5/1/14 I. Mononukleáris sejtek izolálása és tenyésztése II. Limfociták ak=vációjának, proliferációjának kimutatása I. Mononukleáris sejtek izolálása és tenyésztése Limfociták, monociták, makrofágok, dendri=kus sejtek Miért van szükség a sejtszeparálásra? nyirokszervekből, vérből, testüregekből 10. Hét 2014. Április 16. Sejtek terápiás célú használata CD34+ csontvelői sejtek =szotása Aferezis Példa : Ha valamelyik alkotót valamilyen célból eltávolítják Aferezis Aferezis (ógörög, ἀφαίρεσις) - elvétel A szeparált komponensen kezelés végezhető és a többi komponenssel együe visszaadható. Leukociták (leukaferezis) buffy- coat, főként autotranszplantációhoz pl. kemoterápiás kezelést megelőzően a leukociták védelme miae monociták szeparálásához dendri=kus sejt terápia céljára őssejt terápiás célra a csontvelői őssejtek mobilizációja után végzee leukaferezis (ugyanez az autológ és allogén csontvelő átültetés egyik lehetőségeként is szóbajöhet) Emberi vér fehérvérsejt összetétele Átlagos sejtszám/ul vér Fehérvérsejtek 7400 Neutrofilek 4400 Eozinofilek 200 Bazofilek 40 Limfociták 2500 Monociták 300 Dendri=kus sejtek 40 A vérben ill. a különböző nyirokszervekben az egyes sejtpopulációk összetétele eltérő. A primer sejtkultúrák Előnyök: - Humán anyag közvetlenül a betegből - A fiziológiás jelátvitel tanulmányozható (!?) Nehézségek: KéVéle alap hozzáállás: Szeparáció poziwv szeparáció a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől Pl. a sejtek valamelyik felszíni molekuláját (receptorát!) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük. A sejteket a szeparálási procedúra körülményei mellee a receptorához közöe ellenanyag direkt módon befolyásolhatja! A poziov szeparáció viszont gyakran nagyobb =sztaságot eredményez. negawv szeparáció a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük (depléció) A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetében inkább ezt használják. - Gyakran komplex emésztési procedúra - Limitált sejtszám, fenntarthatóság & passzálhatóság - Érzékeny!!! 1
5/1/14 Az immunrendszer sejtjeinek és a vér alkotóinak szeparálása A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás A sejtek fizikai tulajdonságain alapuló szétválasztási technikák A sűrűségkülönbség mia\ az alvadás gátolt vér idővel magától is három részre szeparálódik: alul: leülepede\ vörösvérsejtek felül: sejtmentes vérplazma a ke\ő közö\ a vörösvérsejtekre rétegződő buffy coat fehérvérsejtek és vérlemezkék rétege (jó esetben ez a tulajdonság élő sejteken is megragadható az élő sejtekkel további vizsgálatok végezhetők) " fizikai sűrűség, méret " sejtbiológiai adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre " immunológiai eltérő (sejvelszíni) an[gének Szeparálás eredményességét jelezi: =sztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága (veszteség) sejtek életképessége A folyamat centrifugálással gyorsítható A vérből ilyen módon szeparált fehérvérsejtek még túl szennyeze\ek vörösvérsejtekkel további vizsgálatok számára Ficoll- Paque (1.077g/ml) Ficoll- Paque (1.077 g/ml) (from Google pictures) (Nature Protocols h\p://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69- F1.jpg) Ficoll- Paque sűrűség alapú sejtszeparáció Percoll neutrofil granulociták szeparálásához- perifériás vér mononukleáris sejteket tartalmazó gyűrű átpipe\ázása centrifugálás Physical chemical characteriza=on of Percoll. I- III. Laurent, T.C. et al. Colloid Interface Sci. 76, 124 145 (1980). plazma mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) ficoll vékony pipe\ával a sejtek alá töltö\ Ficoll neutrofil granulociták vvt- k szeparált, [szwto\ sejtek (mononukleáris sejtek) 70-80% T- limfocita 15-20% B- limfocita 8-10% monocita 3-5% NK- sejt lépcsős vagy folyamatos pecoll gradiensen a neutrofil granulociták is elkülöníthetőek Romanian J. Biophys., Vol. 14, Nos. 1 4, P. 53 58, Bucharest, 2004 2
5/1/14 Roze\a képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nemkívánatos sejtek eltávolításához is A sejtek eltérő sejtbiológiai tulajdonságain alapuló szeparálási technikák Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása (negatív és pozitív szeparáció) NegaOv szeparáció Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony [sztaságú Ellenanyag panning Komplement mediált lízis (negaov és poziov szeparáció) ellenanyagok komplement LÍZIS (negaov szeparáció) kitapasztott ellenanyagok (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium- klorid pufferben lizálhatóak) Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől Mágneses sejtszeparálás - MACS (1.) specifikus ellenanyag paramágneses gyöngy ( bead ) 3
5/1/14 Mágneses sejtszeparálás - MACS (3.) MACS (2.) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szeparáció) MÁGNES MÁGNES oszlop AZ ELVE KICSIT HASONLÓ AZ IMMUNSZORBENS TECHNIKÁHOZ Nem jelölt sejtek kinyerése (negatív szeparáció), vagy eltávolítása (depléció) CliniMACS zárt rendszerű mágneses sejt szeparátor CliniMACS Plus CliniMACS Prodigy coming soon Mágneses oszlop A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sej}unkciókat általában nem befolyásolják FACS (Fluorescence Ac=vated Cell Sor=ng) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján CD8+ T cells PMT 4 Minta PMT 3 DETACHaBEAD A mágneses részecskékkel konjugált ellenanyagok Fab része ellen termeltetee poliklonális ellenanyagokkal (amelyek valószínűleg an=- idio=pus an=testeket is tartalmaznak) elérhető, hogy leváljanak a sejtekről. (kompeoció a sej}elszíni an=gén és az an=- idioopus ellenanyag közöe) Áramlási cella PMT 2 PMT 1 Laser 4
5/1/14 CD antigén sejttípus funkció ek antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper ek, (monociták, antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV pdc) CD5 ek, ( alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus ek, (NK, γδ T antigénreceptor koreceptora MHC I Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 ek A CR2-vel (CD21) és a CD81 -gyel együtt a antigénreceptor koreceptor komplexe C3d, ic3b CD28 ek kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt sejt adhézió CD62L (L-szelektin) sejt alpopuláció) CD14 (endotheliális sejtek) CD56 NK sejtek, (T és alpopuláció) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) ligand CD3 NKT sejtek NK sejtek CD21 a felismerő rész limfociták homoadhézió (N-CAM izoform) kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, ado\ stabil helyen cseppekre bomlik Mágneses szeparálással hogyan lehetne ezt megcsinálni? vibráció + + + + + + + + + Lézer Elektromosan töltö\ eltérítő lemezek + + + + - - - - - breakoff point Gyűjtőcső + + + + + - - - - Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp- képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltö\é válik. Elektromosan töltö\ eltérítő lemezek Gyűjtőcső Limfociták ak[vációjának, proliferációjának kimutatása 5
5/1/14 felismerés An[gén Nyugvó IgM +, IgD + ére\ A humorális immunválasz szakaszai Segítő, más s[mulus Ak[vált ak[váció, proliferáció, differenciáció Klonális expanzió IgG expresszáló Nagy affinitású Ig expresszáló An[test termelés IzoWpus váltás Affinitás érés Nagy affinitású IgG Memória An[gén felismerés Naív CD4 + Naív CD8 + A válasz szakaszai Ak[váció Citokinek (pl. IL- 2) Klonális expanzió Citokinek (pl. IL- 2 Nyirok szervek Differenciáció Effektor CD4 + Memória CD4 + Effektor funkciók Effektor CD8 + (CTL) Makrofágok, ek, más sejtek ak[vációja Fertőzö\ target sejtek ölése, makrofág ak[váció Memória CD8 + Perifériás szövetek 6