A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei

Átírás

1 Doktori (Ph.D.) értekezés A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei Dr. Végh György Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Budapest 2001

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés Terhességi trofoblaszt betegségek A terhességi trofoblaszt betegségek definiciója és klasszifikációja A terhességi trofoblaszt betegségek előfordulási gyakorisága és etiológiája A terhességi trofoblaszt betegségek tünetei és diagnosztikája A terhességi trofoblaszt betegségek kezelése és utánkövetése A terhességi trofoblaszt betegségek kialakulásában és progressziójában szerepet játszó biológiai tényezők A terhességi trofoblaszt betegségek citogenetikai jellemzői A protonkogének és tumorszupresszor gének, illetve fehérjetermékeik szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbb onkogének és termékeik A normál és daganatos trofoblaszt sejtek beágyazódását és invazivitását befolyásoló sejtadhéziós molekulák és az azokat bontó proteolitikus enzimek Célkitűzések Vizsgálati módszerek Sejtvonalak tenyésztése Klinikai adatok és szövettani minták Teljes RNS izolálás mrns izolálás Fehérje izolálás..28 ii

3 Sejtmag fehérje izolálás Citoplazmatikus fehérje izolálás Az "Atlas human cdna expression array" membránhibridizációs technika RT-PCR Western-blot Immunhisztokémiai analízis Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből készült szövettani metszeteken végzett immunhisztokémiai analízis A Hsp-27 immunhisztokémiai vizsgálata A c-erbb fehérjék családjának immunhisztokémiai vizsgálata A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk immunhisztokémiai vizsgálata Sejtvonalakon végzett immunhisztokémiai vizsgálat In situ mrns hibridizáció Statisztikai analízis Eredmények Gének kifejeződése a normál humán trofofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakban A Hsp-27 megjelenése a normál humán trofoblasztban és choriocarcinomában in vitro és in vivo A c-erbb fehérjék kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben Megbeszélés A normál humán trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak közötti eltérő génkifejeződés A Hsp-27 lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a choriocarcinomában...52 iii

4 6.3. A c-erbb onkogének és fehérjetermékeiknek lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben A mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék I 9. Függelék..XVII iv

5 A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei Szerző: Dr. Végh György Témavezető: Dr. Fülöp Vilmos és Dr. Kopper László Semmelweis Egyetem, Egészségtudományi Kar, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika A terhességi trofoblaszt betegségek csoportját a terhességgel kapcsolatos invazív és noninvazív proliferatív trofoblaszt elváltozások képezik, melyek magukba foglalják a részleges és teljes molaterhességet, valamint a terhességi choriocarcinomát. A betegség diagnosztikájában és terápiájában elért fontos eredmények ellenére a patogenezisben szereplő molekuláris tényezők nagyrészt ismeretlenek maradtak. Kísérleteink célja az volt, hogy potenciális génkifejeződési különbségeket találjunk a normál méhlepény és a terhességi trofoblaszt tumorok között. Az Atlas human cdna expression array membránhibridizációs módszer alkalmazásával a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtek génkifejeződési mintázatát hasonlítottuk össze. A normál trofoblaszt sejtekhez képest 6 gén fokozott, 3 gén pedig csökkent expressziót mutatott a choriocarcinoma sejtekben. A Hsp-27 csökkent kifejeződését choriocarcinomában RT-PCR, Western-blot és immunhisztokémiai módszerekkel erősítettük meg in vitro sejtvonalakon és in vivo paraffinos szövettani metszeteken. Továbbá a c-erbb fehérjék, valamint a mátrix metalloproteinázok és inhibitorai megjelenését vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel paraffinos szövettani metszeteken. Az értekezésben bemutatott kísérletek eredményei az alábbiakban foglalhatóak össze: 1. Az Atlas cdns membránhibridizációs eljárás hasznos módszernek bizonyult a normál és tumoros sejtek, illetve szövetek eltérő génkifejeződésének meghatározására, valamint alkalmas új biológiai markerek keresésére. 2. A Hsp-27 fontos szerepet játszhat a korai méhlepény kialakulásában, fejlődésében és a trofoblasztok differenciálódásában. Továbbá a Hsp-27 choriocarcinomában való csökkent expressziója a rosszindulatú trofoblaszt tumorok egyedülálló kemoterápia érzékenységének magyarázata lehet. 3. Feltételezhető, hogy a c-erbb fehérjék szerepet játszanak a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisében és a perzisztens posztmoláris tumorok kialakulásában. 4. A mátrix metalloproteinázok és szöveti inhibitoraik kifejeződése összefüggésben lehet a terhességi trofoblaszt betegségek kifejlődésével. v

6 Potential biological markers of the gestational trophoblastic diseases Author: György Végh, M.D. Tutor: Vilmos Fülöp, M.D. and László Kopper, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, Semmelweis University, Faculty of Health Sciences Gestational trophoblastic diseases are a spectrum of pregnancy related, invasive and noninvasive proliferative trophoblastic disorders, which include partial mole, complete mole and gestational choriocarcinoma. Despite important advances in the diagnosis and therapy of these diseases, molecular pathogenesis has remained largely unknown. Our purpose was to identify potential differences in gene expression between normal placenta and gestational trophoblastic tumors. Atlas human cdna expression array membrane hybridization technique was used to study the gene expression pattern in normal trophoblast and choriocarcinoma cell lines. As compared to normal trophoblast cells, 6 genes were upregulated and 3 genes were downregulated in choriocarcinoma cells. The downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma cells was confirmed both in vitro with cell lines and in vivo with paraffin sections using RT-PCR, Western-blot and immunohistochemical methods. Furthermore the expression of c-erbb proteins, and matrix metalloproteinases and their inhibitors were invastigated with paraffin sections by immunohistochemistry. Our findings summerized in this thesis are the following: 1. Atlas cdna array is a useful and suitable technique to identify differentially expressed genes in normal and malignant cells or tissues, and suitable for search after new biological markers as well. 2. Hsp-27 may play an important role in the genesis and the development of early placenta and the differentiation of trophoblasts. Furthermore, the downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma may contribute to the extreme sensitivity of malignant trophoblastic tumors to chemotherapy. 3. Supposingly c-erbb protein family may be important in the pathogenesis of gestational trophoblastic diseases and in the progression to persistent postmolar tumors. 4. The expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors may be related to the development of gestational trophoblastic diseases. vi

7 Rövidítések ABC AEBSF cad CAM Cx DAB datp DNáz dntp DTT ECM EGF EGFR FCS FR- GAPDH hcg HIP-116 hngf hpl Hsp IGF IL INF LH MAP-kináz MMP mrns NP-40 PA PAI PAR PBS PCNA PCR PMSF PVDF RFLP Rnáz RP-L6 RT-PCR SDS SDS-PAGE amino-benzperidol-klorid aminoetil-benzénszulfonil-fluorid cadhedrin sejtadhéziós molekula connexin 3,3-diaminobenzidin-tetrahidroklorid dezoxi-adenozin-trifoszfát dezoxiribonukleáz dezoxi-nukleotid-trifoszfát D,L-ditiotreitol extracelluláris mátrix epidermális növekedési faktor epidermális növekedési faktor receptor magzati borjúszérum fibronektin receptor-béta alegység glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz humán choriogonadotropin DNS repair fehérje humán ideg növekedési faktor humán placentáris laktogén hő shock fehérje inzuliszerű növekedési faktor interleukin interferon luteinizáló hormon mitogén aktivált fehérje kináz mátrix metalloproteináz messzendzser ribonukleinsav nonidét-foszfát-40 plazminogén aktivátor plazminogén aktivátor inhibitor plazminogén aktivátor receptor foszfát pufferos sóoldat proliferáló sejt nukleáris antigén polimeráz lánc reakció fenil-metil-szulfonil-fluorid polivinilidén-difluorid restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus ribonukleáz 60S riboszomális fehérje L6 reverz transzkripciós polimeráz lánc reakció nátrium-dodecil-szulfát SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis vii

8 TBS TGF TIMP TNF TSH Tris puffer sóoldat transzformáló növekedési faktor metalloproteinázok szöveti gátlója tumornekrózis faktor pajzsmirigy stimuláló hormon viii

9 1. BEVEZETÉS A terhességi trofoblaszt betegségek olyan egymással kapcsolatban lévő kóros elváltozások, amelyek a chorionszövetek kóros növekedésével jellemezhetőek és magukban foglalják a változékony helyi invazív és távolra metasztatizálódó hajlammal rendelkező molaterhességet, invazív molát és choriocarcinomát 1. A teljes mola egy egyedülálló megtermékenyülés abban a tekintetben, hogy az összes mag-dns apai eredetű és az összes sejtplazma-dns pedig anyai eredetű 2. A mola hydatidosa megelőzheti a perzisztáló trofoblaszt tumor, köztük az invazív mola és a choriocarcinoma kifejlődését 3. Bár a choriocarcinoma kialakulásának kockázata fokozott teljes molaterhesség után, a marker tanulmányok nem minden esetben igazolják, hogy maga a choriocarcinoma ugyanabból a sejtvonalból ered, mint a komplett mola 4,5. Mivel a morfológia sem önmagában, sem a klinikai jellemzőkkel együtt nem tudja pontosan előre jelezni, hogy mely molák fognak progrediálni, a daganat viselkedésének más jelzőit keresik. Több daganatféleség esetében kimutatták, hogy a protoonkogének és tumorszupresszor gének sejtproliferációra és differenciálódásra való hatása összefüggésben van a daganatos átalakulás és daganatfejlődés többlépcsős folyamatával 6. A trofoblaszt tumorok hatékony kemoterápiás kezelése az emberi rosszindulatú daganatok kezelésében elért legszembetűnőbb sikert mutatja. Az Egyesült Államok Rákkutató Központjában Li és munkatársai alkalmaztak először metotrexátot choriocarcinomák gyógykezelésében, amikor három, már daganat áttétellel rendelkező nőbetegük sikeres terápiájáról számoltak be. Ezzel új korszakot nyitottak egy nagyon rossz prognózisú, általában halálos kimenetelű betegség történetében 7. A citosztatikus kezelés bevezetésében és elterjesztésében néhány amerikai munkacsoport kivételesen nagy érdemeket szerzett azáltal, hogy körülöttük a betegséggel kiemelten foglalkozó centrumok alakultak ki és nagyszámú beteganyagon értékelték ki tapasztalataikat. Ezekben a központokban a teljes gyógyulási arány már a hetvenes évek elején 80%-on felüli volt 8,9. Azóta a terhességi trofoblaszt daganatok klinikai 1

10 megítélése és terápiája jelentős fejlődésen ment keresztül a betegség patológiájában, endokrinológiájában, immunológiájában és molekuláris biológiájában állandóan bővülő ismeretanyag segítségével. Ennek következtében általánosan elismert az a tény, hogy a terhességi trofoblaszt daganatok még gyors, lokális invázió és távolra szóródó, kiterjedt metasztázisok jelenléte mellett is hatékonyan és sikeresen kezelhetőek kemoterápiával 10. Magyarországon elsőként és Európában az elsők között a Pécsi Orvostudományi Egyetem Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján Lajos professzor a hatvanas évek közepétől alkalmazott nagy dózisú metotrexát kezelést choriocarcinomás betegeken. A kis esetszám és a korlátozott feltételek, azonban a betegség átfogó vizsgálatát nem tették lehetővé és a megjelent néhány közlemény esetismertetésre szorítkozott, vagy a betegség csak egy-egy aspektusával foglalkozott 11,12. Hazánkban nemzetközileg is elismert, hatékonynak bizonyuló trofoblaszt központot a hetvenes évek végén Gáti professzor hozott létre az Orvos Továbbképző Intézet (Jelenleg: Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar) Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján. A betegség ritka előfordulása ellenére a viszonylag nagyszámú beteganyagon szerzett tapasztalatok, valamint a több mint 20 éves kutatómunka eredménye révén (kandidátusi értekezések: 1983, 1989, 1993, doktori értekezés: 1992) a munkacsoport korszerű diagnosztikus és kezelési eljárások egész során vezette be és alkalmazta eredményesen. Témavezetőm Dr. Fülöp Vilmos és amerikai partnere, Berkowitz professzor által alapított, tíz éves gyümölcsöző tudományos kapcsolat működik a Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kara (SEEK) és a Harvard Egyetem között. Ennek a kutató csoportnak a munkájába volt lehetőségem 1998 januárjától aktívan bekapcsolódni. Klinikai munkám mellett tudományos kísérleteimet az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet (OHII) Molekuláris Genetikai Laboratóriumában és Bostonban a Harvard Egyetem Brigham and Women s Kórházának Szülészeti, Nőgyógyászati és Reproduktív Biológiai Klinikáján működő Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumában végeztem. Általánosan elmondható, hogy a terhességi trofoblaszt betegségek kutatása rendkívüli klinikai eredményeket hozott a betegség diagnosztikájában és kezelésében. A napról-napra bővülő ismeretanyag ellenére a trofoblaszt betegségek viselkedésének számos pontját még homály fedi, amit a klinikumban a minden erőfeszítés ellenére is 2

11 bekövetkező, ritkán előforduló kudarcok szemléltetnek a legjobban. A viharosan fejlődő molekuláris biológiának köszönhetően egyre többet tudhatunk meg a betegség molekuláris alapjairól. Azonban legnagyobb hiányosságaink is éppen ezen a területen, az intracellulárisan és extracellulárisan zajló biológiai folyamatok szerepének megértésében vannak. Budapest, Május 3

12 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Terhességi trofoblaszt betegségek A mola hydatidosát már 1500 évvel ezelőtt is ismerték. Az amidai Aetius ( ) a bolyhok hydatid elfajulásáról ír az uteri hydropii elnevezésű betegség kapcsán. Megállapítása szerint üszögterhességről van szó, ha a vérzés kimarad, de a nő nem terhes, a méh pedig folyadékkal és apró hólyagszerű képletekkel telődik fel 13. A későbbiekben is a méhre lokalizálódó esetekben az ötéves túlélés 30% alatt volt, és ha a diagnózis felállítása idején már áttétet találtak, a betegek kivétel nélkül rövid időn belül meghaltak 14. Az 1961 után bevezetett eredményes kemoterápiás kezelésekkel a betegség, sokszor a reprodukciós képesség megőrzésével gyógyíthatóvá vált A terhességi trofoblaszt betegségek definiciója és klasszifikációja Hertz 1971-ben kidolgozta a terhességi trofoblaszt betegségek terminológiáját. Felfogása értelmében a gesztációs trofoblaszt betegségek spektruma a hidropikus boholydegenerációtól a mola hydatidosán keresztül a choriocarcinomáig terjed 16. A WHO 1983-ban ezt az állásfoglalást elfogadta és a következők szerint, csoportosította: Terhességi trofoblaszt betegségek: a trofoblaszt sejtekből kiinduló benignus és malignus folyamatok Mola hydatidosa: a chorionbolyhok hólyagos elfajulása (részleges és teljes) Invazív mola: a molaterhesség infiltrálja a miometriumot és áttétet is adhat Terhességi choriocarcinoma: cito- és szinciciotrofoblaszt sejtek malignus daganata, bolyhok nincsenek Placentahely trofoblaszt tumor (PSTT): a méhlepény beágyazódási helyéről kiinduló, főként intermedier trofoblaszt sejtekből álló daganat 4

13 Terhességi trofoblaszt tumorok: azok a trofoblaszt betegségek, amelyek környezetükbe törnek, progrediálnak, áttétet adnak és kezelés nélkül a beteg halálát okozzák 17. A rosszindulatú trofoblaszt tumorok több mint a fele molaterhesség talaján alakul ki, ezért a mola hydatidosát malignus potenciállal rendelkező benignus trofoblaszt tumorként értelmezik 18. A molás szövet progrediálhat és az anyai erekbe törve más szervekbe, főleg tüdő áttétet képezhet és az esetek 20%-ában malignus daganat fejlődik ki. A részleges molaterhesség is lehet invazív és metasztatikus, kb. 5%- ban choriocarcinoma alakulhat ki belőle 19. A kezelés megválasztását és sikerességét a betegség elsősorban anatómiai kiterjedésén alapuló stádiumbeosztása határozza meg ( táblázat). Stádiumbeosztás I. A daganat a méhre lokalizálódik II. A daganat a genitális szerveken okoz áttétet III. Metasztázis a tüdőben, genitális áttéttel vagy anélkül IV. Távoli szerveken való áttét (agy, vese, máj, bél, stb.) Alcsoportok A Rizikófaktor nincs B Egy rizikófaktor C Két rizikófaktor Rizikófaktorok 1. hcg NE/l 2. A betegség fennállása az utolsó terhesség után 6 hónap táblázat A terhességi trofoblaszt tumorok stádiumbeosztása (FIGO 1992) (Goldstein és mtsai: Revised FIGO staging system for gestational trophoblastic tumors. J Reprod Med 43: 37-43, 1998) Tovább kategorizálva a betegséget amely ugyancsak a kezelés megválasztását befolyásolja, főleg ha nem áll rendelkezésre definitív szövettani diagnózis alacsony kockázatú (low-risk) és magas kockázatú (high-risk) csoportokra osztották. A New England Trophoblastic Disease Center (Boston) ajánlása szerint high-risk kategóriába kerül az a trofoblaszt beteg, akinél: a kezdeti hcg-titer NE/l a tünetek kezdete óta 4 hónap telt el agy és/vagy májáttéte van 5

14 előzetes sikertelen kemoterápiát kapott a beteg életkora 40 év "large-for-date" uterus theca-lutein ciszta átmérője 6 cm előzetes molaterhesség, vagy trofoblaszt tumor egyéb: toxémia, hipertireózis, trofoblaszt embolizáció, DIC 20. Ennek alapján számos prognosztikai pontrendszer létezik, abban azonban mindegyik megegyezik, hogy a rossz prognózisú, magas kockázatú esetekben profilaktikus kemoterápia szükséges a beteg gyógyulásához A terhességi trofoblaszt betegségek előfordulási gyakorisága és etiológiája A molaterhesség incidenciája geográfiai megoszlást mutat. Európában és Észak- Amerikában terhességre vonatkoztatott előfordulási aránya 1/2000, endémiás területeken, főleg Délkelet-Ázsiában 1/200. Choriocarcinomára vonatkoztatva ezek az adatok 1/20000 és 1/2000. Magyarországon 1800 terhességre esik egy mola hydatidosa és terhességre egy invazív mola, vagy choriocarcinoma, ami azt jelenti, hogy évente körülbelül 160 új molás és 20 új malignus trofoblaszt tumoros megbetegedést diagnosztizálnak 22. A trofoblaszt betegségek etiológiája még ma sem pontosan ismert. A betegség kórokát kutatva felmerülnek anyai, magzati, fetomaternális, genetikai, immunológiai tényezők és a vírusfertőzés lehetősége sem zárható ki 23. Az etnikai és földrajzi okok mellett az előzetes spontán vetélések, valamint az anamnézisben már korábban szereplő trofoblaszt betegség fokozott rizikótényezőt jelent. Epidemiológiai tanulmányok kimutatták, hogy bizonyos táplálkozási szokások (csökkent karotin és állati eredetű zsírok bevitele) mellett, illetve 40 év feletti és 18 év alatti anyai életkor esetében a teljes mola előfordulási gyakorisága emelkedett 24. Továbbá Berkowitz és munkatársai összefüggést találtak a rendszertelen menstruációs ciklus, a két évnél hosszabb ideig tartó orális fogamzásgátlók szedése, az előzményben fiúgyermek szülése és a részleges molaterhesség gyakoribb kialakulása között 25. 6

15 A terhességi trofoblaszt betegségek tünetei és diagnosztikája A molaterhesség kórismézése tünetei alapján és korszerű morfológiai, laboratóriumi és radiológiai módszerek birtokában általában nem nehéz. A gondos anamnézis felvétel és a fizikális vizsgálati lelet a tünetek helyes értékelésével együtt már önmagukban felvethetik a trofoblaszt tumorok lehetőségét. Elősegítheti a rosszindulatú elfajulás korai felismerését, illetve megelőzését a high-risk faktorok ismerete 26. A leggyakoribb tünet az egy-két menstruáció kimaradása után fellépő hüvelyi vérzés (97%), amely során borsó nagyságú hólyagok is ürülhetnek, miközben a terhességi gyanújelek fennállnak. Fizikális vizsgálattal a számított terhességi hétnél nagyobb méhet, esetleg egy vagy kétoldali theca-lutein tömlőt lehet tapintani. Az igen magas hcg szinttel magyarázható az esetek 20-25%-ában előforduló hiperemezis és toxémia. Az első trimeszterben fellépő preeklampszia a molaterhesség patognomikus jele 27. A hcg mind szerkezetileg, mind pedig biológiailag hasonlít az LH-hoz és a TSH-hoz. A mola hydatidosa nagy mennyiségü hcg-t választ ki, ami a petefészkek hiperstimulációját és theca-lutein ciszták kialakulását idézi elő. A pajzsmirigyben a nagyobb hcg koncentráció a pajzsmirigy hormonok kiválasztódását serkenti és ezáltal kb. 7%-ban hipertireózis alakul ki 28,29. Ritkán (2%) előforduló, néha a beteg halálát okozó súlyos szövődménye a trofoblaszt betegségeknek a trofoblaszt embolizáció, következményes légzési elégtelenséggel, amely megfelelő kardiopulmonális támogatás és ellátás mellett általában 72 órán belül megszűnik 30. Az előzőekben felsorolt tünetek karakterisztikusan csak a komplett molában jellemzőek. A részleges molaterhesség tünetei sokkal szegényesebb formában jelentkeznek, általában a missed abortion vagy spontán vetélés tüneteivel megegyezők. Sokszor csak a szövettani vizsgálat deríti ki és állítja fel a pontos diagnózist 24. A malignus troblaszt tumorok tünetei a molaterhesség tüneteihez hasonlóak, valamint az áttétek jelenlétét szervspecifikus panaszok jellemzik. A profúz hüvelyi folyás - hüvelyi metasztázis, mellkasi fájdalom és véres köpet tüdő, fejfájás - agyi, vesetáji fájdalom és véres vizelet - vese, véres széklet és hasmenés gasztrointesztinális áttét lehetőségére utal 27,31. 7

16 Az 1970-es évekig a terhességi trofoblaszt betegségek diagnózisa általában a második trimeszterre esett. Azóta a korszerű diagnosztikus módszerek birtokában, elsősorban az ultrahang (UH) vizsgálatok lehetősége miatt a kórismézés az első trimeszterre esik, ezért a klasszikus tünetek lényegesen ritkábban és szegényesebben fejlődnek ki. Berkowitz és munkatársainak anyagában az utóbbi évtizedekben preeklampszia és hiperemezis csak néhány esetben, hipertireózis és trofoblaszt embolizáció pedig nem fordult elő 24. Egyéb adatok szerint a 10. terhességi hétig történt felismerés esetén a rosszindulatú kimenetel frekvenciája 10% alá csökken. A gesztációs hét között 9-14%, a 16 gesztációs hét után már 15-41% a malignizálódás aránya 13. Ezért a molaterhesség gyanúja esetén az első választandó lépés az UH vizsgálat. UH vizsgálattal már a 10. terhességi hét előtt biztonsággal felismerhető a betegség. Teljes mola esetében a tágult méhüreget hóesésszerű echorajzolatot adó képlet tölti ki. Parciális molában a magzat jelenléte mellett észlelhető a lepény részleges elfajulása. Ezen kívül, a méh környezetében lévő theca-lutein tömlők pontos mérete is megállapítható 31,32. A vizelet hcg és szérum hcg- -alegység koncentrációja magas. A hcg szint ellenőrzése a diagnózis felállításában való segítségén kívül, a kezelés alatti és utáni nyomon követésben is fontos szerepet kap 1,29. A szövettani vizsgálat a terhességi trofoblaszt betegségek alapvető kórismézési módszere. A pontos, mindenre kiterjedő vizsgálatnak nemcsak a korrekt diagnózis felállításában van jelentős szerepe, hanem a helyes kezelési mód megválasztásában is. A molaterhességnek morfológiailag három fő jellemzője van: 1) a bolyhok vizenyős duzzanata, 2) a bolyhok vérellátásának zavara, vagy hiánya, 3) a boholyhám különböző mérvű burjánzása. Részleges molában ezek a morfológiai jellemzők a méhlepénynek csak egy részét, teljes molában pedig a méhlepény egészét érintik 33. Mivel a betegség felismerése egyre korábbi gesztációs korra tolódik, a szövettani vizsgálat a patológus számára, a hidropikus abortusztól való elkülönítése differenciál diagnosztikai nehézséget okozhat 34,35. Ober és munkatársai szerint, ha a trofoblaszt sejtek beszűrik a boholystromát, illetve a cito- és szinciciotrofoblaszt sejtek keverednek egymással a rosszindulatú elfajulás veszélye 50% felett van 36. A nem invazív és invazív formák elkülönítése 8

17 kórszövettanilag is nehéz lehet. Eltérés a bolyhok elhelyezkedése, méhállományba történő betörésében van, amely sokszor csak mikroszkópikus mértékű. A choriocarcinomában a cito- és szinciciotrofoblasztok nagyfokú polimorfiát mutatnak és boholystruktúra nem látható benne 37. A szövettani vizsgálatok mellett a citogenetikai megfigyelések is megerősítették, hogy a mola hydatidosa két csoportra - teljes és részleges molaterhességre osztható. A DNS állomány ploiditása ugyanis használható paraméternek tűnik a részleges mola egyéb terhességektől való elkülönítésében. Kevés kivétellel a molaszövetek citogenetikai elemzése azt mutatta, hogy teljes mola hydatidosa esetén a sejtek diploid génállománnyal (46,XX, 46,XY) bírnak, míg a részleges molában triploid génállomány (69,XXX, 69,XXY, 69,XYY) található 24,38. A teljes és részleges molaterhesség szövettani és citogenetikai jellemzőit a táblázat foglalja össze. Teljes mola hydatidosa Részleges mola hydatidosa Embrionalis vagy magzati szövet nincs van A chorionbolyhok vizenyős diffúz gócos duzzanata Trofoblasztsejtek burjánzása diffúz gócos A chorionbolyhok szélének nincs van szabálytalansága Stromális trofoblaszt zárványok nincsenek vannak Trofoblaszt beágyazódási hely diffúz, jelentős atípiával gócos, gyenge atípiával Kariotípus diploid triploid (90-93%) táblázat A Teljes és részleges mola hydatidosa hisztopatológiai és citogenetikai jellemzői (Berkowitz és mtsai: Chorionic tumors. N Engl J Med 335: , 1996) A citogenetika rutinszerű klinikai alkalmazását sok technikai nehézség akadályozza: friss szövetre van szükség, a tenyésztés során fennáll a mintavételi hiba lehetősége, speciális laboratóriumot igényel és magasak a költségei. Ezen kívül, több tanulmány alapján bebizonyosodott, hogy a diploid génállomány segíthet kizárni a részleges mola lehetőségét, a triploidia viszont nem specifikus a parciális molaterhességre nézve 39,40. Így a hisztopatológia maradt a meghatározó módszer a betegség diagnosztikájában. 9

18 A trofoblaszt tumorok rendszeresen és gyorsan adhatnak lokális és távoli metasztázisokat, elsősorban a tüdőbe. A daganat kiterjedése és az áttétek elhelyezkedése megfelelő képalkotó eljárásokkal (UH, natív és kontrasztanyagos röntgen, CT, MRI) mutatható ki A terhességi trofoblaszt betegségek kezelése és utánkövetése A mola terhesség evakuációját követően 80%-ban várható spontán remisszió, 15%-ban invazív mola és 5%-ban choriocarcinoma kialakulása. A kemoterápia bevezetésével szinte egyedülálló eredmények születtek a malignus trofoblaszt tumorok kezelésében. Az azelőtt egyedüli beavatkozásként szóba jövő méheltávolítás fokozatosan háttérbe szorult és csak indokolt esetekben másodlagos szerepet játszik a kezelésben. Így a betegek reproduktív képessége sokszor megőrizhető 31. Mivel a dolgozat kereteit jelentősen meghaladja a részletekbe menő terápiás lehetőségek teljes felsorolása, ezért a vezető trofoblaszt centrumok által elfogadott és Intézetünkben is alkalmazott a betegség stádiumára és rizikótényezőire alapozott kezelési protokollt foglalom össze. Profilaktikus kemoterápia molaterhességben Középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia Alacsony kockázatú trofoblaszt tumor Lokális tumor: középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia, rezisztencia esetén: MAC (Metotrexát, Aktinomicin-D, Ciclofoszfamid), vagy CVB (Ciszplatin, Vepezid, Bleomicin) kezelés, szükség esetén citosztatikus perfúzió, vagy méheltávolítás Metasztatikus tumor: középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia, rezisztencia esetén: MAC, vagy CVB kezelés, szükség esetén méheltávolítás és az áttét sebészi eltávolítása Magas kockázatú trofoblaszt tumor Lokális tumor: MAC kezelés, rezisztencia esetén: citosztatikus perfúzió és CVB, vagy EMA-CO (Etopozid, Metotrexát, Aktinomicin-D, Ciklofoszfamid, Onkovin) kezelés; méheltávolítás és CVB, vagy EMA-CO terápia 10

19 Metasztatikus tumor: MAC, vagy CVB terápia, rezisztencia esetén: EMA-CO és szükség esetén méh és az áttétek eltávolítása 41. Ennek alapján az alacsony kockázatú lokális és metasztatikus, valamint a magas kockázatú lokális trofoblaszt tumorokban a várható gyógyulási arány 100%, a magas rizikójú áttétes esetekben kb. 80%-ban érhető el teljes remisszió. A betegség utánkövetésére, illetve a kezelés hatékonyságának ellenőrzésére a hcg- -alegység negatívvá válásig való vizsgálata a legértékesebb módszer. A folyamatosan csökkenő hcg-titer a betegség remissziójára utal, a stagnáló, vagy emelkedő hcg-szint invazív folyamatra, vagy malignus átalakulásra és progresszióra hívja fel a figyelmet. Ez utóbbi esetben kemoterápia megkezdése, vagy esetleges kombinációban való kiegészítésére van szükség. A tapasztalatok szerint egy évig folyamatosan negatív hcg- -alegység esetén relapszus egészen ritkán fordul elő, a beteg gyógyultnak tekinthető. A magas kockázatú eseteket azonban életük végéig célszerű követni, mert a megfigyelések szerint a betegség évek, vagy évtizedek múlva is kiújulhat 42. A nyomonkövetés alatt a beteg fogamzásgátlásáról gondoskodni kell. A hcg- alegység negatívvá válása előtt barrier módszer, utána orális fogamzásgátlók szedése javasolt. Egy éves teljes remisszió után újabb terhesség vállalása megengedett. Irodalmi adatok megerősítik, amennyiben a beteg a nyomonkövetési időszakban a javaslatok ellenére terhes lesz, sem a szülészeti, sem a magzati szövődmények jelentős fokozódásától nem kell tartani 43. Meg kell említeni a trofoblaszt tumorok centralizált ellátásának jelentőségét. Ahol nagyszámú beteganyagon nyert tapasztalatok alapján szerzett rutin és megfelelő interdiszciplináris háttér áll rendelkezésre, ott a betegek gyógyulási esélyei jobbak 13, A terhességi trofoblaszt betegségek kialakulásában és progressziójában szerepet játszó biológiai tényezők Mola terhességet követően a terhességi trofoblaszt betegség ismétlődésének esélye 1%, ez a kockázat két trofoblaszt megbetegedési epizódot követően 20-25%-ra 11

20 emelkedik 44. Mindez azt sugallja, hogy egyes betegeknél öröklötten magas a betegség ismétlődésének kockázata az eredeti lézió teljes kiirtásának ellenére. Így egyes nők predisponáltak lehetnek a kóros fertilizációra. Tuncer és munkatársai azt feltételezik, hogy ennek elsődlegesen anyai okai vannak, az oociták fejlődésének genetikai eredetű zavara áll a háttérben. Igazolódni látszik ez a feltételezés anyagukban, ahol egy asszony előzetes három különböző partnerektől származó molaterhessége után ovum donációval és in vitro fertilizációval élő, egészséges gyermeket szült zavartalan terhességet követően, terminusban 45. A choriocarcinomák patogenezise igen összetett, megjelenhetnek terhességtől függetlenül, normál szülést, vagy spontán vetélést követően is. Az esetek legnagyobb részében, azonban mola hydatidosa után alakulnak ki 46. Bár a choriocarcinoma kialakulásának veszélye megnövekszik teljes molát követően a marker és az RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) vizsgálatok nem mindig igazolják, hogy a choriocarcinoma ugyanahhoz a sejtvonalhoz tartozna, mint a komplett mola. Ennek alapján feltételezhető, hogy az egyes choriocarcinomák patogenezise különböző és néhány esetben teljesen eltér a teljes mola hydatidosa patogenezisétől 47,48. Részleges molaterhességet követően ritkán regisztrálták choriocarcinoma kifejlődését 49. Eddig kevés olyan tényezőt sikerült találni, amelyek előre jelzik a mola hydatidosa progresszióját, vagy malignus átalakulását perzisztáló trofoblaszt tumorokká. A rendszeres hcg-titer kvantitatív monitorizálása érzékeny módszere a perzisztencia és/vagy progresszió megítéléséhez. Azonban a morfológiai elemzés mellett nyilvánvalóvá váltak korlátai is a betegség viselkedésének előrejelzésében 50. Ezért a jelenlegi kutatások új biológia faktorok és módszerek lehetőségét keresi a betegség jobb megismerésének érdekében A terhességi trofoblaszt betegségek citogenetikai jellemzői A szövettani vizsgálatok mellett a citogenetikai megfigyelések erősítették meg, hogy a mola hydatidosa két csoportra (teljes és részleges mola) osztható

21 A teljes mola génállománya kizárólag apai DNS-ből áll, amint a kromoszómális sáv heteromorfizmus és a hipervariábilis DNS szekvenciák analízise kimutatta 52. A teljes molaterhesség sejtjeiben az összes nukleáris DNS apai eredetű, a citoplazma DNS állománya pedig anyai eredetű. Ebből következően a teljes molában minden kromoszóma apai eredetű, azonban a betegség kifejlődéséhez az anya is hozzájárul azáltal, hogy a mitokondriális DNS anyai eredetű 53. Megállapítást nyert, hogy komplett molaterhességben a kromoszómaállomány csaknem mindig diploid: az esetek 90%-ában 46, XX, 10%-ban 46, XY. Egy-egy esetben triploidia, tetraploidia, sőt 45, X kariotípus is található , XX kariotípus esetén egy haploid spermium egy üres petesejtet termékenyít meg, amelynek genetikai állománya megkétszereződik. Az anyai kromoszómák felszívódásának, vagy inaktiválódásának folyamata ismeretlen 55. A 46, XY kariotípus dispermia következménye, az üres petesejt megtermékenyítése két hímivarsejttel (23, X és 23, Y) történik és ezek kromoszóma készlete egyesül 56. A teljes mola androgenezis elméletét Suráni egér-modell kísérletei támasztják alá. Gynogenetikus embriók esetében csökevényes méhlepényt és következményes magzati retardációt találtak. Androgenetikus fejlődés esetében viszont az embriók elmaradt növekedését tapasztalták, míg a placenta hipertrofiás burjánzást mutatott. A normális egyedfejlődéshez tehát szükség van mindkét szülő génállományára. Az anyai DNS elengedhetetlen az embrionális részek fejlődéséhez, az apai DNS pedig az extraembrionális részek differenciálódásához. Ennek alapján az androgenetikus fejlődés a teljes mola hydatidosa analógiájának tekinthető 57. A kóros embriogenezis és tumorgenezis közötti határok összemosódnak, a paternális genom megváltozása ezért kapcsolatba hozható a malignus átalakulással. Ezt a tényt támasztja alá a teljes mola gyakori neopláziás elfajulásának aránya 58. Egyes közlemények szerint a choriocarcinomába progrediáló teljes molák leggyakrabban 46, XY genotípusúak, ami arra utal, hogy inkább dispermikus molából származnak, mint monospermikus lézióból 59. A teljes mola hydatidosában és choriocarcinomában végzett genetikai tanulmányok azt is megerősítették, hogy a heterozigóta teljes mola malignusabb potenciállal rendelkezik, mint homozigóta megfelelője. Véleményük szerint a mola trofoblasztsejtekben talált genetikai instabilitás lehet a felelős a progresszióra és a rosszindulatú átalakulásra való hajlamért

22 A részleges molaterhességek mintegy 90%-ában triploid kariotípus (69, XXX, 69, XXY, 69, XYY) található, leggyakrabban 69, XXY 61. A triploid megtermékenyítés kétféle fenotípust eredményezhet. Amennyiben egy normális petesejtet két spermium termékenyít meg (diandrikus triploidia) a részleges mola tünetei korábban és intenzívebben fejlődnek ki. Ha a három haploid készletből kettő anyai eredetű (digynikus triploidia), a részleges mola jellemzői enyhébbek (kisebb fokú trofoblaszt hiperplazia hidropikus degeneráció nélkül), a magzati elemek viszont jóval fejlettebbek, mint a diandrikus triploid parciális molában. A ritkán előforduló trofoblaszt tumorokká progrediáló részleges molaterhességek diandrikus triploid genotípusúak 62. A maradék 10%-a a részleges mola hydatidosáknak diploid, ritkábban tetraploid kromoszóma készlettel rendelkezik. Érdekes megfigyelés, hogy a tetraploid molás betegek panaszai közül a molaterhességre jellemző karakterisztikus tünetek hiányoznak, ami a korai diagnózist megnehezíti. A szövettani vizsgálatok eredménye csak enyhe, nem proliferatív képet igazol A protonkogének és tumorszupresszor gének, illetve fehérjetermékeik szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben Bár a részleges és teljes molaterhesség genetikai jellemzői jól ismertek, a kulcsszereplő faktorok a betegség patogenezisének és progressziójának megértésében mindeddig ismeretlenek maradtak. A trofoblaszt sejtek szaporodásában feltételezhetően a protoonkogének és szupresszor gének közötti egyensúly lényeges szerepet játszik. A trofoblaszt fejlődése, szöveti egysége a sejtszaporodás, a sejtérés és a sejthalál folyamatának egyensúlyától függ. Ha ezen, funkcionálisan fontos gének, illetve fehérjetermékeik közötti harmónia valamilyen exogén, vagy endogén hatás következtében megbomlik, az a sejtek kontrolálatlan proliferációjával, differenciálatlanságával, vagy pusztulásával jár, ami malignus transzformációhoz vezet 64. Normál körülmények között a protoonkogének és a szupresszor gének ellentétes hatással bírnak, azonban a karcinogenezis során kóros formáik, az onkogének és tumor szupresszor gének hatása egyirányba, a fokozott sejtszaporodás irányába tolódhat el. Így 14

23 a protoonkogének aktiválódása, míg a szupresszor gének inaktiválódása szerepet játszik a különféle humán daganatok kialakulásában és progressziójában 65. A protoonkogének aktiválódása, illetve a szupresszor gének inaktiválódása általában mutáció következménye, mely lehet pontmutáció, deléció, vagy transzlokáció, stb. Leggyakrabban kromoszómális transzlokáció révén indul el a folyamat. A szerkezeti mutáció azonban csak egyike annak a számos lehetséges folyamatnak, ami kiválthatja a normál gének megváltozását 66,67. Ismert, hogy ugyanazon gén aktivációja, vagy elvesztése több különböző humán daganat kifejlődésében is szerepet játszhat. Ezen túlmenően ahhoz, hogy a tumor elérhesse teljes malignus potenciálját, számos különböző lókusz mutációjára van szükség 68. Ezekről a molekuláris szintű, genetikai változásokról és az egymással való kölcsönhatásaik mechanizmusáról azonban még keveset tudunk, ezért intenzív kutatások tárgyát képezi a malignus átalakulást jelző tumormarkerek keresése, valamint azok a funkcionális in vitro és in vivo kísérletek, amelyek közelebb vezethetnek a folyamat mechanizmusának megértéséhez 69. Az eddigi tanulmányok néhány onkogén aktivációját és a növekedési faktorok megváltozott kifejeződését mutatták ki a trofoblaszt daganatokban. A kóros trofoblasztnál fellépő, az expresszióban bekövetkező mennyiségi változások jelentősége néhány esetben nehezen értékelhető, mivel számos protoonkogén és tumorszupresszor gén nagy mennyiségben fejeződik ki a normál méhlepény esetében is 70. Sok szabályozó molekuláról kiderült, hogy hatással vannak a trofoblasztok biológiájának és környezetükhöz való viszonyának területére. A legtöbb tanulmány individuális mediátorok hatását vizsgálta in vitro körülmények között a trofoblaszt sejtek szaporodására és működési differenciálódására vonatkozólag. Mivel a lepényi trofoblaszt olyan környezetben fejlődik, amely egyedülállóan gazdag hormonokban és növekedési faktorokban, a számos regulátor közötti kölcsönhatás, így nagyon valószínű 71. Az előzőekben leírtakat témavezetőm, Dr. Fülöp Vilmos eredményei alapján próbálom meg alátámasztani. A c-myc gátolja a differenciálódást és proapoptotikus hatású. A c-myc fehérjék kifejeződését a növekedési faktorok és azok receptorai idézhetik elő 72. A bcl-2 csökkenti a kórosan szabályozott c-myc expresszió apoptózist serkentő hatását, anélkül, hogy a folyamatos sejtnövekedést befolyásoló képességére hatna. Ezáltal onkogenetikai szinergizmust biztosít a két protoonkogén 15

24 között 73. A bcl-2 fokozott expressziója, amely gátolja az apoptózist, a neopláziák számos típusában lehet gyakori rendellenesség 74,75. Fülöp és munkatársai immunhisztokémiai módszerrel a c-myc és bcl-2 fehérjék erős kifejeződését találták teljes molaterhességekben és choriocarcinomákban, amelyek egymással szinergizmusban fontosak lehetnek a betegség patogenezisében 69,76. A p53, a p21 waf/cip1 és a Rb fehérjék tumorszupresszor gének termékei, amelyek a sejtekben a sejtproliferáció gátlását segítik elő. A p21 génjét a p53 fehérje szabályozza, bár ettől függetlenül több növekedési faktor is indukálhatja kifejeződését 77. Az mdm2-nek más onkogénekkel együtt transzformáló működése van, amelyet fokozott expressziója indíthat el. A vizsgálatok szerint az mdm2 gén több humán malignus tumorban felerősítve van jelen, ami arra utal, hogy jelentősége lehet a daganatképződésben 78. Úgy vélik, hogy az mdm2 géntermék a p53 fehérje egyik sejtes szabályozójaként működik, mivel az a vad típusú p53 fehérjéhez kötődhet. Ez az önszabályozó, visszajelentő mechanizmus fontos szerepet játszik a sejtosztódásban. Ezért az mdm2 túlzott expressziója elfojthatja a p53 fehérje növekedés szupresszáló hatását, aminek köszönhetően bizonyos daganatok megmenekülhetnek a szabályozott növekedési kontroll alól. Ennek alapján több rosszindulatú daganatban sikerült kimutatni az mdm2 felerősítés mellett, paradox módon a p53 fokozott expresszióját is 79. Az mdm2 közvetetten a p53 fehérjén keresztül blokkolja a p21 működését, valamint közvetlenül gátolja az Rb géntermékét azáltal, hogy komplexet képez vele. Ezen a mechanizmuson keresztül a p21 és Rb fehérjék túlzott kifejeződését eredményezheti egyes tumorokban 80. Fülöp és munkatársai az előzőekben leírtakhoz hasonlóan, az mdm2, p53, p21 és Rb fehérjék fokozott expresszióját mutatták ki teljes molában és choriocarcinomában, ami összefüggésben lehet a terhességi trofoblaszt tumorok patogenezisével 81. A choriocarcinomák több mint 50%-a molaterhesség talaján jön létre, ezért kialakulásának kockázata teljes mola hydatidosa után fokozott. Ennek ellenére nem áll rendelkezésre olyan paraméter, amely előre jelezné a molás megbetegedés progresszióját. Több rosszindulatú daganatféleség és a trofoblaszt tumorok esetében is kimutatták, hogy a protoonkogének és tumorszuppresszor gének összefüggésben lehetnek a malignus transzformáció folyamatával 82. Meghatározásuk reverz transzkripciós polimeráz lánc reakcióval (RT-PCR), vagy Northern-blot analízissel 16

25 történhet, ezek a metodikák azonban csak egy génre összpontosítanak egy időben. Sokkal ígéretesebbnek tűnik egy olyan cdns könyvtár egy nukleinsav panel használata, amelyek segítségével a normál és tumoros sejtvonalak, illetve szövetek génállományának aktivitása hasonlítható össze 83, Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbb onkogének és termékeik Az első trimeszterbeli méhlepényben a trofoblaszt sejtek növekedésében és érésében az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) elengedhetetlenül fontos szereppel bír 85. Az EGFR és az azzal rokon c-erbb I. típusú onkogén család fehérje termékei az EGFR (c-erbb-1), a c-erbb-2, a c-erbb-3, a c-erbb-4, közeli szerkezeti homológiát mutatnak a tirozin-kináz aktivitással rendelkező szignál transzdukciós transzmembrán fehérjékkel. Mind a négy c-erbb onkogén által kódolt sejtfelszíni molekula, hasonló szerkezetű: egy ciszteinben gazdag extracelluláris doménből, egy hidrofób transzmembrán régióból és egy intracelluláris tirozin-kináz doménből állnak 86 ( ábra) ábra Az EGFR, c-erbb-2, c-erbb-3 sematikus ábrája és a hasonlóságok a receptorok között (a c-erbb-4-ről nincs elérhető adat) (Prigent SA, Lemoine NR: The Type I (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Prog Growth Factor Res 4: 1-24, 1992.) 17

26 Az EGFR ligandjait, az EGF-t és a lepényi transzformáló növekedési faktortalfát (TGF- ) megköti, ezáltal a tirozin-kinázt aktiválja és a célsejt fehérjék foszforilálásával számos sejtfolyamatot képes aktiválni 86,87. Kimutatták, hogy egyes choriocarcinoma sejtvonalak (BeWo, JEG-3, Jar) nagy mennyiségű EGF-t és TGF- messzendzser RNS-t (mrns) szintetizálnak 88. Az EGF az EGFR kifejeződésén keresztül összefüggésben van a méhlepény által termelt hcg, humán placentáris laktogén (hpl) és progeszteron szekrécióval. Kemoterápiát követően a csökkenő hcg szinttel párhuzamosan a choriocarcinoma sejtek felszínén az EGFR-ok száma is jelentősen redukálódik 89,90. Az EGF egy potenciális mitogén, ami a normál és tumoros sejtek széles skálájában, köztük a choriocarcinoma sejtekben képes aktiválni az EGFR-okat, ami fokozza a sejtnövekedést. A sejtek proliferációs aktivitása és kapacitása a sejtfelszínen kifejezett növekedési faktor receptorok számától függ 91,92. A normál placenta és a terhességi choriocarcinomák beágyazódási helye limfocitákkal és makrofágokkal infiltrált terület 93. Miután a terhességi choriocarcinomát infiltráló immunsejtek nagy valószínűséggel apai eredetű antigének és onkoproteinek hatásának vannak kitéve, ezért ezek a sejtek aktivált állapotba kerülnek. Az aktivált limfociták és makrofágok citokineket termelnek, amelyek parakrin módon hatással vannak környezetükre és befolyásolják a helyi folyamatokat 94. Steller és munkatársai kimutatták, hogy interleukin-1 (IL-1) és tumor nekrózis faktor (TNF- ) citokinek hatására az EGFR expresszió fokozódik a choriocarcinoma sejtek felszínén in vitro 95. Aboagye-Mathiesen és munkatársai interferon-gamma (INF- ) hatására az invazív trofoblaszt sejtek c-erbb-2 fehérje kifejeződés csökkenését figyelték meg 96. Igazolódni látszik tehát az a feltételezés, hogy a citokinek az autokrin növekedést szabályozó folyamatok parakrin mediátoraiként működhetnek és befolyásolják a choriocarcinoma sejtek proliferációját. Az EGFR-t és a többi c-erbb onkogéneket és fehérje-receptor termékeiket számos rosszindulatú tumorban vizsgálták, mint patogenetikai és prognosztikai tényezőket, összefüggéseket találva a betegség és a kifejeződés erőssége között

27 A normál és daganatos trofoblaszt sejtek beágyazódását és invazivitását befolyásoló sejtadhéziós molekulák és az azokat bontó proteolitikus enzimek A lepényszövet trofoblaszt sejtjei heterogén populációt képeznek: szinciciotrofoblasztokból, citotrofoblasztokból és extravillozus trofoblasztokból állnak. Míg a boholytrofoblaszt sejtek nem mutatnak invazív viselkedést, addig az extravillozus trofoblasztok a malignus tumorok sejtjeihez hasonlóan invazív tulajdonságokkal rendelkeznek 100. Az endometriumba történő trofoblaszt betörés a placentáció során szigorúan szabályozott folyamat. Az extravillozus trofoblaszt sejtek a lepény rögzítő bolyhainak bazális membránjától migrálnak, és a mélybe törve elérik a miometriumot 101. A folyamat az anyai szövetek extracelluláris mátrixának (ECM) enzimatikus bontásával történik, melyben különböző proteáz enzimek, mint szerin proteázok, katepszinek és mátrix metalloproteinázok (MMP-k, mátrixinek) játszanak szerepet 102,103. Az MMP-k a cink-atomot tartalmazó endopeptidázok családjába tartozó enzimek, melyek az ECM alkotóelemeinek széles spektrumát képesek bontani. Az irodalomban eddig közel 20 féle MMP-t mutattak ki. Szubsztrát specificitásuk alapján 4 fő csoportba sorolják őket: kollagenázok, zselatinázok, stromelizinek és membrántípusú MMP-k ( táblázat). Az MMP-17 és az MMP-18 szubsztrátját ez idáig még nem sikerült tisztázni 104,105. Az MMP-k inaktív pro-enzimek formájában szekretálódnak. Aktiválódásuk és aktivitásuk számos biológiai modulátortól (hormonok, citokinek, szöveti glikoproteinek, növekedési faktorok) függ, leginkább a szöveti inhibitoraik (Tissue inhibitor of metalloproteinase - TIMP) befolyásolják működésüket. Ezek az inhibitor molekulák kötődnek az MMP-k aktív formáihoz és gátolják a proteolitikus aktivitásukat a szövetekben 106,107. Szerkezetileg négy TIMP molekulát különítettek el, amelyekből a TIMP-1 és a TIMP-2 játsszák a fő szerepet az MMP-k gátlásában. A TIMP-1 az összes típusú MMP-t, a TIMP-2 pedig a zselatinázokat, főleg az MMP-2-t inaktiválja 101,

28 Alcsoport MMP Egyéb elnevezés Molekulatömeg Szusztrát Zsetatinázok MMP-2 Zselatináz A 72 kda zselatináz MMP-9 Zselatináz B 92 kda zselatináz kollagén IV, V, VII, X zselatin,fibronektin, elasztin kollagén IV, V, zselatin Kollagenázok MMP-1 Fibroblaszt kollagenáz Insterticiális kollagenáz kollagén I, II, II, X MMP-5, enaktin MMP-8 Neutrofil kollagenáz kollagén I, III PMNL kollagenáz MMP-13 Kollagenáz kollagén I Stromelizinek MMP-3 Stromelizin-1 Tranzin kollagén III, IV, IX, X zselatin,laminin,kazein fibronektin,elasztin kazein, fibronektin, zselatin MMP-7 PUMP-1 Mátrilizin MMP-10 Stromelizin kollagén II, IV, V Tranzin-2 fibronektin, zselatin MMP-11 Stromelizin kollagén IV, szerpin MMP-12 Metalloelasztáz elasztin, fibronektin Membrán-típusú MMP-14 MT1-MMP pro-mmp-2 MMP-k MMP-X1 MMP-15 MT2-MMP pro-mmp-2 MMP-16 MT3-MMP pro-mmp-2 MMP-17 MT4-MMP nem ismert nem identifikált MMP-18 nem ismert nem identifikált PMNL: polimorfonukleáris leukociták; PUMP-1: putatív metalloproteináz táblázat A metalloproteinázok osztályozása és szubsztrátjai (Bischof és mtsai: Paracrin and autocrine regulators of trophoblast invasion (review) 14: 55-60, 2000) Az implantáció folyamata membrán közvetítette események pontos sorozatától függ, amely komplex sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásokat foglal magába. A trofoblaszt invázió folyamatát térben és időben részben a trofoblaszt sejtek által termelt faktorok autokrin módon, részben pedig az anyai, deciduális faktorok parakrin úton szabályozzák. Ennek következtében az extravillozus trofoblaszt sejtek inváziója normálisan csak az endometriumra és a miometrium proximális harmadára korlátózódik 108. Hormonálisan az első trimeszterben fokozatosan emelkedő progeszteron és hcg szintek gátolják az MMP-k proteolitikus aktivitását. A progeszteron elsősorban a zselatinázok, a hcg pedig a kollagenázok termelődését csökkenti 109,110. A sejtadhéziós molekulák (CAM-ok) közül a kollagének és a laminin fokozzák a sejtek zselatináz szekrécióját, ezzel a trofoblaszt inváziót elősegítik 111. A cadherinek (cad) családjából az E-cad, az N-cad, a cad-6 és a cad-11 glikoproteinek koordinált 20

29 expressziója az extravillozus trofoblasztok invazív migrációját gátolják. Kimutatták, hogy az E-cad, amely egy tumorszupresszor gén terméke, a gyengén differenciálódott, nagy metasztatikus aktivitású tumorokban alacsony, vagy nem kimutatható mennyiségben termelődik, míg a jól differenciált, gyengén metasztatikus aktivitású ráksejtek magas koncentrációban expresszálják 112. A közvetlen sejt-sejt kontaktusban működő réskapcsolat (gap-junction) fehérjék, a connexinek (Cx-ek) közül a Cx40 az invazív extravillozus trofoblasztok felszínén nagy mennyiségben termelődik a terhesség első harmadában, majd fokozatosan eltűnik és az érett méhlepényben már nem mutatható ki. Winterhager és munkatársai ezért a Cx40 fehérje kifejeződését összefüggésbe hozzák a placentáció folyamatával 113,114. Feltételezésüket igazolják Helmann és munkatársai megfigyelései, miszerint in vitro a choriocarcinoma sejtek (BeWo, Jar) erősen kifejezik a Cx40-t 115. A trofoblaszt sejtek és az anyai decidua által termelt citokinek és növekedési faktorok is hatással vannak a trofoblaszt invázió folyamatára. Az extravillozus trofoblasztok IL-eket szekretálnak. Az IL-1, IL-6 és IL-15 fokozzák, míg az IL-10 gátolja az MMP-k proteolitikus aktivitását. A deciduális TNF, az EGF és a TGF- aktiválják az MMP-ket a TIMP-ek egyidejű gyengítésével 105. Unemori és munkatársai az első trimeszterbeli méhlepényben az IL-1 és az EGF faktorok szinergista hatását figyelték meg 116. A deciduális IGF-I parakrin és a trofoblaszt IGF-II autokrin módon erősítik az endometrium trofoblaszt invázió folyamatát 117,118. Ugyancsak kimutatták, hogy a trofoblaszt sejtek által termelt plazminogén aktivátor (PA - szerin proteáz) a plazminogén - plazmin rendszeren keresztül az összes MMP expresszióját és szekrécióját fokozza. A TGF- ezt a hatást két mechanizmuson keresztül ellensúlyozza. Részben a TIMP aktivitást erősíti, részben pedig közvetlenül a PA gátlásán keresztül fejti ki anti-invazív hatását. Érdekesség, hogy a plazmin az MMPk mellett a TGF- aktivitását is fokozza, egy önregulációs kört képezve a trofoblaszt invázió szabályozásának folyamatában 119 ( ábra). Általánosságban elmondható, hogy a proinflammációs citokinek fokozzák, az anti-inflammációs citokinek pedig gátolják az MMP-k aktivitását és ezzel elősegítik, vagy gyengítik a trofoblaszt invázió folyamatát a placentáció során. Ezek a folyamatok transzkripciós szinten zajlanak