!HU000008419T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 419 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 799042 (22) A bejelentés napja: 0. 09. 23. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 00799042 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 179188 A2 06. 03. 30. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 179188 B1. 04. 21. (1) Int. Cl.: C07K 14/0 (06.01) A61K 38/46 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06032697 PCT/EP 0/04771 (30) Elsõbbségi adatok: 0440180 04. 09. 24. EP (72) Feltalálók: MODROW, Susanne, 93177 Altenthann (DE); LOWIN, Torsten, 9301 Regensburg (DE); MÖBS, Markus, 40 Berlin (DE); BRÖKER, Michael, 3041 Marburg (DE) (73) Jogosult: Intercell AG, 30 Vienna (AT) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Parvovírus B19 módosított VP1-kapszidfehérjéje HU 008 419 T2 A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1 HU 008 419 T2 2 A találmány tárgyát módosított parvovírus B19 kapszidfehérjék és ¹részecskék képezik, azok alkalmazásai és gyógyszerek, beleértve vakcinák elõállítása parvovírus B19-cel kapcsolatos betegségek kezelésére. A parvovírus B19¹et 197-ben fedezték fel mint felnõttek szisztémás fertõzéseinek okát, akik vagy tünetmentesek voltak, vagy enyhe nemspecifikus tüneteik voltak, mint például fejfájás, láz, rossz közérzet, fáradtság, izomgyengeség (1, 2, 3). 1984-ben a parvovírus B19¹et az erythema infectiosum oksági ágenseként azonosították, amit ötödik betegségként is ismernek (4). A vírus világszerte elterjedt, de kizárólag humán gazdákra korlátozódik. A regionális eltérések tekintetében körülbelül a népesség 40 60 százaléka mutat ellenanyagokat a virális fehérjék ellen éves korára. A fertõzés endemikus, bár regionális járványokat ér el késõ télen és tavasszal. A vírus nagyon stabil. Általában orálisan adódik át akut fertõzésben szenvedõ személyekrõl (). A fertõzés fõ útja mellett a vírus átadható parenterálisan beadott vérrel és vérkészítményekkel, és vertikálisan az anyáról a magzatra (6, 7, 8, 9). A parvovírus B19 masszív produktív replikációja megy végbe az eritroid progenitorsejtekben (). Tehát az akut fertõzés folyamán a vírusterhelés rendkívül magas, és akár 13 részecske és/vagy vírusgenom is jelen lehet a perifériás vér minden milliliterében. A vírus a P vércsoport antigén (globozid) alkalmazásával kötõdik az eritrocita prekurzorsejtekhez, ami az adszorpció celluláris receptora (11). A fertõzés és a perifériás vérbõl történõ eliminálás után a virális genomokat kimutatták a csontvelõ és bõr sejtjeiben, az ízületi sejtekben, a máj szöveteiben és a miokardium endotéliumában (12, 13, 14,, 16, 17). Jelenleg nem világos, hogy ezek a sejtek termelnek¹e virális fehérjéket és/vagy fertõzõ B19-részecskéket, és hogy a vírus genom reaktiválható¹e produktív reprodukcióra. A közönséges parvovírus B19-fertõzés tünetek nélküli vagy influenzaszerû tüneteket eredményezhet. Különösen a gyermekek szenvedhetnek az erythema infectiosumtól (ötödik betegség), ami egy önkorlátozó kiütéses betegség (18, 19, ). A parvovírus B19¹et továbbá kapcsolatba hozták betegségek széles körével (1. táblázat): tranziens anémia, leukocitopénia vagy trombocitopénia fordulhat elõ, anélkül, hogy kezelni kellene. Azonban bizonyos páciensekben súlyos trombocitopénia, tiszta vörössejtes aplázia vagy pancitopénia volt megfigyelhetõ. Az akut fertõzés ezen hematológiai szövõdményei mellett hepatitisz, miokarditisz, miozitisz, akut tüdõsérülés és neurológiai betegség fordulhat elõ (12, 21, 22, 23, 24). Terhes nõkben spontán vetélésrõl, nem immun hydrops fetalisról és intrauterin magzathalálról számoltak be klinikai tünetként (2, 26). Az akut fertõzésben szenvedõ nem immun terhes nõkben körülbelül 9% magzati halandóságot találtak (9, 27). Azonban vannak olyan vizsgálatok, amelyekben a hydrops fetalis magasabb százalékáról számolnak be B19-vel fertõzött nem immun terhes nõkben (28). A gazda hematológiai állapotától például sarlósejtes vérszegénységben vagy talasszémiában szenvedõ páciensek függõen a B19-fertõzés aplasztikus krízist 2 30 3 40 4 0 60 eredményezhet. Perzisztens parvovírus B19 fertõzésrõl beszámoltak immundeficiens és anélküli páciensek esetében egyaránt (29, 30). Ezen általános megjelenési formák mellett a parvovírus B19 fertõzés magában foglalhatja autoimmun jelenségek széles körét. Az autoimmun citopéniák jól ismert hematológiai betegségek, amelyek bármilyen csontvelõi sejtvonalat befolyásolhatnak. Az esetek nagy többségében csak a sejtvonalak egyike érintett. Azonban ismert a parvovírus B19-fertõzés miatt a neutrofil granulociták és trombociták egyidejû autoimmunközvetített megsemmisülése (31). A parvovírus B19¹et az immunológiai trombocitopénia bizonyos eseteinek lehetséges kiváltójaként azonosították (32, 33, 34, 3). Az autoimmun ízületi betegségek klinikai spektruma az enyhe arthralgiáktól a súlyos nekrotizáló vaszkulitiszig terjed (1. táblázat). Az erythema infectiosum egyes járványaiban gyakori arthralgiákról és arthritiszrõl számoltak be. A B19-fertõzés szimmetrikus perifériás poliarthropátiát okozhat felnõttekben. A tünetek általában önkorlátozók, de hónapokig fennmaradhatnak. Néha kimutattak virémiát kombinálva a VP1 és/vagy VP2 szerkezeti fehérjék elleni IgM/IgG ellenanyagokkal hosszan tartó poliarthralgia/poliarthritisz páciensekben. Azok némelyike eleget tett a reumatoid arthritisz (RA) követelményeinek (26, 37). Azonban az RA akut parvovírusfertõzés utáni kialakulása ritkának tûnik (38, 39). Gyermekekben a B19-fertõzés és az arthritisz-arthralgiák kapcsolata jól ismert. Az érintett gyermekek némelyikében krónikus arthritisz alakul ki, amely megkülönböztethetetlen a fiatalkori idiopátiás arthritisztõl (40, 41, 42, 43). A klinikai spektrum magában foglalja a mono¹, oligo- és poliarthritiszt. Ezenkívül gyakran figyelnek meg perzisztens virémiát szisztémás fiatalkori idiopátis arthritiszben szenvedõ gyermekekben. A fiatalkori arthritisz különbözõ formáiban szenvedõ gyermekekben B19 DNS¹t amplifikáltak a korábban parvovírus B19- cel fertõzöttek szérumának és/vagy ízületi folyadékának 7%-ából. Sok páciensben kimutatható a virális részecskék és immunkomplexek folyamatos jelenléte a perifériás vérben, valamint az ízületi folyadékban (44). A B19-specifikus immunreakció kialakulása és jelenléte ellenére a gyermekek képtelenek voltak eliminálni a vírust és elnyújtott virémiás állapotot vagy virális perzisztenciát mutattak az ízületi folyadékban. A parvovírus B19 fertõzést kapcsolatba hozták vaszkulitisz, kollagenózis különbözõ formáival, és utánozhatja a szisztémás lupus erythematosust (SLE) gyermekekben és felnõttekben (39, 4, 46). Hasonlóan az arthritiszes páciensekben lévõ helyzethez, az SLEpáciensben a parvovírus B19-fertõzést a reumás betegséget okozó vagy kiváltó ágensként írták le (47, 48, 49, 0, 1). Újabban leírták a perzisztens parvovírus B19-fertõzés ész antifoszfolipid ellenanyagok reumatikus betegségben szenvedõ gyermek és felnõtt páciensekbeli termelése közötti kapcsolatot (2). Az antifoszfolipid-szindrómát (APS) (3) hasonlóan bizonyos parvovírus B19-fertõzésekhez, hemocitopéniás és vazookkluzív tünetek széles köre jellemzi. Emellett a visszatérõ magzatvesztés és a negatívan töltött foszfo- 2
1 HU 008 419 T2 2 2 30 3 40 4 0 60 lipidek és fehérje kofaktorok, fõleg a 2-glikoprotein¹I ellen irányuló autoantitestekkel való kapcsolat az APS fõ jellemzõi. Az antifoszfolipid-szindróma és a B19-fertõzésben megfigyelt autoimmun tulajdonságok általános patogenitásának hipotézisét alátámasztja nemcsak az antifoszfolipid ellenanyagok és a parvovírus B19-fertõzés közötti szoros kapcsolat, hanem a klinikai tünetek elõfordulásának hasonlósága a parvovírus B19-cel fertõzött páciensek és az APS-páciensek között. A parvovírus B19 ikozahedrális kapszidja két szerkezeti fehérjébõl áll, a VP1 (83 kda) és a VP2 (8 kda), amelyek azonosak, kivéve 227 aminosavat (aa) a VP1 fehérje aminoterminális végén (a VP1 egyedi régió). Egy foszfolipáz¹a2 motívum van a VP1 egyedi régió aminosavszekvenciájában a 130 19. aminosavakat lefedõ régióban (foszfolipáz¹a2 aktív centrum) (4). Az antifoszfolipid ellenanyagok termelésének kiváltására az egyik patogén mechanizmus ez a foszfolipáz-a2-szerû aktivitás lehet, amelyet a parvovírus B19 VP1 szerkezeti fehérjéjének VP1 egyedi régiójában figyeltek meg (4). Ez az enzimaktivitás jelen van a fertõzõ B19-részecskékben, a VP1/VP2-fehérjékbõl álló rekombináns üres kapszidokban és a VP1 egyedi régió tisztított készítményeiben. Az hozzájárulhat a leukotriének és prosztaglandinok termelése által indukált gyulladásos folyamatokhoz, de szokatlan hasítási termékek keletkezéséhez is vezethet a celluláris foszfolipid vegyületekbõl, amelyek apl-ellenanyagokat indukálhatnak egyedülálló genetikai háttérrel kombinálva. Mostanáig nem érhetõ el parvovírus B19-fertõzést megakadályozó vakcina. A fertõzéssel kapcsolatban megfigyelt súlyos lefolyásokkal kapcsolatosan a terhes nõkben a fertõzéssel kapcsolatos problémák és a vírus képessége különféle autoimmun betegségek indukálására parvovírus B19-fertõzések ellen védõ biztonságos vakcina kifejlesztése. Bakulovírusvektorok által expresszáltatott VP1/VP2-fehérjékbõl álló tisztított üres kapszidokat alkalmaztak I¹fázisú klinikai vizsgálatokban, és azok B19¹et semlegesítõ ellenanyag sikeres indukálását mutatták önkéntesekben (). Azonban ezen vakcina alkalmazása számos különbözõ mellékhatással járt. Az injekció helyén való duzzanat mellett a betegségérzet általánosabb tüneteirõl, mint például lázról, fejfájásról és hasmenésrõl számolt be az önkéntesek több mint 0%¹a. Ezek a mellékhatások arra utalnak, hogy a vakcina alkalmazása olyan mellékhatások szisztémás megjelenését okozzák, amelyek ismert módon kapcsolatosak a gyulladásokkal kapcsolatos védelmi reakciók aktiválásával. Például a fertõzéseket követõ korai immunreakciók folyamán ezek a hatások fõként a celluláris és citoszolbeli foszfolipáz¹a2 aktiválásával kapcsolatosak. Ezek az enzimek felelõsek az arachidonsav termeléséért, amely a prosztaglandin- és leukotriéntermelés prekurzora, különféle cito- és kemokinek indukálásáért, ami lázhoz és általános betegségérzethez vezet. A Ballou és mtsai. által a rekombináns bakulovírus () által termelt VP1/VP2 üres kapszidok alkalmazásával megfigyelt mellékhatások valószínûleg a foszfolipáz-a2-szerû aktivitás miatt voltak, ami a VP1 virális kapszidfehérje VP1 egyedi régiójának része. Girod és mtsai. [The Journal of General Virology 83() (00):973 978. old.] a 2¹es típusú adenoasszociált vírus (AAV 2) parvovírus foszfolipáz-a2-aktivitását ismertetik. Shields és mtsai. [American Journal of Obstetrics & Gynaecology 182(1) (00): 18. old.] parvovírus B19 kapszidfehérjét ismertetnek számos különbözõ sejtes rendszerben történõ inkubálásra, ami csökkent növekedést és kolóniaképzést eredményez az inkubált sejteknél. A WO 03/006067 számú nemzetközi közzétételi irat állati parvovírusokat és azok onkotoxikus hatásait ismerteti. A WO 00/306668 A számú nemzetközi közzétételi irat azt tárja fel, hogy a parvovírus B19 kötõdik a gazdasejteken, például humán hematopoietikus sejteken és más vérsejteken lévõ P¹antigénhez, és hogy a kapszidfehérjék vagy azok fragmensei képesek gátolni a P¹antigént hordozó sejtek növekedését. A találmány alapját képezõ probléma gyógyszerek, mint például parvovírus B19 vakcina biztosítása a parvovírus B19-cel kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, minimális mellékhatásokkal. Ezt a problémát a találmány elõnyösen a parvovírus B19 VP1-kapszidfehérjéjének megváltoztatásával/módosításával oldja meg, ily módon csökkentve a virális VP1 kapszidfehérje VP1 egyedi régiója foszfolipáz-a2-szerû aktivitását. A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgya parvovírus B19 módosított VP1-kapszidfehérjéje, amelynek csökkent a foszfolipáz-a2-szerû enzimaktivitása, összehasonlítva a parvovírus B19 1. azonosító számú szekvencián bemutatott vad típusú VP1-kapszidfehérjéjével, ahol egy vagy több konzervált aminosav-oldallánc a foszfolipáz¹a2 aktív centrumában meg van változtatva a 3. hisztidin pozíciójában, a 7. tirozin pozíciójában, a 162. lizin pozíciójában és/vagy a 168. tirozin pozíciójában. A találmány szerint a természetes foszfolipázaktivitás csökkentve van (ami magában foglalja az aktivitás teljes megszüntetését). Tehát a fehérje azon régiói, amelyek szerepet játszanak ezen foszfolipáz aktivitás csökkentésében, megváltoztathatók a találmány szerint. A vad típushoz képest ezeket a változtatásokat aminosavcserékkel, ¹deléciókkal vagy ¹inszerciókkal építjük be. A foszfolipázaktivitás csökkenését a szakember könnyen meghatározhatja, például az itt feltárt módszerekre támaszkodva, különösen a Dorsch és mtsai., 02 (4) 2. ábráján ismertetett teszt szerint. Másrészrõl a változások nem változtathatják meg szignifikánsan a vakcina immunológiai képességét (azaz az immunológiai tulajdonságait nem befolyásolhatják hátrányosan a mutációk). A találmány szerint a VP1-kapszidfehérje VP1 egyedi régiójában (0 2., specifikusan a 130 19. aminosavak) található aminosav-oldalláncokat változtatjuk meg. Ez a régió erõsen konzervált a 3
1 HU 008 419 T2 2 napjainkig azonosított három parvovírus B19 genotípusban (60; 2. ábra). Azonban habár nyilvánvaló, hogy ez a régió konzervált, eltéréseket figyelhetünk meg a különbözõ parvovírus B19 genotípusok aktivitásában: 1¹es genotípus: 0%, 2¹es genotípus: 70%, 3¹as genotípus: 9%. A vad típusú aktivitásra való hivatkozás azt jelenti, hogy a legközelebbi genotípust választjuk ki a vad típusú mutáns összehasonlítására (például ha a 2¹es genotípus mutánsát készítjük el, a mutáns foszfolipáz aktivitását a 2¹es genotípus vad típusához hasonlítjuk). Általában a teljes VP1 fehérjét mutáltathatjuk a fehérje foszfolipáz-a2-szerû aktivitásának csökkentéséhez vagy megszüntetéséhez. Azonban mivel a VP1 egyedi régión (0 2., specifikusan 30 19. aminosavak) kívüli mutációk általában alacsony, vagy semmilyen csökkentõ hatásúak a foszfolipázaktivitásra, ezen VP1 egyedi régión belüli mutációkat hajtunk végre a találmány szerint. Mindazonáltal a VP1 egyedi régión kívüli mutációkat is beépíthetünk, például aminosavcsonkolásokkal vagy az 0 90., különösen az 9 81. aminosavak régiójában lévõ mutációkkal. Azt, hogy egy mutáció eleget tesz¹e a foszfolipázaktivitás várt csökkenésének, könnyen megállapítható a mutáns expresszáltatásával funkcionális vizsgálati eljárással kombinálva. Az ilyen foszfolipázaktivitási tesztek jól ismertek a szakterületen és a leírásban is ismertetünk ilyeneket. Specifikusan elõnyös mutációs helyek a Ca 2+ -kötõ aminosavak [Tyr(130), Gly(132), Gly(134), Asp(4)] körüliek vagy a katalitikus hálózat [His(3), Tyr(7), Tyr(168)] körüliek, beleértve a foszfolipidkötést [Lys(162)], azaz a 12 140. 0 17. aminosavakat, különösen a 127 137., 2 160. és 16 171. aminosavakat (a szekvenciák tekintetében lásd az 1. azonosító számú szekvenciát és a 2. ábrát). Elõnyös cserék azok a cserék, amelyeket általában az enzimaktivitást-csökkentõ stratégiákban alkalmaznak, például funkciós oldalláncú aminosavak (His, Lys, Tyr, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln stb.) helyettesítése nem funkciós oldalláncú, azonos vagy különbözõ méretû aminosavval (Ala, Phe, Leu, Pro, Ile stb.) vagy különbözõ funkciós oldalláncú aminosavval (például Asn Asp, Gln Ser stb.). Néha kis különbségek is elegendõek (Val Ala, Ser Thr stb.). A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a foszfolipáz¹a2 aktív centrumában található konzervált aminosav-oldalláncok közül egyet vagy többet változtatunk meg. A 3. hisztidin; 7. tirozin; 162. lizin; 168. tirozin; 19. aszparaginsavpozíciókban található aminosav-oldalláncokról leírták, hogy a szarvasmarha-hasnyálmirigy foszfolipáz¹a2 katalitikus triádjának részei és részt vesznek a szubsztrát orientálásában és specificitásban (8, 9). A 3. hisztidin, 7. tirozin, 162. lizin, 168. tirozin oldalláncok közül egy vagy több módosítása a foszfolipáz-a2-szerû aktivitás még kifejezettebb csökkenését eredményezi, míg a 19. aszparaginsav oldallánc módosítása vagy megváltoztatása fokozott foszfolipáz-a2-szerû aktivitást eredményez. 2 30 3 40 4 0 60 Ily módon a találmány szerint a 3. hisztidin pozícióban; 7. tirozin pozícióban; 162. lizin pozícióban és/vagy 168. tirozin pozícióban változtatunk meg egy vagy több aminosav-oldalláncot. Egy még másik elõnyös megvalósítási mód szerint a 3. pozícióban lévõ hisztidint alaninra változtatjuk; a 7. tirozint fenil-alaninra változtatjuk; a 162. lizint leucinra változtatjuk és/vagy a 168. tirozint fenil-alaninra változtatjuk. Általában a találmány szerinti mutációnak amennyire csak lehet, minimálisnak kell lennie (annak érdekében, hogy ne változtassuk meg túlzottan az immunológiai tulajdonságokat): általában kis számú aminosavszubsztitúciónak (6,, 4, 3, 2 vagy elõnyösen 1) és rövid inszerciónak vagy deléciónak (30,,, vagy 1 aminosav) elegendõnek kell lennie a foszfolipázaktivitás hatékony csökkentésére vagy eltávolítására. Azonban hosszabb inszerciók, deléciók (0, 0, 0 aminosav) vagy nagyobb számú szubsztitúció sincs kizárva, mindaddig, amíg az immunológiai tulajdonságok nem változnak meg szignifikánsan. Azonban az utóbbi többszörös mutációk szintén kevésbé elõnyösek a költségek miatt. Azt hogy a mutánsoknak hasonló immunológiai tulajdonságai vannak vagy sem, könnyen meghatározhatjuk például specifikus ellenanyagokkal való reagáltatással vagy az immunválasz kiváltására való in vitro vagy in vivo képesség meghatározásával. Általában a mutánsoknak (specifikus adjuvánsokkal vagy anélkül) körülbelül 0%¹os in vivo immunogenitást kell mutatniuk a vad típushoz képest (adjuvánsok nélkül, vagy elõnyösen ugyanazzal az adjuvánssal, mint a mutáns), legalább egy tudományosan alkalmazott és (szakmailag) elfogadott eljárással, mint például ellenanyagkötés, ELISpot vizsgálati eljárások stb. (lásd még: a bejelentés példa részét). A találmány szerinti módosított VP1 egyedi régió vagy a találmány szerinti módosított VP1-kapszidfehérje csökkentett foszfolipáz-a2-szerû enzimaktivitást eredményez összehasonlítva a vad típusú VP1-kapszidfehérjével. Elõnyösen a csökkenés legalább 30%, összehasonlítva a vad típussal (azaz a vad típusú aktivitás 70%¹a vagy kevesebb). Továbbá elõnyös a csökkenés a vad típusú aktivitás 0%-ára vagy kevesebbre, 30%-ára vagy kevesebbre, %-ára vagy kevesebbre vagy %-ára vagy kevesebbre. A vad típus és mutáns referenciaaktivitását elõnyösen standardizált foszfolipáz-a2-szerû enzimaktivitási teszttel határozzuk meg, különösen az (4) irodalmi hely 2. ábrája szerint. Különösen azok a mutánsok a legalkalmasabban a találmány szerinti vakcinaalkalmazásra és biztonságosságra, amelyek teljesen mentesek ettõl az aktivitástól (azaz % alatti, 1% alatti vagy 0,1% alatti, az eljárás detekciós limitjétõl függõen). Elõnyösen az aminosav-oldalláncok megváltoztatását helyspecifikus mutagenezissel végezzük. a találmány tárgya izolált nukleinsavmolekula, amely a találmány szerinti módosított VP1-kapszidfehérjét kódolja. 4
1 HU 008 419 T2 2 2 30 3 40 4 0 60 A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya rekombináns expressziós vektor, amely a találmány szerinti módosított VP1 egyedi régiót és módosított VP1-kapszidfehérjét kódoló nukleinsavmolekulát tartalmaz. Elõnyösen a találmány szerinti rekombináns expressziós vektor továbbá tartalmazza a parvovírus B19 VP2-kapszidfehérjéjét is, különösen ahol a fehérje együtt expresszáltatható a módosított VP 1 kapsziddal. Azonban a VP1 és VP2 fehérjéknek a sejtbe bejuttatott két vektor alkalmazásával történõ kombinált expressziójának is van elõnye specifikus célokra. Elõnyösebben a találmány szerinti rekombináns expressziós vektor olyan fúziós terméket tartalmaz, amelyben a módosított VP1 egyedi régió vagy a módosított VP1-kapszidfehérje a VP2-kapszidfehérjéhez van fuzionáltatva. a találmány tárgya gazdasejt, amely a találmány szerinti rekombináns expressziós vektor tartalmazza. Elõnyösen a gazdasejt E. coli, élesztõ- vagy állati sejt. Legelõnyösebben a gazdasejt Saccharomyces cerevisiae. Az élesztõ ezen faját két évtizede alkalmazzák rekombináns HBsAg-részecskék termelésére, amely a hepatitis B¹vírusfertõzés ellen véd. A rekombináns S. cerevisiae eredetû HBV-vakcinák alkalmazásáról kimutatták, hogy biztonságos, mellékhatásokat csak nagyon ritkán figyelnek meg. a találmány tárgya eljárás módosított VP1 egyedi régió vagy a módosított VP1-kapszidfehérje vagy a módosított VP1-kapszidfehérje és a VP2-kapszidfehérje fúziós termékének elõállítására, amely magában foglalja gazdasejt transzformálását, a VP1-kapszid (és adott esetben a VP2-kapszid) expresszálását, a fehérje(k) visszanyerését, adott esetben vírusszerû részecskékként, a találmány szerinti gazdasejt alkalmazásával. Elõnyösen az ilyen eljárásban a módosított VP1 egyedi régiót és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérjét és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérje és a VP2-kapszidfehérje fúziós termékét izoláljuk és/vagy tisztítjuk. a találmány tárgya a módosított VP1 egyedi régió és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérje vagy a módosított VP1 egyedi régió és a VP2- kapszidfehérje fúziós terméke, amely a találmány szerinti eljárás szerint állítható elõ. A találmány egy még másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a módosított VP1 egyedi régió és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérje vagy a módosított VP1 egyedi régió és a VP2- kapszidfehérje fúziós terméke, gyógyszerként történõ alkalmazásra. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a módosított VP1 egyedi régió és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérje a VP2- kapszidfehérjével vagy anélkül alkalmazása parvovírus B19-fertõzés és/vagy parvovírus B19-cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány egy még további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a módosított VP1 egyedi régió, a módosított VP1-kapszidfehérje és a VP2- kapszidfehérje fúziós termékének alkalmazása parvovírus B19 fertõzés és/vagy parvovírus B19-cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. Elõnyösen a kezelés a következõk elleni: arthralgiák; arthritisz; elõnyösebben monoarthritisz, oligoarthritisz, poliarthritisz, reumatoid arthritisz és/vagy fiatalkori idiopátiás arthritisz; szisztémás lupus erythematosus (SLE); vaszkulitisz, elõnyösebben leukoklasztikus vaszkulitisz, Purpura Henlein-Schoenoch, Papular-purpuric gloves-and-socks syndrome (PPGSS), Kawasaki-betegség, óriássejtes arteritisz (GCA), Polyarteritis nodosa és/vagy Wegener s granulomatózis; dermatomiozitisz; autoimmun neutropénia; autoimmun trombocitopénia; idiopátiás thrombocytopenia purpura (ITP); autoimmun hemolitikus anémia; és/vagy vírusasszociált hemofagocitikus szindróma (VAHS). a találmány tárgya a találmány szerinti módosított VP1 egyedi régió, a módosított VP1-kapszidfehérje vagy a módosított VP1 egyedi régió és a VP2- kapszidfehérje fúziós terméke alkalmazása tesztelendõ mintában található B19 VP1 vírusfehérje elleni ellenanyagok detektálására szolgáló vizsgálati eljárásban. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya találmány szerinti gazdasejtek alkalmazása tesztelendõ mintában található B19 VP1 vírusfehérje elleni ellenanyagok detektálására szolgáló vizsgálati eljárásban. a találmány tárgya rekombináns vírusszerû részecske, amely a találmány szerinti módosított VP1-kapszidfehérjébõl áll VP2-kapszidfehérjével vagy anélkül. A találmány egy még másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a rekombináns vírusszerû részecske, amely a találmány szerinti módosított VP1 egyedi régió, a módosított VP1-kapszidfehérje és a VP2-kapszidfehérje fúziós termékébõl áll. ezek a rekombináns vírusszerû részecskék alkalmazhatók parvovírus B19-fertõzés és/vagy parvovírus B19- cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. Elõnyösen a kezelés a következõk elleni: arthralgiák; arthritisz; elõnyösebben monoarthritisz, oligoarthritisz, poliarthritisz, reumatoid arthritisz és/vagy fiatalkori idiopátiás arthritisz; szisztémás lupus erythematosus (SLE); vaszkulitisz, elõnyösebben leukoklasztikus vaszkulitisz, Purpura Henlein-Schoenoch, Papular-purpuric gloves-and-socks syndrome (PPGSS), Kawasaki-betegség, óriássejtes arteritisz (GCA), Polyarteritis nodosa és/vagy Wegener s granulomatózis; dermatomiozitisz; autoimmun neutropénia; autoimmun trombocitopénia; idiopátiás thrombocytopenia purpura (ITP); autoimmun hemolitikus anémia;
1 HU 008 419 T2 2 és/vagy vírusasszociált hemofagocitikus szindróma (VAHS). a találmány tárgya a találmány szerinti rekombináns vírusszerû részecskék alkalmazása tesztelendõ mintában található B19 VP1 vírusfehérje elleni ellenanyagok detektálására szolgáló vizsgálati eljárásban. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya gyógyászati készítmény, különösen vakcinakészítmény olyan immunválasz indukálására, amely védelmet nyújt a humán parvovírus B19 ellen, amely készítmény a találmány szerinti módosított VP1 egyedi régiót, a módosított VP1-kapszidfehérjét tartalmazza, VP2-kapszidfehérjével vagy anélkül. a találmány tárgya gyógyászati készítmény, különösen vakcinakészítmény olyan immunválasz indukálására, amely védelmet nyújt a humán parvovírus B19 ellen, amely készítmény a találmány szerinti módosított VP1- kapszidfehérje fúziós termékét tartalmazza. a találmány tárgya gyógyászati készítmény, különösen vakcinakészítmény olyan immunválasz indukálására, amely védelmet nyújt a humán parvovírus B19 ellen, amely készítmény a találmány szerinti rekombináns vírusszerû részecskéket tartalmazza. Elõnyösen a találmány szerinti gyógyászati készítmények továbbá vakcinázási célra alkalmas egy vagy több hordozót és/vagy adjuvánst is tartalmaznak. Tehát a találmány szerinti készítmények, különösen vakcina formájában továbbá immunstimuláns anyagot tartalmazhatnak a polikationos vegyületek, elõnyösen a polikationos polimerek, elõnyösebben polikationos peptidek, különösen poliarginin, polilizin vagy antimikrobiális peptidpolimerek, immunstimuláns dezoxinukleotidok (ODN¹ek), legalább két LysLeuLys motívomot tartalmaz peptidek, neuroaktív vegyületek, különösen humán növekedési hormon, alum, Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuváns vagy ezek kombinációi által alkotott csoportból kiválasztva. A találmány szerinti vakcina elõnyösen a következõket tartalmazza: találmány szerinti módosított VP1 kapszidfehérjét, mint antigént az R 1 XZXZ N XZX R 2 szekvenciát tartalmazó peptidet, ahol N jelentése egész szám 3 és 7 között, elõnyösen, X jelentése pozitívan töltött természetes és/vagy nem természetes aminosavoldallánc, Z jelentése az L, V, I, F és/vagy W által alkotott csoportból kiválasztott aminosav-oldallánc, és R 1 és R 2 egymástól függetlenül a H, NH 2, COCH 3, COH, legfeljebb aminosavoldalláncot tartalmazó peptid vagy peptidreakciós csoport vagy peptiddel vagy anélkül lévõ kapcsolómolekula által alkotott csoportból van kiválasztva; X R 2 a peptid C¹terminális aminosav-oldalláncának az amidja, észtere vagy tioésztere lehet (amit a továbbiakban A¹peptidnek nevezünk), és/vagy 2 30 3 40 4 0 60 immunstimuláns oligodezoxinukleinsav-molekula (ODN), amelynek a képlete az (I) általános képlet szerinti ahol R1 jelentése hipoxantin vagy uracil, bármelyik X jelentése O vagy S, bármelyik NMP jelentése 2 ¹dezoxinukleozid-monofoszfát vagy monotiofoszfát, amely a dezoxiadenozin¹, dezoxiguanozin¹, dezoxiinozin¹, dezoxicitozin¹, dezoxiuridin¹, dezoxitimidin¹, 2¹metil-dezoxiinozin¹, ¹metildezoxicitozin¹, dezoxipszeudouridin¹, dezoxiribózpurine, 2¹amino-dezoxiribózpurin¹, 6¹S-dezoxiguanin¹, 2¹dimetil-dezoxiguanozin- vagy N¹izopentenil-dezoxiadenozin-monofoszfát vagy monotiofoszfát által alkotott csoportból van kiválasztva, NUC jelentése 2 ¹dezoxinukleozid, amely a dezoxiadenozin¹, dezoxiguanozin¹, dezoxiinozin¹, dezoxicitozin, dezoxiuridin¹, dezoxitimidin¹, 2¹metil-dezoxiinozin¹, ¹metil-dezoxicitozin¹, dezoxipszeudouridin¹, dezoxiribózpurin, 2¹amino-dezoxiribózpurin¹, 6¹S-dezoxiguanin¹, 2¹dimetil-dezoxiguanozin- vagy N¹izopentenil-dezoxiadenozin által alkotott csoportból van kiválasztva, a és b értéke 0 és 0 közötti egész szám, feltéve, hogy a+b 4 és 0 közé esik, és B és E jelentése nukleinsavmolekulákban elõforduló gyakori ¹ és/vagy 3 ¹végcsoport (amit a továbbiakban I¹/U¹ODN -nek is nevezünk). Természetesen a találmány szerinti vakcina továbbá tartalmazhat más anyagokat is, például alkalmas gyógyászatilag elfogadható oldószereket vagy hordozókat, puffereket vagy stabilizálóanyagokat stb. A találmány szerinti vakcina tartalmazhat más vagy további adjuvánsokat is, különösen Al(OH) 3 adjuvánst (Alum). Az alum a leírás szerint ételemben magában foglalja az Al 3+ -alapú adjuvánsok humán és állati gyógyászatban és kutatásban alkalmazott minden formáját. Különösen magában foglalja az alumínium-hidroxid minden formáját, amint azt a Römpp,. kiadás, 139 140. oldalán definiálják, annak gél formáit, alumínium-foszfátot stb. A találmány szerint alkalmazandó polikationos peptidek vagy vegyület bármilyen olyan polikationos vegyület lehet, amely a WO97/30721 számú nemzetközi közzétételi irat szerinti jellemzõ hatásokat mutatja. Elõnyös polikationos vegyület a bázikus polipeptidek, szerves polikationok, bázikus poliaminosavak bármelyike, vagy ezek keverékei. Ezen poliaminosavaknak legalább 4 aminosav-oldallánc lánchosszúságának kell lennie. Különösen elõnyös anyagok a peptidkötéseket tartalmazók, mint például polilizin, poliarginin és olyan 6
1 HU 008 419 T2 2 polipeptidek, amelyek több mint %, elõnyösen több mint 0% bázikus aminosavat tartalmaznak, több mint 8, elõnyösen több mint aminosav-oldallánc tartományban, vagy ezek keverékei. Más elõnyös polikationokat és azok gyógyászatilag elfogadható készítményeit írja le a WO 97/30721 (például polietilénimin) és a WO 99/3828 számú nemzetközi közzétételi irat. Elõnyösen ezek a polipeptidek és 00 közötti aminosav-oldalláncot tartalmaznak, különösen 30 és 0 közötti oldalláncot. Ezeket a polikationos készítményeket kémiai úton vagy rekombináns módon állíthatjuk elõ, vagy természetes forrásokból származhatnak. Kationos (poli)peptidek lehetnek polikationos baktériumellenes mikrobiális peptidek. Ezen (poli)peptid lehetnek prokarióta vagy eukarióta eredetûek, vagy lehetnek kémiai úton vagy rekombináns módon elõállítottak. A peptidek tartozhatnak a természetben elõforduló antimikrobiális peptidek osztályába is. Gazdavédelmi peptidek vagy védõszerek szintén a találmány szerinti polikationos polimer elõnyös formáját képezik. Általában az adaptív immunrendszer egy végtermékének aktiválását (vagy gátlását) elõnyösen az APC¹k (beleértve a dendritikus sejteket) közvetítésével lehetõvé tevõ vegyületet alkalmazunk polikationos polimerként. Ezenfelül neuroaktív vegyületek, mint például a (humán) növekedési hormon (amint például a WO01/24822 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti) is alkalmazhatók immunstimulánsként (immunizálószerként). A természetes forrásokból származó polikationos vegyületek közé tartozik a HIV-REV és HIV-TAT (származtatott kationos peptidek, antennapedia peptidek, kitozán vagy kitin más származékai) vagy ezen peptidekbõl biokémiai vagy rekombináns úton származtatott más peptidek vagy fehérjék. Más elõnyös polikationos vegyületek a katelin vagy katelicidinnel rokon vagy abból származtatott anyagok, különösen az egér, szarvasmarha vagy különösen a humán katelicidinek és/vagy katelicidinek. Katelicidinnel rokon vagy abból származtatott anyagok tartalmazzák a katelicidin teljes szekvenciáját vagy annak aminosav-oldallánc hosszúságú részleteit. A származtatás lehet a természetes aminosav szubsztitúciója vagy módosítása olyan aminosavval, amely nincs a szokásos aminosav között. Ezenkívül további kationos oldalláncokat építhetünk be ilyen katelicidinmolekulákba. Ezek a katelicidinmolekulák elõnyösen kombinálhatók a találmány szerinti antigénnel/vakcinakészítménnyel. Azonban ezekrõl a katelin molekulákról meglepõ módon kiderült, hogy hatásosak adjuvánsként is az antigének mellett, további adjuvánsok hozzáadása nélkül. Tehát lehetséges az ilyen katelicidinmolekulák hatásos adjuvánsként történõ alkalmazása vakcinakészítményekben további immunaktiváló anyagokkal együtt vagy azok nélkül. A találmány szerinti vakcina elõnyösen A¹peptidként KLKL KLK¹t és/vagy I¹/U¹ODN-ként oligo-d(ic) 13 ¹t tartalmaz [az A¹peptid és oligo-d(ic) 13 kombinációját 2 30 3 40 4 0 60 IC31-nek is nevezzük]. Ez a két anyag különösen elõnyös a találmány szerint. A találmány szerinti vakcina CpG-motívumot tartalmazó oligodezoxinukleotidot is tartalmazhat immunmoduláló nukleinsavként. A találmány szerinti alkalmazandó immunmoduláló nukleinsavak lehetnek szintetikus, prokarióta és eukarióta eredetûek. Az eukarióta eredetûek esetében a DNS-nek a filogenetikai törzsfa alapján kevésbé fejlett fajból kell származnia (például rovarok, de mások is). A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint az immunogenikus oligodezoxinukleotid (ODN) szintetikusan elõállított DNS-molekula vagy ilyen molekulák keveréke. A találmány tárgykörébe tartoznak olyan ODN¹ek származékok vagy módosítások, mint például tiofoszfátszubsztituált analógok (tiofoszfát-oldallánc helyettesíti a foszfátot), amint például az US 723 33 és US 663 3 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban ismertetik, és más származékok és módosítások, amelyek elõnyösen stabilizálják az immunstimuláns készítmény(eke)t, de nem változtatják meg azok immunológiai tulajdonságait. Egy elõnyös szekvenciamotívum hat bázis hosszúságú DNSmotívum, amely egy (metilálatlan) CpG dinukleotidot tartalmaz, amelyet két ¹purin és két 3 ¹pirimidin szegélyez ( -Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr¹3 ). A találmány szerinti ODN-ekben található CpG motívumok gyakoribbak a mikrobiális, mint a magasabbrendû gerinces DNS-ben, és különbözõ metilációs mintázatokat mutatnak. Meglepõ módon az egér APC-ket stimuláló szekvenciák nem nagyon hatékonyak humán sejtek esetében. A találmány szerinti alkalmazandó elõnyös palindrom vagy nem palindrom ODN-eket ismertetnek például az A 1973/00, A 80/01 számú osztrák szabadalmi iratokban, az EP 0 468 A2 számú európai szabadalmi iratban, a WO 96/02, WO 98/16247, WO 98/188, WO 98/37919, WO 98/400, WO 98/281, WO 98/2962, WO 99/129 és WO 99/67 számú nemzetközi közzétételi iratokban, amelyek mindegyike hivatkozás útján a kitanítás részét képezik. ODN-eket/DNS-eket kémiai úton vagy rekombináns módon állíthatjuk elõ, vagy természetes forrásokból eredhetnek. Elõnyös természetes források a rovarok. A találmány szerinti vakcina polikationos peptidet és CpG-motívumot tartalmazó oligodezoxinukleotidot is tartalmazhat kombinációban. A CpG-ODN és polikationos peptid kombinációja javító hatású a vakcinakészítményekben, ami összehasonlítható az A¹peptid és I¹/U¹ODN¹ek kombinációjának hatásával, és nemcsak kombinálható A¹peptiddel és I¹/U¹ODN-ekkel, hanem akár alkalmazható is helyettük. Természetesen különbözõ immunstimuláns nukleinsavak (I¹/U¹ODN¹ek, CpG-ODN-ek ) és A¹peptid-variánsok (valamint más immunizálószerek) keverékeit is alkalmazhatjuk a találmány szerint. Korábban kimutatták (WO 02/1387 számú nemzetközi közzétételi irat), hogy a természetben elõforduló katelicidineredetû antimikrobiális peptidek vagy azok származékai immunválasz-stimuláló hatásúak és ezál- 7
1 HU 008 419 T2 2 tal nagyon hatásos I¹es típusú indukáló adjuvánsok (immunizálószerek). Az antimikrobiális peptidek fõ forrásai a neutrofilek és respiratorikus, gasztrointesztinális és genitourináris csatornát beborító epitéliális sejtek granulumai. Általában azt találták, hogy azok a mikrobiális támadásnak leginkább kitett anatómiai helyeken találhatók, szekretálódnak a testfolyadékokba vagy professzionális fagociták (neutrofilek) citoplazmatikus granulumaiban tárolódnak. A WO 02/3241 számú nemzetközi közzétételi iratban I¹es típusú indukáló adjuvánst (immunizálószert) tárnak fel, amely képes erõsen fokozni egy specifikusan együtt beadott antigén elleni immunválaszt, és ezáltal nagyon hatásos adjuváns, nevezetesen az A¹peptid, amely az R 1 XZXZ N XZX R 2 szekvenciát tartalmazza. Egy specifikusan elõnyös peptid a KLKLLLLLKLK. A természetben elõforduló antimikrobiális peptidek mellett szintetikus antimikrobiális peptideket is elõállítottak és vizsgáltak. A KLKLLLLLKLK NH 2 szintetikus antimikrobiális peptidrõl kimutatták, hogy szignifikáns kemoterápiás hatása van Staphylococcus aureussal megfertõzött egerekben; a humán neutrofilek aktiválódtak a szuperoxidanion (O 2 ) termelésére a sejtfelszíni kalretikulin útján. A K és L pontos számát és helyét kritikusnak találták a szintetikus peptid antimikrobiális hatása szempontjából. A találmány különösen hasznos, ha a vakcinát szubkután, intramuszkulárisan, intradermálisan vagy transzdermálisan adjuk be. Azonban más alkalmazási formák, mint például parenterális, intravénás, intranazális, orális vagy topikális alkalmazás is alkalmas a találmány szerint. A találmány szerinti parvovírus antigént összekeverhetjük adjuvánssal (immunizálószerrel) (készítmény) vagy másképpen specifikusan kiszerelhetjük, például liposzómaként, retard kiszerelésként stb. A találmány szerinti vakcinákat a szakember számára ismert hatásos mennyiségben adhatjuk be egyénnek. Az antigén mennyiségének és az immunizálószer mennyiségének az optimalizálását megállapított mennyiségekbõl kezdhetjük meg elérhetõ eljárások alkalmazásával. a találmány tárgya diagnosztikai reagenskészlet, amely találmány szerinti módosított VP1 ¹egyedi régiót, módosított VP1-kapszidfehérjét és segédreagenseket tartalmaz. A találmány egy még másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya diagnosztikai reagenskészlet, amely a találmány szerinti módosított VP1-kapszidfehérje fúziós termékét és segédreagenseket tartalmaz. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya diagnosztikai reagenskészlet, amely találmány szerinti rekombináns vírusszerû részecskét és segédreagenseket tartalmaz. a találmány tárgya a találmány szerinti módosított VP1 egyedi régió, a módosított VP1-kapszidfehérje, a VP2-kapszidfehérjével vagy anélkül, olyan ágensként, 2 30 3 40 4 0 60 amely módosítja a gazda foszfolipáz-a2-aktivitását, például génterápiával antiszensz KNS vagy RNSi alkalmazásával. a találmány tárgya a találmány szerinti módosított VP1- kapszidfehérje fúziós terméke, olyan ágensként, amely módosítja a gazda foszfolipáz-a2-aktivitását. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti rekombináns vírusszerû részecske, olyan ágensként, amely módosítja a gazda foszfolipáz-a2-aktivitását. A találmányt tovább szemléltetjük a következõ példákkal és ábrákkal, amelyekbõl további jellemzõk, megvalósítási módok és elõnyök következhetnek. Nyilvánvaló, hogy a példákat csak szemléltetésként adjuk, és nem a feltárást korlátozóként. Az 1. ábra a vad típusú és mutáns fehérje immunológiai összehasonlítását mutatja be. A 2. ábra a parvovírus VP1 fehérje egymás alá rendezését mutatja be. 1. példa Az enzimaktivitás nélküli VP1/VP2 antigének elõállítását elérhetjük azon oldalláncok helyspecifikus mutagenezissel való megváltoztatásával, amelyek az aktív centrum részei. Azon tény ellenére, hogy a Ca 2+ -függõ foszfolipáz-a2-aktivitású celluláris enzimek általános mérete és a virális VP1 egyedi régió mérete különbözõ, az aminosavszekvenciák egymás alá rendezése számos konzervált oldalláncot tárt fel az enzim aktív centrumát képviselõ régióban. Konzervált aminosavakat figyeltünk meg a következõ pozíciókban: 3. oldallánc: hisztidin; 7. oldallánc: tirozin; 162. oldallánc: lizin; 168. oldallánc: tirozin; 19. oldallánc: aszparaginsav. A megfelelõ aminosavakat a szarvasmarha hasnyálmirigyben foszfolipáz-a2¹je katalitikus triádjának részeként írták le, és szerepet játszanak a szubsztrát orientálásában és specifitásban. Tehát végrehajtottuk a VP1 egyedi régióban lévõ ezen oldalláncok helyspecifikus mutagenezissel történõ megváltoztatását mutáltatott láncindítókkal és átfedõ lánchosszabbítással végzett polimeráz-láncreakció alkalmazásával, amint eredetileg Ho és munkatársai (6) ismertették. Amint a 2. táblázatban bemutatjuk, a VP1 egyedi régió foszfolipáz-a2-szerû aktivitását csökkenthetjük a 7. és 168. tirozin egyszerre fenil-alaninra való kicserélésével és a 162. lizin leucinra való változtatásával. Azonban a 19. aszparaginsav alaninra való kicserélése a virális enzim aktivitásának váratlan fokozódásához vezetett, ami határozott különbségekre utal a virális és celluláris foszfolipáz¹a2 enzimek között. Az enzimatikus aktivitás majdnem teljes megszüntetését csak a 3. hisztidin alaninra történõ változtatásával lehetett elérni. Levonhatjuk a következtetést, hogy ez az aminosav-oldallánc az aktív centrum része és a legfontosabb a VP1 egyedi régió enzimatikus aktivitása szempontjából. A megváltoztatása a virális foszfolipáz-a2-szerû aktivitás teljes megszüntetésével jár együtt. 8
1 HU 008 419 T2 2 1. táblázat A parvovírus B19-fertõzéssel kapcsolatosnak tartott autoimmun betegségek Érintett szervek Betegség Ízületek arthralgiák arthritisz monoarthritisz oligoarthritisz poliarthritisz reumatoid arthritisz fiatalkori idiopátiás arthritisz Kötõszövet/erek szisztémás lupus erythematosus (SLE) vaszkulitisz leukoklasztikus vaskulitisz Purpura Henlein-Schoenoch Papular-purpuric gloves-and-socks szindróma (PPGSS) Kawasaki-betegség? óriássejtes arteritisz (GCA) Polyarteritis nodosa Wegener-féle granulomatózis dermatomiozitisz Vérsejtek autoimmun neutropénia autoimmun thrombocitopénia idiopátiás thrombocytopenia purpura (ITP) autoimmun hemolitikus anémia vírusasszociált hemofagocitikus szindróma (VAHS) 2. táblázat Enzimatikus phopholipase-a2-szerû aktivitás a parvovírus B19 VP1 egyedi régióban és helyspecifikus mutagenezissel létrehozott variánsaiban A helyspecifikus mutagenezissel megváltoztatott pozíció Enzimaktivitás (%) Vad típus, 1¹es genotípus 0 Aktív centrum mutánsok Hisztidin 3 alanin 0 Tirozin 7 fenil-alanin Lizin 162 leucin 61 Tirozin 168 fenil-alanin 4 Aszparaginsav 19 alanin 4 Nem aktívcentrum-mutánsok Leucin 76 glutamin, fenil-alanin 81 alanin 80 Izoleucin 66 leucin, leucin 70 glutamin 144 Leucin 9 glutamin, leucin 62 glutamin 143 Nem konzervált régiókban lévõ variációk Parvovírus B19, VP1 egyedi régió 2¹es genotípus/berlin törzs 70 Ala18 asp, gln21 lys, asn68 ser, asn72 asp, ser73 thr, ser96 pro, 2 30 3 40 4 0 60 ala1 thr, vall23 ile, val192 ala Parvovírus B19, VP1 egyedi régió 3¹as genotípus/v9 törzs 9 Lys4 thr, ser thr, gly6 asn, asp12 ser, lys17 gln, ala18 asp, gln21 lys, glu2 gln, val30 ala, asn68 ser, ser98 asn, his0 ser, val123 ile, ser144 asn, val192 ala 2. példa A vad típusú és mutáns VP1 fehérjék közötti immunogenitás összehasonlító vizsgálata Egerek oltása. Nõstény Balc/C egerek ötös csoportjait oltottuk be VP1 egyedi régió/vad típus és a VP1 egyedi régió/h3a mutáns 0 g tisztított készítményével komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva. Retrobulbáris vérmintákat vettünk le a 0., 3., 7.,., 14., 18. és 28. napokon az oltás után. A szérumokat teszteltük a VP1 egyedi régió/vad típus elleni IgG ellenanyagok jelenlétére ELISA vizsgálati eljárásokban. Fehérjetermelés. A VP1 egyedi régió/vad típust és a VP1 egyedi régió/h 3A¹t kódoló szekvenciákat beklónoztuk a pet21a_int T7¹expressziós vektorba, fúzióban intein- és kitinkötõ doménekkel, amint korábban ismertették (Dorsch és mtsai., 01, Dorsch és mtsai., 02). A konstrukciókat bejuttattuk E. coli BL21 törzsbe. A baktériumokat0 g/ml ampicillint tartalmazó LB (luria broth) tápközegre oltottuk le és 37 C¹on inkubáltuk. A rekombináns fehérje expresszióját 1 mm IPTG legalább 3 órás tenyészethez való hozzáadásával indukáltuk. A baktériumokat centrifugálással begyûjtöttük, újra felszuszpendáltuk 30 ml mm HEPES, 1 mm EDTA, 0 mm NaCl, ph 8, pufferben, és lizáltuk French Press alkalmazásával. A törmeléket lecentrifugáltuk 000 g¹n. A felülúszót felvittük kitinoszlopra (NEB) FPLC-rendszer (Pharmacia Biosystems, Freiburg) alkalmazásával. Az oszlopot megmostuk 2 térfogat mm HEPES, 1 mm EDTA, 0 mm NaCl, ph 8, pufferrel, 8 térfogat mm HEPES, 1 mm EDTA, 2 mm NaCl, ph 8, pufferrel és 2 térfogat mm HE- PES, 1 mm EDTA, 0 mm NaCl, ph 8, pufferrel. Azután a fehérjét eluáltuk 3 térfogat 0 mm DTT alkalmazásával mm HEPES, 1 mm EDTA, 0 mm NaCl, ph 8, pufferben. A frakciókat SDS-PAGE-val és ezüst festéssel teszteltük a rekombináns fehérjékre. A pozitív frakciókat egyesítettük, és betöményítettük Centripluskoncentrátor (3 kd kizárási térfogat; Amicon, Beverly, USA) alkalmazásával. A fehérjekoncentrációt PBS (0,9 mm KH 2 PO 4, 8,0 mm Na 2 HPO 2 12H 2 O, 2,7 mm KCl, 137 mm NaCl) elleni dialízis után határoztuk meg Bradford-vizsgálati eljárás (Bio Rad Laboratories, Hercules, USA) alkalmazásával. ELISA vizsgálati eljárás. Mikrotiterlemezeket (Maxisorb, Nunc, Wiesbaden, FRG) vontunk be éjszakán keresztül tisztított fehérjével (VP1 egyedi régió/vad típus, 0 ng/mérõhely) 0, M NaCl¹ot tartalmazó 0,2 M Na- 9
1 HU 008 419 T2 2 CO 3, ph 9,2 pufferben. A szérumokat1:0 hígításban alkalmaztuk PBS/0,% Tween pufferben, és az IgG ellenanyagokat második ellenanyagként HRP-hez kapcsolt poliklonális nyúl antiegér IgG alkalmazásával detektáltuk (hígítás 1:000 PBS/0,% Tween, Dako, Hamburg FRG) és szubsztrátként TMB-vel, az optikai denzitást 40 nm¹en határoztuk meg. Eredmények Az oltás utáni 7. naptól kezdve a VP1 egyedi régió/vad típus elleni IgG ellenanyagok egyaránt detektálhatók voltak azokban az egerekben, amelyek a VP1 egyedi régió/vad típus és VP1 egyedi régió/h3a tisztított preparátumaival voltak beoltva (1. ábra). Az ellenanyagok mennyisége folyamatosan emelkedett az oltás utáni 28. napig. A VP1 egyedi régió/vad típussal vagy a VP1 egyedi régió/h 3A-val oltott egerek reaktivitásának a különbségét nem lehetett megfigyelni. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mindkét fehérje erõsen antigenikus. A variáns VP1 egyedi régió/h3a ellen indukált ellenanyagok képesek kötõdni a VP1 egyedi régió/vad típushoz, amelyet antigénként alkalmaztunk az ELISA-ban, mai nagyfokú keresztreaktivitásra utal. A komplett Freund-féle adjuvánsban emulgeált PBS-sel oltott egerekben nem alakult ki szignifikáns mennyiségû VP1-specifikus ellenanyag. A vad típusú VP1 egyedi régió antigént és a mutáns antigént (His3Ala) egerekbe oltottuk. A VP1- specifikus ellenanyag-termelést ELISA-val elemeztük. Nem figyeltünk meg különbségeket a két antigén VP1- specifikus ellenanyag-termelés kiváltására való képességében. A mutáns His3Ala antigén elleni ellenanyagok hasonló aktivitásúak voltak a vad típusú VP1 egyedi régió kötésére és viszont. Ez arra utal, hogy a parvovírus B19 VP1 egyedi régió mutáns His3Ala variánsának összehasonlítható a képessége ellenanyag termelésének kiváltására, mint a vad típusú fehérjedomén. Mivel a fõ semlegesítõ epitópok ismert módon a virális foszfolipáz-a2-szerû enzim aktív centrumától eltérõ fehérjerészeken helyezkednek el, és nem befolyásolta azokat a beépített mutációk egyike sem, a fehérje immunogenitására gyakorolt hatás nem valószínû (7). A két megközelítési mód VP1/VP2-kapszidok elõállítása rekombináns S. cerevisiaeben és a foszfolipáz- A2-szerû aktivitás megszüntetése kombinációja potenciálisan képes olyan vakcina létrehozására, amely lehetõvé teszi a parvovírus B19 fertõzés megelõzését a fokozott leukotrién és prosztaglandin termelés miatti csökkent számú mellékhatás nélkül, és annak veszélye nélkül, hogy autoimmun reakciókat indukálna, amelyek élethosszig tartó reumás betegségeket eredményezhet. 2 30 3 40 4 0 60 Ábrafeliratok 1. ábra. IgG ellenanyagok kialakulása a VP1 egyedi régió/vad típus ellen. Egerek ötös csoportjait oltottuk be vagy a VP1 egyedi régió/vad típussal, a VP1 egyedi régió/h3a-val vagy PBS-sel. A jelzett napokkal az oltás után vett szérummintákat teszteltünk ELISA-ban a VP1 egyedi régióval antigénként. Minden esetben egér egyedi mintáinak az átlagos értékeit határoztuk meg. Hivatkozások 1. Cossart Y. E., Cant B., Field A. M., Widdows D. 197, Lancet 1, 72. 2. Paver W. K., Clarke S.K.R. 1976, J. Clin. Microbiol. 4, 67. 3. Shneerson J. M., Mortimer PP., Vandervelde E. M. 1980, Br. Med. J., 280,80. 4. Anderson M., Lewis E., Kidd I. M., Hall S. M., Cohen B. J. 1984, J. Hyg. (London) 93, 8.. Chorba T., Coccia P., Holman R. C., Tattersall P., Anderson L. J., Sudman J., Young, N. S., Kurczynski E., Saarinen U. M., Moir R. 1986, J. Infect. Dis. 4, 383. 6. Blümel J., Schmidt I., Effenberger W., Seitz H., Willkommen H., Brackmann H. H., Lo J., Eis-Hübinger A. M. 02, Transfusion, 42, 1473. 7. Hayakawa F., Imada K., Towatari M., Saito H. 02, Br. J. Haematol., 118, 1187. 8. Prowse C., Ludlam C. A., Yap P. L. 1997, Vox Sanguinis, 72, 1. 9. Yaegashi N., Niinuma T., Chisaka H., Watanabe T., Uehara S., Okamura K., Moffat S., Sugamura K., Yajima A. 1998,37,28.. Ozawa K., Young N. 1987, J. Virol., 62, 208. 11. Brown K. E., Anderson S. M., Young N. S. 1993, Science, 262, 114. 12. Bültmann B. D., Klingel K., Sotlar K., Bock, C. F., Kandolf R. 03, Virchows Arch. 442, 8. 13. Cassinotti P., Siegl G., Michel B. A, Bruhlmann P. 1998 J. Med. Virol., 6, 199. 14. Eis-Hübinger A. M., Reber U., Abdul-Nour T., Glatzel U., Lauschke H., Putz U. 01, J. Med. Virol.; 6, 39.. Hokynar K., Brunstein J., Söderlund-Venermo M., Kiviluoto O., Partio E. K., Konttinen Y., Hedman K. 00. J. Gen. Virol., 81,17. 16. Söderlund M., von Essen R., Haapasaari J., Kiistala U., Kiviluoto O., Hedman K. 1997, Lancet 349, 63. 17. Vuorinen T., Lammintausta K., Kotilainen P., Nikkari S. 02 J. Clin. Virol., 2, 217. 18. Cherry J. D. 1994, Adv. Pediatr., 46,24. 19. Török T. J. 1997, Anderson L. J., Young N. S. (Ed). Human parvovírus B19. Monogr Virol, Vol.. Basel: Karger; 61.. Heegard E. D., Brown K. E. 02, Clin. Microbiol. Rev., 48. 21. Langnas A. N., Markin R. S., Cattral M. S., Naides S. J. 199, Hepatology 22, 1661 22. Bousvaros A., Sundel R., Thome G. M., Mclntosh K., Cohen M., Erdman D. D., Perez-Atayde A., Finkel T. H., Colin A. A. 1998, Pediatr. Pulmonol. 26, 36.
1 HU 008 419 T2 2 23. Wardeh A., Marik P. 1998, J. Internal Med., 244, 27. 24. Yoto Y., Kudoh T., Haseyama K., Tsutsumi H. 01, Lancet, 38, 2168. 2. Rogers B. B., Singer, D. B., Mak S. K., Gary G. W., Fikrig M. K., McMillan P. M. 1993, Obstet. Gynecol. 81, 402. 26. Nyman M., Tolfvenstam T., Petersson K., Krassny C., Skjolde-brand-Sparre L., Broliden K. 02, Obstet. Gynecol. 99, 79. 27. Miller E., Fairley C. K., Cohen, B. J., Seng C. 1998, B. J. Obstet. Gynaecol., 174. 28. Knöll A., Louwen F., Kochanowski B., Plentz A., Stüssel J., Beckenlehner K., Jilg W., Modrow S. 02, J. Med. Virol. 67, 29. 29. Kurtzman G. J., Ozawa K., Cohen B., Hanson G., Oseas R., Blase R. M., Young N. S. 1987, N. Engl. J. Med. 317,287. 30. Pont J., Puchhammer-Stöckl E., Chott A., Popow-Kraupp T., Kienzer L, Postner G., Honetz N. 1992, Br. J. Haematol. 80, 160. 31. Scheurlen W., Ramasubbu K., Wachowski O., Hemauer A., Modrow S. 01, J. Clin. Virol.,, 173. 32. Hanada T., Koike K., Hirano C., Takeya T., Suzuki T., Matsunaga Y., Takita H. 1989, Eur. J. Haematol., 42, 77. 33. Lefrere J. J., Courouce A. M., Kaplan C. 1989 Lancet, 1, 279. 34. Murray J. C., Kelley P. K., Hogrefe W. R., McClain K. L. 1994, Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 16, 314. 3. Hida M., Shimamura J., Ueno E., Watanabe 00, J. Pediatr. Int., 42, 708. 36. Naides S. J., Scharosch L. L. Foto F., Howard E. J. 1990, Arthritis. Rheum. 33, 1297. 37. Murai C., Munakata Y., Takahashi Y.; Ishii T., Shibata S., Muryoi T., Funato T., Nakamura M., Sugamua K., Sasaki F. T. 1999, Ann. Rheum. Dis 8, 130. 38. Nikkari S., Luukkainen R., Möttönen T., Meurman O., Hannonen P., Skurnik M., Toivanen P. 1994, Ann. Rheum. Dis. 3, 6. 39. Moore T. L. 00, Curr. Opin. Rheumatol. 12, 289. 40. Lehmann H. W., Kühner L., Beckenlehner K., Müller-Godeffroy E., Heide K. G., Küster R. M., Modrow S. 02, J. Clin. Virol., 2, 13. 41. Nocton J. J., Miller L. C., Tucker L. B., Schaller J. G., 1993, J. Pediat., 122, 186. 42. Mimori A., Misaki Y., Hachiya T., Ito K., Kano S. 1994, Rheum. Int., 14, 87. 43. Oguz F., Akdeniz C., Unuvar E., Kucukbasmaci O., Sidal M. 02, J. Paediatr. Child Health 38, 38. 44. Lehmann H.W., Knöll A., Küster R. M., Modrow S. 03, Arthritis Rheum. 48, 1631. 4. Negro A., Regolisti G., Perazzoli F., Coghi P., Tumiati B., Rossi E. 01, Ann. Ital. Med. Int., 16, 12. 46. Tovari E., Mezey L, Hedman K., Czirjak L. 02, Ann. Rheum. Dis., 61, 662. 47. Cope A. P., Jones A., Brozovic M., Shafi M. S., Maini R. N. 1992, Ann. Rheum. Dis., 1, 803. 2 30 3 40 4 0 60 48. Trapani S., Ermini M., Falcini F. 1999, Semin. Arthr. Rheum. 28, 319. 49. Hemauer A., Beckenlehner K., Wolf H., Lang B., Modrow S. 1999, J. Clin. Virol., 14, 73. 0. Hsu T.¹C., Tsay G. J. 01, Rheumatol., 40, 2. 1. Diaz F., Collazos J., Mendoza F., de la Viuda J. M., Cazallas J., Urkijo J. C., Flores M. 02, Clin Microbiol Infect., 8, 1. 2. Landenberg v. P., Lehmann H. W., Knöll A., Dorsch S., Modrow S. 03, Arthritis Rheum. 48, in press. 3. Cervera R., Piette J. C., Font J., Khamashta M. A., Shoenfeld Y., Camps M. T., Jacobsen S., Lakos G., Tincani A., Kontopoulou-Griva L, Galeazzi M., Meroni P. L., Derksen R. H., de Groot P. G., Grommnica-Dile E., Baleva M., Mosca M., Bombardieri dez-nebro A., Boffa M. C., Hughes G. R., Ingelmo M. 02, Arthritis Rheum., 46, 19. 4. Dorsch S., Liebisch G., Kaufmann B., von Landenberg P., Hoffmann J. H., Drobnik W., Modrow S. 02, J. Virol. 76, 14.. Ballou W. R., Reed, J. L., Noble, W., Young N. S. 03, J. Infect. Diseases, 187, 67. 6. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K., Pease L. R. 1989, Gene 77, 1. 7. Gigler A., Dorsch S., Hemauer A., Williams C., Young N. S., Zolla-Pazner S., Goray M. K., Modrow S. 1999, J. Virol., 73,1974. 8. Arni R. K., and R. J. Ward. 1996. Foszfolipáz A2 a structural review. Toxicon 34: 827 841. 9. Moore, T. L., R. Bandlamudi, S. M. Alam, and G. Nesher. 1999. Parvovirus infection mimicking systemic lupus erythematosus in a pediartric population. Semin. Arthritis Rheum. 28: 314 318. 60. Servant A., Laperche S., Lallemand F., Marinho V., De Saint Maur G., Mentet J. F., Garbarg-Chenon A. Genetic diversity within human erythrovíruses: identification of three genotypes. J. Virol. 02 76:9124 34. 61. Liefeldt, L., Plentz, A., Klempa, B., Kershaw, O., Endres, A. S., Raab, U., Neumayer, H. H., Meisel, Hans G. Fa bender, H., Modrow, S. Recurrent high level parvovírus B19/genotype 2 viremia in a renal transplant recipient analyzed by real-time PCR for simultaneous detection of genotypes 1 to 3. J. Med. Virol., in press. 62. Dorsch, S., Kaufmann, B., Schaible, U., Prohaska, E., Wolf, H., Modrow, S. (01) The VP1-unique region of parvovirus B19: Amino acid variability and antigenic stablity. J. Gen. Virol., 82, 191 199. 63. Dorsch, S., Liebisch, G., Kaufmann, B., Hoffmann, J. H., v. Landenberg, P., Dropnik, W., Modrow, S. (02) The VP1-unique region of parvovírus B19 and its constituent foszfolipáz A2¹like activity. J. Virol., 76, 14 18. A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása: 4. azonosító számú szekvenciához: <223> adjuváns 11
HU 008 419 T2 Szekvencialista <1> Intercell AG <1> Parvovirus <130> r490 <140> EP0799042.6 <141> 0 09 23 <0> EP0440180.7 <1> 04 09 24 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <2> 1 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovirus B19 <400> 1 Met Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala 1 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gly 2 30 Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser 3 40 4 Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala 0 60 Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His 6 70 7 80 Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His Pro His Ala Leu Ser Ser 8 90 9 Ser Ser Ser His Ala Glu Pro Arg Gly Glu Asn Ala Val Leu Ser Ser 0 1 Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr 1 1 12 Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser 130 13 140 Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu 14 0 160 Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu 16 170 17 Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val 180 18 190 Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His 19 0 Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys 2 2 2 Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala 22 230 23 240 12
HU 008 419 T2 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala 24 20 2 Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu 260 26 270 Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala 27 280 28 Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile 290 29 300 Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 30 3 3 3 Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu 32 330 33 Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu 340 34 30 Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val 3 360 36 Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr 370 37 380 Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu 38 390 39 400 Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val 40 4 4 Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala 4 42 430 Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu 43 440 44 Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ser Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val 40 4 460 Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr 46 470 47 480 Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly 48 490 49 Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro 00 0 Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu 2 Gly Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser 30 3 40 Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val 4 0 60 13
HU 008 419 T2 Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile 6 70 7 Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys 80 8 90 Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu 9 600 60 Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly 6 6 6 Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser 62 630 63 640 Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys 64 60 6 Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly 660 66 670 Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu 67 680 68 Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr 690 69 700 Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 70 7 7 7 Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val 72 730 73 Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 740 74 70 Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro 7 760 76 Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu 770 77 780 <2> 2 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovirus B19 <400> 2 Met Ser Lys Lys Ser Asp Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala 1 Lys Asp Val Tyr Lys Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Glu 2 30 Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser 3 40 4 Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala 0 60 14
HU 008 419 T2 Arg Ile Lys Ser Asn Leu Lys Asp Thr Pro Asp Leu Tyr Ser His His 6 70 7 80 Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Phe Asp His Pro His Ala Leu Ser Pro 8 90 9 Ser Ser Ser His Thr Glu Pro Arg Gly Glu Asp Ala Val Leu Ser Ser 0 1 Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Ile Gln Leu Pro Gly Thr 1 1 12 Asn Tyr Ile Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser 130 13 140 Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu 14 0 160 Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu 16 170 17 Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Ala 180 18 190 Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His 19 0 Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys 2 2 2 Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala 22 230 23 240 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala 24 20 2 Thr Phe Thr Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu 260 26 270 Ile Pro Tyr Glu Pro Glu His Arg Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala 27 280 28 Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile 290 29 300 Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 30 3 3 3 Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu 32 330 33 Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu 340 34 30 Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val 3 360 36 Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr 370 37 380
HU 008 419 T2 Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu 38 390 39 400 Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Ala 40 4 4 Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala 4 42 430 Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Glu Leu 43 440 44 Leu Gly Thr Gly Gly Ser Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val 40 4 460 Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr 46 470 47 480 Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly 48 490 49 Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro 00 0 Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu 2 Gly Asp Thr Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser 30 3 40 Thr Gly Thr Ser Gln Ser Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val 4 0 60 Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile 6 70 7 Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys 80 8 90 Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu 9 600 60 Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Ile His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly 6 6 6 Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser 62 630 63 640 Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys 64 60 6 Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly 660 66 670 Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu 67 680 68 Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr 690 69 700 16
HU 008 419 T2 Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 70 7 7 7 Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val 72 730 73 Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 740 74 70 Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro 7 760 76 Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu 770 77 780 <2> 3 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovirus B19 <400> 3 Met Ser Lys Thr Thr Asn Lys Trp Trp Glu Ser Ser Asp Lys Phe Ala 1 Gln Asp Val Tyr Lys Gln Phe Val Gln Phe Tyr Glu Lys Ala Thr Gly 2 30 Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser 3 40 4 Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala 0 60 Arg Ile Lys Ser Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His 6 70 7 80 Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His Pro His Ala Leu Ser Ser 8 90 9 Ser Asn Ser Ser Ala Glu Pro Arg Gly Glu Asn Ala Val Leu Ser Ser 0 1 Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Ile Gln Leu Pro Gly Thr 1 1 12 Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Asn 130 13 140 Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu 14 0 160 Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu 16 170 17 Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Ala 180 18 190 Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His 19 0 17
HU 008 419 T2 Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys 2 2 2 Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala 22 230 23 240 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Thr Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala 24 20 2 Thr Phe Thr Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu 260 26 270 Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala 27 280 28 Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile 290 29 300 Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 30 3 3 3 Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu 32 330 33 Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu 340 34 30 Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val 3 360 36 Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr 370 37 380 Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu 38 390 39 400 Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val 40 4 4 Gly Glu Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala 4 42 430 Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Glu Leu 43 440 44 Leu Gly Thr Gly Gly Ser Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Ala Val 40 4 460 Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr 46 470 47 480 Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly 48 490 49 Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro 00 0 Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Ile Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu 2 18
HU 008 419 T2 Gly Asp Asn Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser 30 3 40 Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val 4 0 60 Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile 6 70 7 Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys 80 8 90 Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu 9 600 60 Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly 6 6 6 Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser 62 630 63 640 Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys 64 60 6 Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly 660 66 670 Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu 67 680 68 Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr 690 69 700 Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 70 7 7 7 Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val 72 730 73 Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 740 74 70 Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro 7 760 76 Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu 770 77 780 <2> 4 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <2> <223> adjuvant <400> 4 Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys 1 19
1 HU 008 419 T2 2 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 2 30 3 40 4 0 60 1. Parvovírus B19 módosított VP1-kapszidfehérjéje, amelynek csökkent a foszfolipáz-a2-szerû enzimaktivitása, összehasonlítva a parvovírus B19 1. azonosító számú szekvencián bemutatott vad típusú VP1-kapszidfehérjéjével, ahol egy vagy több konzervált aminosav a foszfolipáz¹a2 aktív centrumában meg van változtatva a 3. hisztidin pozíciójában, a 7. tirozin pozíciójában, a 162. lizin pozíciójában és/vagy a 168. tirozin pozíciójában. 2. Az 1. igénypont szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, azzal jellemezve, hogy a 3. hisztidin alaninra van változtatva. 3. Az 1. igénypont szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, azzal jellemezve, hogy a 7. tirozin fenil-alaninra van változtatva. 4. Az 1. igénypont szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, azzal jellemezve, hogy a 162. lizin leucinra van változtatva.. Az 1. igénypont szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, azzal jellemezve, hogy a 168. tirozin fenil-alaninra van változtatva. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, azzal jellemezve, hogy az aminosav-oldalláncok megváltoztatása helyspecifikus mutagenezissel van végezve. 7. Izolált nukleinsavmolekula, amely az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérjét kódolja. 8. Rekombináns expressziós vektor, amely 7. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz. 9. A 8. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a parvovírus B19 VP2- kapszidfehérjéjét is tartalmazza.. A 9. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a módosított VP1-kapszidfehérje fuzionáltatva van a VP2-kapszidfehérjéhez. 11. Gazdasejt, amely a 8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns expressziós vektort tartalmaz. 12. A 11. igénypont szerinti gazdasejt, amely E. coli, élesztõ, elõnyösen Saccharomyces cerevisiae, vagy állati sejt. 13. Eljárás az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérje vagy a. igénypont szerinti, módosított VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje fúziós termék elõállítására, a 11. vagy 12. igénypont szerinti gazdasejt alkalmazásával. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a módosított VP1-kapszidfehérje és/vagy a módosított VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje fúziós terméke izolálva és/vagy tisztítva van.. A módosított VP1-kapszidfehérje vagy a módosított VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje fúziós terméke, amely a 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárással állítható elõ. 16. Az 1 6. és. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, vagy a VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje. igénypont szerinti fúziós terméke, gyógyszerként történõ alkalmazásra. 17. Az 1 6.,. és 16. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérje a VP2-kapszidfehérjével vagy anélkül alkalmazása parvovírus B19- fertõzés és/vagy parvovírus B19-cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. 18. A VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje. vagy 16. igénypont szerinti fúziós termékének alkalmazása parvovírus B19-fertõzés és/vagy parvovírus B19-cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a kezelés a következõk ellen irányul: arthralgiák; arthritisz; elõnyösebben monoarthritisz, oligoarthritisz, poliarthritisz, reumatoid arthritisz és/vagy fiatalkori idiopátiás arthritisz; szisztémás lupus erythematosus (SLE); vaszkulitisz, elõnyösebben leukoklasztikus vaszkulitisz, Purpura Henlein-Schoenoch, Papular-purpuric gloves-and-socks syndrome (PPGSS), Kawasaki-betegség, óriássejtes arteritisz (GCA), polyarteritis nodosa és/vagy Wegener s granulomatózis; dermatomiozitisz; autoimmun neutropénia; autoimmun trombocitopénia; idiopátiás thrombocytopenia purpura (ITP); autoimmun hemolitikus anémia; és/vagy vírusasszociált hemofagocitikus szindróma (VAHS).. Az 1 6. és. és 16. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérje, vagy a VP1- kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje. vagy 16. igénypont szerinti fúziós termékének alkalmazása tesztelendõ mintában található B19 VP1 vírusfehérje elleni ellenanyagok detektálására szolgáló vizsgálati eljárásban. 21. A 11. vagy 12. igénypont szerinti gazdasejtek alkalmazása tesztelendõ mintában található B19 VP1 vírusfehérje elleni ellenanyagok detektálására szolgáló vizsgálati eljárásban. 22. Rekombináns vírusszerû részecskék, amelyek 1 6. vagy. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti módosított VP1-kapszidfehérjékbõl állnak a VP2-kapszidfehérjével vagy anélkül. 23. Rekombináns vírusszerû részecskék, amelyek módosított VP1-kapszidfehérje és VP2-kapszidfehérje. vagy 16. igénypont szerinti fúziós termékébõl állnak. 24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti rekombináns vírusszerû részecskék alkalmazása parvovírus B19- fertõzés és/vagy parvovírus B19-cel kapcsolatos autoimmun és reumás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. 2. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a kezelés a következõk ellen irányul: arthralgiák; arthritisz; elõnyösebben monoarthritisz, oligoarthritisz, poliarthritisz, reumatoid arthritisz és/vagy fiatalkori idiopátiás arthritisz; szisztémás lupus erythematosus (SLE); vaszkulitisz, elõnyösebben leukoklasztikus vaszkulitisz, Purpura Henlein-Schoenoch, Papular-purpuric gloves-and-socks syndrome