Fluorescencia polariáció, aniotrópia FRAP A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció 11..15. Polariált fén, polariáció Elektromágneses hullámok Megjelenés fotóáskor! Miért van ilen hatása? Polariáció fogalma A elektromágneses sugárás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatároott görbe mentén moog (térbeli iránultság!). A polariált fén Ha a görbe egenes: lineáris v. sík polariáció Ha a görbe kör: cirkuláris polariáció (Ha a görbe elipsis: elliptikus polariáció) A polariálatlan fénben a polariációs síkok keverednek. A polariált fénben a polariációs síkok össhangban vannak (aonosak). 1
Síkban polariált fén A polariátor Definíció: A polariátor eg olan eskö mel képes a polariálatlan elektromágneses sugárást (fén) olan sugárássá alakítani, melben csak egféle polariációs sík van jelen. Polariátor működésének elve Hol találkotunk már polariátorral? Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Polariáció, intenitások Optikai aktivitás: poláros fén síkját elforgatják Fénforrás = lc t α α λ Θ polariátor Intenitás eg adott iránban: Ι=Ι cos ma Θ Polariátor Párhuamos állás: Mintatartó Θ =, I = I ma Merőleges állás: Analiátor Θ = 9, I = Megfigelő királis molekulák nem kell gerjesteni! Polariméter
A absorpciós vektor fogalma Fotoselekció M A = absorpciós vektor θ A Nincs absorpció (θ= 9 o ) E gerjestés Maimális absorpció (θ= o ) θ A Absorpció ~ cos θ A (ma=1) absorpciós vektor: megsabja a foton absorpciójának valósínűségét. A fotoselekció eredméne Mi történik a fotoselekciót követően? E r E r Mogás: - transláció; - rotáció. Minderre τ idő van! Hogan jellemehető e a rotációs mogás? A emissiós vektor M E = emissiós vektor I Z θ E gerjestés E I Y Detektor emissiós vektor: megsabja a foton emissiójának valósínűségét. 3
Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a komponens! SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F M P S I Z θ E I Z vs. I sum = I Z + + I Y I Y Vag vertikálisan, vag horiontálisan heleük el a polariátorokat: 9 o P M I VV I VH (A teljes intenitásho tudjuk visonítani.) I HV I HH D Polariátorokat alkalmaunk!!! Íg a teljes intenitás: I sum = I Z + + I Y I sum = I VV + I VH + I VH Fluorescencia polariáció I Z θ E I Y I sum = I VV + I VH Fluorescencia polariáció p = (I VV -GI VH ) / (I VV + GI VH ) p = (I VV -GI VH ) / (I VV + GI VH ) Ha τ = lenne: I VV ma., I VH =, tehát p = 1. dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja nem additív!!! értéke -tól 1-ig váltohat (ld. követkeő dia). G = I HV / I HH Ha τ nagon hossú lenne: I VV = I VH, tehát p =. De nem additív!!! 4
Emissiós aniotrópia Emissiós aniotrópia r = (I VV -GI VH ) / (I VV + GI VH ) dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától G = I HV / I HH a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja additív!!! Emlékeünk! I sum = I Z + + I Y I sum = I VV + I VH + I VH I sum = I VV + I VH Mint láttuk, rotációs mogást ír le! A aniotrópia jelentése és alkalmaásai Polariált fén I Z θ E τ I Z θ E I Y I Y Résben polariált fén Rotációs diffúió r A aniotrópia időfüggése I(t) = I ep -t/τ r( t) = r ai ep( t / θ ) t Alkalmaások Serkeeti tulajdonságok visgálata Fehérje denaturáció nomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás visgálata Serkeet visgálata a körneeti paraméterek (ph, ionok) váltoásának függvénében Dinamikus tulajdonságok visgálata Membránho kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viskoitásról Fehérjékhe kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a fehérjemátri fleibilitásáról Mire emléketet a időfüggés? 5
A aktin de novo polimeriációja Actin monomer Actin filament Példa alkalmaásra Depolmerisation Dimer Elongation Nucleation Trimer T. D. Pollard: Cell, 11, 453-465, 3. A forminok domén serkeete Kutatási kérdés GBD FH3 FH1 FH DAD Mammalian Diaphanous-related formins Formin homolog (FH) domains: FH1, FH, FH3 Hogan váltoik meg a aktin filamentumok serkeete a forminok kötődésének hatására? Rho-GTPase binding domain (GBD): Diaphanous Autoregulator domén (DAD): Autoregulation Alkalmaott módserekm A mérések alapelve Fehérj rjék (formin, mioinm ioin,, aktin, a tropomioin ioin) prepar parálása. Mérések fluorescencia aniotrópia lecsengés módserével. bending monomer rotation twisting segmental motion 6
A aniotrópia időfüggésének mérése Hogan értelmehetjük a eredméneket? longer rotational correlation time (ns) 8 6 4 shorter rotational correlation time (ns) 5 4 3 1 1 3 4 5 [mdia1-fh] (μm) A 1 3 4 5 [mdia1-fh] (μm),,,4,6,8 1, A forminok megnövelték a aktin filamentumok fleibilitását. fleibilit (arb. units) 3,,5, 1,5 1, T = 3 o C [mdia1-fh+linker] : [actin] Side - binding End - binding fleibilit (arb. units) 3, T = 3 o C,5, 1,5 1,,,,4,6,8 1, [mdia1-fh+linker] : [actin] Határérték aniotrópia (r ) További fogalmak, össefüggések A teljes modulatlan, fagott fluorofór aniotrópiája. 3cos β 1 r = 5 β Absorpciós vektor Emissiós vektor β: a absorpciós és emissiós vektor által beárt sög. β r.4 45.1 54.7 9 -. Francis Perrin - 196 Mitől függ a aniotrópia értéke? ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ flurescencia depolariáció - A rotációs mogás gorsaságától; rotációs diffúió; - A rendelkeésre álló időtől; fluorescencia élettartam! Perrin egenlet: r r r = = τ 1+ 1+ 6Dτ Θ Rotációs korrelációs idő határérték aniotrópia diffúiós állandó ηv Θ = RT 7
Perrin egenlet r r r = τ 1+ 1+ 6Dτ Θ r ~ r 1/τ Θ 1/D = FRAP FRAP ( Fluorescence Recover After Photobleaching ) cél: membrán-fehérjék laterális diffúiójának (DL) visgálata Fehérjék selektív jelölése fluorofórral Fénforrás: léer Mikroskóp a fluorescencia detektálására Photobleaching = fotohalvánodás (kifehéredés) A Photobleaching fogalma fluorofór irreveribilis fotokémiai destrukciója gerjestő fén tönkretesi a fluorescens molekulát elkerülése: anti-photobleaching oldat (pl. glükó oidá katalá merkaptoetanol) epoiciós idő csökkentése pulusserű gerjestés alacsonabb intenitású gerjestő fén ellenállóbb fluorofor (pl. Alea) hasnálata: háttér eliminálása autoquenching FLIP, FRAP www.microscopu.com Módser Alkalmaás 1. Fluorescens minta Membránkomponensek laterális diffúiója Monomer turnover / beépülés. Meghatároott terület kiégetése (pl. léerrel) Photobleach Lippincott-Schwart, 3 Fehérje motilitás Diffúiós konstans meghatároás 3. Fluorescencia helreállás 4. Egensúl beállta (általában: < ) Relativ fluorescencia (%) I I ω D = 4t 1/ t 1/ Idő 8
Össefoglalás 9