AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKA KORSZERŰ MÓDSZEREI A BIOANALITIKAI LABORGYAKORLAT ELMÉLETI HÁTTERE Készítette az A3 csoport: Kiss Bálint Mezei Pál Dániel Szkiba Ivett Szűcs Rózsa Varga Dániel 2010/2011 TAVASZI FÉLÉV
ELISA Az immunanalitikai módszerek az antigén és antitest (ellenanyag) reakcióján alapulnak, amelyek másodlagos kötőerőkkel összekapcsolódva komplexet hoznak létre. SZENDVICS ELISA Az ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) egy immunanalitikai módszer, egyik fajtája, a szendvics immunoassay azon alapul, hogy az antigén (jelen esetben a fehérje) felületén több olyan régió van, amelyhez ellenanyag készíthető. Az első, antigénre specifikus ellenanyagot a mikrotiter lemez felületén előzőleg immobilizálták, ehhez adjuk hozzá a vizsgálandó antigént (minta). Fontos, hogy a felületen több antigén-kötőhely legyen, mint amennyi antigén a mintában van, így minden antigén megkötésére adott a lehetőség. Ahhoz, hogy az ellenanyag és az antigén között specifikus kötés alakuljon ki, meghatározott ideig inkubáljuk az elegyet, majd a rögzítetlen anyagokat vízzel kimossuk. Ezután a második, specifikus, enzimmel konjugált ellenanyag hozzáadása következik. Fontos, hogy ez is feleslegben legyen a minta antigéntartalmához képest, tehát minden antigénhez kötődjön egy ellenanyag. Így a vizsgálandó antigént egy szenvics -komplexbe zártuk, már csak annyi a teendőnk, hogy kromogén szubsztrát tartalmú oldatot adunk a rendszerhez, amely a második ellenanyaghoz kötődik színes termék képződése közben. Ennek intenzitását megfelelő hullámhosszon ELISA plate reader spektrofotométerrel mérjük, az abszorbanciákat kalibrációs görbe alapján koncentrációkra számíthatjuk át, így végezhetünk mennyiségi elemzést ezzel a módszerrel. Ebben az esetben a mért abszorbancia a vizsgálandó fehérje (minta, antigén) koncentrációjával egyenesen arányos.
INDIREKT KOMPETITÍV ELISA Az ELISA másik fajtája az indirekt kompetitív immuoassay, mely több megközelítés alapján történhet, itt a klasszikus módszer bővebb kifejtésére kerül sor. A mikrotiter lemez felületéhez antigének vannak immobilizálva, ehhez adják hozzá a mintát (szintén antigén) és a korlátozott számú (ismert mennyiségű) ellenanyagot. Ekkor a felületen immobilizált antigének és a minta antigénjei versengenek az ellenanyaghoz való kötődésben, ezért kompetitív a módszer. Miután megtörtént a kötődési reakció, mosás következik, tehát kimosnak mindent, ami nem volt immobilizálva (minta+ellenanyag), a felületen immobilizált antigénhez kötődött ellenanyaghoz pedig hozzáadnak egy második, erre specifikus, enzimmel konjugált ellenanyagot, melyhez enzim szubsztrátját adva színes termék keletkezik. Ennek intenzitása fotométerrel mérhető, a mért abszorbancia a vizsgálandó fehérje (minta, antigén) koncentrációjával fordítottan arányos, mivel minél több a mintában az antigén, annál több ellenanyagot köt meg, így annál kevesebb ellenanyag kötődik a felületen immobilizált antigénekhez (melyet mérnek).
KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS BEVEZETÉS - ELEKTROFORÉZIS Az elektroforézis olyan elválasztási technika, melynek alapja az ionok elektromos térbeli mozgékonysága. A pozitív töltésű ionok a negatív elektród, a negatív töltésűek pedig a pozitív elektród irányába vándorolnak. Az ionok vándorlási sebessége különböző, ezért lehetséges az elválasztásuk. A vándorlási sebességet az ion teljes töltése, mérete és formája befolyásolja. Az elektroforézishez szükséges: erősáramú tápegység, elektródák, puffer és egy közeg, ami a puffert tartalmazza. Ez a közeg lehet szűrőpapír, cellulóz-acetát csík, poli(akril-amid) gél, vagy kapilláris cső. KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS Az elektroforézist kis átmérőjű kapillárisban kivitelezve lehetővé válik nagy elektromos mező alkalmazása, mert a kis kapilláris hatásosan adja le a keletkező hőt. Az elektromos mező növelésével hatékonyabb elválasztás érhető el rövidebb idő alatt. A kapillárisok belső átmérője 50-100 mm, hosszuk 0,5-1 m. Az alkalmazott feszültség 10-30 kv. Az elektroozmotikus áramlás következtében minden komponens a negatív elektród felé vándorol, ezért a kis mennyiségű mintát (10 nl) a kapilláris pozitív végénél injektálják, és az elválasztott komponenseket a kapilláris negatív vége közelében detektálják. A kapilláris elektroforézis a folyadékkromatográfia és az elektroforézis viszonylag újszerű formája, melynek jellemzői: elektroforetikus elválasztás kapilláris csőben, nagy térerő alkalmazása (gyakran nagyobb, mint 500 V/cm), modern detektálási technika, mint az elektroferogram, mely gyakran hasonlít egy kromatogramra, hatékonysága eléri vagy meghaladja a kapilláris gázkromatográfiáét, az elválasztáshoz szükséges idő nagyon rövid, a mennyiségi analízis könnyen automatizálható, kis mennyiségű reagens szükséges, más analitikai elválasztási technikákkal összehasonlítva széleskörű elemzést tesz lehetővé.
ELEKTROOZMOTIKUS ÁRAMLÁS (EOF) A szilikát üveg kapilláris felülete negatív töltésű funkciós csoportokat tartalmaz, melyek vonzzák a pozitív töltésű ellenionokat. A pozitív töltésű ionok a negatív elektród felé vándorolnak, és magukkal viszik az oldószer molekulákat is. Ezt az oldószer mozgást nevezik elektroozmotikus áramlásnak. Az elválasztás során a töltéssel nem rendelkező molekulák az elektroozmotikus áramlással majdnem azonos sebességgel mozognak, ezért esetükben az elválasztás csak igen kismértékű. A pozitív töltésű ionok gyorsabban, a negatív töltésűek pedig lassabban mozognak. Lehetőség van több ioncsoport egyidejű elválasztására. KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS MÓDSZEREK OSZTÁLYOZÁSA A kapilláris elektroforézises módszereket osztályba sorolhatjuk az alapján, hogy töltetet tartalmaz-e a kapilláris, ill. aszerint, hogy milyen komponenseket tartalmaz a puffer stb. Alapvetően a következő módszereket különböztetjük meg: kapilláris zónaelektroforézis (CZE), kapilláris gélelektroforézis (CGE), micelláris elektrokinetikus kapilláris kromatográfia (MECC vagy MEKC), kapilláris elektrokromatográfia (CEC), kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF), MŰSZERES HÁTTÉR A CE-ben nagyfeszültséget alkalmazunk, de a feszültség növelésének határt szab a kapillárisban képződő hő. Ha a hő nem tud a kapilláris falán keresztül eltávozni, akkor a kapillárisban sugárirányú hőmérséklet gradiens alakul ki. Ennek hatására az elválasztott komponensek visszakeverednek. A gyakorlatban 10-30 kv feszültség alkalmazása általános, melynek hatására 5-50 ma áram mérhető. A CE RENDSZER FELÉPÍTÉSE A mintaadagolás úgy történik, hogy a Pt elektródot és a kvarc kapilláris végét egy mechanika a mintatartóba helyezi. A minta nyomáskülönbség (hidrodinamikus adagolás) vagy nagyfeszültségű impulzus hatására (elektrokinetikus adagolás) kerül a kapillárisba. Az automata mintaadagolóval (reprodukálhatóság) adagolt mintatérfogat 1-40 nl. A kapilláris anyaga az esetek többségében kvarcüveg. A kapilláris elektroforézisnél alkalmazott detektorok hasonlóak, mint a HPLC-ben alkalmazottak, beleértve az abszorbancián, fluoreszcencián, elektrokémián és tömegspektrometrián alapuló mérési módszereket is. UV detektáláshoz a kvarc kapillárisról eltávolítjuk a védő poliimid réteget és UV fénnyel átvilágítjuk. A kimutatási határt az optikai úthossz szabja meg, mely megegyezik a kapilláris átmérőjével. Az optikai úthossz növelésére a detektálásnál buborékot képezünk, vagy meghajlítjuk a kapillárist és tengelyirányból világítjuk meg. CE ALKALMAZÁSA A kapilláris elektroforézis alkalmazásának fő területe a nagy molekulatömegű ionos anyagok (fehérjék, polipeptidek, nukleinsavak) és az optikailag aktív komponensek meghatározása. Az enantiomer szelektivitás elérhető optikailag aktív anyag (pl. b-ciklodextrin származék) pufferhez való adagolásával. Újabb módszerek alkalmasak anionok gyors meghatározására. A CE megfelelő additívok alkalmazásával minden olyan területen alkalmazható, mint a HPLC. A CEben az oldószer felhasználás minimális, így előnyösebb környezetvédelmi szempontból.
LOC LAB-ON-A-CHIP MÉRÉSTECHNIKA A modern elválasztástechnika, illetve a jövő fejlesztési lehetősége ez a technika, melynek lényege, hogy egy soklépéses laboratóriumi vizsgálatot tudunk végezni egyetlen egy méréssel egy mikrochipet használva. A technika a kapilláris elektroforézisből lett kifejlesztve, az elemzés egy üveg vagy műanyag lapba maratott kapillárisokban történik. A kapillárisok hossza néhány cm, átmérőjük és mélységük pedig mikrométeres nagyságrendbe esik, hálózatukat számítógéppel tervezik meg. A miniatürizálás előnye, hogy kis minta illetve reagens mennyiséggel dolgozunk, illetve mivel több csatorna van egy lapon kialakítva, az elválasztást gyorsabbá teszi, a mérési idő lerövidül. DETEKTOR A fenti ábra mutatja a műanyag- vagy üveglapba maratott kapilláris elrendezéseket, illetve minta és reagens tartókat. Gél forrás az eluens, létra a kalibrációs sor. A kapilláris csatornákhoz elektródok csatlakoznak, melyek változó nagyságú és polaritású elektromos teret hozhatnak létre, a minta és a pufferoldat szabályozása ennek segítségével történik, az injektálás és az áramlás elektroozmotikus lesz. Az elválasztandó anyagot a szürkével jelzett, kör alakú kisebb mintatartókba mérjük mikropipetta segítségével, majd az elválasztáshoz ezeknek kis részleteit használjuk fel. A mintaútvonal cikcakkos, akárhonnan indul is a futtatás, mindig ugyanannyi utat tesz meg a vizsgálandó elegy. A bemérést mintaelőkészítés előzi meg. Erre először SDS (nátrium-dodecil-szulfát) használunk, mely a fehérjék egy részét beoldja - ezek összetételét határozzuk meg - de a polimer fehérjéket nem. A mintához DTT (ditio-treitol)-t is adunk, ami a szulfid hidakat redukálja. Belső standardként két ismert moláris tömegű fehérjét használunk, a ph-t pufferrel állítjuk be. A minta mellett kalibrációs standardot mérünk. Az elválasztás során a legkisebb moláris tömegű fehérje halad át a leggyorsabban a csatornán, a moláris tömeg meghatározása kalibrációs egyenes alapján történik, a mérési tartomány 4,5-230kDa. A lap közepén végighúzódó és a detektorban végződő csatornát szeparációs csatornának nevezzük. A szeparációs csatorna és a minta csatorna kereszteződésében történik az elválasztás és a detektálás. Az elválasztást, injektálást, detektálást a chip mind elvégzi, sőt működhet bioreaktorként és frakciószedőként is. Mivel vékonyfalú csatornákat (kapillárisok) használunk az elválasztás során, a vizsgált molekulák nagy része a fal közelében helyezkedik el, felületi jelenségek, kölcsönhatások lépnek fel, mely eredményeként dugószerű áramlásprofil valósul meg. Az áramlást létrehozhatjuk:
elektrokinetikusan (elektromos potenciál-gradiens alakul ki, ez okozza az áramlást) nyomással, melynek előnye hogy a nem töltött részek is szeparálhatóak, ám az áramlásprofil romlik, parabolikus lesz e kettő kombinációjával Az injektálás folyamata: különféle injektálási módok léteznek, de mindegyiknek a lényege, hogy valamilyen módon a mintát a szeparációs csatornába irányítjuk, ez rendszerint feszültséggel történik. A szeparációs csatorna és a mintacsatorna kereszteződésében történik a detektálás. Detektorként használhatunk pl. lézer indukált fluoreszcenciát: a szeparációs csatornán átvilágítva, a mintacsatornából az odakerülő mintát gerjesztve a minta fluoreszcens fényt bocsájt ki magából, melynek intenzitása detektorral mérhető. A mérés eredményeként elektroferogramot nyerünk Az x tengelyen a móltömeg, míg y-on detektorjel (intenzitás) látszik, ami a koncentrációnak megfeleltethető. Előnyei: gyors mérés, kis elemzési idő kis minta illetve reagens igény olcsó (a többi módszerhez képest, 5-6 millió Ft.) kapcsolható Hátrány: új módszer, validálni kell (kontrollmódszerekkel való összehasonlítás) a gél-elektroforézis akkor helyettesíthető ezzel a módszerrel, ha egyszerre nem túl sok fehérjét akarok vizsgálni Jól alkalmazható: gyors, rutinszerű méréseknél (pl. gyártásközi ellenőrzés), illetve más módszerekkel (SEC, RP-HPLC) kiegészítve.