Vér és szöveti sejteken megjelenő polimorf jellegek heterogén csoport genetikai szempontok szerinti csoportosítás i) Vörösvérsejttel közös antigének ( ABO, Lewis, Ii, P) ii) HLA antigének (HLA-Io, HLA-IIo) iii) thrombocyta/granulocyta specifikus antigének (HPA/HNA) az antigén eredete szerinti csoportosítás i) Sejtmembrán struktúra ii) Plazmából adszorbálodott molekula (ABH, P, Lewis, I, HLA-Io.) az antigén kémiai természete szerinti csoportosítás i) Glikoszfingolipid (ABH, P, Lewis, I) ii) Glikoprotein (HLA, HPA, HNA) Toldi J.: Polimorf jellegek a vérsejteken (GK2018)
Thrombocytákon megjelenő polimorf jellegek a vörösvérsejten megjelenő közös antigének ( ABO, Lewis, Ii, P) HLA antigének csak a thrombocytákra jellemző polimorf struktúrák (HPA-1 15) HPA rendszer antigén jelölés eredeti elnevezés antigén gyakoriság a kaukázusi szerző, a publikáció éve antigén struktúra Monoklónális antitest besorolás (CD) epitop pontmutáció helye a génben HPA-1a Zw(a), Pl A1 97,9 van Logham, 1959; HPA-1 Shulmann, 1961; van GPIIIa CD61 Leu33Pro T176C HPA-1b Zw(b), Pl A2 28,8 der Weerdt, 1963 HPA-2a Ko b van der Weerdt, 99,9 HPA-2 1961 HPA-2b Ko a, Sib a van der Weerdt, GPIbά CD42b Thr145Met C482T 13,2 1965 HPA-3a Bak a, Lek a von dem Borne, 80,9 HPA-3 1980 GPIIb CD41 Ile843Ser T2621G HPA-3b Bak b 69,8 Kickler, 1988 HPA-4 HPA-5 HPA antigének (HPAs) HPA-4a Yuk b, Pen a 99,9 Friedman, 1985 HPA-4b Yuk a, Pen b 0,1 Shibata, 1986 HPA-5a Br b, Zav b 99 Kiefel, 1988 HPA-5b Br a, Zav a, Hc a 19,7 Kiefel, 1989 HPA-6bw Ca a, Tu a Kekomaki, 1993 GPIIIa CD61 Arg489Gln G1544A HPA-7bw Mo a Kuijpers, 1993 GPIIIa CD61 Pro407Ala C1297G HPA-8bw Sr a Kroll, 1990 GPIIIa CD61 Arg636Cys C1984T HPA-9bw Max a Noris, 1995 GPIIb CD41 Val837Met G2602A HPA-10bw La a Peyruchaud, 1997 GPIIIa CD61 Arg62Gln G263A HPA-11bw Gro a Simsek, 1994 GPIIIa CD61 Arg633His G1976A HPA-12bw Iy a Kiefel, 1995 GPIbβ CD42c Gly15Glu G119A HPA-13bw Sit a Santoso, 1999 GPIa CD49b Thr799Met C2483T HPA-14bw Oe a Santoso, 2002 GPIIIa CD61 Lys611del 1909_1911delAAG GPIIIa GPIa CD61 CD49b Arg143Gln Glu505Lys G506A G1600A Toldi J.: Polimorf jellegek a vérsejteken (GK2018) 15a Gov b 74 Kelton, 1990 HPA-15 CD109 CD109 Ser682Tyr C2108A 15b Gov a 81 Smith, 1995 HPA-16bw Duv a Jallu, 2002 GPIIIa CD61 Thr140Ile C497T Metcalfe et al. Nomenclatura of human platelet antigens Vox Sanq. 2003; 85:240-245
Thrombocyta antigén ellenes antitestek Alloimmunizáció thrombocyta antigénekre ITP Felnőttek Thrombocyta refrakter állapot PTP (poszt transzfúziós purpura) Újszülöttek Neonatal alloimmun thrombocytopenia - NAIT Toldi J.: Polimorf jellegek a vérsejteken (GK2018) 1957 Moulinier gyakoriság 1: 2000 4000 újszülött mortalitás ~ 10% intracraniális vérzés: a magzati életben 50% (általában 30-35 terhességi hét folyamán) újszülött korban 1:20.000 a kiváltó anti-hpa antitest specifitása anti-hpa-1a (147/199 esetben ~ 73,9% ) (kaukázusi/fekete bőrű populáció) anti-hpa-2a, -4a (távol-keleti populáció) klinikai kép: - születést követő azonnali generalizált purpura (rash), - haematoma - intrakraniális vérzés - súlyos thrombocyta típusú (petechia, haematoma) vérzéssel járó autoimmun folyamat - a betegséget kiváltó autoantitest általában nem thrombocyta antigén (GPIIb/IIIa struktúra) ellen irányul
Fehérvérsejten megjelenő polimorf jellegek a vörösvérsejten megjelenő közös antigének ( ABO, Ii, P) HLA antigének csak a granulocitákra jellemző polimorf struktúrák HNA rendszer HNA-1 antigén jelölés eredeti elnevezés HNA antigének szerző, év antigén gyakoriság a kaukázusi populációban (%) HNA-1a NA1 Lalezari et al., 58 HNA-1b NA2 1960 88 HNA-1c SH Bux et al., 1997 5 HNA-1 null 0,15 antigén struktúra Fcγ recptor IIIb Monoklónális antitest besorolás (CD) CD16b Lalezari et al., HNA-2 2a NB1 97 1971 gp50-64 CD177 Leeuwen et al., HNA-3 3a 5b 97 gp70-95 1964 Kline at al., HNA-4 4a MART 99 1986 Décary et al., HNA-5 5a OND 96 1979 Bux J.: Human neutrophil alloantigens. Vox Saq. 2008;94:277-285 CD11b CD11a CD11b CD11a Toldi J.: Polimorf jellegek a vérsejteken (GK2018)
Fehérvérsejt antigén ellenes antitestek Alloimmunizáció fehérvérsejt antigénekre Felnőttek Transzfúzió okozta alloimmun neutropénia (transfusion-related alloimmun neutropenia (TRAIN) - előzetes transzfúziókkal kiváltott HLA- és/vagy granulocytaellenes antitestek okozta felnőttkori neutropénia - Ritkán okoz súlyos, fertőzéssel, szepszissel járó tüneteket. T R A L I NHLTR Újszülöttek Neonatal alloimmun neutropénia (NAIN) - Loghem írta le 1959-ben. - Granulocytaellenes antitestek elsősorban a HNA-1a- és HNA-1b-antigének ellen képződnek. - A betegség előfordulásának gyakorisága megközelítőleg 3%. - Az esetek többségében: tünetmentes enyhe fokú neutropenia, általában a diagnózis sem kerül megállapításra. - Fertőzéseket okozó, súlyos mértékű neutropenia ritkán, az esetek 0,1 0,2%-ában fordul elő. - A fertőzések leggyakrabban a légző-, húgyúti szerveket, valamint a bőrszövetet érintik. - Therápia: Antibiotikumok, esetenként G-CSF adása szükséges. Autoimmun eredetű agranulocytosyis Toldi J.: Polimorf jellegek a vérsejteken (GK2018)
HLA rendszer Dr. Toldi József OVSZ Szegedi Regionális Vérellátó Központ
A HLA rendszer felfedezése - a savóban megjelenő HLA antitestek felismerése Daussett,J., Nenna, A.: Presence d'une leuco-agglutinine dans le serum d1une case d'agranulocytose chronique. C.R.Soc.Biol.(Paris) 146, 1539 (1952) Daussett,J.: Iso-leuco-anticorps. Acta haemat.(basel) 20, 156-166 (1958) Payne, R., Rolfs, M.R.: Fetomaternal leukocyte incompatibility. J.clin. Invest. 37 1756-1763 (1958) Rood, J.J. van, Eernisse, J.G., Leeuwen, A. van: Leucocyte antibodies in sera from pregnant women. Nature 181, 1735-1736 (1958) Jean Dausset (1916 2009), Orvosi Nobel díj 1980 Toldi J.: HLA antigének (GK2018) Rose Payne 1909-1999 Jon van Rood 1926-
MHC: fő hisztokompatibilitási génkomplex MHC II. osztály MHC I. osztály III. osztály II. osztály 0 1800 2500 3400 bp - Klasszikus gének 6p21.31 - Nem klasszikus gének HLA A C B DR DQ DP A1 B4 B3 B5 B2 B1 A1 B1 B2 A2 A1 B1 A2 B2 MHC I. osztály HLA- Mars és mtsai után (2004) Allélek száma Antigének száma F G E DOB DMB DMA DOA A 349 24 B 627 50 C 182 9 E 5 F 2 G 15 DRB 394 17 DRA 3 - DRB3 41 1 DRB4 13 1 DRB5 18 1 DQB1 61 6 DQA1 28 - DPB1 116 6 DPA1 22 - Jelmagyarázat: klasszikus erősen polimorf gén klasszikus gyengén polimorf gén nem klasszikus polimorf gén pszeudogén Centro mera
Kimutatott antigének/ allélek száma
I. és II. osztályú HLA antigének szerkezete Peptid-kötő régió Primer/szekunder pontmutációk kifejeződése a HLA antigének szerkezetében Immunglobulin szerű régió Transzmembrán régió Citoplazma régió HLA antitestek crossreaktivítása
HLA antigén háromdimenziós szerkezet (HLA-A2) oldalnézet felülnézet Brojkman, P.,J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennett, W,S., Strominger, J.,L., Wiley, D.C.: Structure of the human class histocompatibility antigens. Nature 329, 512-518 (1987)
HLA tipizálás (CDC teszt) - antigén szintű meghatározás NIH technika Pozitív reakció Negatív reakció I. Antigén-Antitest reakció A2 antigén A2 antigén - HLA tesztsavó - Lymphocyta II.Komplement függő citolizis - Nyúl komplement /C/ C C C anti-a2 antitest C C C C C C C anti-a24 antitest III. Sejtfestés és fixálás -Eosyn -Formalin
Szerológiai HLA - tipizálás (CDC teszt)
3. 2. tábázat A HLA antigének gyakorisága HLA-A egyedi gyakoriság (%) másodlagos (split) antigének kaukázusi populáció 1 dél-magyarországi populáció 2 pontmutáció termékei egyedi (split) antigének HLA-B gyakoriság (%) kaukázusi populáció 1 dél-magyarországi populáció 2 másodlagos pontmutáció termékei kaukázusi populáció 1 délmagyarországi populáció 2 kaukázusi populáció 1 délmagyarországi populáció 2 A1 28,6 28,4 - B7 17,7 15,3 Bw6 Cw1 8,2 5,4 DR1 18,5 17,7 - DQ1 67,4 58,8 A2 45,8 51,4 - B8 18,1 18,1 Bw6 Cw2 10,1 12,1 DR4 23,6 21,2 DR53 DQ2 37,3 35,9 A3 20,6 21,9 - B13 5,9 7,6 Bw4 Cw3 15,0 13,8 DR7 26,2 24,7 DR53 DQ3 21,7 53,7 A11 9,9 13,5 - B18 9,2 15,7 Bw6 Cw4 17,9 23,3 DR8 5,5 5,4 - DQ4 4,4 4,5 A36 0,8 0,1 - B27 7,5 10,8 Bw4 Cw5 7,1 8,0 DR9 3,6 1,4 - blank - 35,5 A43 0,0 0,0 - B35 15,4 23,0 Bw6 Cw6 17,6 14,0 DR10 3,6 2,7 - A80 - - - B37 4,4 3,3 Bw4 Cw7 37,1 29,4 DR15 19,9 12,0 DR2, DR51 A23 3,2 4,8 A9, Bw4 B41 2,0 4,2 Bw6 Cw8-1,6 DR16 2,4 11,7 DR2, DR51 A24 16,8 20,2 A9, Bw4 B42-0,0 Bw6 blank 6,3 7,1 DR17 15,1 DR3, DR52 17,7 A25 6,1 6,7 A10, Bw4 B46 0,0 0,2 Bw6 DR18 0,2 DR3, DR52 A26 7,3 9,5 A10 B47 1,2 0,5 Bw4 DR11 17,0 27,7 DR5, DR52 A34 1,2 1,0 A10 B48 0,4 0,1 Bw6 DR12 2,8 5,8 DR5, DR52 A66 - - A10 B53 1,6 0,5 Bw4 DR13 21,7 18,8 DR6, DR52 A68 A28 B59 0,0 0,0 Bw4 DR14 2,4 5,4 DR6, DR52 8,8 5,8 A69 A28 B70 3,2 0,3 Bw6 blank - 13,4 - A29 4,7 4,0 A19 B73 0,8 0,1 Bw6 A30 4,7 3,7 A19 B51 6,9 10,3 B5, Bw4 A31 4,4 3,7 A19 B52 2,4 4,4 B5, Bw4 A32 9,6 5,4 A19, Bw4 B44 19,7 20,3 B12, Bw4 A33 2,0 4,1 A19 B45 1,2 0,2 B12, Bw6 A74 - - A19 B64 B14, Bw6 7,6 7,6 blank 0,4 1,4 - B65 B14, Bw6 B62 10,3 6,2 B15, Bw6 B63 0,8 0,7 B15, Bw4 B38 7,6 8,4 B16, Bw4 B39 3,6 3,5 B16, Bw6 B57 7,3 4,7 B17, Bw4 B58 2,0 0,9 B17, Bw4 B49 4,4 3,5 B21, Bw4 B50 4,4 2,5 B21, Bw6 B54 0,0 0,1 B22, Bw6 B55 4,4 2,5 B22, Bw6 B56 1,6 0,8 B22, Bw6 B60 8,2 5,2 B40, Bw6 B61 5,9 4,8 B40, Bw6 blank 0,0 7,8 egyedi (split) antigének HLA-Cw gyakoriság (%) egyedi (split) antigének HLA-DR gyakoriság (%) másodlagos pontmutáció termékei egyedi (split) antigének HLA-DQ gyakoriság (%) kaukázusi populáció 1 délmagyarországi populáció 2 forrás: 1=The Central Data Analysis Committee. Allele Frequencies, Section 6.3 Splits Combined (Five Loci). In: The Data Book of the 11th International Histocompatibility Workshop: Yokohama, 1991:2:807-14. 2= a szerző saját adatai 1468 HLA-ABC és 515 -DRDQ vizsgálat alapján Toldi J.: HLA antigén, allél és haplotípusgyakoriság a dél-magyarországi populációban, Hematológia - Transzfúziológia 37.(4), 274-279 (2004)
A Dél-Magyarországi populációra jellemző haplotípus gyakoriság (N=1486) Linguage disegulibrium jelenség A B kapcsoltság számított talált A1,B8 0,0122 0,1091 A3,B7 0,0097 0,0667 A11,B35 0,0091 0,0545
HLA gén szintű meghatározás (PCR-SSP* teszt) K. Mullis (1944- ) Kémiai Nobel díj 1993 Kleppe K, et al (1971) Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA s as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. Biol. 56: 341 361(1971) Mullis, Kary The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American 262 (4): 56 61, 64 5.(1990) * szekvencia-specifikus primerek)
Chiptechnológia működési elv A diagnosztikai felület kétdimenziós irányított elrendezése
Chiptechnológia a reagens felépítése
Chiptechnológia eszközök - szoftver
HLA antigének öröklődése Mendeli intermedier öröklődés menet szabályainak megfelelően
HLA antigének orvos-biológiai jelentősége immunológiai felismerés szabályozása egyediséget meghatározó jelleg
Az immunológiai felismerés szabályozása A kettős HLA korlátozott immunológiai felismerés (Zinkernagel és Doherty, 1974)
Szerzett (adaptív) fajlagos - T ly függő indirekt immunválasz T- depens antigén fehérjeszerkezetű struktúra Y -FcγR - foszfatidilszerin R e T ly IL4 CD154 e. Th2 B ly DC40 - Antigén feldolgozás - Antigén bemutatás APCs CD80 IL6 IL10 - TCR - sig B ly d. peptid - r. MHC II. -TCR Y B ly proliferáció - Effektor célsejt Th(CD4+) - recipiens Nyugvó T ly CD28 Plazma sejt differenciálódás aktivált T ly IgM szekretáló klón (rövidéletű) IgG szekretáló klón m T ly s T ly e T ly
HLA antigének mint egyediségek meghatározó jellegek A HLA antigén tulajdonság jelentősége - Betegségekre történő fogékonyság, rezisztencia - Származás megállapítás HLA antigénre képződő antitest jelentősége - Transzplantációban - Transzfúziós szövődmény kiváltásában
A HLA antigének jelentősége a szervtranszplantációban Opelz, G.: Inportance of HLA antigen splits for kidney transplantation matching. Lancet ii, 61-64 (1988)
93 06 93 09 93 12 94 03 94 06 94 09 94 12 95 03 95 06 95 09 95 12 96 03 Transzfúzióval kiváltott HLA immunizáció (HLA antigének antitest kiváltó képessége) Transzfúziós igény (ml) 1000 800 600 400 200 0 70 60 50 40 30 20 10 0 93 06 08 10 12 02 04 06 08 10 12 02 04 06 08 10 12 02 PRA (%) Megjegyzés: PRA (panelreaktivítás) a beteg savójának pozitív reakciója 20 ismert HLA fenotípusú sejttel százalékos értékben kifejezve
Transzfúziós igény - Transzfúziós - éra (1986) Transzfúziós igény - Erythropoietin - éra (1995) 100 80 60 40 20 0 01 02. 03. 04. 05. 06. 07. 08. 09. 10. 11. 12. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 01. 02. 03. 04. 05. 06. 07. 08. 09. 10. 11. 12. Panelreaktivitás mértéke - Transzfúziós-éra (1986) Panelreaktivitásmértéke - Erythropoietin éra (1995) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0% 10-50% 50-100% 5% 01 02. 03. 04. 05. 06. 07. 08. 09. 10. 11. 12. 80 70 60 50 40 30 20 10 0 01. 02. 03. 04. 05. 06. 07. 08. 09. 10. 11. 12. Toldi J., Kiss É.: A transzfúziós- illetve Eryhropoietin-era összehasonlítása hemodializált betegek HLA-immunizációja szempontjából. Transzfúzió 29. 213-26. 1996.
Veseátültetés eredményei a transzfúziók függvényében 1986-1993 100 80 60 40 20 0 HLA immunizált Rejectio /1hó/ Túlélés 12+ hó Trf. száma: 1-5 N=127 6-10 N=35 11-50 N=78 51+ N=39 Forrás: HLA laboratórium SZOTE Véradó Állomás, Szeged a transzfúziók számával arányosan nő a HLA immunizálta száma az immunizációban képződött HLA antitestek rontják a beültetet vese működését, amely emelkedett graftrejectióban és csökkenő túlélésben nyilvánul meg.
Transzfúziós szövődményt kiváltó HLA antitestek I. Lázas - nem hemolitikus (FNH) transzfúziós reakció a transzfúzió alatt, illetve az követően ( 1-2 h ) 1 o C-t meghaladó hőemelkedés gyakoriság: 0,5 % vezető tünet: hidegrázás, hőemelkedés kiváltó ok: HLA, granulocita,-trombocita specifikus antitest patomechanizmus: recipiens antitest-donor antigén (Io.), citokin felszabadulás (IL-1) prognózis: jó, spontán is megszűnik terápia: ha szükséges, transzfúzió megszakítása, analgetikum adása megelőzés: leukocita szegény készítmény alkalmazása (in vitro neutralizáció?)
Transzfúziós szövődményt kiváltó HLA antitestek II. Transzfúzióval kapcsolatos akut tüdőkárosodás ( TRALI ) a transzfúzió alatt vagy 6 órán belül észlelhető akut tüdőkárosodás gyakoriság: 0,02%, 1/ 10000 vezető tünet: akut légzéselégtelenség, súlyos hypoxia, láz, hidegrázás vérnyomáscsökkenés röntgenkép: akut tüdő ödéma ( nem kardiogén eredetű ) kiváltó ok: donor (esetleg recipiens) eredetű HLA antitest patomechanizmus: donor anti-hla (I. o.) recipiens antigén, komplementaktiváció ( 3a, 5a), tüdőkapilláriosok permeabilitásának fokozódása prognózis: általában jó, de halálos kimenetelű is lehet ( 5%) terápia: transzfúzió azonnali leállítása,intravénás szteroidok adása, légzéstámogatás megelőzés: HLA antitesttel rendelkező donorvérek kiszűrése
Transzfúziós szövődményt kiváltó HLA antitestek III. Trombocita refrakter állapot gyakoriság 14-38 % vezető tünet Tr. készítmény adását követően elmarad a trombocitaszám növekedése kiváltó ok HLA-, trombocita specifikus antitest patomechanizmus recipiens antitest - donor antigén (Io.) terápia szteroidok, nagy dózisú intravénás Immunglobulin készítmény megelőzés kompatibilis trombocita készítmény, HLA A vagy Bu egyezés biztosítása
A HLA rendszer és a betegségek kapcsolata 1. - fogékonyságot eredményező HLA antigének - Biostatisztikai vizsgálatokkal igazolható összefüggések Betegség Szerológia DNS meghatározás RR ag+ beteg x ag- egészséges ag- beteg x ag+ egészséges M. Bechterew - B27 B*2702; 2705 150 Sclerosis Multiplex (SM) - DR2 DRB1*1501 12 -DQ1 DQB1*0602 Rheumatoid arthritis -DR4/1 DRB1*0401/0404 6-14 Coeliaka -DQ2 DQB1*0302 11,6
A HLA rendszer és a betegségek kapcsolata 2. Az autoimmun folyamat patomechanizmusának megismerésével igazolható Az autoreaktív T sejteket aktiváló peptid HLA kapcsolat Betegség Self peptid HLA antigén Rheumatoid arthritis (RA) II típusú kolagén DRB1*0401 DRB1*0404 Sclerosis Multiplex (SM) myelin bázisfehérje DRB1*1501 DQB1*0602 Coeliaka gliadin DQB1*0201 DQB1*0302
HLA antigének mint egyediségek meghatározó jellegek származás megállapítás az apaságból történő kizárás a mendeli öröklődés alapján (Berstein féle szabályok) a HLA rendszer alkalmazásának előnyei a származás megállapítási perekben 1/99 anya gyermek apajelölt Nagyfokú polimorfizmus HLA - A 11 2 26 30 11 30 B 13 35 7 51 51 41 jelleghiányon alapuló kizárás (Berstein 1. szabály) 2/96 anya gyermek apajelölt HLA - A 2 2 2 11 11 31 B 17 17 27 52 41 40 A gén allélizmusán alapuló kizárás (Berstein 2 szabály) Konzekvens mendeli (intermedier) öröklődés Egyszerű, de biztonságos meghatározás A tévesen megjelölt apák apaságából való kizárásának hatékonysága: a HLA rendszer alapján 96% a HLA és vércsoport rendszerek összesítése után 99,9% - anya gyermek HLA - apajelölt A 1 1 2 31 2 28 B 51 50 18 61 61 50 A gyermek olyan géneket örökölt, amely az apajelöltben nem egy haplotípusban találhatók
Crossing-over jelenség a meiotikus sejtosztódás profázis szakaszában Crossing over jelenség beteg testvér anya apa 92/1994 108/1994 404/1993 405/1993 HLA - A 2 2 2 3 25 3 3 25 B 13 13 13 18 40 40 38 40 Cw 3 3 3 1994. 01-2011. 03 : 4465 HLA meghatározás ebből 719 családvizsgálat forrrás: Toldi J. SzRVK - HLA laboratórium
A polimorfizmus jelentősége az egyedre nézve - az egyén biológiai azonosítója - származás megállapítás biztosító tulajdonság - transzfúziós szövődményt okozó tulajdonság - rejetiót okozó tulajdonság - anya-magzati összeférhetetlenséget okozó tulajdonság - bizonyos terápiás lehetőségeket megnehezítő tulajdonság Toldi J.: HLA (OT2017) (GK2018)