Reakciókinetika és katalízis 14. előadás: Enzimkatalízis 1/24
Alapfogalmak Enzim: Olyan egyszerű vagy összetett fehérjék, amelyek az élő szervezetekben végbemenő reakciók katalizátorai. Szubsztrát: A reakcióban átalakuló molekula. Aktív centrum: Az enzimmolekula azon része, ami a reakcióban ténylegesen részt vesz. Az aktív centrumon való megkötődés szelektív, melynek több fajtája létezik: 1 szubsztrátspecifitás: Csak egyfajta molekula megkötésére alkalmas az enzim. (Pl.: glükózizomeráz, ami a glükóz-fruktóz átalakulást katalizálja) 2 csoportspecifitás: Az enzim a szubsztrátmolekula meghatározott funkcióscsoportjához képes csak kapcsolódni függetlenül a molekula többi részéhez. (Pl.: Észter-hidrolázok) 3 sztereospecifitás: Egy adott molekula sztereoizomerjei közül csak az egyiket képes az enzim megkötni. (Pl.: fumaráz, ami a fumarát L-malát átalakulást katalizálja.) 2/24
Enzimaktivitás Enzimaktivitás: Az enzimek katalitikus hatásának jellemzésére szolgál. Megadja, hogy adott körülmények között, adott idő alatt, adott mennyiségű enzim mennyi anyagot képes átalakítani. Aktivitást befolyásoló tényezők: 1 ph (általában optimális ph szükséges a működéshez) 1.0 0.8 Kimotripszin Kolinészteráz Pepszin Papain rel. aktivitás 0.6 0.4 0.2 0.0 1 3 5 7 9 11 ph 3/24
2 Hőmérséklet (Arrhenius 1 Denaturáció): Az aktivitás maximumgörbe szerint változik a hőmérséklet függvényében. aktivitás csak T hatás csak denaturáció összhatás extrapolált érték T/K 1 A hőmérséklet hatása önmagában egy bizonyos hőmérséklet határon túl nem mérhető a növekvő denaturáció miatt. Az ábrán ezt szaggatott vonal jelzi, ami arra utal, hogy ezek csak extrapolált értékek. 4/24
Legyen E + S k a,k a ES k b P + E Alkalmazzuk a steady-state közelítést [ES]-re Azaz d[es] dt Kihasználva, hogy = k a [E][S] k a [ES] k b [ES] 0 [ES] = k a[e][s] k a + k b behelyettesítve kapjuk, hogy [ES] = [E] 0 = [ES] + [E] k a [E] 0 [S] k a + k b + k a [S] 5/24
A reakciósebességre kapjuk: v = d[p] dt ahol K M a Michaelis állandó: = k b [ES] = k ak b [E] 0 [S] k a + k b + k a [S] = k b[e] 0 [S] K M + [S] K M = k a + k b k a 1 Ha [S] K M : v k b [E] 0 Azaz a reakció formálisan nulladrendű lesz a szubsztrátra nézve, tehát a reakciósebesség tovább nem növelhető a szubsztrátkoncentráció növelésével. 2 Ha K M [S]: v k b K M [E] 0 [S] Azaz a reakció formálisan elsőrendű lesz a szubsztrátra néve, tehát a reakciósebesség lineárisan nő a szubsztrátkoncentrációval. 6/24
v/(m/s) 1. rend 0. rend [S]/M 7/24
Lineweaver-Burk ábrázolás Jelöljük: v max = k b [E] 0 Ekkor [S] v = v max K M + [S] Átalakítva kapjuk, hogy 1 v = K M 1 v max [S] + 1 v max 1/v (s/m) meredekség=k M /v max -1/K M 1/vmax 1/[S] (1/M) 8/24
Integrális módszer Előző megfontolásaink alapján: v = d[s] dt Átalakítva, változók szeparációjával: = v max [S] K M + [S] K M + [S] d[s] = v max dt [S] Integrálva: [S] ( ) KM [S] 0 y + 1 dy = t 0 v max dx Kiintegrálás és algebrai átrendezés után: 1 t ln[s] 0 [S] = 1 ([S] 0 [S]) + v max K M t K M 9/24
ln([s] 0 /[S])/t (1/s) v max /K M meredekség=-1/k M v max ([S] 0 -[S])/t (M/s) 10/24
Két köztitermékes Legyen E + S k 1,k 1 ES 1 k 2 ES2 + P 1 k 3 E + P2 Alkalmazzuk a steady-state közelítést [ES 1 ] és [ES 2 ]-re: [ES 1 ] = k 1[E][S] k 1 + k 2 [ES 2 ] = k 2[ES 1 ] = k 1k 2 [E][S] k 3 k 3 (k 1 + k 2 ) Felhasználva, hogy [E] 0 =[E]+[ES 1 ]+[ES 2 ]: Azaz: [E] 0 = [E] + k 1[E][S] + k 1k 2 [E][S] k 1 + k 2 k 3 (k 1 + k 2 ) [E] = [E] 0 k 3 (k 1 + k 2 ) k 3 (k 1 + k 2 ) + k 1 [S](k 2 + k 3 ) 11/24
Behelyettesítve: v = d[p 2] dt k 1 k 2 k 3 [E] 0 [S] k 3 (k 1 + k 2 ) + k 1 (k 2 + k 3 )[S]) = = k 3 [ES 2 ] = k 1k 2 [E][S] k 1 + k 2 = k2k3 k 2 +k 3 [E] 0 [S] k 3 (k 1 +k 2 ) k 1 (k 2 +k 3 ) + [S] = A kapott egyenlet alakra megegyezik az egy köztitermékes esettel. V, K M kifejezés bonyolultabb. V [S] K M + [S] Hosszas számolás esetén belátható, hogy akárhány köztiterméket feltételezünk, a kapott egyenlet alakja ugyanaz marad. Következmény: Csak a stacionárius kinetika tanulmányozásával NEM lehet meghatározni a folyamatban résztvevő komplexek számát! 12/24
: Az inhibitor reverzibilisen csak az enzimet köti meg. Legyen E + S ka,k a Korábban már láttuk, hogy: E + I k I,k I ES k b P + E EI [ES] = k a[e][s] k a + k b Továbbá: [EI] = k I[E][I] k I Felhasználva [E] 0 = [E] + [ES] + [EI] 13/24
Levezethető, hogy: Ezért Így [E] = [ES] = k I (k a + k b )[E] 0 (k a + k b )(k I + k I [I]) + k a k I [S] k a k I [E] 0 [S] (k a + k b )(k I + k I [I]) + k a k I [S] v = d[p] dt = k b [ES] = k b [E] 0 [S] K M (1 + K I [I]) + [S] Felhasználva, hogy v max =k b [E] 0 v = v max [S] K M (1 + [I]K I ) + [S] 14/24
v (M/s) [I] csökken [S]/M 15/24
Lineweaver-Burk ábrázolás átrendezés után: 1 v = K M(1 + [I]K I ) 1 v max [S] + 1 v max 1/v (s/m) [I] csökken 1/[S] (1/M) Lényeg: y-tengelymetszet állandó! 16/24
: Az inhibitor reverzibilisen csak az enzim-szubsztrátumot köti meg. Legyen E + S ka,k a ES + I k II,k II ES k b P + E ESI Alkalmazzuk [ES]-re a steady-state közelítést: d[es] dt = k a [E][S] k a [ES] k b [ES] k II [ES][I] + k II [EIS] } {{ } = 0 0 Így: [ES] = k a[e][s] k a + k b 17/24
Felhasználva, hogy [E] 0 = [E] + [ES] + [ESI] és [ESI] = k II k II [ES][I] kapjuk: Azaz: v = d[p] dt (k a + k b )[E] 0 [E] = k a + k b + k a [S](1 + k II k II [I]) = k b [ES] = k b k a [S][E] 0 k a + k b + k a [S](1 + K II [I]) = k b [E] 0 [S] K M + (1 + K II [I])[S] Kihasználva, hogy v max =k b [E] 0 : v = v max [S] K M + (1 + K II [I])[S] 18/24
v (M/s) [I] csökken [S]/M 19/24
Lineweaver-Burk ábrázolás átrendezés után: 1 v = K M v max 1 [S] + 1 + K II[I] v max 1/v (s/m) [I] csökken 1/[S] (1/M) Lényeg: meredekség állandó! 20/24
: Az inhibitor reverzibilisen nemcsak az enzimet, hanem az enzim-szubsztrátumot is megköti. Legyen E + S ka,k a E + I k I,k I ES + I k II,k II ES k b P + E EI ESI Alkalmazzuk [ES]-re a steady-state közelítést: d[es] dt = k a [E][S] k a [ES] k b [ES] k II [ES][I] + k II [EIS] } {{ } = 0 0 Így: [ES] = k a[e][s] k a + k b 21/24
Felhasználva, hogy [E] 0 = [E] + [ES] + [EI] + [ESI], [ESI] = k II k II [ES][I], [EI] = k I k I [E][I] kapjuk: [E] 0 = [E] Ebből átrendezéssel: [E] = ( 1 + k a[e][s] + k I[E][I] + k ) IIk a [E][S][I] k a + k b k I k II (k a + k b ) (k a + k b )[E] 0k Ik II (k a + k b )k Ik II + k Ik II(k a + k b )[I] + k ak I[S](k II + k II[I]) Kapjuk, hogy [ES] = k ak Ik II[E] 0[S] k Ik II(k a + k b ) + k Ik II(k a + k b )[I] + k Ik a[s](k II + k II[I]) Kihasználva, hogy K M = k a + k b k a 22/24
v = d[p] dt = k b [ES] = Kihasználva, hogy v max =k b [E] 0 : v = k b [E] 0 [S] (1 + K I [I])K M + (1 + K II [I])[S] v max [S] (1 + K I [I])K M + (1 + K II [I])[S] v (M/s) [I] csökken [S]/M 23/24
Lineweaver-Burk ábrázolás átrendezés után: 1 v = (1 + K I[I])K M v max 1 [S] + 1 + K II[I] v max 1/v (s/m) [I] csökken 1/[S] (1/M) Lényeg: meredekség és tengelymetszet változik, de a különböző [I] értékekhez tartozó egyenesek egy pontban metszik egymást! 24/24