ÖBLÍTÉSRE SZÁNT GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK cikkely változásai:

ÖBLÍTÉSRE SZÁNT GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK cikkely változásai: 704. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:1116 A Definíció rész 2. bekezdésének utolsó mondata helyesen: Az öblítésre szánt oldatokat rendszerint úgy állítják be, hogy a vérrel izotóniás készítményt nyerjenek. 705. oldal Az Előállítás rész a következő bekezdéssel bővült: A fejlesztés során igazolni kell, hogy a készítmény a névleges tartalomnak megfelelő mennyiségben kivehető a tartályból. A Vizsgálatok rész Kivehető tömeg vagy térfogat pontja törlésre került.

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-1 01/2007:20422 2.4.22. ZSÍRSAVÖSSZETÉTEL GÁZKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA Az idegen olajok vizsgálatát gázkromatográfiásan végezzük (2.2.28), és ehhez a vizsgálandó olajban található zsírsavakat metil-észterekké alakítjuk. A MÓDSZER E módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók, sem olyanokra, amelyek nagy arányban tartalmaznak nyolc szénatomnál rövidebb láncú zsírsavakat és olyanokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. Amennyiben a cikkely előírja, metilezés előtt megszárítjuk a vizsgálandó olajat. Ezután 1,0 g olajat visszafolyóhűtővel és gázbevezető csővel ellátott, 25 ml-es csiszolatos gömblombikba mérünk. 10 ml R vízmentes metanolt és R kálium-hidroxid R metanolos, 60 g/l töménységű oldatából 0,2 ml-t elegyítünk hozzá. Felszereljük a visszafolyóhűtőt, az elegyen mintegy 50 ml/perc sebességgel R nitrogént áramoltatunk, az oldatot összerázzuk, és forrásig melegítjük. Az oldat feltisztulásától számítva (ami kb. 10 percet vesz igénybe), a melegítést további 5 percig folytatjuk. Ezután az oldatot folyó vízzel lehűtjük, majd választótölcsérbe visszük. A lombikot 5 ml R heptánnal átmossuk és ezt a mosófolyadékot is a választótölcsérbe öntjük. A választótölcsérben lévő oldatot R nátrium-klorid 200 g/l töménységű oldatának 10 ml-ével erőteljesen összerázzuk. A fázisok elkülönülése után a szerves fázist R vízmentes nátrium-szulfátot tartalmazó edénykébe visszük át, és állás után megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). Ezen fejezetnek egyik az egyedi cikkely által előírt táblázata alapján 0,50 g kalibráló keveréket készítünk. (Amennyiben a cikkely nem ír elő speciális oldatot, a 2.4.22.-1. táblázat szerinti összetételt alkalmazzuk.) A keveréket R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot R heptánnal 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 0,50 g zsírsav-metilészter keveréket készítünk, melynek összetétele megfelel a vizsgálandó anyag cikkelyében feltüntetett zsírsav-

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-2 összetételnek. Az elegyet R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. A kereskedelemben kapható zsírsav-metilészter elegyek is felhasználhatók. Oszlop: anyaga: kvarcüveg, üveg vagy kvarc; méretei: l = 10 30 m, Ø = 0,2 0,8 mm; állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,1 0,5 μm) vagy egyéb, megfelelő állófázis. Vivőgáz: R gázkromatográfiás célra szánt hélium vagy R gázkromatográfiás célra szánt hidrogén. Áramlási sebesség: 1,3 ml/perc (ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm). Mintaáram-elosztási arány: 1:100 vagy kisebb, az adott oszlop belső átmérőjéhez igazodva; pl. ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm, akkor 1:50. Hőmérséklet: oszlop: izoterm körülmények között 160 200 C; ezen belül az oszlop hosszához és típusához kell igazodni; ha például az oszlop hossza 30 m, bevonata pedig R makrogol 20 000, akkor a hőmérséklet 200 C; ha lineáris hőmérséklet-programozásra van szükség, akkor a 30 m-es oszlop hőmérsékletét percenként 3 C-kal 170 C-ról 230 C-ra emeljük; injektor: 250 C; detektor: 250 C. Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. Érzékenység: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs magassága érje el a regisztráló teljes skálaszélességének 50 70 %-át. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-1. vagy a 2.4.22.-3. táblázat kalibráló elegyét használjuk:

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-3 csúcsfelbontás: legalább 1,8, a metil-oleát és a metil-sztearát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-mirisztát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján; elméleti tányérszám: legalább 30 000, a metil-sztearát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-2. táblázat kalibráló elegyét használjuk: csúcsfelbontás: legalább 4,0, a metil-kaprilát és a metil-dekanoát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-kaproát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján; elméleti tányérszám: legalább 15 000, a metil-dekanoát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. A KROMATOGRAMOK ÉRTÉKELÉSE A vizsgálati körülményeket úgy kell megválasztani, hogy ne keletkezhessenek elfedett csúcsok (egymástól kevéssé eltérő retenciós idejű összetevők, például linolénsav és arachinsav egyidejű jelenléte esetén). Kvalitatív értékelés. A csúcsokat a c) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk (akár izoterm vizsgálati körülményeket, akár lineáris hőmérsékleti programozást alkalmaztunk). Izoterm kromatografálás esetében a csúcsokat úgy is azonosíthatjuk, hogy az a) összehasonlító oldat kromatogramja, valamint a 2.4.22.-1., a 2.4.22.-2, ill. a 2.4.22.-3. táblázat adatatai alapján kalibrációs görbéket szerkesztünk. 2.4.22.-1. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.)

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-4 A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-laurát 5 R metil-mirisztát 5 R metil-palmitát 10 R metil-sztearát 20 R metil-arachinát 40 R metil-oleát 20 2.4.22.-2. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-kaproát 10 R metil-kaprilát 10 R metil-dekanoát 20 R metil-laurát 20 R metil-mirisztát 40 2.4.22.-3. táblázat Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok Összetétel (% m/m) R metil-mirisztát 5 R metil-palmitát 10 R metil-sztearát 15 R metil-arachinát 20 R metil-oleát 20 R metil-ejkozenoát 10

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-5 R metil-behenát 10 R metil-lignocerát 10 Az a) összehasonlító oldat kromatogramján lemérjük valamennyi csúcs redukált retenciós idejét (t R ). A redukált retenciós idő nem az injektálás időpontjától, hanem az oldószer-csúcstól mért retenciós idő. Felvesszük a kalibrációs görbét: log( t R ) = f (szénlánchossz-egyenérték) Telítetlen savak log t R értékei e görbének olyan pontjain helyezkednek el, amelyek nem egész számú szénlánchossz-egyenértéknek felelnek meg; a szénlánchosszegyenérték annak az elméleti telített szénláncnak a hossza, amelynek t R értéke megegyezne az azonosítandó zsírsavéval. Például, a linolsav t R értéke egy elméletileg 18,8 szénatomszámú, telített zsírsavéval egyezik meg. A vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő csúcsokat a kalibrációs görbe és a redukált retenciós idők felhasználásával azonosítjuk. A szénlánchosszegyenértékeket a 2.4.22-4. táblázat foglalja össze. 2.4.22.-4. táblázat. Szénlánchossz-egyenértékek. (Ezen értékek, melyeket kalibrációs görbe alapján kell kiszámolni, példaként szerepelnek, és R makrogol 20 000-rel bevont oszlopra vonatkoznak.) Zsírsav Kapronsav Kaprilsav Kaprinsav Laurinsav Mirisztinsav Palmitinsav Palmitoleinsav Margarinsav Sztearinsav Olajsav Linolsav Gamma-linolénsav Alfa-linolénsav Arachinsav Ejkozénsav Arachidonsav Behensav Erukasav 12-Oxosztearinsav Szénlánchossz-egyenérték 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 16,3 17,0 18,0 18,3 18,8 19,0 19,2 20,0 20,2 21,2 22,0 22,2 22,7

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-6 Ricinolsav 12-Hidroxisztearinsav Lignocerinsav Nervonsav 23,9 23,9 24,0 24,2 Kvantitatív értékelés. Általában a normalizációs eljárást alkalmazzuk, melynek során a kromatogramon megjelenő csúcsok területösszegét az oldószercsúcsok területét figyelmen kívül hagyva 100%-nak tekintjük. Egy-egy összetevő mennyiségét úgy számítjuk ki, hogy meghatározzuk az illető csúcs területének a csúcsok területösszegéhez viszonyított százalékos arányát. Azokat a csúcsokat, amelyeknek területe kisebb, mint a csúcsok területösszegének 0,05%-a, nem vesszük figyelembe. Az egyedi cikkely esetenként, például tizenkét szénatomos vagy ennél rövidebb láncú zsírsavak jelenléte esetén, átszámítási faktorokat ad meg a csúcsterületek átszámításához m/m százalékra. B MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók és olyan olajokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,100 g-ját csavaros kupakkal ellátott, 10 ml-es centrifugacsőbe mérjük, 1 ml R heptán és 1 ml R dimetil-karbonát segítségével oldjuk és enyhe melegítés (50 60 C) közben erőteljesen keverjük. Ezután hozzáadjuk R nátrium R vízmentes metanolos, a szükséges óvintézkedések figyelembevételével készített, még meleg, 12 g/l-es oldatának 1 ml-ét. Az elegyet kb. 5 percig erőteljesen keverjük. Ezután 3 ml R desztillált vizet adunk hozzá, és kb. 30 másodperces, erőteljesen keverés után 1500 g-vel 15 percig centrifugáljuk. A szerves fázisból 1 μl-t injektálunk. Összehasonlító oldatok és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az A módszerben előírtak szerint járunk el. Oszlop: anyaga: kvarcüveg; méretei: l = 0,30 m, Ø = 0,25 mm;

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-7 állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,25 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc. Mintaáram-elosztási arány: 1:100. Hőmérséklet: Idő (perc) Hőmérséklet ( C) Oszlop Injektor Detektor Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. 0 15 15 36 36 61 100 100 225 225 250 250 C MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, aldehid-, keton-, ciklopropil- és ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei, továbbá konjugált, többszörösen telítetlen és acetilén-kötést tartalmazó vegyületek találhatók, mivel ezen csoportok részben vagy teljesen elbomlanak. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,10 g-ját 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban R nátrium-hidroxid R metanollal készült, 20 g/l töménységű oldatának 2 ml-ében oldjuk, és az oldatot visszafolyóhűtő alkalmazásával 30 percig forraljuk. Ezután a hűtőn keresztül 2,0 ml R metanolos bór-trifluorid oldatot juttatunk hozzá, és 30 percig forraljuk, majd ismét a hűtőn keresztül 4 ml R heptánt juttatunk hozzá, és 5 percig forraljuk. Lehűtés után 10,0 ml R telített nátrium-klorid oldattal kb. 15 másodpercig rázzuk, majd még annyi R telített nátrium-klorid oldatot adunk hozzá, hogy a felső fázis a lombik nyakába kerüljön. A felső fázis 2 ml-ét kivesszük, 3 2 ml R vízzel mossuk, és R vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk.

2.4.22 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.5.6-8 Összehasonlító oldatok, kromatográfiás vizsgálat és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az A módszerben előírtak szerint járunk el.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 1 01/2007:20612 2.6.12. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: ÖSSZES ÉLETKÉPES AEROB MIKROORGANIZMUSSZÁM Ez az általános fejezet két vizsgálatcsoportot foglal magában. Az 1. csoport a cikkelyeknek való megfelelés megállapítására szolgáló referenciamódszereket tartalmaz. Ezért amennyiben egy cikkely jelen fejezetre hivatkozik, úgy a hivatkozás az 1. csoport követelményeinek való megfelelésre vonatkozik, hacsak a 2. csoport vizsgálatait nem engedélyezték. A 2. csoportban közölt vizsgálatok szintén az Európai Gyógyszerkönyv részét képezik, tehát ilyen értelemben lehet rájuk hivatkozni, különösen forgalomba hozatali engedéllyel kapcsolatos eljárás esetén. A tervek szerint az érintett cikkelyek felülvizsgálata során az 1. csoport vizsgálatai helyébe a 2. csoport vizsgálatai lépnek. A 2. csoport vizsgálati módszereit a Japán Gyógyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben fejlesztették ki, a követelményrendszer harmonizálása céljából. A.. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Az itt ismertetett vizsgálatok aerob körülmények között szaporodó mezofil baktériumok, valamint gombák számának meghatározására szolgálnak. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy adott a Gyógyszerkönyvben hivatalos termékrõl megállapítható legyen, megfelel-e azoknak a mikrobiológiai követelményeknek, amelyeket a vonatkozó cikkely előír. Amennyiben vizsgálatainkkal ezt kívánjuk megállapítani, az alábbi útmutatások szerint járunk el, beleértve a mintavételek számát és az eredmények értékelését is. Ugyanezeket a vizsgálatokat alkalmazhatjuk A mikrobiológiai tartósítás hatékonyságának vizsgálatára (5.1.3), továbbá a kiindulási anyagok minőségellenőrzésére, valamint a mikrobiológiai tisztaságra megadott irányelvekkel összefüggésben is (5.1.4). Amennyiben a vizsgálat ilyen célokat szolgál, pl. a gyártó ellenőrizni kívánja a kiindulási anyagokat és/vagy a késztermékeket, vagy eljárásvalidálást végez, a vizsgálatok menete beleértve a vizsgálandó minták számát, valamint az eredmények értékelését a gyártó és az illetékes hatóságok közötti megegyezés tárgyát képezi. A meghatározást olyan körülmények között végezzük, hogy a vizsgálandó termék véletlen szennyeződését kizárjuk. A szennyeződés elkerülésére tett

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 2 elővigyázatossági intézkedések csak olyanok lehetnek, amelyek nem hatnak a kimutatandó mikroorganizmusokra. Amennyiben a vizsgálandó termék antimikrobás hatással rendelkezik, azt megfelelő módon semlegesíteni kell. Ha erre a célra inaktiváló szereket használunk, ezek hatékonyságát és azt, hogy a mikroorganizmusokkal szemben nem toxikusak, bizonyítani kell. Az összes életképes aerob mikroorganizmusszámot membránszűréssel vagy lemezen számlálással határozzuk meg, aszerint, hogy a vonatkozó cikkely melyik módszert írja elő. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN = Most Probable Number) módszert csak olyan esetekben alkalmazzuk, amikor más módszer nem használható. A módszer megválasztásakor pl. a termék sajátosságait és a várható mikroorganizmusszámot vehetjük alapul. A választott módszert megfelelően validálni kell. Amennyiben a vizsgálatot az 5.1.3. vagy az 5.1.4. fejezetben előírtakhoz kapcsolódva végezzük, akkor a lemezöntés, a felületi szélesztés és a membránszűrés módszereit alkalmazhatjuk. A MINTA ELÕKÉSZÍTÉSE Mintavételi terv. A mintavételt pontosan meghatározott terv szerint kell végezni. A mintavételi tervet olyan tényezők figyelembevételével kell kialakítani, mint pl. a gyártási tétel nagysága vagy az elfogadhatatlan mértékben szennyezett termékek felhasználásával járó egészségügyi kockázat, továbbá a termék sajátosságai, valamint a szennyezettség várható mértéke. Ha más előírás nincs, a fentiekben említett elővigyázatossági szempontokat figyelembevéve 10 g-os vagy 10 ml-es mintá(ka)t veszünk a vizsgálandó anyagból vagy készítményből. A mintá(ka)t véletlenszerűen választjuk az ömlesztett anyagból vagy a készítmény tartályaiból. Amennyiben szükséges a vizsgálandó anyag vagy termék sajátosságaitól függően a mintákhoz előírt anyagmennyiség biztosításához több tartály tartalmát kell homogenizálni. Mikrobiológiailag inhomogén termékek esetében például a háromfokozatú mintavételi terv alkalmazható. Ebben az esetben minden gyártási tételből öt mintát veszünk, és ezeket külön-külön vizsgáljuk. A három fokozat a következõ: (i.) elfogadható minták; ezekben a telepképző egységek száma (CFU = Colony Forming Units) grammonként, illetve milliliterenként kisebb, mint m, ahol m a megfelelő cikkelyben megadott határérték,

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 3 (ii.) az elfogadhatóság határán lévő minták; ezekben a telepképző egységek száma grammonként, illetve milliliterenként nagyobb, mint m, de kisebb, mint 10m, (iii.) nem elfogadható minták; ezekben a telepképző egységek száma grammonként, illetve milliliterenként nagyobb, mint 10m. Vízben oldódó termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) nátriumklorid pepton tompítóoldatban (ph 7,0) vagy más alkalmas folyadékban oldjuk, illetve hígítjuk. Általában tízszeres hígítást készítünk, de ha a termék sajátosságai vagy az érzékenységre vonatkozó követelmények szükségessé teszik, más hígítási arányokat is alkalmazhatunk. Ha olyan terméket vizsgálunk, amelynek antimikrobás hatása ismert, inaktiváló szert adhatunk a hígító folyadékhoz. Ha szükséges, az oldat ph-értékét kb. 7-re állítjuk és a hígító folyadékkal további tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Vízben nem oldódó, nem zsírnemű termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) nátrium-klorid pepton tompítóoldatban (ph 7,0) vagy más alkalmas folyadékban szuszpendáljuk. Általában tízszeres hígítást készítünk, de a termék sajátosságaitól függően nagyobb hígításra is szükség lehet. Rosszul nedvesedő anyagok szuszpendálását megfelelő felületaktív anyag pl. literenként 1 g poliszorbát 80 hozzáadásával segíthetjük elő. Ha olyan terméket vizsgálunk, amely antimikrobás hatású, inaktiváló szert adhatunk a hígító folyadékhoz. Ha szükséges, az oldat ph-értékét kb. 7-re állítjuk és ugyanazon hígító folyadékkal további tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Zsírnemű termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) legfeljebb fele mennyiségű, steril poliszorbát 80-nal vagy más megfelelő steril felületaktív anyaggal szükség esetén legfeljebb 40 C-ra, illetve kivételes esetekben maximum 45 C-ra melegítve homogenizáljuk. A homogenizálást óvatos keveréssel végezzük és ha szükséges, a kívánt hőmérsékletet vízfürdőben vagy termosztátban biztosítjuk. Ezután annyi előmelegített nátrium-klorid pepton tompítóoldatot (ph 7,0) adunk a keverékhez, amennyi az eredeti termékre vonatkoztatott tízszeres hígításhoz szükséges. A keverést változatlan hőmérsékleten az emulzióképződéshez szükséges legrövidebb ideig, de legfeljebb 30 percig óvatosan folytatjuk. Megfelelő mennyiségű, steril poliszorbát 80-at vagy más steril felületaktív anyagot tartalmazó nátrium-klorid pepton tompítóoldattal (ph 7,0) további tízszeres hígításokból álló sorozatot készíthetünk. Transzdermális tapaszok. Tíz tapaszról steril csipesz segítségével eltávolítjuk a védőréteget, majd öntapadó oldalukkal felfelé, steril üveg- vagy műanyaglapokra

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 4 helyezzük. Az öntapadó felületet, ha szükséges, steril gézzel (vagy szövött-szűrő típusú, egyszálas műanyaghálóval) befedjük, és a tíz tapaszt legalább 500 ml, megfelelő inaktivátorokat, pl. poliszorbát 80-at és/vagy lecitint tartalmazó nátriumklorid pepton tompítóoldatba (ph 7,0) helyezzük. Az oldatot a tapaszokkal legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk ( A kivonat). További tíz, ugyanilyen módon elõkészített tapaszt legalább 500 ml D folyékony táptalajba helyezünk és a táptalajt a tapaszokkal legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk ( B kivonat). A MINTA VIZSGÁLATA Membránszűrés. Olyan membránszűrőket használunk, amelyeknek névleges pórusmérete legfeljebb 0,45 μm és baktérium-visszatartó képességük bizonyított. A szűrő anyagát úgy választjuk meg, hogy baktérium-visszatartó képességét a vizsgálandó minta összetevői ne befolyásolják. Például vizes, olajos és híg alkoholos oldatokhoz cellulóz-nitrát szűrőket, tömény alkoholos oldatokhoz cellulóz-acetát szűrőket használhatunk. A szűrőberendezés kialakítása olyan legyen, hogy a szűrőt áthelyezhessük a táptalajba. A minta előkészítése c. részben előírtak szerint előkészített mintából mindkét membránszűrőre megfelelő mennyiséget viszünk fel (1 1 g terméknek megfelelõ mennyiség javasolt, vagy ha nagy telepszám várható, akkor ennél kevesebb) és haladéktalanul megszűrjük. A szűrőket alkalmas folyadék, pl. nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) kb. 100 ml-es részleteivel háromszor átmossuk. Ehhez a folyadékhoz felületaktív anyagokat, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk. Háromnál kevesebb mosás is megengedett akkor, ha ezt validálással alátámasztjuk. Azt a membránszűrőt, amelyet elsősorban baktériumok számlálására szánunk, megfelelő agar-táptalaj (pl. B táptalaj) felületére, azt pedig, amelyet elsősorban gombák számlálására szánunk, ennek megfelelő agar-táptalaj (pl. C táptalaj) felületére helyezzük. A B agar-táptalaj lemezt 30 35 C-on, a C agar- táptalaj lemezt 20 25 C-on inkubáljuk 5 napon át, hacsak ennél rövidebb időn belül nem kapunk megbízható mikroorganizmusszámot. Ezután kiválogatjuk azokat a lemezeket, amelyeken a legnagyobb, de 100-nál kisebb a telepszám, és kiszámoljuk a termék 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkoztatott telepképző egységek számát. Transzdermális tapaszok vizsgálatához két steril membránszűrőn külön-külön leszűrünk 50 ml A kivonatot. Az egyik membránt az összes aerob baktérium szám meghatározására B, a másik membránt a gombák számlálására C agartáptalajra helyezzük.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 5 A lemezen számlálás módszerei a. Lemezöntéses módszer. A minta előkészítése c. részben leírtak szerint előkészített mintából 1 1 ml-t 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe mérünk és mindegyikhez 15 20 ml baktériumtenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. B táptalajt) vagy 15 20 ml gombatenyésztésre alkalmas felolvasztott agartáptalajt (pl. C táptalajt) öntünk; a táptalajok hőmérséklete legfeljebb 45 C lehet. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalaj mennyiségét ezzel arányosan növeljük. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. A lemezeket 30 35 C-on (gombák esetében 20 25 C-on) inkubáljuk 5 napon át, hacsak ennél rövidebb időn belül nem kapunk megbízható mikroorganizmusszámot. Ezután kiválasztjuk az azon hígításhoz tartozó lemezeket, amelyeken a telepszám a legnagyobb, de még nem éri el a 300-at (gombák esetében a 100-at). A telepszámok számtani átlagából kiszámoljuk a készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkoztatott telepképző egységek számát. b. Felületi szélesztéses módszer. 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe 15 20 ml baktériumtenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. B táptalajt) vagy 15 20 ml gombatenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. C táptalajt) öntünk, majd a táptalajokat hagyjuk megszilárdulni. A felolvasztott táptalajok hőmérséklete kb. 45 C legyen. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agartáptalaj térfogatát ezzel arányosan növeljük. A lemezeket pl. lamináris áramlást biztosító fülkében vagy inkubátorban megszárítjuk. A minta előkészítése c. részben leírtak szerint előkészített minta mért legalább 0,1 ml térfogatát szélesztjük a táptalaj felületén. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. Az inkubálást és a telepképző egységek számának meghatározását a lemezöntéses módszernél leírt módon végezzük. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszere A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer torzításmentessége és pontossága kisebb, mint a membránszűréses vagy a lemezen számlálásos módszeré. Az eredmények, különösen penészgombákra, nem eléggé megbízhatóak. Ezért az MPN-módszert csak baktériumszámlálásra alkalmazzuk, olyan esetekben, amikor más módszer nem alkalmazható. Ha a módszer használata indokolt, az alábbiak szerint járunk el. 2.6.12.-1. táblázat A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (Most-probablenumber MPN) Minden hígításhoz 3 kémcső

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 6 Pozitív kémcsövek száma Besorolás * 95%-os MPN/g konfidenciahatárok 0,1 g 0,01 g 0,001 g 1 2 0 0 0 <3 0 1 0 3 x <1 17 1 0 0 3 x 1 21 1 0 1 7 x 2 27 1 1 0 7 x 2 28 1 2 0 11 x 4 35 2 0 0 9 x 2 38 2 0 1 14 x 5 48 2 1 0 15 x 5 50 2 1 1 20 x 8 61 2 2 0 21 x 8 63 3 0 0 23 x 7 129 3 0 1 38 x 10 180 3 1 0 43 x 20 210 3 1 1 75 x 20 280 3 2 0 93 x 30 390 3 2 1 150 x 50 510 3 2 2 210 x 80 640 3 3 0 240 x 100 1400 3 3 1 460 x 200 2400 3 3 2 1100 x 300 4800 3 3 3 >1100 * 1. kategória: normálisnak tekinthető (elfogadható)eredmények; az esetek 95%-ában fordulnak elő 2. kategória: kevésbé valószínű (kevésbé elfogadható) eredmények; mindössze az esetk 4%-ában fordulnak elő. Fontos döntéseknél nem használhatók! A 2. kategóriánál kevésbé valószínű eredmények a táblázatban nem szerepelnek és soha nem tekinthetők elfogadhatónak. A termékből A minta előkészítése c. részben előírtak szerint legalább háromtagú, egymást követő tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Mindegyik hígítási fokozatból három 1 g-os (vagy 1 ml-es) részlettel beoltunk három kémcsövet,

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 7 amelyek 9 10 ml-t tartalmaznak a megfelelő folyékony táptalajból (pl. A folyékony táptalajból). Szükség esetén felületaktív anyagot, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk a táptalajhoz. Tehát, ha három hígítási fokozatból álló sorozatot állítottunk elő, akkor kilenc kémcsövet oltunk be. A kémcsöveket 5 napon át 30 35 C-on inkubáljuk. Feljegyezzük, hogy hígítási fokozatonként hány kémcsőben észlelhető mikroorganizmus-növekedés. Amennyiben az eredmények a vizsgálandó termék sajátosságai miatt nehezen vagy bizonytalanul értékelhetők, ugyanazon táptalajba vagy megfelelő agartáptalajra (pl. B agar-táptalajra) átoltásokat végzünk. Az ennek során beoltott táptalajokat 18 24 órán át, az előbbivel azonos hőmérsékleten inkubáljuk. Az így nyert eredményeket vesszük figyelembe. A vizsgálandó készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkozó legvalószínűbb baktériumszámot a 2.6.12.-1. táblázat alapján határozzuk meg. A TÁPTALAJOK HATÉKONYSÁGA ÉS A MIKROORGANIZMUSSZÁMLÁLÁS MÓDSZEREINEK ÉRVÉNYESSÉGE A baktérium-referenciatörzseket külön-külön, megfelelő folyékony táptalajt (pl. A folyékony táptalajt) tartalmazó tartályokban, 18 24 órán át, 30 35 C-on inkubáljuk. A gomba-referenciatörzseket szintén külön-külön, megfelelõ agartáptalajban (pl. antibiotikumokat nem tartalmazó C táptalajban) 20 25 C-on inkubáljuk, Candida albicans esetében 48 órán át, Aspergillus niger esetében pedig 7 napon át. Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83) Escherichia coli pl. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126) Bacillus subtilis pl. ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62) Candida albicans pl. ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72) Aspergillus niger pl. ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83) Nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) felhasználásával milliliterenként kb. 100 telepképző egységet (CFU) tartalmazó referenciaszuszpenziókat készítünk. A számlálási módszerek ellenőrzéséhez minden mikroorganizmus referenciaszuszpenzióját külön-külön használjuk, a vizsgálandó termék jelenlétében és távollétében is. Ha a membránszűréses vagy a lemezen számlálásos módszert ellenőrizzük, a referencia-mikroorganizmus számlálásának eredménye és az inokulumból számított érték bármelyik mikroorganizmusról is legyen szó legfeljebb ötös faktorral térhet el egymástól. Ha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszerét ellenőrizzük, az inokulumból számított értéknek az eredmények 95%-os konfidencia-határain belül kell lennie. Ha a táptalaj és a hígító

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 8 folyadék sterilitását, valamint az eljárás aszeptikus kivitelezését ellenőrizzük, vizsgálandó készítményként steril nátrium-klorid pepton tompítóoldatot (ph 7,0) alkalmazunk; ez esetben mikroorganizmus-növekedés nem mutatkozhat. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE Baktériumszámnak nevezzük a B agar-táptalajon talált telepképző egységek átlagos számát. Gombaszámnak nevezzük a C agar-táptalajon megjelenő telepképző egységek átlagos számát. Az összes életképes mikroorganizmus szám az így definiált baktériumszám és gombaszám összege. Ha kiderül, hogy a két táptalajon elszaporodott mikroorganizmusok típusa azonos, ezt figyelembe vehetjük. Ha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszerét alkalmazzuk, a számított érték a baktériumszám lesz. Ha a vonatkozó cikkely határértéket ír elő, azt a következőképpen kell értelmezni: 10 2 mikroorganizmus: az elfogadhatóság felső határa: 5 10 2, 10 3 mikroorganizmus: az elfogadhatóság felső határa: 5 10 3, és így tovább. Ha például háromfokozatú mintavételi tervet alkalmazunk, a következőképpen járunk el: Mind az öt mintára külön-külön kiszámoljuk az összes életképes mikroorganizmus számot. Az anyag vagy készítmény a következõ feltételek teljesülése esetén megfelel a vizsgálatnak: (i.) az összes életképes aerob mikroorganizmus szám egyik mintában sem haladja meg az előírt határérték tízszeresét (azaz nem lehetnek köztük nem elfogadható minták ), és (ii.) az összes életképes aerob mikroorganizmus szám legfeljebb két mintában esik az előírt határérték és annak tízszerese közé (azaz legfeljebb két, elfogadhatóság határán lévõ minta fordulhat elő köztük). Az ajánlott oldatok és táptalajok leírását a 2.6.13. általános fejezet tartalmazza. B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER: NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: A MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁT MEGHATÁROZÓ VIZSGÁLATOK

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 9 1. BEVEZETÉS Az itt ismertetett vizsgálatok aerob körülmények között szaporodó mezofil baktériumok és gombák számának meghatározására szolgálnak. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy egy adott anyagról vagy termékről megállapítható legyen: megfelel-e a mikrobiológiai minőségre megállapított követelménynek. Amennyiben a vizsgálatokat ebből a célból végezzük, az alábbi útmutatások szerint járjunk el, figyelembe véve a minták számát is, és az eredményeket a következők szerint értlemezzük. A módszerek nem alkalmazhatók életképes mikroorganizmusokat hatóanyagként tartalmazó termékekre. Más mikrobiológiai eljárások, beleértve az automatizált módszereket, is használhatók, amennyiben igazolták, hogy egyenértékűek a Gyógyszerkönyvben leírt módszerrel. 2. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK A meghatározás körülményeit úgy kell kialakítani, hogy a vizsgálandó termék külső eredetű mikrobiológiai szennyeződését elkerüljük. Az óvintézkedések megtételekor ugyanakkor ügyelni kell arra, hogy azok a vizsgálat során kimutatandó mikroorganizmusokra ne legyenek kihatással. A termék esetleges antimikrobás hatását adott esetben amennyire lehetséges meg kell szüntetni vagy semlegesíteni kell. Ha erre a célra inaktiválószereket használunk, igazolni kell azok hatékonyságát, továbbá azt, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak. Amennyiben a mintaelőkészítés során felületaktív anyagokat használunk, igazolni kell, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak, továbbá hogy az inaktiválószerekkel nem összeférhetetlenek. 3. A MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁT MEGHATÁROZÓ MÓDSZEREK Az előírás alapján a membránszűrés vagy a lemezen számlálás módszerét használjuk. Noha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer a legkevésbé pontos

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 10 a mikroorganizmusok számának megállapítására, egyes csekély mikrobiológiai szennyezettségű termékcsoportok esetében a legalkalmasabb módszer lehet. A módszer kiválasztása például olyan tényezőktől függ, mint a termék sajátosságai és a mikroorganizmusszámra előírt határérték. A kiválasztott módszernek olyannak kell lennie, amely lehetővé teszi megfelelő nagyságú minta vizsgálatát az előírt követelményeknek való megfelelés megállapításához. A választott módszer alkalmasságát bizonyítani kell. 4. A MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉS ELŐSEGÍTÉSÉNEK VIZSGÁLATA ÉS A SZÁMLÁLÓMÓDSZER ALKALMASSÁGA 4-1. ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK Meg kell állapítani, hogy a vizsgálat alkalmas-e mikroorganizmusok kimutatására a vizsgálandó termék jelenlétében. A módszer alkalmasságát újból igazolni kell, ha a módszerben vagy a termékben olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. 4-2. REFERENCIATÖRZSEK KÉSZÍTÉSE A referenciatörzsek stabilizált szuszpenzióit használjuk, illetve az alábbiak szerint referenciatörzseket készítünk. Oltócsíra-tenyészetet fenntartó módszereket (oltócsírarendszerek) alkalmazunk, oly módon, hogy a beoltáshoz használt életképes mikroorganizmusok az oltócsíra-törzstételhez képest legfeljebb 5 átoltásból származzanak. Az egyes baktérium- és gomba-referenciatörzseket külön-külön, a 2.6.12.-2. táblázatban leírtak szerint tenyésztjük. A referencia szuszpenziók készítéséhez nátrium-klorid pepton tompítóoldatot (ph 7,0) vagy foszfát tompítóoldatot (ph 7,2) használunk. Az A. niger spórák szuszpendálásakor a tompítóoldathoz 0,05% poliszorbát 80 adható. A szuszpenziókat 2 órán belül, illetve ha 2 8 C-on tároltuk 24 órán belül felhasználjuk. A vizsgálat során beoltásra az A. niger vagy B. subtilis vegetatív sejtjeiből készített és hígított friss szuszpenzió alternatívájaként megfelelő térfogatú stabil spóraszuszpenzió is használható. A stabil szuszpenzió 2 8 C-on megfelelően igazolt időtartamig eltartható.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 11 2.6.12.-2. táblázat A referencia-mikroorganizmusok előkészítése és használata Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP 4.83 NBRC 13276 A referencia-törzs készítése Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 30 35 C 18 24 óra Mikroorganizmus-növekedés elősegítése Teljes aerob mikroorganizmussz ám Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Teljes élesztő- és penészgombaszám A számlálómódszer alkalmassága a termék jelenlétében Teljes aerob Teljes élesztő- és mikroorganizmussz penészgombaszám ám Mikroorganizmus Szója-kazeinagar/MPN szójakazein foly. táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC 13275 Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 30 35 C 18 24 óra Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Szója-kazeinagar/MPN szójakazein foly. táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Bacillus subtilis pl. ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134 Szója-kazein-agar vagyszója-kazein folyékony táptalaj 30 35 C 18 24 óra Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Szója-kazeinagar/MPN szójakazein foly. táptalaj 100 CFU 30 35 C 3 nap Candida albicans pl. ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594 Sabouraud-glükóz-agar vagysabouraud-glükóz folyékony táptalaj 20 25 C 2 3 nap Szója-kazein-agar táptalaj 100 CFU 30 35 C 5 nap Szója-kazein-agar táptalaj 100 CFU 30 35 C 5 nap MPN: nem alkalmas Sabouraud-glükózagar 100 CFU 20 25 C 5 nap Sabouraud-glükózagar 100 CFU 20 25 C 5 nap Aspergillus niger pl. ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455 Sabouraud-glükóz-agar vagyburgonya-glükóz-agar 20 25 C 5 7 nap vagy megfelelő spóraképződésig Szója-kazein-agar táptalaj 100 CFU 30 35 C 5 nap Szója-kazein-agar táptalaj 100 CFU 30 35 C 5 nap MPN: nem alkalmas Sabouraud-glükózagar 100 CFU 20 25 C 5 nap Sabouraud-glükózagar 100 CFU 20 25 C 5 nap

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 12 4-3. NEGATÍV KONTROLL A vizsgálati körülmények ellenőrzésére negatív kontroll vizsgálatot végzünk, melynek során a vizsgálandó készítmény helyett a választott hígítófolyadékot alkalmazzuk. Ebben mikroorganizmus-növekedés nem következhet be. 4-4. A TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ HATÁSA A kész táptalajok, valamint a szárított táptalajból vagy az összetevőiből készített táptalajok minden gyártási tételét vizsgáljuk. Szója-kazein folyékony táptalaj vagy szója-kazein-agar táptalaj adagokat/lemezeket a 2.6.12-2. táblázatban feltüntett mikroorganizmusok kis mennyiségével (legfeljebb 100 CFU) beoltunk. Minden mikroorganizmus esetében külön táptalajrészletet (adagot/lemezt) használunk. Sabouraud-glükóz-agar táptalaj-lemezeket a 2.6.12-2. táblázatban feltüntett mikroorganizmusok kis mennyiségével (legfeljebb 100 CFU) beoltunk. Minden mikroorganizmus esetében külön táptalaj-lemezt használunk. Az inkubálást a 2.6.12.-2. táblázatban megadott körülmények között végezzük. Szilárd táptalajok esetén a növekedés nem térhet el a kétszeresnél nagyobb mértékben a standardizált inokulumra számított értéktől. Frissen készített inokulum esetén a mikroorganizmus-szaporodás hasonló mértékű a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételével. Folyékony táptalaj akkor alkalmazható, ha a mikroorganizmus-növekedés hasonló mértékű a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételével. 4-5. A MIKROORGANIZMUSSZÁMLÁLÁS MÓDSZERÉNEK MEGFELELŐSÉGE A TERMÉK JELENLÉTÉBEN 4-5-1. Mintaelőkészítés. A minta előkészítésének módszere a vizsgálandó termék fizikai sajátságaitól függ. Amennyiben az alábbi eljárások egyike sem bizonyul megfelelőnek, úgy más eljárást kell kifejleszteni. Vízben oldódó termékek. A vizsgálandó terméket nátrium-klorid pepton tompítóoldatban (ph 7,0), foszfát tompítóoldatban (ph 7,2) vagy szója-kazein folyékony táptalajban oldjuk vagy hígítjuk (általában tízszeres hígítást készítünk). Szükség esetén a ph-t 6 8 értékre állítjuk be. Szükség esetén ugyanazon hígítószerrel további hígításokat készítünk.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 13 Vízben nem oldódó, nem zsírnemű termékek. A vizsgálandó terméket (általában tízszeres hígítást készítünk) nátrium-klorid pepton tompítóoldatban (ph 7,0), foszfát tompítóoldatban (ph 7,2) vagy szója-kazein folyékony táptalajban szuszpendáljuk. Rosszul nedvesedő anyagok szuszpendálását megfelelő felületaktív anyag pl. literenként 1 g poliszorbát 80 hozzáadásával segíthetjük elő. Szükség esetén a ph-t 6 8 értékre állítjuk be. Szükség esetén ugyanazon hígítószerrel további hígításokat készítünk. Zsírnemű termékek. A vizsgálandó terméket szűréssel sterilezett izopropilmirisztátban oldjuk, vagy steril poliszorbát 80 vagy más megfelelő steril felületaktív anyag legkisebb szükséges mennyiségével elegyítjük. Az elegyet szükség esetén legfeljebb 40 C-ra, illetve kivételes esetekben maximum 45 C-ra melegítve homogenizáljuk. A homogenizálást óvatos keveréssel végezzük, és ha szükséges, a kívánt hőmérsékletet vízfürdő alkalmazásával tartjuk fenn. Ezután az előmelegített hígítószerből annyit adunk a keverékhez, hogy az eredeti termékre vonatkoztatva tízszeres hígítást kapjunk. A keverést változatlan hőmérsékleten, az emulzióképződéshez szükséges legrövidebb ideig óvatosan folytatjuk. Megfelelő mennyiségű steril poliszorbát 80-at vagy más steril felületaktív anyagot tartalmazó hígítószerrel további tízszeres hígításokból álló sorozatot készíthetünk. Folyékony vagy szilárd aeroszolok. A további mintavételhez a terméket aszeptikus körülmények között membránszűrős készülékbe vagy steril tartályba visszük át. A tartályokból vagy a teljes tartalmat, vagy meghatározott számú, pontosan mért adagot használnuk fel. Transzdermális tapaszok. Tíz tapaszról steril csipesz segítségével eltávolítjuk a védőréteget, majd öntapadó oldalukkal felfelé, steril üveg- vagy műanyaglapokra helyezzük. Az öntapadó felületet steril porózus anyaggal, pl. steril gézzel befedjük, hogy elkerüljük a tapaszok összetapadását, és a tíz tapaszt a megfelelő mennyiségű kiválasztott hígítószerbe helyezzük. A hígító folyadék megfelelő inaktivátorokat, pl. poliszorbát 80-at és/vagy lecitint tartalmaz. A tapaszokat legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk. 4-5-2. Beoltás és hígítás. A 4-5-1. pont szerint előkészített mintához, valamint egy konrollkészítményhez (nem tartalmazza a vizsgálandó anyagot) mikroorganizmusszuszpenziót adunk olyan mennyiségben, hogy a kapott inokulum legfeljebb 100 CFU-t tartalmazzon. Az inokulum-szuszpenzió térfogata nem haladhatja meg a hígított termék térfogatának 1%-át. Az elfogadható mikroorganizmus-visszanyerés igazolása érdekében a minta lehető legkisebb hígítását használjuk a vizsgálathoz. Ahol ez az antimikrobás hatás vagy a

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 14 rossz oldékonyság miatt nem lehetséges, további megfelelő előírásokat kell kidolgozni. Ha a növekedés minta által okozott gátlása másképp nem kerülhető el, a mikroorganizmus-szuszpenziót semlegesítés, hígítás vagy szűrés után adjuk a mintához. 4-5-3. Az antimikrobás hatás semlegesítése/megszüntetése. Az előkészített mintából a 4-5-2. pont szerinti hígítás és a 4-5-4. pontban leírt inkubálás után mért mikroorganizmusszámot összevetjük a kontrollból kimutatott mikroorganizmusszámmal. Ha a szaporodás gátolt (2-nél nagyobb faktor szerinti csökkenés), módosítjuk az adott mikroorganizmusszám meghatározó eljárást az eredmények érvényességének biztosítása céljából. Az eljárást pl. a következőképpen módosíthatjuk: (1) a hígító folyadék vagy a táptalaj térfogatának növelése; (2) specifikus vagy általános semlegesítőszerek elegyítése a hígító folyadékba; (3) membránszűrés; (4) a fenti eljárások kombinálása. Semlegesítőszerek. Az antimikrobás anyagok hatásának közömbösítése céljából semlegesítőszerek alkalmazhatók (2.6.12.-3. táblázat), amelyeket célszerűen a sterilezést megelőzően adunk a hígítószerhez vagy a táptalajhoz. Amennyiben semlegesítőszereket használunk, üres kísérlettel (semlegesítőszer alkalmazása a termék távollétében) igazolni kell azok hatékonyságát, továbbá azt, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak. 2.6.12.-3. táblázat Szokásos semlegesítőszerek a zavaró anyagok kiküszöbölésére Zavaró anyag Glutáraldehid, higanyvegyületek Fenolok, alkohol, aldehidek, szorbátok Aldehidek Kvaterner ammónium-vegyületek (KAV), para-hidroxibenzoátok (parabének), bisz-biguanidok KAV, jód, parabének Higanyvegyületek Higanyvegyületek, halogének, aldehidek EDTA (edetátok) Lehetséges semlegesítő Nátrium-hidrogénszulfit (nátriumbiszulfit) Hígítás Glicin Lecitin Poliszorbátok Tioglikolátok Tioszulfátok Mg 2+ vagy Ca 2+ ionok

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 15 Ha nem találunk megfelelő semlegesítő módszert, akkor feltételezhető, hogy a beoltott mikroorganizmus izolálása azért nem sikerült, mert maga a termék mikrobaölő aktivitással rendelkezik. Ez az információ arra utal, hogy a termék valószínűleg nem szennyeződhet az adott mikroorganizmussal. Mindazonáltal lehetséges, hogy a termék csak néhány itt megadott mikroorganizmus növekedését gátolja, ugyanakkor nem gátol olyanokat, amelyek nincsenek megadva a referenciatörzsek között, illetve amelyekre nézve a referenciatörzsek nem reprezentatívak. Ilyen esetben a vizsgálatot azzal a legnagyobb hígítással végezzük, amely a mikroorganizmus növekedésével és a specifikus elfogadási követelményeknek megfelel. 4-5-4. Mikroorganizmusok kimutatása a termék jelenlétében. A felsorolt mikroorganizmusok mindegyikét külön-külön vizsgáljuk. Csak a hozzáadott referenciatörzs mikroorganizmusait számláljuk meg. 4-5-4-1. Membránszűrés. Legfeljebb 0,45 μm névleges pórusmérettel rendelkező membránszűrőket használunk. A szűrő anyagát úgy választjuk meg, hogy baktériumvisszatartó képességét a vizsgálandó minta komponensei ne befolyásolják. A felsorolt mikroorganizmusok mindegyikére egy membránszűrőt használunk. A 4-5-1. 4-5-3. pontban leírt módon előkészített minta megfelelő mennyiségét (lehetőleg a termék 1 g-jának megfelelő, vagy ha nagy telepszám várható, annál kisebb mennyiségét) a membránszűrőre visszük, késedelem nélkül szűrjük és a szűrőt megfelelő mennyiségű hígítószerrel mossuk. A teljes aerob mikroorganizmusszám (TAMC total aerobic micro-organism count) meghatározásához a membránszűrőt szója-kazein-agar táptalaj felületére helyezzük. A teljes élesztőgomba-/penészgombaszám (TYMC total yeasts/moulds count) meghatározásához a szűrőt Sabouraud-glükóz-agar táptalajra helyezzük. A lemezeket a 2.6.12.-2. táblázat szerint inkubáljuk, majd elvégezzük a számlálást. 4-5-4-2. A lemezen számlálás módszerei. A lemezen számlálást mindegyik táptalaj esetében legalább két párhuzamosban végezzük és az eredmények átlagát használjuk. 4-5-4-2-1. Lemezöntéses módszer A 4-5-1. 4-5-3. pontokban leírt módon előkészített mintából 1 1 ml-t 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe mérünk és mindegyikhez 15 20 ml szója-kazein-agar táptalajt vagy Sabouraud-glükóz-agar táptalajt adunk; a táptalajok hőmérséklete legfeljebb 45 C lehet. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalajok

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 16 mennyiségét ezzel arányosan növeljük. A 2.6.12-2. táblázatban felsorolt minden egyes mikroorganizmusnál legalább két Petri-csészével dolgozunk. Az inkubálást a 2.6.16.-2. táblázat szerint végezzük. A táptalajonként kapott mikroorganizmusszámok számtani átlagából kiszámoljuk az eredeti inokulumban található telepképző egységek (CFU) számát. 4-5-4-2-2. Felületi szélesztés. 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe 15 20 ml, legfeljebb 45 C hőmérsékletű szójakazein-agar táptalajt vagy Sabouraud-glükóz-agar táptalajt adunk, majd a hagyjuk őket megszilárdulni. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalajok térfogatát ezzel arányosan növeljük. A lemezeket pl. lamináris áramlást biztosító fülkében vagy inkubátorban megszárítjuk. A 2.6.12-2. táblázatban felsorolt minden egyes mikroorganizmusnál legalább két Petri-csészével dolgozunk. A 4-5- 1. 4-5-3. pontokban leírt módon előkészített minta mért legalább 0,1 ml térfogatát szélesztjük a táptalaj felületén. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. Az inkubálást és a telepképző egységek számának meghatározását a 4-5-4-2-1. pontban leírt módon végezzük. 4-5-4-3. Legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer torzításmentessége és pontossága kisebb, mint a membránszűrésé vagy a lemezen számlálásé. Az eredmények, különösen penészgombákra, nem eléggé megbízhatóak. Ezért az MPN-módszert csak TAMCmeghatározásra alkalmazzuk, olyan esetekben, amikor más módszer nem alkalmazható. Ha a módszer használata indokolt, az alábbiak szerint járunk el. A termékből 4-5-1. 4-5-3. pontokban előírtak szerint legalább háromtagú, egymást követő tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Mindegyik hígítási fokozatból három 1 g-os (vagy 1 ml-es) részlettel beoltunk három kémcsövet, amelyek 9 10 ml szója-kazein folyékony táptalajt tartalmaznak. Szükség esetén felületaktív anyagot, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk a táptalajhoz. Tehát, ha három hígítási fokozatból álló sorozatot állítottunk elő, akkor kilenc kémcsövet oltunk be. A kémcsöveket legfeljebb 3 napon át 30 35 C-on inkubáljuk. Amennyiben az eredmények a vizsgálandó termék sajátosságai miatt nehezen vagy bizonytalanul értékelhetők, ugyanazon táptalajba vagy szója-kazein-agar táptalajra átoltásokat végzünk. Az átoltott táptalajokat 1 2 napig, az előbbivel azonos hőmérsékleten inkubáljuk, és az így nyert eredményeket vesszük figyelembe. A vizsgálandó készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkozó legvalószínűbb baktériumszámot a 2.6.12.-4. táblázat alapján határozzuk meg.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 17 2.6.12.-4. táblázat A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (MPN) Az egyes sorozatokban mikroorganizmus-növekedést mutató kémcsövek számának kombinációi A termék mennyisége a kémcsövekben (g vagy ml) 0,1 0,01 0,001 MPN/g vagy MPN/ml 95%-os konfidenciahatár 0 0 0 <3 0 9,4 0 0 1 3 0,1 9,5 0 1 0 3 0,1 10 0 1 1 6,1 1,2 17 0 2 0 6,2 1,2 17 0 3 0 9,4 3,5 35 1 0 0 3,6 0,2 17 1 0 1 7,2 1,2 17 1 0 2 11 4 35 1 1 0 7,4 1,3 20 1 1 1 11 4 35 1 2 0 11 4 35 1 2 1 15 5 38 1 3 0 16 5 38 2 0 0 9,2 1,5 35 2 0 1 14 4 35 2 0 2 20 5 38 2 1 0 15 4 38 2 1 1 20 5 38 2 1 2 27 9 94 2 2 0 21 5 40 2 2 1 28 9 94 2 2 2 35 9 94 2 3 0 29 9 94 2 3 1 36 9 94 3 0 0 23 5 94 3 0 1 38 9 104 3 0 2 64 16 181 3 1 0 43 9 181 3 1 1 75 17 199 3 1 2 120 30 360 3 1 3 160 30 380 3 2 0 93 18 360 3 2 1 150 30 380 3 2 2 210 30 400 3 2 3 290 90 990 3 3 0 240 40 990 3 3 1 460 90 1980 3 3 2 1100 200 4000 3 3 3 >1100

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. 18 4-6. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK A membránszűrés vagy a lemezen számlálás módszere alkalmasságának igazolása során a vizsgált mikroorganizmusokra kapott számok átlagértékei legfeljebb 2-es faktor értékkel térhetnek el a 4-5-2. pontban definiált kontrollra (termék nincs jelen) kapott eredménytől. Az legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer alkalmasságának igazolása során az inokulumból számított értéknek a kontrollra kapott eredmények 95%-os konfidencia-határain belül kell lennie. Ha a fenti kritériumok egy vagy több, a fent leírt módszerek bármelyikével vizsgált mikroorganizmusra nem teljesülnek, úgy a termék vizsgálatára olyan körülményeket és olyan módszert alkalmazunk, amely(ek)kel a kritériumok a lehető legjobban teljesülnek. 5. A TERMÉKEK VIZSGÁLATA 5-1. A VIZSGÁLT TERMÉKMENNYISÉG Ha más előírás nincs, a vizsgálandó termék 10 g-ját vagy 10 ml-ét használjuk, a fent említett óvintézkedések alkalmazása mellett. A folyékony és szilárd aeroszolok esetében 10 tartályból veszünk mintát. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor 10 tapaszt veszünk mintának. A vizsgált minta mennyisége csökkenthető olyan hatóanyagok esetén, amelyeket a következőképpen formulálnak: az adagolási egység (pl. tabletta, kapszula injekció) hatóanyagtartalma kisebb, mint 1 mg, illetve (adagolási egység nélküli gyógyszerformák esetén) a grammonkénti/milliliterenkénti hatóanyag-tartalom kisebb, mint 1 mg. Ezekben az esetekben a vizsgálandó mintamennyiség legalább a 10 adagolási egységben, illetve a termék 10 g-jában vagy 10 ml-ében jelenlevő hatóanyagnak megfelelő mennyiség legyen. Az olyan hatóanyagok esetében, amelyeknek mennyisége korlátozott vagy a gyártási tételek nagysága nagyon kicsi (ti. kevesebb, mint 1000 ml vagy 1000 g), a gyártási tétel 1%-át használjuk, kivéve, ha kisebb mennyiséget írtak elő, illetve ha annak használata indokolt és engedélyezett. Olyan termékeknél, ahol a gyártási tételben található egységek száma kisebb, mint 200 (pl. klinikai vizsgálatok esetén), a mintamennyiség 2 egységre csökkenthető, illetve ha a gyártási tétel egységeinek száma kevesebb, mint 100 1 egység vizsgálata is lehetséges.