó negatív pozitív egyéb állatfajok (szarvasmarha, őz, ló, rackajuh, vadnyúl, pulyka, házityúk, lúd, kacsa, fácán, lazac, magyar szürke) egyéb növényfajok (búza, burgonya, szója, rizs, feketebors, fokhagyma, kömény, kukorica, repce, takarmány, zeller) negatív negatív negatív negatív
Real-time PCR TaqMan technika
Primer optimalizálás QRT-PCR Optimalizálás Próba optimalizálás Linearitás kimutatási tartomány Hatékonyság Szelektivitás Mérés megbízhatósága Mennyiségi mérések 8
V1 Referenciagén -- primer koncentrációjának kiválasztása 50x50 300x50 900x50 50x300 300x300 900x300 50x900 300x900 900x900 300 50x 50x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 200 nm, Rv: 200 nm 9
V1 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása 50 100 150 200 250 100-250 50 Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm
V2 Referenicagén -- primer koncentrációjának kiválasztása 50x50 300x50 900x50 50x300 300x300 900x300 50x900 300x900 900x900 50x300 50x900 300x50 900x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 50 nm, Rv: 300 nm
V2 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása 50 100 150 200 250 100-250 50 Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm 12
Markergén -- Primer koncentráció kiválasztása 50x50 50x200 50x400 50x900 200x50 200x200 200x400 200x900 400x50 400x200 400x400 400x900 900x50 900x200 900x400 900x900 400x400 50x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 400 nm, Rv: 400 nm
Markergén -- Próba koncentráció kiválasztása 50 100 150 200 250 250 100-200 50 Kiválasztott próba koncentráció: 250 nm
50 ng 100 ng 200 ng 1 ng Ct értékek 0,1 ng 0,01 ng V1 Referenciagén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=92% 42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,522x + 32,175 R² = 0,9952-2,50-2,00-1,50-1,00-0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
50 ng 100 ng 200 ng 1 ng Ct értékek 0,1 ng 0,01 ng V2 Referenciagén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=92% 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,5181x + 32,134 R² = 0,9933 LOG Hígítás -2,5-2 -1,5-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
200 ng 20 ng 2 ng Ct ÉRTÉKEK 0,2 ng 0,02 ng SNP1-3 Linearitás Markergén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=94% 42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,4785x + 32,346 R² = 0,9933-2 -1,5-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 LOG hígítás
Mangalica specifikus DNS alapú módszer validálása
A nemzetközi körvizsgálatban résztvevő laboratóriumok Résztvevő laboratóriumok Real-Time PCR készülék Ország Állami kutatólaboratórium Rotor-Gene RG-3000 Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium BioRad CFX96 Magyarország Független laboratórium ABI 7300 Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium BioRad icycle Magyarország Független laboratórium ABI StepOne Plus Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium ABI 7000 Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7500 Magyarország Állami kutatólaboratórium Eppendorf Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7500 Magyarország Hatósági laboratórium ABI 7500 Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7900 Észtország Egyetemi kutatólaboratórium ABI 7300 Németország Független laboratórium ABI 7500 Németország Független laboratórium ABI 7500 Magyarország
Biztosított reagensek Markergén reverz primer Markergén forward primer Markergén próba Referenciagén reverz primer Referenciagén forward primer Referenciagén próba Standard (S1-S5) Ismeretlen minta jelölése F1 (mangalicaxdurok) hús menyisége % Nem mangalica sertéshús mennyisége % Mangalica tartalom % Termék U1 0 100 0 párizsi U2 20 80 10 kolbász U3 50 50 25 kolbász U4 70 30 35 kolbász U5 100 0 50 kolbász
Standard görbék statisztikai eredményei Referenciagén Markergén Meredekség Hatékonyság R 2 Meredekség Hatékonyság R 2 Átlag (10) -3,621 89,04% 0,997-3,601 89,69% 0,997 Szórás 0,129 0,042 0,001 0,114 0,038 0,002
Mangalica tartalmak eltérését a várt értéktől
A megbízhatóság és reprodukálhatósági értékek alapján megállapítható, hogy az általunk kidolgozott, saját fejlesztésű mangalica-specifikus TaqMan alapú real-time PCR diagnosztikai rendszer a 0-50%-os mangalica tartalom tartományban minden adatpontban megfelel az elvárásoknak.
Köszönöm a megtisztelő figyelmet! A MANGFOOD projekt a Nemzeti Innovációs Hivatal támogatásával valósulhatott meg, TECH_08 A3/2 2008 0405.