A Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinika, Budapest, közleménye Hisztopatológiai elváltozások az izomszövetben végtaghosszabbítást követően DR. PAP KÁROLY, DR. KISS SÁNDOR, DR. SHISHA TAMÁS, DR. DOMOS GYULA, DR. BERKI SÁNDOR, DR. HOLNAPY GERGELY, DR. SZŐKE GYÖRGY Érkezett: 2008. május 30. ÖSSZEFOGLALÁS A callus distractiót már régóta használják a különböző eredetű végtaghossz különbségek korrekciójára. A végtaghosszabbítás hatása a harántcsíkolt izomra még nem teljesen tisztázott. Jelen tanulmány a végtaghosszabbítás során a nyulak vázizmában kialakuló változásokat mutatja be. Kísérletünkben 23 nyúlon végeztünk végtaghosszabbítást. Az állatokat 6 csoportba osztottuk életkoruk és a hosszabbítás mértéke szerint. A műtét után 7 napos kompressziót követően kezdtük el a tibia elongatióját. A hosszabbított izom degeneratív elváltozásait Lee pontrendszerének segítségével elemeztük. Miután az elongált flexor digitorum longus izmok degenerációját szövettani vizsgálatokkal (izomatrophia, sejtmag internalizáció, az izomrostok degenerációs jelei, peri- és endomysealis fibrosis és izom ín átmeneti haematomák) elemeztük, igazolódott, hogy már a normális hosszabbítási ráta mellett is jelentős degeneráció figyelhető meg azokban. A nagyobb mértékű nyújtás (1,6 mm/nap) során az izmok természetesen jobban károsodnak. A degeneratív jelek a felnőtt állatokban sokkal gyakrabban fordulnak elő, mint ugyanolyan mértékben hosszabbított fiatalabb állatok esetében. A hisztopatológiai elváltozások az izomhas distalis régióját súlyosabban érintik. Kulcsszavak: Állatkísérlet; Izom, skeletalis Fiziopatológia; Nyúl; Végtaghosszabbítás Komplikációk; Végtagok Műtéti kezelés; K. Pap, S. Kiss, T. Shisha, Gy. Domos, S. Berki, G. Holnapy, Gy. Szőke: Histopathological changes in rabbit striated muscle after limb lengthening The callus distraction is a widely used method for correcting extremity length inequality. The response of skeletal muscle to limb lengthening is not fully understood. The present study evaluated the histologic changes in the muscle tissue after limb lengthening in rabbits. 23 male Domestic White rabbits were operated (divided into six groups) and different lengthening protocols were used in mature and immature rabbits. The histopathologic changes were analyzed by a semiquantitative method according to the scoring system of Lee et al. After the evaluation of main five degenerative parameters (muscle fiber-size variation: muscle atrophy, muscle nuclei internalization, degeneration of the muscle fiber, perimysial and endomysial fibrosis, and haematomas at the MTJ) it is evident that the adults lengthened at 1.6 mm/day showed more degenerative changes than those lengthened at 0.8 mm/day. The adult 1.6 mm/day lengthened group presented significantly higher damage in the muscle and lower regenerative sings compared with the young 1.6 mm/day lengthened group according to the summarized degenerative scores. The distal region of the muscle belly is more involved by degenerative signs compared with the proximal region. Key words: Animals; Bone lengthening Adverse effects; Extremities Surgery; Muscle, skeletal Physiopathology; Rabbits; BEVEZETÉS Az ismereteink bővülésének köszönhetően a végtaghosszabbítás az ortopédiában széles körben alkalmazott technikává vált (18). Több kutatási eredmény és klinikai tanulmány is beszámolt már a hosszabbított csontszakasz jó regenerációs képességéről (10, 15), de úgy tűnik, hogy a csontot körülvevő lágyrészek meglehetősen sérülékenyek (10, 17). A végtaghosszab- Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3. 217
bítás során felmerülő súlyos szövődmények hátterében a harántcsíkoltizom áll. E szövettípus felelős a contracturák, ízületi subluxatio/luxatio, tengelyeltérés kialakulásáért (16). Úgy vélik, hogy a harántcsíkolt izom válasza a nyújtásra nem csak passzív folyamat, hanem aktív, adaptív reakció, amit a szakirodalom distractiós histogenesisként ismer (4, 11, 20). Ez a folyamat degeneratív és regeneratív fázisokból áll. Valószínű, hogy az izomrost necrosis beindítja és fokozza a regeneratív folyamatokat is. Gyakran az elhalt rostok fagociták általi eltakarítása párhuzamos a regenerációs folyamatokkal, ezért ezek gyakran láthatóak azonos területeken (13). Jelen vizsgálat célja, hogy elemezze nyulak harántcsíkolt izmában a végtaghosszabbítás során kialakuló degeneratív elváltozásokat. ANYAG ÉS MÓDSZER 23 új-zélandi fehér nyúlon végeztünk végtaghosszabbítást. A műtétet a callotasis elvének megfelelően 7 napos kompresszió követte. Az állatokat 6 csoportba osztottuk. Az első csoportba (G1) tartozó 4 felnőtt állat tibiáján napi 0,8 mm-t nyújtottunk. A második (G2) csoportban (5 felnőtt állat) 1,6 mm-t hosszabbítottunk naponta (2 0,8 mm). A hármas (G3) csoportba 5 fiatal állat került és bal tibiájukat naponta 0,8 mm-rel hosszabbítottuk. A négyes (G4) csoportba tartozó 4 fiatal állat hátsó lábán 2 0,8 mm-t nyújtottunk naponta. Az ötös, G5 (2 felnőtt állat) és a hatos, G6 (3 fiatal állat) csoportba kerültek az áloperált állatok. (Az áloperált állatokon elvégeztük a műtétet és a fixateur-t is behelyeztük, de a végtagot nem nyújtottuk.) A fiatal állatok 9 10, a felnőttek 28 30 hetesek voltak (21). A nyulak altatásához ketamint és xylazint vagy medetotimidint használtunk. A műtétet Simpson leírásának megfelelően végeztük (22). A műtét során különös figyelmet fordítottunk a lágyrészek védelmére. A műtét után minden állat intravénásan 20 ml/ttkg cephalonsporint kapott, posztoperatív röntgen készült (50 kv, 8,0 mas). Az elongációs program befejeztével, az állatok leölését követően, kipreparáltuk és eltávolítottuk a flexor digitorum longus izmot, majd 10%-os formalinban fixáltuk azokat 48 órán át. Azért ezt az izmot választottuk, mert a tibiához viszonyított helyzete miatt igen érzékenyen reagál a végtaghosszabbításra. Az izmokat distalis és a középső, illetve a középső és a proximalis harmad határán elvágtuk. Majd a mintákat paraffinba ágyaztuk és 5 μm vastagságú, keresztmetszeti orientációjú szeleteket készítettünk, majd Haematoxylin Eosin, van Gieson trichrome és Masson trichrome festést használtunk. A hisztopatológiai elváltozásokat Lee semi-quantitaiv pontrendszerével elemeztük (9). Ezek az alábbiak: 1: izomrostok harántméretének változékonysága, 2: izom sejtmagjának internalizációja, 3: izomrost regeneráció, 4: endo- és perimysial fibrosis, 5: izomsejtmag internalizáció az izom ín átmenet (myotendinous junction: MTJ) területén, 6: sejtszám az MTJ területén, 7: haematomák az MTJ területén. Az elváltozásokat 0 3-ig pontoztuk. A 0 a normál volt. A metszeteket Zeiss ICM 405 mikroszkóppal vizsgáltuk és a felvételeket Zeiss M 35-ös kamerával rögzítettük. Minden mintából, meghatározott izomrégióban, 20 látótérben elemeztük az elváltozásokat. A statisztikai elemzéshez Kruksal Vallis és Wilkoxon ranksum tesztet használtunk. EREDMÉNYEK Azok a felnőtt állatok, amelyeken napi 1,6 mm-t hosszabbítottunk (G2) szignifikánsan nagyobb izomrost átmérő változékonyságot mutattak (ami az izom atrophiára utal), mint azon társaik, akiknél csak 0,8 mm hosszabbítottunk (G1) (p<0,005). A két fiatal csoport között (G3, G4) nem találtunk szignifikáns különbséget, de nagyobb mértékékű hosszabbítás itt is emelkedett értéket mutatott. 218 Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3.
Abban az esetben, ha az életkor szerint hasonlítottuk össze a nyulakat, akkor a 0,8 mm/ nap, és az 1,6 mm/nap hosszabbítási rátájú felnőtt állatokban szignifikánsan emelkedett az izomrost átmérő változékonysága (p<0,05) a megfelelő hosszabbítási rátájú fiatal állatokhoz viszonyítva (átlagértékek: Gl: 1.5; G3: 1.2; G2: 2.35; G4: 1.38). A felnőtt állatoknál az izmok distalis részében az izomrost átmérő változékonysága valamivel kifejezettebb volt a proximalis metszetekkel összehasonlítva, de a különbség nem volt szignifikáns (Gl PROX: 1.375; Gl DIST: 1.625; G2 PROX: 2.1; G2 DIST: 2.6 ). A G2 csoport állataiban az izomsejtmag centralizációs tendenciája lényegesen erőteljesebb volt, mint a fiatal G4 csoportban (p<0,05). A G1 és a G3 csoport között nem találtunk különbséget (átlagértékek: Gl: 0.75; G2: 1.35; G3: 0.8; G4: 0.938). Abban az esetben, ha a mintavétel magassága szerint vizsgálódtunk, akkor csak a G1 csoport distalis részében találtunk szignifikánsan emelkedett izomsejtmag internalizációt (az adott izom proximalis részéhez viszonyítva) (p<0,05) (átlag értékek: Gl PROX: 0.5; Gl DIST: 1; G2 PROX: 1.3; G2 DIST: 1.4). A hosszabbított izomrostokban megfigyelhető, hogy a fiatalabb egyedek szignifikánsan jobb regenerációs készséget mutatnak, mint idősebb társaik (p<0,001). Amikor a G3 és a G4 csoportot hasonlítjuk össze, azt tapasztaljuk, hogy a G4 csoport regenerációs pontszáma több mint a duplája a G3-nak (p<0,001) (átlagértékek: Gl: 0.375; G2: 0.95; G3: 0.8; G4: 1.75). A proximalis és a distalis minták között nem találtunk különbséget. I. táblázat A végtaghosszabbítás után vizsgált degenerációs és regenerációs paraméterek. Szövettani elváltozások 0.8 mm/nap G1 Felnőtt Fiatal Felnőtt Fiatal 1.6 mm/nap G2 0.8 mm/nap G3 1.6 mm/nap G4 Áloperált G5 Áloperált G6 Izomatrophia 1,5 2,35 1,2 1,375 0 0,0833 Sejtmag internalizáció 0,75 1,35 0,8 0,9375 0,125 0,0833 Izom-regeneráció 0,375 0,95 0,8 1,6875 0 0 Endomysialis és perimysialis fibrosis 1,0625 2,85 0,85 1,4375 0 0 Sejtmag internalizáció az MTJ területén 0,4375 1,45 1,2 2 0 0,0833 Sejtszám az MTJ területén 0,5625 1,95 0,95 1,625 0 0 Haematomák az MTJ területén 0,1875 1,85 0 0,125 0 0 1. Izomatrophia: 0 normál; 1 az izomrostok átmérője 2/3-a az ellenoldali ép izomrost méretnek, és ez a látótér kevesebb, mint 20%-ban megfigyelhető; 2 az izomrostok átmérője 2/3-a az ellenoldali ép izomrost átmérőjének, és ez a látótér 20 40%-ában megfigyelhető; 3 az izomrostok átmérője 2/3-a az ellenoldali ép izomrost átmérőjének, és ez a látótér több, mint 40%-ában megfigyelhető. 2. Izomsejtmag internalizáció: 0 normál; 1 3 5 izomrost centralizált maggal 10 látótérben; 2 10 látóterenként 6< izomrost centralizált maggal egészen látóterenkénti 5 izomrost centralizált magig; 3 látóterenkénti 5< izomrost centralizált mag. 3. Izomregeneráció: 0 normál; 1 1 2 regenerálódó izomrost 10 látótérben; 2 3 10 regenerálódó izomrost 10 látótérben, 10< regenerálódó izomrost 10 látótérben. 4. Endo-perimysialis fibrosis: 0 normál; 1 enyhe részleges fibrosis; 2 1 és 3 között; 3 erőteljes, kiterjedt fibrosis 5. Izomsejt-mag internalizáció a mytendinous junctio(mtj) vonalában: 0 normál (az MTJ a látótér középvonalában); 1 >6 izomsejt mag internalizáció egy látótérben; 2 10 21 izomsejt mag internalizáció egy látótérben; 3 20< izomsejt mag internalizáció egy látótérben 6. Sejtszám az MTJ vonalában: 0 normál >10 sejt egy látótérben; 1 10 20 sejt egy látótérben; 2 1 és 3 között; 3 50< sejt egy látótérben. 7. Haematomák az MTJ területén: 0 normál, nincs haematoma; 1 csak elszórt apró bevérzések; 2 1 és 3 között; 3 sok nagy kiterjedésű bevérzés. Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3. 219
A felnőtt állatokban a peri- és endomysialis fibrosis sokkal nagyobb arányban fordul elő, mint fiatalabb társaiknál. A nagyobb mértékű nyújtás következménye, nagyobb mennyiségű fibrotikus szövet. (Gl G2: p<0.001; G3 G4: p<0.01). A distalis és a proximalis régiók között nem volt különbség. Azokban az állatokban, amelyeken napi 1,6 mm-t (G2, G4) hosszabbítottunk szignifikánsan megemelkedett az izomsejtmag internalizáció az MTJ területén, mint a másik két csoportban (G1, G3) (Gl G2: p<0.001; G3 G4: p<0.001). A fiatal egyedek emelkedettebb izomsejtmag internalizációt mutattak a felnőtt csoportokhoz képest. A gyorsabb ütemű hosszabbítás hatására nagyobb mértékben emelkedett a sejtszám az MTJ területén, mint a kisebb mértékű nyújtás hatására (Gl G2: p<0.001; G3 G4: p<0.01). A proximalis és a distalis minták között nem találtunk különbséget. A felnőtt csoportokban lényegesen többször alakult ki haematoma az 1,6 mm/nap rátájú hosszabbításnál az MTJ területén, mint a 0,8mm/nap rátájú csoportban (G1 G2: p<0.01). A fiatal egyedeket kevésbé érintette ez a jelenség (G1: 0.188; G2: 1.85; G3: 0; G4: 0.1) (I. táblázat). KÖVETKEZTETÉSEK Miután áttekintettük az izomdegenerációt jellemző paramétereket (izomrost átmérő változékonyságot, izomsejtmag internalizációt, peri- és endomysialis fibrosist, valamint a haematomák előfordulási gyakoriságát az MTJ területén) kimondható, hogy a nagyobb mértékű hosszabbítás, nagyobb izomkárosodást okoz. A felnőtt G2 csoport flexor digitorum longus izma sokkal rosszabbul alkalmazkodott az elongációhoz, mint a fiatalabb, G 4-es csoportban. Mindezek mellett észrevehető egy tendencia, ami statisztikailag nem kimutatható hogy a hosszabbított izmok distalis részét jobban megviseli a hosszabbítás, mint a proximalis területét. A G2 csoportban a hosszabbítás során számos haematoma alakult ki. Ezek az MTJ területén gyakran kitöltik az izomrostok közötti réseket, mononuclearis infiltrátum látható bennük, ami kizárja azok arteficiális eredetét. A peri- és endomysialis fibrosis mennyisége a hosszabbítás mértékével és az életkorral emelkedik. Williams vizsgálatai során azt találta, hogy 1,6mm/napos nyújtás során lényegesen nagyobb az izmok kötőszövet és kollagén tartalma, mint 0,8mm/nap hosszabbítás után. Ez az elváltozás természetesen contracturák kialakulásához is vezethet (26). Mindezek alapján úgy tűnik, hogy a végtaghosszabbítás valamilyen szinten izomrost károsodáshoz vezet (5, 6). Fontos megemlíteni, hogy mindkét csoportban sejtszám növekedés volt látható az MTJ területén. Ez a reakció aktív, adaptív válasza lehet ennek a régiónak a nyújtásra. Tsujimura és munkatársai azt találták, hogy harántcsíkolt izmokban elhelyezkedő őssejtek, a sarcomerek meghatározott mértékű nyújtására aktiválódnak (3, 24, 25). Caiozzo szerint az izomrostnyújtás hasonlóan működik, mint egy kapcsoló. Ha eléri a megfelelő hosszúságot a sarcomer, akkor a satelit sejtek aktiválódnak (2). Az aktiválódott satelit sejtek osztódni kezdenek, majd fuzionálnak a már létező izomrostokkal és megkezdik az új izomrostok kialakítását (7, 19). Úgy tűnik, hogy az MTJ területén a legnagyobb mértékű a satelit sejtek aktivációja, ezért ez a régió igen jelentős izomrostképző képességgel rendelkezik. Gyakran nevezik ezt a régiót az izom regenerációs raktárának (2). A regenerációs jelek is sokkal gyakrabban fordultak elő a fiatal állatokban. Ennek az lehet az egyik magyarázata, hogy a fiatalabb állatokban átlagosan nagyobb számú aktiválható satelit sejt található, mint felnőtt példányokban (21). Lee (9) elemző pontrendszerét használva arra az eredményre jutottunk, hogy a fiatal állatok harántcsíkolt izmai jobban alkalmazkodnak a végtaghosszabbításhoz (1. ábra). Az elon- 220 Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3.
gált izmok distalis régiója súlyosabb degeneratív elváltozást mutat, mint a proximalis terület (2. ábra). Ez a károsodás indíthatja be a hosszabbított izmok regenerációs reakcióját. A necroticus szövet helyét később újonnan képződő izomrostok, kötő- és zsírszövet tölti ki. Ezen szövetek arányát erőteljesen befolyásolja a hosszabbítás napi mértéke, valamint a hosszabbításon átesett állatok életkora. 1. ábra A degeneratív paraméter összesített értékei. 2. ábra Izmok distalis és proximalis régiójának összesített degeneratív jelei. IRODALOM 1. Aronson J.: Temporal and spatial increases in blood flow during distraction osteogenesis. Clin. Orthop. Relat. Res. 1994. 301: 124 131. 2. Caiozzo V. J., Utkan A., Chou R., Khalafi A., Chandra H., Baker M., Rourke B., Adams G., Baldwin K., Green S.: Effects of distraction on muscle length: Mechanisms involved in sarcomerogenesis. Clin. Orthop. Relat. Res. 2002. 403S: 133-145. 3. Cooper R. N., Tajbakhsh S., Mouly V., Cossu G., Buckigham M., Butler-Browne G. S.: In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. J. Cell Sci. 1999. 112: 2895-2901. 4. Day C. S., Moreland M. S., Floyd S. S., Huard J. Jr.: Limb lengthening promotes muscle growth. J. Orthop. Res. 1997. 15: 227-234. 5. Dubowitz V.: Muscle biopsy. A practical approach. London, Bailliere Tindall Co. 1985. 6. Engel A. G., Banker B. Q.: Myology. New York, McGraw-Hill Book Company 1986. 7. Hawke T. J., Garry D. J.: Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 2001. 91: 534-551. 8. Jones D. A., Round J. M.: Skeletal muscle in health and disease. A text book of muscle physiology. Manchester. University Press. 1990. 9. Lee D. Y., Choi I. H., Chung C. Y., Chung P. H., Chi J. G., Suh Y. L.: Effect of tibial lengthening on the gastrocnemius muscle. A histopathologic and and morphometric study in rabbits. Acta. Orthop. Scand. 1993. 64: 688-692. 10. Leung K. S., Cheung W. H., Yeung H. Y., Lee K. M., Fung K. P.: Effect of weight bearing on bone formation during distraction osteogenesis. Clin. Orthop. Relat. Res. 2004. 419: 251-257. 11. Lindsey C. A., Makarov M. R., Shoemaker S., Birch J. G., Buschang P. H., Cherkashin A. M., Welch R. D., Samchukov M. L.: The effect of the amount of limb lengthening on skeletal muscle. Clin. Orthop. Relat. Res. 2002. 402: 278-287. 12. Marakov M. R., Kochutina L. N., Samchukov M. L., Birch J. G., Welch R. D.: Effect of rhythm and level of distraction on muscle structure. Clin. Orthop. Relat. Res. 2001. 384: 250-264. 13. Mastalgia F. L., Dawkins R. L., Papadimitrou J. M.: Morphological changes in skeletal muscle after transplantation: a light electron microscopic study of the initial phases of degeneration and regeneration. J. Neuro. Sci. 1975. 25: 227-247. Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3. 221
14. Matano T., Tamai K., Kurokawa T.: Adaptation of skeletal muscle in limb lengthening: a light diffraction study on the sarcomere length in situ. J. Orthop. Res. 1994. 12: 193-196. 15. Meffert R. H., Tis J. E., Inoue N., McCarthy E. F., Brug E., Chao E. Y. S.: Primary resective shortening followed by distraction osteogenesis for limb reconstruction: a comparison with simple lengthening. J. Orthop. Res. 2000. 18: 629-636. 16. Paley D.. Problems, obstacles and complications of limb lengthening. Clin Orthop. Relat. Res. 1990. 250: 81-104. 17. Saleh M., Hamer A. J.: Bifocal limb lengthening. A preliminary report. J. Pediatr. Orthop. 1993. 2: 42 48. 18. Sangkaew C.: Distraction osteogenesis for the treatment of post traumatic complications using a conventional external fixator. A novel technique. Injury, 2005. 36: 185-193. 19. Schultz E., McCormick K. M.: Skeletal muscle satellite cells. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1994. 123: 213-257. 20. Schumacher B., Keller J., Hvid I.: Distraction effects on muscle. Leg lengthening studied in rabbits. Acta Orthop. Scand. 1994. 65: 647-650. 21. Shisha T., Kiss S., Pap K., Simpson H., Szőke G.: Relative ability of young and adult muscles to respond to limb lengthening. J. Bone Joint Surg. 2007. 88: 1666-1669. 22. Simpson A. H., Williams P. E., Kyberd P., Goldspink G., Kenwright J.: The response of muscle to leg lengthening. J. Bone Joint Surg. 1995. 77-B: 630-636. 23. Tamai K., Kurokawa T., Matsubara I.: In situ observation of adjustment of sarcomere length in skeletal muscle under sustained stretch. J. Jpn. Orthop. Assoc. 1989. 63: 1558-1563. 24. Tatsumi R., Sheehan S. M., Iwasaki H., Hattori A., Allen R. E.: Mechanical stretch induces activation of skeletal muscle satellite cells in vitro. Exp. Cell Res. 2001. 267: 107-114. 25. Tsujimura T., Kinoshita M., Abe M.: Response of rabbit skeletal muscle to tibial lengthening. J. Orthop. Sci. 2006. 11: 185-190. 26. Williams P., Simpson H., Kyberd P., Kenwright J., Goldspink G.: Effect of rate of distraction on loss of range of joint movement, muscle stiffness, and intramuscular connective tissue content during surgical limb-lengthening: a study in the rabbit. Anat. Rec. 1999. 255: 78-83. Dr. Pap Károly Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinika 1113 Budapest, Karolina út 27. E-mail: drpapster@gmail.com Fax: 06 (1) 466-8747 222 Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet 2009. 52. 3.