POLIMORFIZMUSOK ÉS HAPLOTÍPUSOK KLINIKAI VONATKOZÁSAI

Átírás

1 POLIMORFIZMUSOK ÉS HAPLOTÍPUSOK KLINIKAI VONATKOZÁSAI Doktori értekezés Szilágyi Ágnes Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Kalász Huba Hivatalos bírálók: Dr. Bagdy György Dr. Vásárhelyi Barna Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Klebovich Imre Dr. Tekes Kornélia Dr. Hársing László Budapest 2006.

2 Az értekezés kísérleti anyagának molekuláris genetikai része a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében készült Dr. Sasvári Mária irányításával. A neurológiai diagnózist Dr. Farkas Viktor (I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika) állította fel. A statisztikai elemzéseket Dr. Székely Anna (ELTE PPK Pszichológiai Intézet) végezte.

3 Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK Táblázatok jegyzéke... 3 Ábrák jegyzéke... 4 Rövidítések jegyzéke Bevezetés Irodalmi áttekintés Genetikai polimorfizmusok és haplotípusok Genetikai polimorfizmusok A haplotípusok vizsgálatának jelentősége Komplex öröklődésű kórképek Komplex öröklődésű kórképek jellemzői Poligénes rendszerek vizsgálati módszerei Populáció-alapú asszociáció-vizsgálatok Családalapú asszociáció-vizsgálatok Gyermekkori migrén Klinikai tünetek Diagnózis A migrén genetikai háttere Kábítószerfüggőség Diagnózis Heroinfüggőség A kábítószerfüggőség és a gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitási zavar lehetséges kapcsolata A kábítószerfüggőség genetikai háttere A szerotonin rendszer A szerotonin rendszer kandidáns génjei A szerotonin transzporter (SERT) A szerotonin rendszer szerepe a migrénben A szerotonin rendszer szerepe a kábítószerfüggőség kialakulásában A dopamin rendszer A dopamin rendszer kandidáns génjei A D4-es dopamin receptor (DRD4) A dopamin transzporter (DAT) A dopamin lebontása (COMT) A dopamin rendszer szerepe a migrénben A dopamin rendszer szerepe a kábítószerfüggőség kialakulásában Az MHC régió genetikai variabilitása Az MHC régió Ősi haplotípusok Az RCCX modul A C4-es komplement komponens jellemzői A C4-es komplement génje A C4 gén hiányos egér fenotípusa A C4 molekulák szerepe a komplementrendszerben A C4 aktiválódása és izotípusainak jellemzői A C4 komplement szerepe az immunbetegségek kialakulásában A C4 gének számának meghatározására alkalmazott korábbi módszerek Célkitűzések Módszerek A vizsgálatokban résztvevő személyek Klinikai populációk

4 Tartalomjegyzék Kontroll csoport Mintavétel és DNS izolálás Genotípus és haplotípus meghatározás A hosszúság polimorfizmusok genotipizálása Az egypontos polimorfizmusok (SNP) vizsgálata Restrikciós fragmentumok hosszúság polimorfizmusa (PCR-RFLP) Kétirányú allél-specifikus amplifikáció (ASA) A DRD4 gén promoter régiójának haplotípus analízise Haplotípus meghatározás ASA-val Haplotípus meghatározás PCR-RFLP-vel Amplifikációs körülmények A PCR elegy összetétele A PCR termociklus A PCR termékek restrikciós emésztésének körülményei A PCR termékek elektroforetikus elválasztása A C4A és C4B gének számának meghatározása A real-time PCR körülményei A kapilláris elektroforézis körülményei Statisztikai módszerek Eredmények Genetikai asszociáció-vizsgálatok eredményei A gyermekkori migrén genetikai tényezőinek vizsgálata A szerotonin transzporter polimorfizmusainak vizsgálata A dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A drogfüggőség genetikai tényezőinek vizsgálata A szerotonin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A gyermekkori ADHD lehetséges hajlamosító szerepének vizsgálata Új módszerek kidolgozása a C4A és C4B génszám meghatározására A C4 gének vizsgálata real-time PCR alkalmazásával A hatékonysági hányadosok kiszámolása A módszer reprodukálhatóságának vizsgálata A kiindulási DNS mennyiség hatásának vizsgálata Az újonnan kidolgozott módszer alkalmazása A C4 gének vizsgálata kapilláris elektroforézis alkalmazásával A polimeráz láncreakció körülményeinek optimalizálása A C4A és C4B génszám kvantitatív analízise Az újonnan kidolgozott módszer alkalmazása Az eredmények megbeszélése A szerotonin és dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A gyermekkori migrén genetikai rizikófaktorai A szerotonin rendszer polimorfizmusainak szerepe A dopamin rendszer polimorfizmusainak hatása A drogfüggőség genetikai rizikófaktorai Kópiaszám polimorfizmusok vizsgálata Real-time PCR Multiplex-PCR és kapilláris elektroforézis A kidolgozott módszerek alkalmazása Összefoglalás Summary Irodalomjegyzék Saját publikációk jegyzéke Köszönetnyilvánítás

5 Táblázatok jegyzéke TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 1. táblázat. A migrén prevalenciája gyermekkorban táblázat. A Nemzetközi Fejfájás Társaság diagnosztikus kritériumai az aura nélküli és az aurával járó migrénben táblázat. Az Amerikai Pszichiátriai Társaság kritériumai a pszichoaktív szer függőség diagnosztizálására (DSM IV) táblázat. Az opiát típusú drogok hatásai táblázat. A C4A és C4B fehérjék biokémiai jellemzőinek összehasonlítása táblázat. A hosszúság polimorfizmusok genotípusának meghatározásához használt primerek táblázat. A PCR-RFLP-vel történő SNP meghatározásnál alkalmazott restrikciós enzimek táblázat. Az SNP meghatározásnál alkalmazott primerek táblázat. A haplotípus meghatározásnál használt primerek fontosabb jellemzői táblázat. A DRD4 promoter -615AG és -616CG haplotípus meghatározása során alkalmazott restrikciós enzimek táblázat. A horizontális gélelektroforézis során alkalmazott gél típusok és az elválasztás ideje táblázat. A C4A és C4B génszámának meghatározásához használt primerek táblázat. Az 5-HTTLPR polimorfizmus allél- és genotípus-eloszlása táblázat. A STin2 polimorfizmus genotípus- és allél-eloszlása táblázat. A D4-es dopamin receptor 48 bp hosszúság polimorfizmusának genotípus-eloszlása a kontroll és a migrénes populációban táblázat. A dopamin transzporter 3 UTR hosszúság polimorfizmusának allél- és genotípus-eloszlása a kontroll és a beteg populációkban táblázat. A COMT G1947A SNP allél- és genotípus-eloszlása a kontroll és a beteg populációkban táblázat. A szerotonin és a dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata heroinfüggők körében táblázat. A dopamin rendszer négy polimorfizmusának haplotípus-frekvenciái és asszociáció-analízise heroinfüggők körében táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív validitás vizsgálatának statisztikai adatai táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív adatainak statisztikai elemzése táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív eredményei a -615AG SNP genotípusa szerint csoportosítva táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív eredményei a 48 bp VNTR genotípusa szerint csoportosítva táblázat. A DRD4 gén -615AG és 48 bp VNTR polimorfizmusok hatásának elemzése az ADHD-RS retrospektív kérdőív figyelemhiány és hiperaktivitás skálák tekintetében táblázat. A korábban publikált és az újonnan kidolgozott módszerrel meghatározott C4A és C4B géndózisok előfordulási gyakoriságának összehasonlítása táblázat. A szerotonin transzporter polimorfizmusainak vizsgálata migrénben...8 3

6 Ábrák jegyzéke 27. táblázat. Az általunk vizsgált dopaminerg polimorfizmusok korábbi asszociáció-analízisei migrénes betegek körében táblázat. A szerotonin transzporter hosszúság polimorfizmusainak korábbi vizsgálata a kábítószerfüggőség tekintetében táblázat. A dopamin rendszer vizsgált polimorfizmusainak korábbi asszociációanalízisei kábítószerfüggők körében táblázat. A C4 génszám meghatározására alkalmazott módszerek összehasonlítása...8 ÁBRÁK JEGYZÉKE 1. ábra. A migrénes roham fázisai, klinikai tünetei ábra. A szerotonin transzporter gén hosszúság polimorfizmusai ábra. A D4-es dopamin receptor gén polimorfizmusai ábra. A humán genomban előforduló kópiaszám polimorfizmusok ábra. Az ismétlődő RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modulok lehetséges variációi ábra. A C4-es komplement célsejthez való kötődésében kulcsszerepet játszó 15- tagú tiolakton gyűrű felépítése és a kapcsolódás mechanizmusa ábra. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív összértékének valamint a figyelemhiány és a hiperaktivitás skáláinak átlagos pontszáma nemek szerint a kontroll és a heroinfüggő populációban ábra. A DRD4 gén -615AG és 48 bp VNTR polimorfizmusainak együttes hatása az ADHD-RS retrospektív kérdőív figyelemhiány és hiperaktivitás skálák esetében ábra. A C4A és B génszám meghatározásra tervezett primerek és próbák pozíciója ábra. A C4 génszám meghatározás reprodukálhatóságának vizsgálata ábra. A C4A és C4B génszám meghatározás DNS koncentráció-függésének vizsgálata ábra. A C4A és C4B génszám meghatározására tervezett multiplex PCR rendszer vázlata ábra. A polimeráz láncreakció dinamikájának vizsgálata 3 DNS koncentráció és 8 különböző ciklusszám alkalmazásával ábra. A négy reakció esetén kapilláris elektroforézissel mért normalizált csúcsmagasságok a kiindulási DNS mennyiség függvényében ábra. Génszám meghatározás kapilláris elektroforézissel...8 4

7 Rövidítések jegyzéke RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 120 bp dup A D4-es dopamin receptor promoter régiójában található 120 bp hosszúságú duplikáció UTR Nem transzlálódó régió (Untranslated region) 3 UTR VNTR A dopamin transzporter 3 régiójában található hosszúság polimorfizmus 48 bp VNTR A D4-es dopamin receptor gén harmadik exonjában található, 48 bp ismétlődéséből álló hosszúság polimorfizmus -521CT SNP A D4-es dopamin receptor promoterében a -521-es pozícióban előforduló citozin/timin csere -615 AG SNP A D4-es dopamin receptor promoterében a -615-os pozícióban előforduló adenin/guanin csere -616 CG SNP A D4-es dopamin receptor promoterében a -616-os pozícióban előforduló citozin/guanin csere 5HIAA 5-hidroxi-indolecetsav 5HT 5-hidroxi-triptamin, szerotonin 5HT1B, 5HT2A, Szerotonin receptor altípusok 5HT2C, 5HT3 5-HTTLPR A szerotonin transzporter promoterében található hosszúság polimorfizmus (5-hydroxy-triptamine transporter linked polymorphic region) ADHD Figyelemhiányos hiperaktivitási zavar (Attention Deficit Hyperactivity Disorder) ADHD-RS ADHD Rating Scale kérdőív ANOVA Statisztikai próba két független csoport átlagértékeinek összehasonlítására (Analysis of variance) ASA Allél-specifikus amplifikáció (Allele specific amplification) BNO-10 Egészségügyi Világszervezet Betegségek Nemzetközi Osztályozása 10. Revíziója bp Bázispár C4 4-es komplement komponens camp Ciklikus adenozin-monofoszfát CGE Kapilláris gélelektroforézis CNP Kópiaszám polimorfizmus (Copy number polymorphism) COMT Katekol-O-metiltranszferáz (Catechol-O-methyltransferase) C T Küszöb ciklusszám (Threshold cycle) CYP21 Citokróm 21-hidroxiláz DA Dopamin DAT Dopamin transzporter datp Dezoxiadenozin-trifoszfát df Szabadsági fok DNS Dezoxiribo-nukleinsav dntp Dezoxiribonukleozid-trifoszfát DRD1, DRD2, D1-es, D2-es, D3-as és D4-es dopamin receptor altípusok DRD3, DRD4 dsdns DSM IV. Kettősszálú (double strand) DNS Mentális zavarok diagnosztikai és statisztikai kézikönyve IV. kiadás (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) 5

8 Rövidítések jegyzéke DTT EDTA EEG G1947A SNP GABA GTP HERV HGP HLA IHCD-II IHS kb KO LIF MANOVA MAOA Mb MHC MRI mrns n N NCBI OR PCR RFLP RP SDS SERT SNP SPSS SSRI STin2 SUD TAE TBE TDT TE TNX VNTR Dithio-DL-threitol Etilén-diamin-tetraacetát Elektro-enkefalográfia A katekol-o-metiltranszferáz gén 1947-es pozíciójában előforduló guanin/adenin csere Gamma-aminovajsav Guanozin trifoszfát Humán endogén retrovírus Humán genom project Humán leukocita antigén Nemzetközi Fejfájás Társaság által kidolgozott diagnosztikus kritériumrendszer második kiadása Nemzetközi fejfájás társaság (International Headache Society) Kilobázis Génkiütött (Knock-out) Lézer indukált fluoreszcencia Többváltozós variancia-analízis (Multivariate analysis of variance) Monoamino-oxidáz A izoenzim Megabázis Fő hisztokompatibilitási génkomplex (Major Histocompatibility Complex) Mágneses rezonanciás képalkotás (Magnetic resonance imaging) Messenger ribonukleinsav Ismétlődési szám Egyedszám National Center of Biotechnology Information ( Esélyhányados (Odds ratio) Polimeráz láncreakció (Polymerase chain reaction) Restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (Restriction fragment lenght polymorphism) Nukleáris protein kináz Nátrium-dodecil-szulfát (Sodium-dodecil sulphate) Szerotonin transzporter Egypontos nukleotid polimorfizmus (Single nucleotide polymorphism) Statisztikai programcsomag Szelektív szerotonin visszavétel gátló vegyületek (Selective serotonin reuptake inhibitor) A szerotonin transzporter gén második intronjában található hosszúság polimorfizmus (Serotonin transporter intron 2) Szerhasználati zavar (Substance use disorder) Tris-acetát-EDTA puffer Tris-borát-EDTA puffer Preferenciális allél-/haplotípus-átadás vizsgálat (Transmission disequilibrium test) Tris-EDTA puffer Tenascin-X Ismétlési szám polimorfizmus (Variable number of tandem repeats) 6

9 Bevezetés 1 BEVEZETÉS Napjaink humán genetikai kutatásainak egyik fő irányvonala a humán szekvencia variánsok (polimorfizmusok) azonosítása és funkcionális jellemzése. A genetikai polimorfizmusok fontos szerepet játszhatnak az emberi társadalmat széles körben érintő kórképek, például a szív- és érrendszeri megbetegedések, a daganatok vagy a pszichiátriai rendellenességek kialakulásában is. Az ilyen, úgynevezett komplex öröklődésű betegségek etiológiájában több gén valamint a szervezetet érő környezeti hatások együttesen vesznek részt, így az egyes génvariánsok hatása meglehetősen csekély. A genetikai hajlamosító faktorok kutatásának egyik legelterjedtebb módszere a kandidáns gének asszociáció-analízise, melynek célja a kiválasztott gének egyes változatai és a vizsgált fenotípusos jegy közötti kapcsolat elemzése. A kandidáns gének a vizsgált fenotípus pathomechanizmusában szerepet játszó komponensek közül kerülnek ki, míg a fenotípus egy betegség megléte vagy hiánya lehet. Egy új irányvonal a viselkedés vagy rendellenesség egyes elemeinek, az úgynevezett endofenotípusoknak a vizsgálata, melyek nagyobb valószínűséggel hozhatók összefüggésbe egy-egy génvariánssal. Jelen dolgozat központi témája két, komplex öröklődésű jelleg, a kábítószerfüggőség valamint a gyermekkori migrén genetikai hátterének kutatása. A szerotonin és a dopamin rendszer legfontosabb génváltozatainak lehetséges hajlamosító szerepét genetikai asszociáció-analízissel vizsgáltuk. Az egyes emberek genetikai információ-tartalma közötti eltérések intenzív kutatása az utóbbi években meglepő eredményre vezetett, ugyanis egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy a korábban a variáció fő forrásának gondolt nukleotidcserék és rövid szekvenciákat érintő hosszúság polimorfizmusok mellett jóval nagyobb különbségek is előfordulhatnak. Az ilyen, akár több százezer bázispárt érintő variációkat gén kópiaszám polimorfizmusoknak nevezték el. Ezen újonnan leírt variánsok vizsgálata új irányt adhat a komplex öröklődésű jellegek kutatásának, habár a probléma módszertanilag még nem megoldott. Ezért, a C4-es komplement komponens génvariánsait modell rendszerként alkalmazva, két új módszert dolgoztunk ki a gén kópiaszám különbségek kvantitatív mérésére. Ezek az új módszerek megkönnyítik majd a gén kópiaszám polimorfizmusok további vizsgálatát. 7

10 Irodalmi áttekintés 2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 GENETIKAI POLIMORFIZMUSOK ÉS HAPLOTÍPUSOK Az 1989-ben induló Humán Genom Project célja a teljes humán DNS szekvencia, azaz kb. 3 milliárd nukleotid sorrendjének megismerése volt. A molekuláris biológiai technikák fejlődésével lehetővé vált, hogy 2001-ben az USA, Anglia, Németország, Franciaország, Japán és Kína nemzeti támogatásával dolgozó, 20 csoportból álló konzorcium bejelentse, hogy elkészítették a humán genom szekvenciájának első munkapéldányát (1, 2). Ez a szekvencia egy személy haploid kromoszóma készletének bázissorrendjét tartalmazza, így a következő lépés az egyes emberek genomja közötti eltérések feltérképezése. Becslések szerint bármely két, nem rokon ember genomja kb. 99,9%-ban azonos, azaz DNS szekvenciájuk kb. 3 millió bázispárban különbözik. Ezen különbségeknek, valamint ezek szerepének felderítése jelenleg is folyamatban van (3) Genetikai polimorfizmusok Az egyes emberek nukleotid sorrendjében fellelhető különbségeket a variánsok elterjedési gyakorisága alapján csoportosítják. Azokat a szekvencia változatokat, melyek legalább 1%-os gyakorisággal fordulnak elő egy átlagos populációban polimorfizmusoknak nevezzük (3). Ezek jelentőségét többek között az adja, hogy hozzájárulhatnak az emberek közti öröklött különbségek kialakulásához, egyes variánsok protektív vagy rizikófaktorok lehetnek bizonyos betegségekre, fenotípusos jegyekre nézve, valamint felelősek lehetnek a különböző gyógyszerek eltérő terápiás hatékonyságáért is. Formai szempontból a polimorfizmusoknak két fő típusát különböztetjük meg: Az egyik a hosszúság polimorfizmusok csoportja, melyre bizonyos hosszúságú szekvencia különböző számú ismétlődése jellemző. Ennek egyik típusa a Variable Number of Tandem Repeats vagy VNTR, ami egy szekvencia azonos irányultsággal egymás után elhelyezkedő, változó számú ismétlődését jelöli. Egy gén kódoló vagy szabályozó régiójában elhelyezkedő hosszúság polimorfizmusok hatással lehetnek a kifejeződő fehérjetermék méretére vagy a transzkripció befolyásolásán keresztül mennyiségére. Ezen polimorfizmusokon kívül még számos, elszórva elhelyezkedő, azonos vagy fordított irányultságú ismétlődő szakasz található a humán genomban, akár 40-50%-át 8

11 Irodalmi áttekintés ilyen repetitív szekvenciák alkothatják (2). Nagy számban találhatók például olyan, több ezer bázispár hosszúságú homológ ismétlődő szakaszok, amelyek több gént is magukba foglalhatnak Ezek a szegmentális duplikációval létrejött ismétlődések feltehetően az új gének keletkezésében, valamint az emberi evolúcióban játszanak szerepet (4). A polimorfizmusok másik csoportja az egypontos polimorfizmusok (single nucleotide polymorphism, SNP). Ebben az esetben a polimorf lókusz alléljai egy nukleotidban különböznek, ami általában báziscsere következtében jön létre. Az SNP-k alig 1%-a okoz változást a fehérje szerkezetében, a többi, még nem tisztázott szerepű SNP esetében intenzív kutatások folynak az esetleges funkcionális hatás kimutatására (5). A polimorfizmusokat lokalizáció szerint csoportosítva kódoló, illetve nem kódoló régióban elhelyezkedő variációkról beszélhetünk. Megkülönböztethetünk továbbá funkcionális és nem funkcionális polimorfizmusokat, attól függően, hogy a variánsok befolyásolják-e a kódolt fehérjék felépítését, működését, a gén expresszióját vagy a fehérjeszintézis szabályozását. A nem kódoló régiókban bekövetkező változások az esetek többségében nem járnak funkcionális következményekkel, előfordulhat azonban, hogy a szekvencia megváltozása az adott régióban a splicing folyamatát, vagy a szabályozási mechanizmusokat befolyásolja A haplotípusok vizsgálatának jelentősége A gyakran csak kis hatású SNP-k funkciójának elemzését napjainkban egyre inkább felváltja ezen polimorfizmusok együttes hatásának, azaz haplotípusának vizsgálata. A haplotípus alatt az egyes polimorf allélok relatív kromoszómális elhelyezkedését értjük. A haplotípusok elemzése nemcsak a komplex öröklődésű betegségek genetikai hátterének vizsgálata esetében, de az emberiség történetének kutatása szempontjából is egyedülálló jelentőségű. A genetikai markerek alléljainak egymáshoz viszonyított helyzete ugyanis gyakran nem véletlenszerű eloszlást mutat, hanem hosszabb, számos lókuszt tartalmazó, kapcsoltan öröklődő csoportok, haplotípusblokkok jönnek létre, amelyeken belül az egyes polimorfizmusoknak mindig azonos változata fordul elő. Az ilyen, az emberi evolúció során többé-kevésbé változatlanul megmaradt szekvenciák valamint a kevésbé konzervatív blokkok egymáshoz illetve más gerincesek ortológ régióihoz való hasonlítása nemcsak az emberi populációk kialakulásáról és elterjedéséről de az emberi evolúció lépéseiről is információt nyújthat (4). 9

12 Irodalmi áttekintés 2.2 KOMPLEX ÖRÖKLŐDÉSŰ KÓRKÉPEK Komplex öröklődésű kórképek jellemzői A polimorfizmusok és haplotípusok kutatásának egyik fő irányvonala ezen variánsok lehetséges szerepének vizsgálata az ún. multifaktoriális vagy komplex öröklődésű betegségek tekintetében. Komplex öröklődésű betegségnek nevezi az irodalom mindazon kórképeket, melyek hátterében genetikai és környezeti hatás is feltételezhető. Számos gyakori kórkép tartozik ebbe a betegségcsoportba, többek között a migrén (6), a legtöbb viselkedészavarral járó betegség, például a gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitási zavar (ADHD) (7), a szenvedélybetegségek (8) és más pszichiátriai kórképek. Az öröklődő faktorok szerepét a betegség magas arányú családi előfordulása, valamint a családi, iker- és adoptációs vizsgálatok támasztják alá (9). A komplex öröklődésű betegségek esetében nem beszélhetünk monogénes, mendeli öröklésmenetről, melyben egyetlen gén variációi határozzák meg a jól vizsgálható fenotípus változatokat. A multifaktoriális kórképeket poligénes öröklésmenet jellemzi, kialakulásukért feltehetően több gén és a környezet hatásának interakciója felelős. A betegség hátterében álló genetikai faktorok rendszerint olyan hajlamosító tényezők, amelyek nem határozzák meg egyértelműen a fenotípusos jelleget, nem determinálják annak kialakulását. A különféle allélok ráadásul egyenként csak minimális hatással járulnak hozzá a betegség megjelenéséhez (10), valamint genetikai heterogenitás, inkomplett penetrancia és pleiotrópia jellemezheti őket, ami jelentős mértékben nehezíti azonosításukat (6, 11). A komplex öröklődésű kórképek vizsgálatának másik akadálya, hogy jelenleg a neurológiai illetve pszichiátriai betegségek klasszifikációs rendszere heterogén kórképeket ír le, ahol a diagnózis felállítása elsősorban a szindrómára jellemző tünetek kifejeződésén, azaz a fenotípusos jegyeken alapul. A betegség hátterében álló genetikai faktorok azonban sok esetben valószínűleg nem magára a betegség kialakulására hajlamosítanak, hanem csak annak egy típusára vagy specifikus csoportjára nézve jelentenek rizikófaktort. A probléma megoldására a nemrégiben indult Humán Fenom Projekt az intermedier fenotípus vagy endotípus kategóriák bevezetését javasolja (12). Az endofenotípus egy heterogén kórkép olyan altípusa, amely feltehetően meghatározott öröklött komponenssel rendelkezik, elkülönítése standardizált objektív módszerekkel mérhető tulajdonságok alapján történhet (13). 10

13 Irodalmi áttekintés Poligénes rendszerek vizsgálati módszerei A komplex öröklődésű betegségek genetikai tényezőinek kutatása többféle stratégiával történhet. Egyik lehetőség a meghatározó faktorok kromoszómális lokalizációjának linkage analízissel történő felderítése, ez azonban csak akkor járhat sikerrel, ha a betegség hátterében néhány fő génhatás áll. Egy másik, széles körben elterjedt módszer a hipotetikusan választott kandidáns gének asszociáció-analízise, amely akár 1-2%-os genetikai hozzájárulást is képes kimutatni. A szelekció alapja, hogy az adott gén terméke feltehetően szerepet játszik a vizsgált betegség pathomechanizmusában, így a génben történő változások azáltal, hogy megváltoztatják a fehérje szerkezetét vagy expresszióját, hozzájárulhatnak a betegség kialakulásához (9) Populáció-alapú asszociáció-vizsgálatok A populáció-alapú asszociáció-vizsgálatok egyik formája az ún. case-control study vagy eset-kontroll vizsgálat. Ennek során a kandidáns gének genetikai polimorfizmusainak allél- és genotípus-gyakoriságát hasonlítják össze bizonyos fenotípusos jegyekkel rendelkező (eset populáció) és nem rendelkező (kontroll populáció) nem rokon egyének esetében. A két populáció közötti (allél-vagy genotípus-frekvencia) különbség arra utal, hogy a vizsgált génváltozat a betegség protektív vagy prediszponáló tényezője lehet Családalapú asszociáció-vizsgálatok A polimorfizmusok eloszlása etnikai és geográfiai különbségeket mutat, ami befolyásolhatja a konvencionális eset-kontroll asszociáció-vizsgálatok eredményeit. Populációs rétegződés esetén a kontroll csoport szelekciójából adódó hiba hamis pozitív asszociáció kimutatásához vezethet (14). Ennek a lehetőségnek a kizárására vezették be alternatív megoldásként a családalapú vizsgálatokat. Az egyik ilyen megközelítési mód a heterozigóta szülők preferenciális allélátadásának vizsgálata, az ún. Transmission Disequilibrium Test (TDT). A módszer alapja, hogy az adott polimorfizmusra nézve heterozigóta szülők ugyanolyan valószínűséggel adhatják át utódaiknak mindkét allélváltozatot. Amennyiben bizonyos fenotípusos jegyekkel rendelkező gyerekek esetén az egyik allél átadása gyakoribb, az adott variáns a vizsgált fenotípus rizikófaktora lehet. 11

14 Irodalmi áttekintés Gyermekkori migrén A komplex öröklődésű kórképek körébe sorolható a széles körben ismert és a demográfiai adatok szerint a népesség kb. 15%-át érintő migrén betegség (15). A migrén paroxizmálisan jelentkező sajátos fájdalomszindróma, amelyet típusos kísérő tünetek jellemeznek. A fájdalom 4-72 óráig tartó rohamokban jelentkezik, súlyos vagy középsúlyos, rendszerint lüktető jellegű, féloldalra lokalizálódik, az egyszerű napi aktivitás fokozza és gyakran hányingerrel, hányással, fény-, hang- és szagingerek kerülésével jár. A betegség gyermekkori manifesztációja esetén jellemző különbségek, hogy a fejfájás 1-72 óráig tarthat és gyakori a kétoldali lokalizáció (16). A gyermekkori migrén prevalenciája és nemek közötti megoszlása életkoronként eltérő. Óvodáskorban a fiúk között elterjedtebb, kisiskoláskorban az arány kiegyenlítődik, majd serdülőkorban feltehetően a hormonális hatások miatt a lányok között válik gyakoribbá. A serdülőkori eloszlás lesz jellemző felnőttkorban is (1. táblázat) (17). 1. táblázat. A migrén prevalenciája gyermekkorban (17) Életkor (év) >15 Prevalencia (%) 1,2-3, Nemek aránya fiú > lány fiú = lány fiú < lány fiú << lány Klinikai tünetek A migrénes rohamok lefolyása során 3 vagy 4 fázis különíthető el. (1. ábra) A roham előtti napokban a betegek 26-60%-a panaszkodik közérzetváltozásra, ez lehet levertség vagy indokolatlan jókedv, megfigyelték a koncentráló-képesség csökkenését, az aktivitás változását, valamint gyakori ásítás és bizonyos ételek megkívánása is jellemző lehet. Ezeket összefoglaló néven prodromális tüneteknek nevezzük (18). A fejfájást megelőző egy órán belül tapasztalható reverzibilis neurológiai illetve vizuális zavar az aura, mely a betegek körülbelül egyharmadánál, míg a migrénes gyermekek 10-50%-ánál jelentkezik (19). Az auratünetek igen változatosak lehetnek, egy személynél azonban általában monomorf jellegűek. A tünetek olykor még a fejfájás kezdetekor is fennállhatnak, ilyenkor a betegek gyakran kísérő tünetként értékelik ezeket. A tünetek alapvetően két nagy csoportba sorolhatók. A vizuális szimptómák, mint a 12

15 Irodalmi áttekintés szikralátás, scotoma, hemianopsia, macropsia serdülőkor előtt ritkán jelentkeznek, később azonban felválthatják a neurológiai tüneteket, vagy társulhatnak melléjük és felnőttkorban már az auratünetek 99%-áért felelősek. A különböző (szomatomotoros és szomatoszenzoros) neurológiai deficit tünetek, mint a motoros afázia, faciobrachiális zsibbadás, vertigo, testvázlatzavarok gyermekkorban gyakrabban fordulnak elő (18). F á j d a l o m Prodroma Aura Fejfájásos fázis közérzetváltozás hipo-hiperaktivitás depresszió/eufória koncentráló képesség csökkenése ismétlődő ásítás, álmosság bizonyos ételek megkívánása Kísérőtünetek: * hányinger, hányás * fény-, hang-, szagkerülés * levertség, gyengeség * dekoncentráltság * szédülés * roham alatti hasmenés * neurológiai gócjelek: arcfél, testfél zsibbadás Attack utáni fázis * kimerültség * alvás * a hajas fejbőr túlérzékenysége * nyak-, válltáji izomfájdalom * izomláz Vizuális szikralátás fénylő, növekvő karikák scotoma színek felerősödése homályos látás hemianopsia Neurológiai (Szomatosensoros és motoros tünetek) faciobrachiális zsibbadás mono-, hemiparézis motoros afázia testvázlatzavarok ( mintha megnyúlt volna a karom ) vertigo 1. ábra. A migrénes roham fázisai, klinikai tünetei A migrénes roham harmadik fázisa a fejfájás. Jellege lüktető, görcsös, többnyire féloldali és homlok- vagy halántéktájra lokalizált, azonban pubertáskor előtt tipikusan kétoldali és homloktájékon jelentkezik. A rutinszerű fizikai aktivitás (pl.: lépcsőjárás, séta) fokozza, vagy a fizikai aktivitás elkerülését okozhatja. A fájdalom intenzitása súlyos vagy középsúlyos, gyermekekben 1-72, felnőttekben 4-72 órán át tarthat. A típusos migrénes fejfájást hányinger és/vagy hányás, illetve foto- és fonofóbia kíséri. Ezeken kívül azonban még számos tünet társulhat a fejfájáshoz, mint pl.: szagkerülés, aluszékonyság, gyengeség, szótalálási nehézség, hasi panaszok, zsibbadás, dekoncentráltság. 13

16 Irodalmi áttekintés A fejfájást követően az órákig vagy akár napokig tartó posztdromális időszakban kimerültség, aluszékonyság, a hajas fejbőr túlérzékenysége, izomláz jelentkezhet (20) Diagnózis A migrén betegség diagnózisa a pontos anamnézis felvételen és a fizikális vizsgálaton alapul. Jelenleg a Nemzetközi Fejfájás Társaság (IHS) által kidolgozott diagnosztikus kritérium-rendszer második kiadása (IHCD-II) van érvényben (16), ami döntően a fejfájás és az aura jellemzői, illetve a kísérő tünetek elemzésén alapul (2. táblázat). Gyermekkorban a diagnózis felállítását megnehezíti, hogy a gyermek verbalizációs fejlettsége jelentősen befolyásolja a tünetek pontos leírását (20). 2. táblázat. A Nemzetközi Fejfájás Társaság diagnosztikus kritériumai az aura nélküli és az aurával járó migrénben (16) Migrén aura nélkül Migrén aurával A. Legalább 5, a B-D kritériumoknak megfelelő roham B. A roham fennállása 4-72 óra C. A fejfájásjellemzők közül legalább kettő teljesül 1. féloldali lokalizáció 2. pulzáló jelleg 3. a fájdalom intenzitása közepes vagy súlyos 4. a rutinszerű fizikai aktivitás fokozza, vagy annak elkerülését okozza D. A fejfájás alatt legalább egy jellemző 1. hányinger és/vagy hányás 2. fotofóbia és fonofóbia A. Legalább 2 migrénes rohamban teljesül B-C B. Az aura legalább egyet tartalmaz a következőkből és nincs motoros gyengeség: 1. teljesen reverzibilis vizuális tünetek a pozitív (pl.: vibráló fények) és/vagy a negatív (pl.: látás elvesztése) jellegzetességeket is beleértve 2. teljesen reverzibilis szenzoros tünetek a pozitív (pl.: bizsergés) és/vagy a negatív (pl.: zsibbadtság) jellegzetességeket is beleértve 3. teljesen reverzibilis diszfáziás beszédzavar C. Az aura legalább kettőt tartalmaz a következőkből: 1. homonim vizuális tünetek és/vagy féloldali szenzoros tünetek 2. legalább egy aura tünet több mint 5 perc alatt fokozatosan fejlődik ki és/vagy a különböző aura tünetek sorozatosan egymás után jelennek meg több mint 5 percben 3. minden tünet 5 percnél tovább de 60 percnél kevesebb ideig tart A diagnózis felállításához elengedhetetlen a másodlagos fejfájást okozó kórképek (fej vagy nyaktrauma, koponyai vagy nyaki érbetegség, nem éreredetű intrakraniális betegség, túlzott gyógyszerfogyasztás vagy arról való leszokás, fertőzés, homeosztázis zavar, koponya, nyak, szem, fül, orr, melléküregek, fogak, száj vagy más arci és kopo- 14

17 Irodalmi áttekintés nyai struktúrák betegsége, pszichiátriai betegségek okozta fejfájás) jelenlétének kizárása. Ha ilyen kórkép jelen van, tisztázni kell, hogy annak első előfordulása és a migrén között nincs közeli időbeli kapcsolat (16). Továbbá ki kell zárni a migrénhez hasonló tüneteket provokáló állapotokat epilepszia, mitokondriális DNS betegségek (MELAS: mitokondriális encephalomiopathia laktát acidózissal és stroke típusú epizódokkal), CADASIL (autoszomális domináns cerebrális arteriopathia szubkortikális infarktusokkal és leukoencephalopathiával) carotis interna dissectio célzott belgyógyászati, szemészeti, fül-orr-gégészeti, képalkotó (röntgen, MRI, CT) és EEG vizsgálatokkal (18) A migrén genetikai háttere A jelenleg elfogadott álláspont szerint a migrén genetikailag meghatározott betegség különböző klinikai tünetek jelenlétével, komplex öröklődéssel és a környezeti tényezőkre adott eltérő mértékű válaszadó képességgel (6). Az öröklött tényezők szerepét számos klasszikus genetikai vizsgálat támasztja alá. Russel és munkacsoportja a migrénes betegek elsőfokú rokonai és házastársai között vizsgálta a migrén előfordulási gyakoriságát. Aurával járó migrénes betegek elsőfokú rokonai között 4-szeresére növekedett rizikót találtak, míg a házastársak körében nem nőtt a migrén kialakulásának kockázata, ami jelentős genetikai háttérre utal. Aura nélküli migrénesek esetében a rokonok 1,9-szeres, a házastársak 1,4-szeres rizikóval rendelkeztek, mely mutatja, hogy az aura nélküli migrén esetében a környezeti tényezőknek is jelentős szerepük van (21). Az aurával járó forma esetén a monozigóta ikrek konkordanciája 34%, a dizigótáké 12% volt (22), míg az aura nélküli migrénes monozigóták 28%-a, a dizigóta ikrek 18%-a esetén volt jelen mindkét ikerben a betegség (23). Ezen tanulmányok alapján az öröklött faktorok különböző mértékben járulnak hozzá a migrén kialakulásához az egyes altípusok esetében, a betegség örökölhetőségét összességében 40-60%-ra becsülik (24). Számos, a betegség pathomechanizmusában közvetlenül (endotél receptorok nitrogén-monoxid szintetáz különböző izoformája, mitokondriális defektusok) vagy csak feltételesen, közvetetten (inzulin receptor, alvadási faktorok, angiotenzin konvertáló enzim, apolipoproteinek) szerepet játszó tényező genetikai polimorfizmusainak eloszlását vizsgálták migrénes betegekben. Kiemelt figyelem irányul két neurotranszmitter, a szerotonin és a dopamin rendszer génjeinek polimorfizmusai felé. 15

18 Irodalmi áttekintés Kábítószerfüggőség Napjainkban egyre szélesebb körben elfogadott az a nézet, amely szerint a kábítószerfüggőség kialakulásában számos rizikótényezőként azonosított környezeti hatás mellett a genetikai különbségeknek is fontos szerepe lehet. A különböző hajlamosító faktorok azonosításának jelentőségét a kábítószer használat és dependencia egyre növekvő prevalenciája is alátámasztja (25). A magyarországi helyzetről a leginkább veszélyeztetett korosztály, a középiskolások drogfogyasztásáról végzett nemzetközi összehasonlító felmérés eredményei adnak átfogó képet. Míg 1995-ben a 10. évfolyamban tanuló diákok 10%-a próbált már ki valamilyen illegális szert, 1999-re ez az érték közel kétszeresére, 19%-ra növekedett. A 2003-ban végzett ismételt felmérés további növekedést mutatott, a évfolyamos diákoknak ekkor közel egynegyede fogyasztott már legalább egyszer valamilyen illegális drogot (26). A kábítószerfüggőség vagy dependencia olyan viselkedési, kognitív és fiziológiai jelenségek meghatározott együttese, amely egy pszichoaktív szer ismételt fogyasztását követően alakulhat ki. A pszichoaktív szer kategóriába azok a kémiai anyagok tartoznak, amelyek a központi idegrendszeren keresztül fejtik ki hatásukat. A függőség jellemzői erős vágy a kábítószer bevételére, illetve annak elmaradásakor erőteljes hiányérzet, megnövekedett tolerancia a szerrel szemben, a használat kontrollálási nehézsége, valamint az abúzus folytatása a fellépő káros következmények ellenére, és annak előnyben részesítése más aktivitásokkal szemben. Addikció kialakulhat egy meghatározott szerrel (pl.: dohány, heroin), szerek egy csoportjával (pl.: hallucinogének) vagy akár farmakológiailag különböző szerek számos típusával (politoxikománia pl.: gyógyszer- és alkoholfüggőség) szemben. A függőséghez vezető út fázisait valamint a különböző abúzusszerekkel szembeni dependencia kialakulását nehéz elkülöníteni, így a genetikai kutatások során gyakran egy tág fenotípus kategóriába, a substance use disorder -be (SUD) ( szerhasználati zavar ) sorolják a kábítószer fogyasztást, az abúzust és a függőséget is, rendszerint az alkoholizmust és a dohányzást is beleértve Diagnózis A függőség klinikai diagnózisa a BNO-10 (Egészségügyi Világszervezet Betegségek Nemzetközi Osztályozása 10. revíziója) vagy a DSM IV. (Mentális zavarok diag- 16

19 Irodalmi áttekintés nosztikai és statisztikai kézikönyve IV. kiadása) kritérium-rendszere alapján történik (3. táblázat). 3. táblázat. Az Amerikai Pszichiátriai Társaság kritériumai a pszichoaktív szer függőség diagnosztizálására (DSM IV) A szer használatának maladaptív módja, mely klinikailag jelentős károsodáshoz vagy zavarhoz vezet, ami a következő tünetek formájában jelentkezhet és közülük ugyanabban a 12 hónapos időszakban legalább 3 jelen van: - a szer jelentősen fokozott mennyiségeinek az igénye a kívánt hatás elérése érdekében vagy 1. Tolerancia - a szer azonos adagjának folyamatos használata esetén jelentősen csökken a hatás - a szerrel kapcsolatban jellegzetes megvonásos szindróma vagy 2. Megvonás - ugyanolyan (vagy hasonló) szer bevétele a megvonási tünetek csökkentésére vagy elkerülésére 3. A szert gyakran nagyobb adagokban vagy hosszabb ideig szedik, mint eredetileg szándékozták 4. Állandó kívánság vagy sikertelen kísérletek a szerhasználat abbahagyására vagy kontrollálására 5. Jelentős idő és aktivitás irányul a szer megszerzésére, a szer használatára vagy hatásaitól való megszabadulásra 6. Fontos szociális, foglalkozási vagy rekreációs tevékenységek feladása, vagy csökkentése a szerhasználat miatt 7. A szerhasználat folytatása olyan állandó vagy visszatérő fizikai vagy pszichológiai problémák megléte ellenére, amiről tudja, hogy valószínűleg a szerhasználat okozza vagy súlyosbítja Heroinfüggőség A drogok leginkább elfogadott csoportosítása a központi idegrendszerre gyakorolt hatásuk alapján történik, eszerint három kategória különíthető el, az elsődlegesen stimuláló (stimulánsok), a főképp nyugtató (depresszánsok) hatású valamint a hallucinogén vagy pszichedelikus szerek. A depresszáns hatású drogok közé tartozik az opiátok csoportja (ópium, morfin, heroin, kodein, methadon), amelyek elsősorban az endogén μ-opioid receptoron keresztül fejtik ki hatásukat (4. táblázat). Ezek a hét transzmembrán doménnel rendelkező G- fehérjéhez kapcsolt receptorok különböző fiziológiai funkciók szabályozásában vesznek részt, többek között szerepük van a fájdalomra és stresszhatásra adott válasz, a gasztrointesztinális motilitás valamint az immunfunkciók modulálásában, illetve az agyi jutal- 17

20 Irodalmi áttekintés mazó rendszer működésében. Az opiát típusú drogok között a legelterjedtebb a heroin használata, egy 2002-es tanulmány szerint az Egyesült Államokban 3,5 millióan használtak már opiátokat, és 1 millió heroinfüggőt tartottak nyilván (27). Magyarországon egy 2003-as felmérés tanúsága szerint a középiskolás korosztály 2%-a fogyasztott már heroint (28). A heroinfogyasztás társadalmi vonatkozása is jelentős, többségében a heroinfüggők tartoznak az ún. problémás droghasználók körébe, hozzájuk kötődik a legtöbb beszerzési bűnözés, valamint a túladagolt betegek jelentős hányada is közülük kerül ki. 4. táblázat. Az opiát típusú drogok hatásai (26) Kis mennyiség esetén Nagy mennyiség esetén Testi tünetek Pszichés tünetek nyugtató, izgalomcsökkentő hatás csökkent reakciókészség csökkent fájdalomérzet pupillaszűkülés a szexuális vágy csökkenése vagy megszűnése flash -érzet kellemes közérzet relaxáltság, nyugodtság eufória szorongás, félelem csökkenése túlzott önértékelés bágyadtság légzési elégtelenség keringési elégtelenség, vérnyomásesés általános görcsös állapot bélrendszeri működések csökkenése rosszullét álmosság A kábítószerfüggőség és a gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitási zavar lehetséges kapcsolata Számos tanulmány támasztja alá, hogy a kábítószerfüggők között jelentős számban találhatók figyelemhiányos hiperaktivitás zavarral (Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD) diagnosztizált betegek (29). Az ADHD multifaktoriális etiológiájú gyermekpszichiátriai kórkép, ahol a genetikai háttér mellett a környezeti hatásoknak is nagy szerepet tulajdonítanak. A betegség a gyermekek 5-10%-ában fordul elő, többnyire gyógyul serdülőkorban, de 30-50%-os valószínűséggel felnőttkorban is megmaradhat. Prospektív, longitudinális vizsgálatok azt találták, hogy az utánkövetési időszak végére a hiperaktív gyermekek esetében gyakrabban alakul ki kábítószerfüggőség vagy alkoholizmus, mint az egészséges kontroll populációban (30, 31). Hasonló eredményt mutatnak a különböző retrospektív kutatások is, amelyek addikció miatt orvosi kezelés alá 18

21 Irodalmi áttekintés került betegek vizsgálata alapján az ADHD és a SUD (substance use disorder) komorbiditását 30-50%-ra becsülik (32, 33). Különböző kábítószereket fogyasztók körében végzett tanulmányok arra mutatnak rá, hogy azon betegek, akik anamnézisében a gyermekkori hiperaktivitás is szerepelt, súlyosabb tüneteket mutattak, esetükben nagyobb arányban jelentkezett antiszociális viselkedés, gyakrabban részesültek pszichiátriai kezelésben, valamint nagyobb százalékban választottak opiát típusú drogokat, mint akiknél nem diagnosztizáltak ADHD-t (29) A kábítószerfüggőség genetikai háttere Jól ismert a szociális és kulturális hatások jelentősége a drogfogyasztás terjedésében, de ezek mellett számos (ismert vagy mindeddig még nem azonosított) individuális tényező befolyásolhatja a betegség kialakulásának rizikóját, valamint hozzájárulhat a súlyosság mértékének egyéni különbségeihez (11). Napjainkban egyre elfogadottabbá válik az a nézet, miszerint a kábítószerfüggőség komplex kórképnek tekinthető, kialakulásában a környezeti faktorok mellett genetikai tényezők is jelentős szerepet játszanak (34, 35). Klasszikus genetikai tanulmányok (család-, iker- és adoptációs vizsgálatok) alapján az öröklött faktorok szerepe az addikció kialakulásában 40-60%-ra tehető (24). A lehetséges genetikai tényezők tanulmányozása során számos kandidáns gén szerepe felmerült, amelyek a biológiai vagy pszichológiai vulnerábilitás befolyásolásával szerepet játszhatnak a kábítószerfüggőség kialakulásában. Az abúzusszerek célmolekulái, a metabolizmusukban résztvevő enzimek valamint a reward rendszer működésében szerepet játszó faktorok különböző változatai a kábítószerek farmakokinetikai és farmakodinámiai paramétereit befolyásolva növelhetik az addikció megjelenésének valószínűségét, ezek alkotják a függőségre való hajlam biológiai tényezőit. Pszichológiai tekintetben többek között a kábítószerfüggőség kialakulásával összefüggésbe hozható komorbid betegségek (ADHD) és személyiségjegyek (újdonságkeresés) befolyásolhatják a fogékonyságot. Az addikció örökletes tényezőinek kutatása során mindezen tényezők génjei valamint ezek változatai állnak a középpontban, közöttük is hangsúlyos szerepet kap a szerotonin és a dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata. 19

22 Irodalmi áttekintés 2.3 A SZEROTONIN RENDSZER Napjainkban az egyik legtöbbet vizsgált központi idegrendszerrel kapcsolatos kutatási terület a szerotonin rendszer, ennek egyik oka, hogy a szerotonerg neuronok az agytörzs mediális és dorzális raphe magvaiból kiindulva a központi idegrendszer nagyrészébe projektálnak, így számos funkció szabályozásában vesznek részt. A limbikus rendszerrel, a törzsdúcokkal, a talamusszal, a hipotalamusszal és a frontális cortexszel való összeköttetést biztosító felszálló rostokon keresztül, a szerotonin (5HT: 5-hidroxi-triptamin) részt vesz a cirkadián ritmusok, mint az alvás és a táplálékfelvétel illetve a hőháztartás szabályozásában, valamint befolyásolja a magatartást, az érzelmi és a hangulati életet. A raphe magvak deszcendens ágai a nyúltvelő és a gerincvelő motoros neuronjain a motoros működések szabályozásában játszanak szerepet, valamint gátló kimenettel bírnak a gerincvelő hátsó szarva és a trigeminus magvak felé, ahol direkt és indirekt módon modulálják a szenzoros neurotranszmissziót és az endogén fájdalomkontrollt. Neurotranszmitter szerepén túl a szerotonin kulcsszerepet játszik a központi idegrendszer érésében is (sejt proliferáció, migráció, differenciáció) (36). A szerotonin perifériás moduláló szerepe is szerteágazó, a bélrendszerben fokozza a simaizomműködést, az érrendszer különböző receptorain hatva vazokonstriktív és vazodilatatív hatása is lehet, valamint fokozza a trombocita aggregációt. A nociceptorok, kisvérköri kemoreceptorok és a vagus gastroenterális érző idegvégződéseinek ingerlésével részt vehet a fájdalomérzés, a pulmonális kemoreflex illetve a hányinger, hányás kiváltásában (37). A szerotonin rendszer érintettsége számos pszichiátriai betegség esetén felmerült, amit a neurotranszmitter sokrétű szabályozó szerepe mellett a szerotonin rendszer működését befolyásoló gyógyszerek terápiás hatékonysága indokol. Az egyik legismertebb farmakológiai példa a szerotonin szinaptikus visszavételének gátlásán alapuló (SSRI: Selective Serotonin Reuptake Inhibitor) antidepresszáns gyógyszerek alkalmazása, amelyek a depresszión kívül többek között szorongásos kórképekben, étkezési zavarok esetén és szkizofréniában is hatásosnak bizonyultak (38, 39). A szerotonin által mediált ingerületátvitel különféle receptorokon jöhet létre, jelenleg 7 fő receptorcsaládot (5-HT1-7) és 14 altípust ismerünk, melyek az ionotróp 5- HT3 kivételével G fehérjéhez kapcsolt receptorok. 20

23 Irodalmi áttekintés A szerotonin rendszer kandidáns génjei A szerotonin transzporter (SERT) A szerotonin receptorokra jellemző diverzitással szemben a szinaptikus résbe jutott szerotonin visszavételéért egyetlen fehérje, a szerotonin transzporter (SERT) felelős. A 12 transzmembrán doménnel rendelkező monoamin transzporterek családjába tartozó SERT a preszinaptikus sejt plazmamembránjában helyezkedik el. A Na + /Cl kotranszporttal és K + antiporttal működő fehérjének kulcsszerepe van az intracelluláris neurotranszmitter raktár feltöltésében, valamint az extracelluláris térben hozzáférhető szerotonin szint szabályozásával a szinaptikus transzmisszió terminálásában. Ezt támasztja alá a SERT génkiütött egerek vizsgálata is, ezekben az állatokban megfigyelték, hogy több agyi terület extracelluláris szerotonin szintje kb. a hatszorosára emelkedett, míg a szöveti neurotranszmitter szint jelentősen csökkent. A transzporter fehérje a szerotonin rendszer egész területén kimutatható, elsősorban az axon terminálison helyezkedik el, de megtalálható a sejttesteken és a dendriteken is, míg perifériásan a trombocitákon, a gasztrointesztinális traktusban és a mellékvesevelőben jelenik meg (40). A szerotonin transzporter génje a 17-es kromoszóma hosszú karján, a 17q régióban lokalizálódik. A 14 exont és 13 intront tartalmazó gén kódoló régiója nagymértékben konzervált, így a genetikai vizsgálatok középpontjában a szabályozó régió két, feltehetően funkcionális hosszúság polimorfizmusa áll (2. ábra). 5 Ia Ib II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV 3 5HTTLPR STin2 2. ábra. A szerotonin transzporter gén hosszúság polimorfizmusai A sötét szürke számozott négyzetek az exonokat, a világos szürke csíkozott területek a polimorfizmusokat jelölik. 5-HTTLPR és STin2 A gén promoter régiójában leírt polimorf régió (5HT transporter linked polymorhic region - 5-HTTLPR) egy bp hosszúságú, nem teljesen azonos bázis- 21

24 Irodalmi áttekintés sorrendű szekvencia ismétlődéséből áll (41). A polimorfizmus leggyakrabban előforduló variációinak funkcionális vizsgálata során a homozigóta, 16 ismétlődést tartalmazó genotípus esetében 2-3-szor nagyobb transzkripciós aktivitást tapasztaltak, mint a rövidebb, 14 ismétlődést tartalmazó allél jelenléte esetén (42, 43). A szerotonin transzporter másik gyakran vizsgált hosszúság polimorfizmusa a gén 2. intronjában található STin2 (szerotonin transzporter intron 2), amelyben egy bp-nyi szakasz ismétlődik leggyakrabban 9-, 10- vagy 12-szer (42). Embrionális őssejtek vizsgálata során a 12 ismétlődést tartalmazó allél jelenlétében fokozottabb génexpressziót tapasztaltak, mint a 10 ismétlődést hordozó forma esetén (44) A szerotonin rendszer szerepe a migrénben Számos megfigyelés támasztja alá, hogy a migrénes betegekre a szerotonerg metabolizmus szisztémás zavara jellemző. A prodromális időszakban és a rohamok között megnövekszik a trombocita aggregáció készség és fokozódik a szerotonin kiáramlás, míg a rohamok alatt a keringő szerotonin szintje lecsökken, és fő metabolitja az 5- hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) vizeletben történő kiválasztása ugrásszerűen megemelkedik (45). A szerotonin intravénás infúzióval beadva megszünteti a migrénes rohamot (bár elfogadhatatlan mellékhatások kíséretében), ez az alapja az 5HT1B/D receptor agonista triptánok alkalmazásának (18). A fokozott szerotonin felszabadulást előidéző reserpin viszont migrénes betegek esetében jellegzetes fejfájást indukál, míg egészséges személyek esetén nem tapasztaltak ilyen hatást (46). A centrális szerotonerg rendszer zavarára utal továbbá, hogy migrénesekben gyakoribb a neurózis (47), a major depresszió (48, 49) és a szorongásos betegségek (50) előfordulása. A szoros kapcsolatot támasztja alá az 5HT1A receptor parciális agonisták feszültségoldó hatása, valamint a szerotonin visszavétel gátló szerek hatékonysága a migrén profilaktikus terápiájában (45). A migrén betegség esetében számos, a szerotonin rendszerhez tartozó kandidáns gén szerepe felmerült. A közlemények nagyrésze nem talált kapcsolatot a vizsgált szerotonin receptorok (5HT1A, 1B/1D, 1F, 2A, 2C) illetve a MAOA gén polimorfizmusai és a migrén betegség között. A szerotonin transzporter tekintetében egymásnak ellentmondó tanulmányok születtek, mind a promoter régióban található, mind a 2. intron hosszúság polimorfizmusa esetében. 22

25 Irodalmi áttekintés A szerotonin rendszer szerepe a kábítószerfüggőség kialakulásában A szerotonin rendszer szerepe a kábítószerfüggőség kialakulásában meglehetősen komplex és ezidáig kevéssé tisztázott. A szerotonin hatása egyrészt a dopamin rendszerrel való interakció valamint a dopaminerg funkciók sokrétű modulálásán keresztül valósulhat meg (51, 52). Másrészről közvetlen szerepe is lehet, ezt támasztja alá, hogy számos kísérletben fokozott szerotonin aktivitás esetén csökkent reakciókészséget tapasztaltak különböző kábítószerekkel szemben. A szerotonin felszabadulást fokozó és visszavétel gátló dexfenfluramine hatását olyan patkányok esetében vizsgálták, akik egy billentyű megnyomásával heroint tudtak bejuttatni a szervezetükbe. Az állatok kábítószer fogyasztása szignifikánsan csökkent a kezelés hatására, ezt a szerepet az 5HT1-es és 5HT2-es receptoroknak tulajdonították (53, 54). Egy másik kísérletben az antidepresszáns hatású, szerotonin reuptake gátló venlafaxine esetében hasonló tapasztalatokról számoltak be (55). Széles körben vizsgálták egy másik SSRI-nek, a fluoxetinnek az amfetamin- valamint a kokain-önadagolásra kifejtett hatását, a kezelés minden esetben csökkentette a kábítószer beadás gyakoriságát (56). A szerotonin rendszer génjeinek szerepét számos kábítószerfüggő populáció esetében vizsgálták. A szerotonin transzporter promoter polimorfizmusa (5-HTTLPR) tekintetében ellentmondó eredmények születtek, míg a STin2 tanulmányozása során nem találtak kapcsolatot a kábítószerfüggőség és a variáns gyakorisága között. 23

26 Irodalmi áttekintés 2.4 A DOPAMIN RENDSZER A központi idegrendszer szintén széles körben kutatott területe egy másik neurotranszmitter, a dopamin által szabályozott folyamatok rendszere. Három fő funkciójának megfelelően a dopamin rendszer három anatómiailag jól körülhatárolható pályarendszerből áll. A dopaminerg rostok 70 75%-át a substantia nigrából induló nigrostriatális pályarendszer tartalmazza, ez biztosítja a putamennel és a nucleus caudatusszal való összeköttetést, valamint a dopamin mozgáskoordinációban való résztvételét. A dopamin neuroendokrin szabályozásban betöltött funkciójáért elsősorban a hipotalamusz nucleus arcuatusából a hipofízishez és az eminentia medianához vezető pálya felelős. Pszichológiai-pszichiátriai szempontból a középagy ventrális tegmentumából induló mezolimbikus/mezokortikális pályarendszer a legfontosabb. A mezolimbikus pálya rostjai a limbikus rendszer elemeihez, az amygdalához, a hippocampushoz és a nucleus accumbenshez futnak, ezek felelnek az érzelmek, indulatok ösztönös magatartások és motivációk szabályozásáért. A prefrontális kéreghez vezető mezokortikális pálya a kognitív folyamatokban játszik szerepet. A jelátvitelért felelős dopamin receptorok a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartoznak, génjeik egyazon ősi szekvenciából eredeztethetők, a későbbi diverzitás kialakulásában főképp a génduplikációnak lehetett szerepet. A receptor családhoz tartozó fehérjék nagyfokú hasonlóságot mutatnak, hét transzmembrán domént tartalmaznak, valamint mind GTP-kötő fehérjéhez kapcsolt jelátviteli mechanizmusokban vesznek részt. A dopamin receptorokat az adenilát ciklázra gyakorolt hatásuk alapján két szubtípusba sorolják. A D1-szerű receptorok (D1-es és D5-ös) növelik, míg a D2- szerűek (D2-es, D3-as és D4-es) csökkentik az intracelluláris camp-szintet. Az ötféle emberi dopamin receptor mindegyikének számos genetikai variánsa létezik, közülük a D4-es receptor (DRD4) rendelkezik a legtöbb változattal (57). 24

27 Irodalmi áttekintés A dopamin rendszer kandidáns génjei A D4-es dopamin receptor (DRD4) A D2-es típusú DRD4 az agy számos területén kimutatható, bár expressziója rendszerint alacsonyabb a D2-es dopamin receptorénál. Legnagyobb mennyiségben a retinában fejeződik ki, de jelen van a prefrontális kéregben, az amygdalában, a hipotalamuszban, a hipofízisben és a bazális ganglionok területén is. Kis mértékű expresszió kimutatható a hippocampus egyes sejtjein és az agykéreg piramidális, valamint bizonyos nem-piramidális neuronjain is. DRD4 receptor fehérjéket nemcsak a központi idegrendszer területén figyeltek meg, viszonylag nagy mennyiségben találhatók a szívpitvar (58) és a vese sejtjeiben (59) valamint a limfocitákon (60, 61). A D4-es dopamin receptor funkciója ma még kevéssé ismert, bár transzgénikus állatokon végzett kísérletek alapján feltételezhető, hogy leginkább a mozgásszabályozás területén lehet szerepe. Ezt támasztja alá, hogy a homozigóta DRD4 génkiütött egerek kevesebb spontán lokomotoros aktivitást, felágaskodást mutattak vad típusú társaikhoz képest, viszont jobb eredményeket értek el a koordinációs készséget mérő tesztekben. A DRD4 befolyásolhatja a különböző abúzusszerekre mutatott válaszkészséget is, a DRD4 hiányos állatok ugyanis hiperérzékennyé váltak a kokain, a metamfetamin és az etanol lokomotoros stimuláló hatására (62). A 4 exont és 3 intront tartalmazó DRD4 gén a 11-es kromoszóma rövid karján (11p15.5) helyezkedik el a Harvey Ras és a tirozin hidroxiláz génje között (63). Feltehetően a telomer közeli lokalizációból adódóan a DRD4 gén szabályozó és kódoló szakasza is rendkívül polimorf, ezidáig több mint 90 SNP-t és számos hosszúság polimorfizmust írtak le ebben a régióban. A pszichogenetikai szakirodalomban leggyakrabban a III. exonban található VNTR, valamint a feltételezhetően funkcionális hatású promoter polimorfizmusok (120 bp duplikáció, -616CG, -521CT) szerepét vizsgálják (3. ábra). 120 bp dup A promoter régió egyetlen hosszúság polimorfizmusa a start kodontól 1200 bázispár távolságra, upstream irányban elhelyezkedő 120 bp-os duplikáció (3. ábra), melyet korábban PstI polimorfizmusként írtak le (64). Az ismétlődő szekvencia számos 25

28 Irodalmi áttekintés transzkripciós faktor (GR, MEP-1, Rad-1, Zeste, Sp-1, myogenin, MBF-1) kötőhelyét tartalmazza, az Sp1 esetében in vitro kísérleti rendszerben sikerült is kimutatni a fehérje kötődését, így feltételezhető, hogy a polimorfizmus szerepet játszik a DRD4 génexpresszió szabályozásában (65, 66). 603Tdel 602Gdel 11CT 600GC 291CT 1106TC 768GA 376CT 128GT 1217Gdel 809GA 12 bp dup 21 bp del 13 bp del 31GC G N 6 bp ins 8 bp del 5 I II III IV bp duplikáció 616CG 615AG 521CT 48 bp VNTR 3. ábra. A D4-es dopamin receptor gén polimorfizmusai A sötét szürke számozott négyzetek az exonokat, a világos szürke és csíkozott területek a polimorfizmusokat jelölik. Az általunk vizsgált polimorfizmusok a gén alatt vannak feltüntetve. -616CG SNP A -616CG SNP a DRD4 fehérje szövet-specifikus expressziójáért felelős régió és egy feltételezett negatív regulátor szakasz között helyezkedik el. A citozin guanin csere funkcionális jelentőségét támasztja alá, hogy egy lehetséges AP-2 transzkripciós faktor kötőhelyet hoz létre a promoter régióban. -615AG SNP A Dr. Sasvári Mária munkacsoportja által azonosított -615AG polimorfizmus (67) funkcionális jelentőségét még nem bizonyították, azonban a közeli lokalizáció alapján feltételezhető, hogy a -616CG SNP moduláló szerepét befolyásolhatja. -521CT SNP A promoter régió legszélesebb körben vizsgált polimorfizmusa a -521CT SNP. In vitro retinoblasztóma sejteken végzett riporter gén kísérletek alapján megállapították, hogy a timint tartalmazó allél jelenlétében 40%-kal alacsonyabb a gén expressziója, 26

29 Irodalmi áttekintés mint citozin esetén (68). Dr. Sasvári Mária munkacsoportjának eredményei ezt a hatást nem támasztják alá (69), ami a gén promoter régiójában található számos polimorfizmus haplotípusának jelentőségére hívja fel a figyelmet. A -521CT SNP szerepét többek között szkizofrénia (68), újdonságkeresés (70), gyermekkori figyelemhiányos hiperaktivitási zavar (71) valamint csecsemőkori kötődési viselkedés (72) tekintetében vizsgálták. 48 bp VNTR A DRD4 gén legtöbbet vizsgált polimorfizmusa a III. exonban elhelyezkedő VNTR (73), az itt található 48 bp hosszúságú szekvencia ismétlődéseinek száma 2 és 10 között változhat (74). Ez a szakasz a harmadik citoplazmatikus hurok kódolásáért felelős, ami a receptor C-terminális régiójával együtt a G-fehérjével való kapcsolódásban vesz részt (75). Az ismétlődő egységek szekvenciája különböző lehet, számos genom szekvenálásával azt találták, hogy csak az első és az utolsó szakasz nukleotidsorrendje változatlan. Ez alapján feltételezhető, hogy az első és az utolsó 48 bázispár fontos szerepe tölt be a receptor funkciójában, ezt támasztja alá az is, hogy ezidáig nem írtak le kettőnél kevesebb ismétlődést tartalmazó genotípust (76). A leggyakoribb receptor típusok farmakokinetikai jellemzőit vizsgálva megállapították, hogy a dopamin kötődésekor bekövetkező camp szint csökkenés a hét ismétlődést tartalmazó izoforma esetén körülbelül a fele a kettes és négyes változat esetében tapasztaltnak (77). Egy másik tanulmány szerint az ismétlődések száma és a kifejtett hatás között nem vonható közvetlen párhuzam, a 4 ismétlődést tartalmazó változat tűnik a legjobb hatásfokúnak, míg az ennél rövidebb vagy hosszabb citoplazmatikus hurokkal rendelkező receptorok kevésbé hatékonyak a dopamin szignál továbbításában (78). A 48 bp VNTR funkcionális jelentőségét kizáró kutatási eredmények is születtek, in vitro és patkányokon végzett in vivo kísérletekkel bizonyították, hogy a hosszúság polimorfizmus teljes hiánya sem okoz változást a receptor működésében, valamint ligandja iránti affinitásában. Újabb adatok alapján az is felvetődött, hogy a polimorfizmus a gén expressziójára lehet hatással (79). Bár a 48 bp VNTR a DRD4 gén legtöbbet vizsgált polimorfizmusa, a receptor funkcióban betöltött tényleges szerepét a mai napig nem sikerült egyértelműen tisztázni. 27

30 Irodalmi áttekintés A dopamin transzporter (DAT) A dopamin transzporter (DAT) a szinaptikus résbe ürült dopamin visszavételéért felelős, így részt vesz a dopaminerg transzmisszió terminálásában, valamint fontos szerepet tölt be a központi idegrendszer dopamin egyensúlyának fenntartásában (80, 81). A DAT a szerotonin transzporterhez hasonlóan a 12 transzmembrán doménnel rendelkező transzporterek családjába tartozik, a működéséhez szükséges energiát Na + /Cl kotranszport és K + antiport biztosítja. A fehérje főleg a substantia nigra, a striatum, a nucleus accumbens és a ventrális tegmentális area régióiban található, valamint kimutatható a prefrontális cortex és az amygdala területén is (80, 82). Génkiütött egerek vizsgálatával megállapították, hogy a dopamin transzporter hiánya esetén a striatum extracelluláris terében 300-szorosára nőtt a dopamin koncentráció. Egy másik közleményben arról számolnak be, hogy a DAT KO egerekben a striatális dopamin koncentráció 95%-kal csökkent, míg az extracelluláris térben ötszörösére nőtt (80, 81). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy DAT hiányában a neurotranszmitter csak diffúzióval juthat vissza a sejtekbe, vagyis a transzporter a dopaminerg funkciók szabályozásának és a dopamin egyensúly fenntartásának nélkülözhetetlen eleme. A dopamin transzporter számos terápiás és abúzus szer hatásmechanizmusának fontos résztvevője. A dopaminhoz hasonló szerkezetű amphetamin és származékai a transzporter szubsztrátjaként bejuthatnak az idegvégződésekbe, ahol a monoamin tartalmú vezikulák kiürülését okozzák, majd reverz transzportot indukálva fokozzák a transzmissziót (83, 84). A kokain és egyes antidepresszánsok a dopamin transzporter gátlásával fokozzák a neurotranszmitter koncentrációját a szinaptikus térben (85, 86). A szinaptikus dopamin koncentráció emelkedése a receptorok folyamatos ingerléséhez, így a reward rendszer kontroll nélküli aktiválásához vezet. DAT 3 UTR VNTR A 64 kilobázis hosszúságú DAT génje az 5-ös kromoszómán, 5p15.3 pozícióban lokalizálódik, 15 exont és 14 intront tartalmaz (87, 88). A génben számos polimorfizmus található, bár asszociáció-analízisek során ezidáig csak kis részüket alkalmazták. A DAT leggyakrabban vizsgált polimorfizmusa a 3 UTR régióban elhelyezkedő, 40 bp ismétlődéséből áll hosszúság polimorfizmus. Az ismétlődések száma 3-15 között vál- 28

31 Irodalmi áttekintés tozhat, a leggyakoribbak a 9-es és a 10-es allélok. A polimorfizmus feltételezhetően funkcionális jelentőségű, bár pontos hatását ezidáig még nem sikerült egyértelműen tisztázni (89, 90) A dopamin lebontása (COMT) A katekol-o-metiltranszferáz (COMT) enzim fontos szerepet játszik az endogén vagy exogén eredetű, biológiailag aktív vagy toxikus katekolok metabolizmusában, azáltal, hogy katalizálja egy metil csoport átvitelét az S-adenozil-L-metioninről (AdoMet) a katekol vegyület egy hidroxil csoportjára. A COMT szubsztrátjai közé tartoznak többek között az ingerületátvitelben vagy a hormonrendszerben fontos katekolaminok, mint a dopamin, a noradrenalin, az adrenalin illetve a katekol-ösztrogének és ezek metabolitjai, valamint a katekol szerkezetű gyógyszerek, mint például a Parkinsonkórban alkalmazott L-DOPA, a melanin metabolizmus egyes köztitermékei illetve bizonyos xenobiotikumok, mint a karcinogén katekol-gyűrűt tartalmazó flavonoidok (91). A 22-es kromoszóma hosszú karján (22q11.2) elhelyezkedő COMT génről kétféle fehérjetermék íródhat át, egy rövidebb, a citoszólban előforduló szolubilis protein, amely leginkább a májban és a vesében fejeződik ki, valamint egy 50 aminosavval hoszszabb, membránhoz kötött forma, amelynek az agyban van kiemelt szerepe (92). COMT G1947A SNP A COMT gén egy meglehetősen gyakori polimorfizmusa az 1947-es pozícióban előforduló guanin-adenin tranzíció, ami a kifejeződő fehérjék 108. illetve 158. kodonjában valin-metionin aminosavcserét eredményez. A valint tartalmazó enzim hővel szemben ellenállóbb és aktivitása 3-4-szerese a metionint tartalmazó formának (91) A dopamin rendszer szerepe a migrénben A 70-es évek végétől kezdve számos tanulmány hozta kapcsolatba a dopamint a migrénnel (93) ennek legfőbb oka, hogy a prodromális és posztdromális időszakban, valamint a roham alatt egyaránt jellemzőek a dopamin rendszer aktivitásával összefüggésbe hozható tünetek, például ásítás, hányinger, hányás, irritabilitás, hiperaktivitás vagy hipotenzió. A centrális és perifériás dopamin rendszer fokozott reaktivitására utal, 29

32 Irodalmi áttekintés hogy míg migrénes betegekben dopamin agonisták adásával indukálható ezeknek az ún. dopaminerg tüneteknek a megjelenése, egészséges személyeknél nem tapasztaltak ilyen hatást (94, 95). A dopaminerg transzmisszió zavarát támasztja alá az a megfigyelés is, hogy dopamin antagonistákkal azonnal enyhíthetők vagy megszüntethetők a roham szimptómái (96). A dopamin rendszer hiperszenzitivitását magyarázhatja, hogy migrénesek esetében nagyobb DRD3, DRD4 és DRD5 receptor-denzitást tapasztaltak a perifériás vérben található limfociták felszínén (97, 98), valamint a vérlemezkék dopamin szintje is magasabb volt (99), mint az egészséges résztvevőknél. A dopamin rendszer érintettségét támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a Parkinson kóros betegek esetében alacsonyabb a migrén gyakorisága, mint a kontroll populációban valamint a Parkinson kór megjelenésével csökken a meglévő migrén betegség súlyossága, vagy teljes mértékben gyógyul (100). Mindezek alapján ma már széles körben elfogadott az a nézet, mely szerint a dopamin rendszernek kulcsszerepe van a migrén pathomechanizmusában. A migrén genetikai tényezőinek kutatása során a dopamin rendszer génjeinek lehetséges szerepe is felmerült, többek között a dopamin receptorok, a dopamin transzporter, a katekol-o-metiltranszferáz valamint a dopamin-β-hidroxiláz gének polimorfizmusait vizsgálták. Egyik variánst sem sikerült egyértelműen rizikó vagy protektív faktorként azonosítani, a legtöbb polimorfizmus esetében pozitív és negatív eredmények is születtek A dopamin rendszer szerepe a kábítószerfüggőség kialakulásában A különböző típusú pszichotróp szerek közös tulajdonsága, hogy pozitív élményt, eufóriát idéznek elő, amely megerősíti a szer ismételt használatát és végül hozzászokáshoz vezet (101). A kábítószerek nagyrésze - egyéb farmakológiai hatásaik mellett - közvetlenül vagy közvetve fokozza a központi idegrendszeri dopaminerg transzmisszót és dopamin felszabadulást idéz elő a mezolimbikus régiókban, főképp a nucleus accumbens területén (10, 102, 103). Számos kísérlet támasztja alá, hogy ezen szerek megerősítő hatása annak függvénye, hogy milyen mértékben képesek a középagyi ventrális tegmentális area területén lévő dopaminerg rostok ingerlésére. Ezek a pályák a limbikus rendszer, a nucleus accumbens, a bazális ganglionok valamint különböző kérgi területek felé projektálnak. Az érzelmi életért és reakciókért felelős limbikus rendszerben helyezkednek el az agyi jutalmazó rendszer elemei, ezen belül is kiemelt 30

33 Irodalmi áttekintés fontosságú a nucleus accumbens magcsoportjának szerepe. A jutalmazó vagy reward rendszer aktiválódása elégedettséget, boldogságérzetet idéz elő, amelynek élettani szerepe olyan tevékenységek támogatása, megerősítése, amelyek alapvetők a létfenntartás vagy fajfenntartás szempontjából. Így például finom étel fogyasztása esetén a nyelv ízérzékelő sejtjeiből induló ingerület a ventrális tegmentális areába jut, majd a dopaminerg neuronokon keresztül a limbikus rendszert aktiválja, így kellemes érzést idéz elő, megerősíti a tevékenység folytatását. Más viselkedésformák, például felfedező magatartás vagy szexuális aktivitás esetén tapasztalt pozitív emocionális hatások hátterében is hasonló folyamatok állnak (104). A drogok különböző mechanizmusok révén hatnak a jutalmazó rendszer aktivitására: közvetlenül dopamin felszabadítás útján (pl. ecstasy, nikotin, amfetamin) vagy indirekt módon (pl. morfin, enkefalin). Opiát fogyasztás hatására csökken a GABA-erg neuronok aktivitása, így a mezolimbikus/mezokortikális pályák felszabadulnak ezek gátlása alól, ami fokozott dopaminerg transzmissziót és a jutalmazó rendszer aktivizálódását idézi elő. Míg a természetes, megerősítést kiváltó tevékenységek különböző feedback mechanizmusok révén jól szabályozottak, a kábítószerek kontroll nélkül aktiválják a jutalmazó rendszert, így ismételt drogbevitelhez, majd függőség kialakulásához vezetnek (105). A kábítószerfüggőség tekintetében leggyakrabban a D2-es és a D4-es dopamin receptorok valamint a dopamin transzporter változatainak lehetséges hajlamosító szerepe merül fel. Mindegyik vizsgált polimorfizmus esetében napvilágot láttak a prediszponáló hatást alátámasztó, valamint ezzel ellentmondó eredmények is. A DRD4 receptor kiemelt szerepére hívják fel a figyelmet a kábítószerfüggő szkizofrén betegek szelektív DRD4 antagonista clozapinnal történő kezelésének tapasztalatait bemutató klinikai vizsgálatok. Ezek a tanulmányok kivétel nélkül arról számolnak be, hogy a szkizofréniával komorbid függőség clozapinnal történő kezelés hatására az esetek nagy százalékában jelentős javulást mutatott. Egy vizsgálat arról számolt be, hogy a clozapinnal kezelt betegeknek csupán 8%-a míg a nem kezeltek 40%-a esetén tapasztaltak visszaesést. Egy másik megfigyelés szerint a kezelt betegek 79%-a szokott le a kábítószerfogyasztásról, a clozapinnal nem kezelteknek viszont csak a 34%-a (106, 107). Ezek alapján felmerült a clozapin alkalmazásának lehetősége az alkohol- és kábítószerfüggőség gyógyszeres kezelésében is. 31

34 Irodalmi áttekintés 2.5 AZ MHC RÉGIÓ GENETIKAI VARIABILITÁSA A humán genom project befejezésével intenzív kutatás indult az egyes emberi genomok közötti különbségek feltérképezésére. Korábban az egy bázist érintő polimorfizmusokat gondolták a variáció fő forrásának, de hamar világossá vált, hogy ennél jóval nagyobb területet is érinthetnek ezek a különbségek. A humán genom jelentős számban tartalmaz akár több százezer bázispárt átfogó duplikációkat, inzerciókat, deléciókat vagy inverz szekvenciákat (4. ábra). Ezeket a jelenségeket összefoglaló néven gén kópiaszám polimorfizmusnak (Copy Number Polymorphism CNP) nevezték el (108). Egy 2004-es tanulmány 20 egészséges személy genomjának vizsgálata során 221 (109), egy másik 55 emberben 255 ilyen kópiaszám variációt írt le (110). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a génszám különbségek meglehetősen gyakoriak, így feltehetően kis hatásúak, az egyes emberek közötti különbségek kódolásán kívül prediszponáló vagy protektív szerepük lehet a komplex öröklődésű kórképek esetében. Kromoszóma A B C Egy referencia genom génjei Deléció A C Inzerció A B D C Inverzió C B A Kópiaszám variáció A A A B C Szegmentális duplikáció A B C A B C 4. ábra. A humán genomban előforduló kópiaszám polimorfizmusok (108) A kópiaszám variációk egy jól ismert példája az MHC (Major Histocompatibility Complex) régióban található, feltehetően szegmentális duplikációval létrejött ismétlődő moduláris struktúra, amely négy gén szekvenciáját foglalja magába. 32

35 Irodalmi áttekintés Az MHC régió Amióta 1936-ban először leírták a fő hisztokompatibilitási génkomplex (Major Histocompatibility Complex, MHC) létezését, az MHC régió a gerincesek genomjának egyik legintenzívebben kutatott régiójává vált, amit többek között az immunfunkciók, a transzplantáció valamint az autoimmun folyamatokban betöltött szerepe indokol (111). A 6-os kromoszóma rövid karján elhelyezkedő emberi MHC régió első szekvenciaalapú térképe, amelyet 1999-ben publikáltak, még csak 224 génlókuszt tartalmazott a 3,6 megabázis (Mb) hosszúságú kromoszóma-szakaszon (112). A konzervatív szekvenciák és a kapcsoltsági viszonyok vizsgálata során azonban világossá vált, hogy az MHC régió a klasszikus elképzelésnél jóval nagyobb területet fed le, így a 6-os kromoszóma szekvenálásának befejezésével 2003-ban megszületett a kiterjesztett MHC régió (extendedmhc, röviden xmhc) definíciója (113). A 7,6 Mb hosszúságú xmhc 421 gént tartalmaz, amelyek mozaikos elrendeződésű konzervatív és kevésbé konzervatív szakaszokban követik egymást (114) Ősi haplotípusok Az MHC régió HLA (Human Leukocyte Antigen) génjeinek kapcsoltsági vizsgálata során Dawkins és munkatársai szokatlan haplotípus-mintázatot figyeltek meg, amelyet ősi haplotípus-struktúrák (ancestral haplotype) jelenlétével magyaráztak. Az ősi haplotípusok olyan konzervált, populáció specifikus, folyamatos szekvenciák, amelyek egy, az evolúció során viszonylag korán kialakult szekvenciából jöttek létre minimális változással vagy változás nélkül. Az ilyen haplotípusok több ezer bázispár hosszúságú szakaszokat tartalmaznak, amelyeket befagyott blokkoknak neveznek (polymorphic frozen block). Ezek a struktúrák számos kapcsoltan öröklődő polimorfizmust tartalmaznak, rekombinációs és feltehetően mutációs szupresszió jellemzi őket, ami ezeknek a hosszú szakaszoknak a több generáción keresztüli változatlan öröklődéséhez vezetett. A blokkok számos módosuláson mentek át a befagyás előtt, duplikációk, inszerciók és deléciók alakították ki a mai szekvenciájukat. A folyamat előidézésében feltehetően szerepet játszottak az MHC régión belül nagy sűrűségben előforduló retrolemek, mint például az L1, az Alu szekvenciák vagy a HERV, amelyek részben főemlős- vagy gyakrabban ember-specifikusak. Mivel rekombináció csak a blokkok között történik, a blok- 33

36 Irodalmi áttekintés kokon belül soha vagy nagyon ritkán, ezek a rögzült szekvenciák az emberi evolúció során összekeveredtek, így új, etnikumonként különböző haplotípus-változatok jöttek létre (115) Az RCCX modul Az MHC régió génjeit hagyományosan három osztályba sorolják, a 6-os kromoszóma rövid karján telomerikusan illetve centromerikusan elhelyezkedő MHC I-es és IIes régiók kódolják többek között az antigén felismerésben fontos szerepet játszó HLA gének nagy részét. A középső, MHC III-as régióban számos olyan fehérje génje lokalizálódik, amelyek terméke az immunválasz modulálásáért felelős, így itt találhatók például a tumor nekrózis faktor (TNF) vagy a komplement rendszer egyes elemeinek génjei. Ez a kb. 730 kb hosszúságú, centrális MHC-nak is nevezett terület legalább 62 gén kódolásáért felelős (116), így nemcsak az MHC régiónak, de a teljes humán genomnak is ez a génekben leggazdagabb szakasza. Itt helyezkedik el többek között az MHC II-es régiótól a kromoszóma telomer régiója irányában kb. 200 kb távolságra egy négy génből álló egység, az ún. RCCX modul. Ebben a moduláris struktúrában található egy nukleáris protein kináz (RP), a 4-es komplement komponens (C4), a citokróm 21-hidroxiláz (CYP21) és egy extracelluláris mátrix fehérje, a tenascin-x (TNX) génje. Ezek a gének mindig együtt duplikálódnak vagy deletálódnak, rendszerint mono-, bi- vagy trimoduláris komplexet alkotva a kromoszómán (5. ábra) (117). RP1 C4 C4 C4 TNXB CYP21B Trimoduláris RP2 CYP21A TNXA RP2 CYP21A TNXA RP1 C4 CYP21A TNXA RP2 C4 CYP21B TNXB Bimoduláris RP1 C4 CYP21B TNXB Monomoduláris 5. ábra. Az ismétlődő RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modulok lehetséges variációi [II] 34

37 Irodalmi áttekintés Az RP1 génből, amely feltehetően egy sejtmagban működő szerin/treonin protein-kinázt kódol, mindig egy működő kópia van jelen, az ismétlődő modulokban levő RP2 az RP1 részlegesen duplikálódott, nem funkcionális szakasza (118). A citokróm P450 szteroid 21-hidroxiláz a glükokortikoidok és mineralokortikoidok bioszintézisének elengedhetetlen résztvevője, hiánya a 21-hidroxiláz deficiencia kialakulásáért felelős (116). A CYP21 fehérjét a CYP21B gén kódolja, a CYP21A pszeudogén, egy 8 bázispáros deléció következtében ugyanis kereteltolódás és korai stop kodon jön létre a gén 3. exonjában. A CYP21A és B gének 3 vége átfed a TNXB és TNXA gének 3 végével, mivel ez utóbbiak leolvasási iránya ellentétes a modul többi génjével. A szívben és a vázizomban kifejeződő tenascin-x funkciója még nem ismert, de az extracelluláris mátrix proteinekkel mutatott hasonlósága alapján ezen fehérjék családjába sorolják (116). A TNXA a B gén parciális duplikációjával jött létre, a leolvasási keret eltolódása miatt azonban nem hoz létre működő fehérjeterméket. A másik hárommal ellentétben a C4 gén minden modulban funkcionális, a génekről átíródó C4-es komplement fehérje mennyisége arányos a modulok számával A C4-es komplement komponens jellemzői A C4-es komplement génje A C4-es komplementet kódoló régió genetikai diverzitása a humán genom egyik legszokatlanabb jelensége. A C4 gének száma a kromoszómán az RCCX modulok számától függően 1 és 3 között változhat, valamint minden egyes modul tartalmazhat C4A vagy C4B gént, amelyek a C4 fehérje két izotípusának kódolásáért felelősek, így mindkét génváltozat 1-6 kópiában lehet jelen a diploid genomban. A két variáns szekvenciája több mint 99%-ban megegyezik, a kétféle komplement osztály eltérő tulajdonságait 4 aminosav különbség okozza, amelyeket a 26. exonban található 5 nukleotid cseréje eredményez. A C4A és C4B osztályokon belül még számos C4 allotípus létezik, azonban a különböző mobilitású és hemolitikus aktivitású fehérjék eltérő tulajdonságaiért felelős polimorfizmusok több mint 75%-át még nem sikerült azonosítani. A géndózis különbségen kívül a C4 gének hossza is változhat attól függően, hogy a 9. intronban jelen van-e egy 6,4 kb hosszúságú humán endogén retrovírus (HERV-K), így minden egyes modul 14,2 vagy 20,6 kb méretű C4 gént tartalmazhat. A HERV-K orientációja a 35

38 Irodalmi áttekintés C4 gén átíródásával ellentétes irányú, így annak expressziójakor egy HERV-specifikus antiszenz RNS keletkezik, amelynek a retrovírusokkal szembeni védekezésben lehet szerepe. A C4A és C4B gének gyakorisága a kaukázusi populációban kb. 55 és 45%, míg a hosszú-rövid C4 gének aránya nagyjából 3:1 (117). A C4 gén elsődlegesen a májban fejeződik ki, de kis mértékű expresszió a monocitákban, a vese és a bél epiteliális sejtjeiben, a bőr fibroblaszt sejtjeiben, a pajzsmirigyben, a tímuszban, a lépben, a szívben, a petefészekben, a hasnyálmirigyben valamint a mellékvese velő- és kéregállományában is kimutatható (119). A plazma illetve szérum C4 komplement szintje jelentős individuális eltérést mutat, a teljes C4 fehérje mennyiség 100 és 1000 mg/liter között változhat, valamint a C4A és C4B fehérjék aránya is egyénenként különböző. A C4A és C4B komplement fehérjék mennyiségét elsősorban az őket kódoló gének száma határozza meg, azonban kis mértékben más tényezők is befolyásolhatják, például a HERV-K endogén retrovírust tartalmazó C4 gének száma vagy a test-tömeg index (120) A C4 gén hiányos egér fenotípusa Az emberi szervezetben előforduló ismeretlen vagy részben ismert funkciójú molekulák vizsgálatának egyik módja a fehérje kódolásáért felelős gén embrionális korban történő funkcióképtelenné tétele vagyis kiütése, az így kialakított állattörzsben tapasztalt rendellenességek a fehérje fiziológiás szerepéről adnak információt. A vad típusú egerekhez képest a C4 génkiütött állatok fogékonyabbak a fertőzésekre, ezt támasztja alá, hogy amikor a C4 komplement hiányos egereket T-sejtek által felismert antigénnel immunizálták az elsődleges és másodlagos immunválasz csökkent intenzitású volt, a lép nyiroktüszőiben a normálisnál alacsonyabb számú és kisebb méretű csírasejtek alakultak ki, valamint az IgM-IgG izotípusváltás folyamata is zavart szenvedett (121). A vad típusú egér csontvelőjének C4 hiányos egerekbe történő átültetése helyreállította a humorális immunválasz folyamatát, a transzplantáció után a C4 génkiütött állatok is IgG antitesteket termeltek az immunogénekkel szembeni védekezéskor (122). A C4 knock-out egértörzsek további vizsgálata a C4 komplement komponens immunológiai toleranciában és autoimmunitásban játszott alapvető szerepére hívta fel a figyelmet (123). A C4 hiányos állatoknál súlyos autoimmun betegség alakult ki, lépük megnagyobbodott, gyakoribb volt a vese intersticiális gyulladása, károsodott a komple- 36

39 Irodalmi áttekintés ment mediált immunkomplex eltávolítás, valamint nagy mennyiségű sejtmag és DNS specifikus autoantitest termelődött (124, 125). A saját szövetek duplaszálú DNS-e elleni ellenanyag termelődést, ami a szisztémás lupus betegség egyik fontos jellemzője, heterozigóta C4 génkiütött egerek esetében is sikerült kimutatni (126) A C4 molekulák szerepe a komplementrendszerben A komplementrendszer számos funkciója révén mind a természetes, mind az adaptív immunválasz fontos résztvevője. A kaszkádszerűen aktiválódó enzimrendszer feladatai közé tartozik többek között az extracelluláris sejtek, kórokozók opszonizálása illetve lízise, a saját sejtek károsodásának megakadályozása, valamint a szervezetben keletkező immunkomplexek eltávolítása a keringésből. A C4 komplement komponens a komplement-aktiváció klasszikus és lektinfüggő útvonalának szereplője (127). A klasszikus aktiváció első lépéseként a C1-es komplement komponens az antigénnel reakcióba lépett immunglobulin molekulához kötődik. A C4 molekula három (α, β és γ) polipeptid láncból álló glükoprotein, amely akkor aktiválódik, amikor a C1 az α- lánc N-terminális végéről lehasítja a kis molekulatömegű C4a-peptidet. Az így bekövetkező térszerkezeti változások eredményeképpen a keletkező nagyobbik, C4b fragmentumon feltárul az a láncon belüli tioészter-kötés, amely az antigén sejtfelszíni hidroxilvagy amino-csoportjaival kovalens kötés kialakítására képes. A lektinfüggő aktiváció ezen a ponton kapcsolódik a klasszikus útvonalhoz, a patogének szénhidrátmolekulákban gazdag felszínéhez kötődő mannózkötő lektin-mannózkötő lektin asszociált szerinproteáz komplex a C1-hez hasonlóan képes a C4 hasítására és így az antigénnel fajlagosan reagáló ellenanyag-molekulák jelenléte nélkül indítja el a komplement-kaszkádot. Mindkét útvonal következő lépéseként az aktiváló felülethez kovalensen kötődő C4b molekula reagál a C2-proenzimmel, amelyet a közelében lévő C1 molekula (vagy a mannózkötő lektin asszociált szerinproteáz enzim) C2a és C2b peptidekre hasít. A nagyobbik, C2b fragmentum a C4b-hez kötődik, és ezzel kialakul a klasszikus út C3- konvertáz enzime, amely a C3-proenzimet aktiválja. A C4b2b-komplex hasítja a C3 molekulát, majd az így keletkező C3b fragmentum kötődése után létrejön a C4b2b3b trimoduláris komplex, azaz a C5-konvertáz enzim. Ez az enzimkomplex hasítja a C5 molekulát, így a nagyobbik, C5b fragmentum képes lesz az antigén felületére kötődni. 37

40 Irodalmi áttekintés A láncreakció utolsó fázisában a C5, C6, C7, C8 és C9 komponensek vesznek részt. A C6-tal összekapcsolódó C5b valamint a C7 és a C8 molekula kölcsönhatása révén a kórokozó membránján egy kis pórus jön létre. A C9 molekulák bekötődése a folyamat utolsó lépése, melynek eredményeként létrejön az ún. membránkárosító komplex, így olyan nagy méretű pórus keletkezik a patogén felszínén, amely már a sejt líziséhez vezet. A komplement-mediált lízis elősegítésén kívül a C4 komplement komponensek még számos funkciót láthatnak el: Opszonizáció: A kórokozó felszínére kötődő C4b fragmentumok, vagy opszoninek a CR1 komplement-receptorral rendelkező fagocita sejtekhez kapcsolódva elősegítik az antigének bekebelezését. Immunkomplexek eltávolítása a keringésből: A kóros mennyiségben jelen levő immunkomplexek nagy méretű aggregátumokat hozhatnak létre, amelyek különböző helyeken (például az erek falában) lerakódnak, ahol így gyulladás alakul ki és szövetkárosító folyamatok indulnak meg. A C4b molekulák a komplexekhez kötődve szolubilizálják a hálózatot, így elősegítik azok eliminációját. Immunkomplex clearance, az immunkomplexek eltávolításának egy speciális változata: A vörösvértestek membránjában lévő CR1 komplement-receptorok megkötik a C3b vagy C4b fragmentumokat tartalmazó immunkomplexeket és azokat a lép vagy a máj fagocitasejtjeihez szállítják. Feltételezik, hogy a C4 komplementnek valamilyen eddig ismeretlen mechanizmus útján szerepe lehet az antigén stimuláció hatására bekövetkező IgM-IgG izotípus váltás folyamatában, az immunológiai tolerancia kialakulásában valamint az autoreaktív B-sejtek eliminálásában is A C4 aktiválódása és izotípusainak jellemzői A C4-es komplement, a C3-hoz hasonlóan, az α 2 -makroglobulinok családjába tartozik, ezek egyik jellemzője az a molekulán belüli tioészter, ami lehetővé teszi, hogy ezek a fehérjék észter- vagy amid-kötések létrehozásával kovalensen kötődjenek a célmolekulához. Az emberi C4-es fehérje es pozícióiban található cisztein, glicin, glutaminsav és glutamin aminosavak alkotják, a cisztein tiol- és a glutamin acil- 38

41 Irodalmi áttekintés csoportjának összekapcsolódásával létrejövő 15 tagú tiolakton gyűrűt. A C4-es komponens aktiválódása során a tiolakton gyűrű a molekula felszínére kerül, megváltozik a tioészter-kötés stabilitását biztosító konformáció, így a kötésben résztvevő C-atom nukleofil támadása hatására a gyűrű felbomlik miközben a C4b fragment az antigén egy felszíni molekulájához kapcsolódik (6. ábra). 6. ábra. A C4-es komplement célsejthez való kötődésében kulcsszerepet játszó 15-tagú tiolakton gyűrű felépítése és a kapcsolódás mechanizmusa A: A tiolakton gyűrű felépítése. A gyűrűs szerkezet létrehozásáért a cisztein tiol- és a glutamin acil-csoportja között kialakuló, az ábrán pirossal jelölt tioészter-kötés felelős. B: A C4A és a célmolekula kovalens kapcsolódásának feltételezett mechanizmusa. C: A C4B molekula 1106-os pozíciójú hisztidinjének szerepe a hidroxil-csoportot tartalmazó antigénnel létesített kötés létrehozásában. 39

42 Irodalmi áttekintés Az immunglobulinok kivételével a C4-es komplement valószínűleg a legpolimorfabb szérum fehérje, több mint 41 allotípusa létezik, amelyeket a célsejttel létrehozott kapcsolat alapján két fő típusba sorolhatunk. Ezek az amino-csoportot tartalmazó antigénekkel amid-kötést kialakító C4A illetve a célmolekula hidroxil-csoportjával észter-kötést létesítő C4B osztályok (5. táblázat). 5. táblázat. A C4A és C4B fehérjék biokémiai jellemzőinek összehasonlítása (117) C4A C4B Elektroforetikus mobilitás - agaróz gélben gyors lassú A tioészter reaktivitása - Hemolitikus aktivitás - Relatív affinitás amino csoporthoz hidroxil csoporthoz - A C4b fragment féléletideje alacsonyabb magasabb alacsonyabb >10 másodperc magasabb alacsonyabb magasabb <1 másodperc CR1 receptorhoz való kötődés erősebb gyengébb Immunprecipitáció gátlás magasabb alacsonyabb Vércsoport antigénekkel szemben mutatott reaktivitás Rodgers 1, 2 Chido 1, 2, 3, 4, 5, 6 A különböző allotípusokat kódoló gének vizsgálata során 24 aminosav cserét eredményező szekvencia eltérést fedeztek fel, amelyek közül azonban csak 4 okozza a két osztály közötti funkcionális különbségeket. A C4A izotípusba tartozó molekulákban PCPVLD 1, míg a C4B osztály estében LSPVIH 1 aminosavak találhatók a fehérje os pozícióiban. A két C4 típus további vizsgálata egyértelművé tette, hogy az eltérő célmolekulával szemben mutatott relatív affinitás különbségért egyedül az 1106-os pozícióban bekövetkező hisztidin/aszparaginsav csere felelős. A hisztidin egy intermedier létrehozása révén katalizálja a tioészter-kötés transzacetilációját, a gyors reakcióidejű de gyorsan bomló közti termék miatt azonban az aktív C4B féléletideje kevesebb, mint 1 másodperc. Az aszparaginsav oldalláncnak nincs katalitikus szerepe, a C4A féléletideje így kb. 10 másodperc, valamint irányított mutagenezissel bizonyították, hogy a hisztidinnel ellentétben az aszparaginsav nem feltétlenül szükséges a reakcióhoz, 1 Az aminosavak jelölése az egybetűs kódok szerint: P: prolin; C: cisztein; V: valin; L: leucin; D: aszparaginsav; S: szerin; I: izoleucin; H: hisztidin. 40

43 Irodalmi áttekintés mivel savas vagy semleges oldalláncú aminosavakkal helyettesítve is létrejön az amidkötés. Míg a C4B csak a komplement-kaszkád aktivációjában vesz részt, a C4A hoszszabb reakcióideje lehetővé teszi, hogy a CR1 komplement-receptorhoz kapcsolódva az opszonizációban, valamint az immunkomplexek eltávolításában is fontos szerepet játszszon (117) A C4 komplement szerepe az immunbetegségek kialakulásában A C4 géndózis illetve az ezzel szoros korrelációt mutató vérplazma C4 szint nagymértékű változása valamint az A és B fehérjék arányának szélsőséges eltolódása kóros immunfolyamatokat idézhet elő. Míg alacsony C4 szint esetén lassulhat az immunkomplex aggregátumok eltávolítása a keringésből és csökkenhet a fertőzésekkel szembeni ellenálló képesség, addig a magasabb géndózis a komplement-kaszkád túlzott aktiválásán keresztül a szövetkárosító autoimmun folyamatok kockázatát növelheti. A leggyakoribb, bimoduláris struktúrában egy C4A és egy C4B gén található a kromoszómán, így a populáció kb. 70%-ában a két változat egyenlő arányban van jelen. Kb %-os gyakorisággal fordulnak elő olyan haplotípusok, amelyek nem tartalmazzák az egyik C4 génváltozatot vagy valamilyen mutáció következtében működésképtelen gént hordoznak, ezek előfordulása részleges vagy teljes C4A (C4AQ0) illetve C4B (C4BQ0) komplementhiányhoz vezethet. A C4A fehérje expressziójának csökkenése vagy hiánya növeli a bakteriális és virális fertőzések kialakulásának valószínűségét, valamint számos kórkép rizikófaktora lehet, ilyenek például a szisztémás lupus betegség (128), a krónikus érkárosodás és az azt követő miokardiális infarktus (129, 130) vagy a herpesz (131). A C4B fehérjehiány hajlamosító szerepét többek között az erythema nodosum (132) és az IgA nephropathia (133) kórképek esetében igazolták. Egy 2002-es tanulmány 28 eddig leírt teljes C4 hiányos személyről számolt be, egy kivételével mindannyiuk esetében felfedeztek valamilyen kóros jelenséget, ami az immunkomplexek eltávolításának zavarára utalt, például szisztémás lupus erythematosust vagy más lupus jellegű kórképet, vesegyulladást vagy más vesebetegséget illetve fényérzékenységet. A teljes C4 hiány valamilyen szisztémás autoimmun betegség kialakulását idézte elő a hordozók 75-96%-ában, így ez az egyik legmagasabb penetranciájú genetikai hiba a humán genomban (134). 41

44 Irodalmi áttekintés A C4 gének számának meghatározására alkalmazott korábbi módszerek Mivel a vér C4 szintjének individuális különbözősége, amelyet elsősorban a C4A és C4B géndózis határoz meg, számos immunbetegség kialakulására hajlamosíthat, a gének számának pontos ismerete kiemelkedő jelentőségű lehet a C4 izotípusok fiziológiás és kóros immunfolyamatokban játszott szerepének megértésében. A C4A és C4B gének számának illetve fehérjetermékeik mennyiségének meghatározására korábban főképp az alábbi módszereket alkalmazták: A C4 fenotipizálás vagy allotipizálás során a vérplazma mintát neuraminidáz és karboxi-peptidáz B enzimekkel emésztik, az így kapott termékeket magas feszültségű agaróz gélelektroforézissel választják el. Az immunofixálás nyúl vagy kecske anti-humán C4 ellenanyag felhasználásával történik, így mosás és festés után elkülöníthetőek az eltérő mobilitású C4 allotípusok (135, 136). RFLP-Southern-blot: A Taq I illetve a PshA I restrikciós endonukleázokkal emésztett genomi DNS fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel elválasztják, majd Southern-blotot követően különböző, izotóppal jelölt (Taq I: RP1 és RP2, CYP21A és B valamint TNXA és B; PshA I: C4A és B specifikus) próbákkal hibridizálják. Így meghatározható az RCCX modulszám illetve az RP1-hez és RP2-höz kapcsolódó hosszú és rövid C4 gének, valamint a C4A-C4B, CYP21A- B és a TNXA-B gének aránya (137). Az előzőhöz nagyon hasonló a PFGE (pulse-field gelelectrophoresis) technika alkalmazásán alapuló módszer. A PmeI enzimmel emésztett DNS fragmentumok elválasztása változó áramerősségű gélelektroforézissel történik, autoradiográfiás detektálás után a modulok számáról és hosszáról is információt kapunk (138). A C4A és B génekben előforduló deléciók meghatározására számos PCR-alapú technikát fejlesztettek ki, amelyek többek között restrikciós enzimek vagy szekvencia-specifikus primerek alkalmazásán (139), illetve hosszú PCR termékek amplifikációján (140) alapulnak. A C4A/B arány szempontjából informatív, genomi DNS emésztésén, illetve a C4 allotípusok eltérő mobilitásán alapuló technikák széles körű alkalmazásának határt szab, hogy munkaigényesek és kivitelezésükhöz jelentős mennyiségű vérminta szükséges, ráadásul a denzitometriás mérésen alapuló kvantifikálás nem mindig megbízható. 42

45 Célkitűzések 3 CÉLKITŰZÉSEK Doktoranduszi munkám egyik fő feladata két komplex öröklődésű kórkép, a kábítószerfüggőség, valamint a gyermekkori migrén genetikai rizikófaktorainak kutatása, a következő konkrét célkitűzésekkel: 1. A szerotonin és a dopamin rendszer legfontosabb polimorfizmusainak analízise gyermekkori migrénes betegek csoportjában eset-kontroll populációs vizsgálattal, család-analízissel, valamint endofenotípusok definiálásával. 2. Ugyanezen polimorfizmusok és haplotípusaik asszociáció-vizsgálata kábítószerfüggő populációban eset-kontroll elrendezésben, valamint kvantitatív endofenotípus jellegekkel való megközelítésben. A szerotonin és a dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálati módszerei a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében, Dr. Sasvári Mária laboratóriumában rendelkezésemre álltak. Ugyanakkor felmerült az igény egy új típusú polimorfizmus, a gén kópiaszám variációk kvantitatív mérésének kidolgozására, melyre több módszertani megoldás kínálkozott. Célkitűzéseink így a következő pontokkal bővültek: 3. A gén kópiaszám mérése kvantitatív real-time PCR technikával 4. Kapilláris elektroforézis felhasználása a gén-dózis mérésére Az utóbbi két célkitűzés megvalósítása a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikájának Prof. Füst György által vezetett laboratóriumával kollaborációban történt, modell rendszerként a C4-es komplement génvariánsokat használva fel, melyek gén kópiaszámának variabilitása jól ismert, de a C4A és C4B génszám meghatározása csak hosszadalmas módszerekkel volt lehetséges. 43

46 Módszerek 4 MÓDSZEREK 4.1 A VIZSGÁLATOKBAN RÉSZTVEVŐ SZEMÉLYEK Klinikai populációk A migrén genetikai hátterének kutatásában 87 migrénes gyermek (46 fiú és 40 lány) valamint szüleik vettek részt. A 87 családból 12 esetben csak az egyik szülő volt elérhető, míg 2 beteg esetében egyik szülőtől sem tudtunk mintát venni. A diagnózis felállítása a Nemzetközi Fejfájás Betegségek Klasszifikációjának 2. átdolgozott kiadása szerint (International Classification of Headache Disorders IHCD-II) dr. Farkas Viktor kezelőorvos irányításával a Semmelweis Egyetem I. számú Gyermekgyógyászati Klinikáján történt. A fejfájást megelőző vagy kísérő vizuális illetve neurológiai tünetek jelenléte alapján 49 beteg aura nélküli, míg 38 gyermek aurás migrén betegségben szenvedett. A betegek átlagéletkora a betegség kezdetekor 9,7 év volt, a mintavétel a betegekkel való első találkozás után átlagosan fél évvel történt (1 hónap 1 év). A betegség kezdetekor betöltött életkor alapján elkülönítettük a 6 év alatti betegcsoportot (n=23). A mintavétellel egyidőben a gyermekek (szükség esetén szülői segítséggel) egy, a munkacsoportunk által kidolgozott kérdőívet töltöttek ki a migrénes fejfájás jellemzőinek részletes felmérésére. A tünetek alapján meghatároztunk egy 41 főből álló betegcsoportot (migraine with severe vomiting and abdominal pain - MwVA), akiknél legalább 5 migrénes rohamot ismétlődő (1 órán belül legalább kétszeri) hányás és hasi fájdalom kísért, de kizárható volt bármilyen gasztrointesztinális kórkép jelenléte. A hasi fájdalom osztályozása von Bayer és Walker ajánlása (141) szerint történt. A kábítószerfüggőség rizikófaktorainak vizsgálata 300 nem rokon heroinfüggő személy bevonásával történt (208 férfi, 92 nő). A betegek három nagy központból kerültek ki: 51-en az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézetben álltak gondozás alatt, 76 személyt a Szeged Megyei Jogú Város Önkormányzata "Dr. Farkasinszky Terézia" Ifjúsági Drog Centrumban kezeltek, míg 173 heroinfüggő a Nyírő Gyula Kórház Drogambulanciáján folyó methadon programban vett részt. A pszichiátriai diagnózisok felállítása minden esetben a DSM IV. (Mentális Betegségek Diagnosztikai és Statisztikai Kézikönyve IV. kiadása) szerint történt. A gyermekkori ADHD-s előzményt 121 beteg esetében vizsgáltuk a DSM/BNO tünetegyüttes alapján összeállított retrospektív önki- 44

47 Módszerek töltős kérdőív alkalmazásával. A kérdőív eredeti, már validált változatát (ADHD Rating Scale) (142), mely a páciensek szüleinek segítségével vizsgálja a gyermekkori ADHD tünetek jelenlétét, a Vadaskert Alapítvány bocsátotta rendelkezésünkre. A vizsgálati személyek valamint (a kiskorú betegek esetében) szüleik szóbeli és írásos tájékoztatót kaptak a mintavételről és a vizsgálatok további menetéről, majd az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága (ETT- TUKEB) által jóváhagyott Hozzájárulási Nyilatkozaton a vizsgálatba történő beleegyezésüket aláírásukkal igazolták Kontroll csoport Az asszociáció-vizsgálatokban kontrollként használt populációt 604 nem rokon, kaukázusi személy (248 férfi, 356 nő) alkotta, akik a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében a dr. Sasvári Mária által vezetett munkacsoport más témájú kutatásaiban vettek részt. A kontroll populáció genotípus-eloszlása minden polimorfizmus esetében Hardy-Weinberg egyensúlyban volt. Az eset-kontroll vizsgálatok során a teljes kontroll minta nem szerint illesztett szubpopulációit használtuk. A C4-es komplement faktor génszámának meghatározásához használt 118 egészséges személy DNS mintáit Dr. Füst György Professzor úr (Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinika) bocsátotta rendelkezésünkre. Az önkéntesek az alkalmazott mintavételi eljárásról és a vizsgálat menetéről írásos tájékoztatót olvashattak, a vizsgálatba történő beleegyezésüket aláírásukkal igazolták. A résztvevők kódolása számozással történt. 4.2 MINTAVÉTEL ÉS DNS IZOLÁLÁS A DNS minták gyűjtése a Dr. Sasvári Mária laboratóriumában kidolgozott noninvazív technikával (143) történt. A mintavétel során a vizsgálati személy vattapálca segítségével a szájnyálkahártya másodpercig tartó dörzsölésével nyálkahártya eredetű hámsejteket gyűjtött, majd a mintavevő pálcákat a 350 μl lízis puffert (0,1 M NaCl; 0,01 M Tris HCl ph 8,0; 0,5% SDS; 0,2 mg/ml proteináz K; 0,01 M Na 2 EDTA ph 8,0) tartalmazó 15 ml-es csőbe helyezte. Személyenként két azonos mintavevő cső 45

48 Módszerek készült, csövenként 2 mintavevő pálcát használtunk. A DNS izolálás első lépéseként a mintákat egy éjszakán át inkubáltuk 56 C-on. Másnap a vattapálcából centrifugálással (1000g, 20 perc) nyertük ki a lizált sejtkivonatot, majd az így összegyűlt lizátumból történt a DNS izolálása az első időszakban hagyományos fenol-kloroformos módszerrel (144), a későbbiekben a Puregene DNS izoláló kit (Gentra) alkalmazásával. A különböző módszerekkel izolált DNS mennyiségét és minőségét 1%-os agaróz gél elektroforézissel ellenőriztük, ismert mennyiségű standard felhasználásával. A Dr. Füst György által rendelkezésünkre bocsátott minták Flexigene DNS izoláló kit (Qiagen) segítségével vérből izolált DNS-t tartalmaztak. A szájnyálkahártya minták valamint a tisztított DNS preparátumok tárolása 20 C-on történt. 4.3 GENOTÍPUS ÉS HAPLOTÍPUS MEGHATÁROZÁS A szerotonin és dopamin rendszer polimorfizmusainak genotipizálása során alkalmazott módszerek Dr. Sasvári Mária laboratóriumában rendelkezésre álltak. 6. táblázat. A hosszúság polimorfizmusok genotípusának meghatározásához használt primerek Név Szekvencia (5 3 ) Pozíció (5 3 ) T m ( C) SERT 5-HTTLPR 5-HTTLPR1b GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC ,2 5-HTTLPR2b GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC ,3 SERT STin2 STin2 1b CAA TGT CTG GCG CTT CCC CTA CAT AT ,1 STin2 2b GAC ATA ATC TGT CTT CTG GCC TCT CAA G ,9 DRD4 48 bp VNTR 48bp1 GCG ACT ACG TGG TCT ACT CG ,9 48bp2 AGG ACC CTC ATG GCC TTG ,9 DRD4 120 bp dup 120dup1c GTT GGC TGT CTT TTC TCA TTG TTT CCA TTG ,6 120dup2c GAA GGA GCA GGC ACC GTG AGC ,7 DAT 3 UTR VNTR dat1 TGT GGT GTA GGG AAC GGC CTG AG ,8 dat2 CTT CCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG ,8 46

49 Módszerek A hosszúság polimorfizmusok genotipizálása A hosszúság polimorfizmusok esetében a polimorfizmuson kívül eső konzervatív szekvenciákra komplementer primerek alkalmazásával a genotípus közvetlenül meghatározható, mivel a különböző allélváltozatokról eltérő méretű PCR termékek keletkeznek. Ezzel az elvvel történt a szerotonin transzporter két variánsának (5-HTTLPR és STin2) vizsgálata, valamint a DRD4 promoter 120 bp dup, 48 bp VNTR és a DAT 3 UTR VNTR polimorfizmusok genotípusának meghatározása. Az alkalmazott primerek szekvenciáit, elhelyezkedését és olvadáspontját (Tm) a 6. táblázat tartalmazza Az egypontos polimorfizmusok (SNP) vizsgálata Az egypontos polimorfizmusok genotípusának meghatározására kétféle módszert használtunk: a restrikciós fragmentumok hosszúság polimorfizmusának analízisét (PCR-RFLP) és a kétirányú allél-specifikus amplifikációt (ASA). A felhasznált primereket a 7. táblázat tartalmazza. Az eredmények megbízhatóságának növelése céljából a vizsgált SNP-k genotípusát sok esetben mindkét módszerrel meghatároztuk Restrikciós fragmentumok hosszúság polimorfizmusa (PCR-RFLP) A PCR-RFLP módszere csak abban az esetben alkalmazható, ha a vizsgálni kívánt SNP megváltoztatja egy restrikciós enzim hasítási helyét: eltünteti azt vagy újat alakít ki. A módszer alkalmazása során első lépésként a vizsgálni kívánt DNS szakaszt polimeráz láncreakcióval felsokszoroztuk, majd a PCR termékeket restrikciós endonukleázzal emésztettük. A meghatározás biztonságának növelése céljából úgy választottuk ki az amplifikált DNS szekvenciát, hogy az egy kontroll hasítási helyet is tartalmazzon, mivel így kizárható a restrikciós endonukleáz nem megfelelő működéséből származó hibalehetőség. A DRD4-521CT, a -616CG és a COMT G1947A SNP-k PCR- RFLP-vel történő vizsgálatához a 8. táblázatban részletezett restrikciós enzimeket használtuk fel. A munkám során használt enzimeket minden esetben az ajánlott, standard körülmények között alkalmaztuk, így kizárható a star-aktivitás problémája, azaz az enzimek feltehetően csak a specifikáció szerinti felismerő hely jelenléte esetén hastíják a kétszálú DNS-molekulát. 47

50 Módszerek 7. táblázat. A PCR-RFLP-vel történő SNP meghatározásnál alkalmazott restrikciós enzimek N = A, C, G vagy T Polimorfizmus -616GC Felismerő hely GAGGACCAG GAGGGCCAG Restrikciós endonukleáz Sau 96 (GGNCC) -521CT GGTGCGCACG Fsp I (TGCGCA) COMT G1947A GGCATGAA Nla III (CATG) Kétirányú allél-specifikus amplifikáció (ASA) Ennél a módszernél két, ellentétes irányú, allél-specifikus (azaz 3 végén a polimorfizmus egyik alléljára komplementer bázist tartalmazó) primert, valamint két külső primert alkalmazunk. A külső primerek a vizsgált polimorfizmustól eltérő távolságban helyezkednek el, így elektroforetikusan jól elkülöníthető allél-specifikus termékek jönnek létre. 8. táblázat. Az SNP meghatározásnál alkalmazott primerek Név Szekvencia (5 3 ) 5 3 T m ( C) -521CT valamint a -616CG RFLP primerek illetve -521CT ASA külső primerek 521ctk1 GGA ATG GAG GAG GGA GCG GG ,4 521ctk2 CGC TCC ACC GTG AGC CCA GTA T ,0-521CT ASA allél-specifikus primerek 521c1 GGA GCG GGC GTG GAG GGC ,3 521t2 GCC TCG ACC TCG TGC GCA ,4 616CG ASA primerek 616cgk1a GAA CCT ACC CCG GCC TGT CGT ,9 616cgk2a AGA CGG GAA TGA AGC GAG GTG G ,1 616c1 TGG TCG CGG GGG CTG AGC ,8 616g2ag CCC CCC MGC AGC CTC TGG YC ~62,5 COMT G1947A RFLP primerek comt3 CTC ATC ACC ATC GAG ATC AA ,6 comt2 CCT TTT TCC AGG TCT GAC AA ,7 COMT G1947A ASA primerek comtagk1b TGC TCA CCT CTC CTC CGT ,9 comtagk2b ACA CCC ATA CAA GCA TTC ATC ,9 comta1e TGG TGG ATT TCG CTG GCA ,5 comtg2d CAC ACC TTG TCC TTC AC ,1 48

51 Módszerek A DRD4-521CT, a -616CG és a COMT G1947A SNP ASA-val történő genotipizálásához a 11. táblázatban felsorolt primereket használtuk. A -616CG genotipizálását nehezíti, hogy a közvetlenül mellette levő -615 pozíció is polimorf, ezért az antisense allél-specifikus primer második pozíciója degenerált, azaz a reakcióelegy a -615AG mindkét változatára komplementer allél-specifikus primert tartalmaz, így a reakció a -615AG genotípustól függetlenül elindul A DRD4 gén promoter régiójának haplotípus analízise A DRD4 gén promoter polimorfizmusok genotipizálása után az egyes allélok relatív kromoszómális elhelyezkedését, azaz a haplotípusát is meghatároztuk. A haplotipizálás közvetlen amplifikációs módszerekkel történt, amelyet molekuláris vagy direkt haplotípus meghatározásnak is neveznek, megkülönböztetve ezzel a családok vizsgálatán alapuló, indirekt haplotipizálástól. Dr. Sasvári Mária munkacsoportja a DRD4 promoter négy polimorfizmusának (120 dup, -521CT, -615AG, -616CG) vizsgálatára számos kettős vagy hármas haplotípus meghatározó módszert dolgozott ki (145, 146). 9. táblázat. A haplotípus meghatározásnál használt primerek fontosabb jellemzői M = A vagy C, Y = C vagy T Név Szekvencia (5 3 ) 5 3 T m ( C) 120 bp-os duplikáció és -616CG SNP haplotípusának meghatározása 120dup1b GGC TGG ACT CGC CGT TTG G ,0 616cgk2a AGA CGG GAA TGA AGC GAG GTG G ,1 616c2ag CCC CCC MGC AGC CTC TGG YG ,4 616g2ag CCC CCC MGC AGC CTC TGG YC ,5 120 bp-os duplikáció és -521CT SNP haplotípusának meghatározása 120dup1b GGC TGG ACT CGC CGT TTG G ,0 521ctk2 CGC TCC ACC GTG AGC CCA GTA T ,0 521c2 GCC TCG ACC TCG TGC GCG ,4 521t2 GCC TCG ACC TCG TGC GCA ,4-616CG, -615AG és -521CT SNP-k haplotípusának meghatározása 521ctk1 GGA ATG GAG GAG GGA GCG GG ,4 521c2 GCC TCG ACC TCG TGC GCG ,4 521t2 GCC TCG ACC TCG TGC GCA ,4-616CG és -521CT SNP haplotípusának meghatározása 521ctk1 GGA ATG GAG GAG GGA GCG GG ,4 521c2 GCC TCG ACC TCG TGC GCG ,4 521t2 GCC TCG ACC TCG TGC GCA ,4 49

52 Módszerek Haplotípus meghatározás ASA-val Ebben az esetben az allél-specifikus amplifikáció két reakcióelegy alkalmazásával reakciónként 3 primerrel (egy allél-specifikus és két, a 120 bp duplikációt is közrefogó külső primerrel) történik (9. táblázat). Erre a módszerre azon személyek esetében volt szükség, akik heterozigóták a 120 bp duplikációra valamint a -616CG vagy a - 521CT SNP-re. Az egyes reakcióelegyekben meginduló DNS amplifikáció az SNP, míg az így keletkező PCR termékek hossza a 120 bp dup genotípusáról nyújt információt Haplotípus meghatározás PCR-RFLP-vel A DRD4 gén promoterében egymás melletti pozícióban elhelyezkedő -615AG és -616CG SNP-k négyféle haplotípus-kombinációban fordulhatnak elő, így haplotípusuk négy megfelelő specificitású restrikciós endonukleáz enzim alkalmazásával határozható meg (10. táblázat). A reakcióelegyek összeállítása a -521CT genotípus meghatározása után, annak függvényében történik. Az SNP-re heterozigóta minták esetében kétféle reakcióelegy készül, az egyik a citozinra (521c2) a másik a timinre (521t2) tervezett allélspecifikus antisense primert, valamint a -616-ös pozíciótól 5 irányban tapadó sense primert (521ctk1) tartalmazza, míg homozigóta személyek esetében egy, a megfelelő allélra specifikus reakcióelegy elegendő. A polimeráz láncreakció után a reakcióelegyet négyfelé osztjuk és négy olyan restrikciós endonukleázzal emésztjük, amelyek a -615-ös és -616-os pozíciójú SNP-k csak egy bizonyos kombinációja esetén hasítanak (10. táblázat). A négy (illetve a -521CT SNP-re heterozigóták esetében nyolc) elegy elektroforetikus elválasztása után megállapítható, hogy melyik reakcióelegy(ek)ben történt emésztés, azaz hogy mely allélok helyezkednek el egy kromoszómán. 10. táblázat. A DRD4 promoter -615AG és -616CG haplotípus meghatározása során alkalmazott restrikciós enzimek W = A + T, Y = C + T -616CG~ -615AG haplotípus felismerő hely restrikciós endonukleáz -616 G ~ -615 A TGAGGACCA Ava II (GGWCC) -616 C ~ -615 A TGAGCACCA BsiHKA I (GWGCWC) -616 G ~ -615 G TGAGGGCCA Hae III (GGCC) -616 C ~ -615 G TGAGCGCCA Hae II (RGCGCY) 50

53 Módszerek Amplifikációs körülmények A PCR elegy összetétele A polimeráz láncreakció μl-es térfogatban zajlott, a reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta: kb. 0,1 ng/μl DNS templát 1-1 μm a megfelelő primerekből Az egyes polimorfizmusok és haplotípusok vizsgálatánál alkalmazott primerek szekvenciáit a 6., 7. és 9. táblázat tartalmazza. 200 µm dntp 200 µm datp, dttp, dctp és dgtp illetve 200 µm datp, dttp, dctp, 100 µm dgtp és ditp a DRD4 48 bp VNTR és a haplotípus meghatározások esetében. Ha a DNS szakasz guaninban és citozinban gazdag (48 bp VNTR), vagy a keletkező termékek között jelentős a méretbeli különbség (haplotípus meghatározás), a denaturáció során a magas GC-tartalmú valamint a több ismétlődést tartalmazó szálak nehezebben válnak szét, így egyes allélok preferenciálisan képződhetnek, ez az úgynevezett allélkiesés jelensége (147). Ennek a problémának a kiküszöbölésére a 200 μm dgtp-t 50%-ban ditp-tal (dezoxiinozin trifoszfáttal) helyettesítettük, azaz 100 μm dgtp-t és 100 μm ditp-t adtunk a reakcióelegyhez. Az inozin olyan guanozin analóg, amely a citozinnal csak két H-híd kialakítására képes, így csökkenti a DNS olvadáspontját, ezáltal elősegíti a GC-gazdag valamint a hosszabb termékek keletkezését. 0,025 U/μl Qiagen HotStarTaq DNS-polimeráz Ez a Thermus aquaticusból izolált 94 kda-os rekombináns DNS-polimeráz egy módosított formája. Az enzim nagyfokú érzékenysége alkalmassá teszi a szájnyálkahártyából nyert kis mennyiségű DNS vizsgálatára. Emellett nincs 3-5 irányban hibajavító aktivitása, ami az allél-specifikus primerek alkalmazásakor elengedhetetlen követelmény. Az enzimre kapcsolt antitest csak a PCR első lépése során, a 15 perces 95 C-on történő inkubálás alatt válik le az enzimről, így elkerülhető, hogy a reakcióelegy összemérése közben aspecifikus termékek keletkezzenek. 51

54 Módszerek 1x Qiagen puffer (1,5 mm Mg 2+ ) A puffer a megfelelő Mg 2+ -koncentráció biztosításával növeli az enzim specifitását úgy, hogy széles hőmérsékleti tartományban elősegíti a specifikus primerkötődést. 1x Qiagen Q-oldat A Taq polimeráz kithez tartozik a Q oldat is, amely a DNS olvadáspontját csökkentve elősegíti a nehezen átíródó szakaszok (pl. GC-gazdag régiók) amplifikálását A PCR termociklus A termociklus első lépése a 95 C-on 15 percig tartó kezdeti denaturáció, ami során szétválnak a genomiális DNS szálai és aktiválódik a HotStarTaq polimeráz enzim. Ezt termociklus követi; ciklusonként három lépéssel: 1 perc denaturálás 94 C-on; 30 másodperces anneálás polimorfizmusonként különböző hőmérsékleten (65 C: 5- HTTLPR, -521CT, -616CG és a haplotípusaik; 60 C: 48 bp VNTR, DAT 3 UTR VNTR; 58 C: 120 bp dup, STin2; 56 C: COMT G1947A) és végül 1 perc extenzió 72 C-on. A PCR reakció lezárásaként a 72 C-on történő 10 perces végső extenzió után a mintákat 4 C-ra hűtöttük le, majd a további vizsgálatokig -20 C-on tároltuk A PCR termékek restrikciós emésztésének körülményei Az amplifikációt követő restrikciós emésztés során a restrikciós enzimkeveréket 1:2,5 arányban adtunk a PCR termékekhez. Az enzimkeverék 0,6 U (Fsp I, Sau96 I, Ava II, Hae II és BsiHKA I), vagy 1,2 U (Hae III) mennyiségű enzimet tartalmazott, a dithio-dl-threitol (DTT) végső koncentrációját 1 mm-ra, a MgCl 2 -ét 10 mm-ra állítottuk be. A Hae II és BsiHKA I enzimekhez a leírásuknak megfelelően 0,1 g/l BSA-t is adtunk. Az emésztés a BsiHKA I enzim esetén 65 C-on, a többi enzimnél 37 C-on zajlott 3 órán keresztül vagy egész éjszakán át A PCR termékek elektroforetikus elválasztása A különböző méretű PCR termékek elválasztása hagyományos, alámerülő gélelektroforézis technikával történt. A PCR termékek méretétől, valamint a lehetséges allélok méretkülönbségétől függően 2,5% töménységű agaróz, 1,5% agaróz 2% 52

55 Módszerek Metaphor agaróz gél keverék vagy 4% Metaphor agaróz gél mátrixot alkalmaztunk (11. táblázat). A Metaphor agaróz rövidebb fragmentek (kb bp) elválasztására alkalmas, mint a hagyományos agaróz gél (kb bp), azonban annál jóval drágább és nehezebben kezelhető. Így a bp méretű DNS fragmentek analízisekor a két különböző agaróz keverékéből álló gélt alkalmaztuk, amely egyesíti a két gél előnyös tulajdonságait (rövid fragmentumok megbízható elválasztása és könnyű kezelhetőség). 11. táblázat. A horizontális gélelektroforézis során alkalmazott gél típusok és az elválasztás ideje Módszer Gél Elválasztás ideje -616CG- -615AG Hae III 45 perc -616CG (Sau96 I) RFLP 2% Methaphor 1,5% agaróz 40 perc SERT STin2 1 óra SERT 5-HTTLPR 2 óra DRD4 120 bp dup 1 óra DRD4 48 bp VNTR 1,5 óra -616CG ASA 1 óra -616CG (Ava II) RFLP 1 óra -521CT RFLP 1 óra -521CT ASA 1 óra 2,5% agaróz -616CG- -615AG Ava II 45 perc -616CG- -615AG Hae II 45 perc -616CG- -615AG BsiHKAI 45 perc 120 dup ~ -616CG 1,5 óra 120 dup ~ -521CT 1,5 óra DAT 3 UTR VNTR 1,5 óra COMT G1947A ASA 45 perc COMT G1947A RFLP 4% Metaphor 45 perc A futtató puffer összetétele minden esetben 10 mm Tris-acetát (ph = 8,5) és 2 mm Na 2 EDTA (TAE) volt. A PCR termékek elválasztása szobahőmérsékleten 6,6 V/cm térerő alkalmazásával történt (az elektroforézis időtartama polimorfizmusonként különbözött lásd 11. táblázat), amelyet 15 perces 1 µg/ml etidium-bromidot tartalmazó futtató pufferben történő utófestés követett. A DNS-EtBr komplexek UV fénnyel megvilágítva láthatóvá tehetők (λ em = 620 nm); a gélről a Bio-Rad Gel-Doc 1000 dokumentációs rendszer segítségével digitális fényképet készítettünk. 53

56 Módszerek 4.4 A C4A ÉS C4B GÉNEK SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA A C4 izoformák kópiaszámának meghatározására real-time PCR valamint hagyományos PCR és kapilláris elektroforézis kombinációját alkalmazó módszereket állítottunk be. Mindkét eljárás esetében mintánként három párhuzamos kísérlet alapján határoztuk meg a C4A és C4B gének számát, ami kvantitatív mérés esetében elengedhetetlen feltétel A real-time PCR körülményei A C4A és C4B gén kópiaszám real-time PCR-rel történő meghatározása 25 µl végtérfogatú reakcióelegyben zajlott, amelyek a következőket tartalmazták: kb. 5 ng genomiális DNS 1x TaqMan Universal PCR Master Mix (AmpliTaq Gold DNS Polimeráz, dntp dutp-vel, passzív referencia festék) 6 µm forward és 6 µm reverse primer (C4k1 és C4k2) (12. táblázat) 4 µm C4A vagy C4B specifikus TaqMan próba (12. táblázat) 1x RNase P Detection Mix Ez tartalmazta az RNáz P gén detektálásához szükséges primereket, valamint a FAM festékkel (ABI Cat. No ) vagy VIC festékkel (ABI Cat. No ) jelölt RNáz P specifikus Taqman próbát. A DNS amplifikáció ABI 7500 Real-Time PCR készülékben zajlott, a kezdeti 95 C 10 perces elődenaturálást 40 kétlépcsős ciklus követte: 95 C 15 másodpercig és 60 C 1 percig. A detektálás minden ciklusban a 60 C-os szakaszok alatt történt A kapilláris elektroforézis körülményei A kapilláris elektroforézis jól automatizált elektroforetikus technika, melynek a hagyományos horizontális gélelektroforézissel szemben számos előnye van. A kapilláris kis átmérője ( µm) miatt az elektromos ellenállás igen magas, ami rendkívül nagy ( V/cm-es) elektromos térerő alkalmazását teszi lehetővé, mivel az áramerősség és így a hőfejlődés alacsony marad. A nagy térerő használata rövid mérési 54

57 Módszerek időt és nagy felbontást eredményez, az on-line LIF (lézer indukált fluoreszcencia) detektálási mód pedig a rendszer érzékenységét biztosítja (148). A kapilláris elektroforetikus elválasztás egy DNS minta széles mérettartományban történő elemzésére alkalmas, ezen felül a laboratóriumunkban rendelkezésre álló P/ACE-MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) kapilláris elektroforézis készülék kétféle fluoreszcens jelölés detektálására, ezáltal a különböző festékekkel jelölt PCRtermékek megkülönböztetésére is képes. A polimeráz láncreakció körülményei megegyeznek a pontban már leírtakkal. A multiplex PCR reakcióelegy összesen 7 féle primert tartalmazott, kettő az RP1 génre specifikus, míg a maradék öt a C4 gén valamely szakaszára komplementer oligonukleotid (12. táblázat). 12. táblázat. A C4A és C4B génszámának meghatározásához használt primerek Név Szekvencia (5 3 ) 5 3 T m ( C) Real-time PCR C4k1 GCA GGA GAC ATC TAA CTG GCT TCT ,8 C4k2 CCG CAC CTG CAT GCT CCT ,7 C4A-TaqMan VIC-ACC CCT GTC CAG TGT TAG-MGB ,4 C4B-TaqMan FAM-ACC TCT CTC CAG TGA TAC-MGB ,9 Multiplex PCR kapilláris elektroforézis rp1c Cy5 TCC ATT CCT ACC CCT TCC CC ,8 rp2 CGC GGT TCT AAC AAA ACT CTC ,7 c4a1a Alexa Fluor-CCA GGA CCC CTG TCC AGT GT ,9 c4b1c Cy5-CCA GGA CCT CTC TCC AGT GA ,1 c4k2x TGA GTG CCA CAG TCT CAT CAT T ,1 c4os1a Alexa Fluor - GGG CCA CCT TTT CTC ATT AC ,8 c4os2 TCT TGG GCT CTC GAT TCA T ,4 A PCR termékeket elektrokinetikusan injektáltuk 8 kv feszültséggel 10 másodpercig, az elektroforézis 266,7 V/cm térerő alkalmazásával 20 cm elválasztási távolságon 25 C-on zajlott. A jó reprodukálhatóság biztosítása érdekében poliakrilamiddal bevont, így felszíni töltéssel nem rendelkező, 100 µm belső átmérőjű kapillárist alkalmaztunk, amelyet minden elválasztás előtt DNS ecap dsdns 1000 Kit lineáris poliakrilamid géllel töltöttünk meg. A detektálás argon lézer indukált fluoreszcencián alapult (gerjesztő fény hullámhossza: 488 nm, emissziós szűrő: 600±20 nm). 55

58 Módszerek 4.5 STATISZTIKAI MÓDSZEREK A Hardy-Weinberg egyensúly meglétét minden polimorfizmus esetében χ 2 próbával ellenőriztük. A haplotípus-frekvenciákat kétféle program segítségével számítottunk. Az EH (Estimated Haplotype) (149) genotípus adatokkal dolgozik, a munkacsoportban kifejlesztett HAPFR program azonban haplotípusadatok alapján számol. A kétféleképpen kapott haplotípus-frekvencia értékek χ 2 -próbával vethetők össze. A genetikai asszociáció-vizsgálatoknál az SPSS 11.5 statisztikai programcsomagot használtuk, amely a beteg illetve a kontroll populáció allél-, genotípus- illetve haplotípus-frekvenciáit χ 2 -próba alkalmazásával hasonlítja össze. A kérdőíves adatok genotípus-kategóriák szerinti kiértékelésénél többváltozós (MANOVA) vagy egyváltozós (ANOVA) variancia-analízist alkalmaztunk, a genotípusokat csoportosító tényezőként használva. A DRD4 48 bp VNTR genotípus-kategóriákat aszerint csoportosítottuk, hogy rendelkeznek-e hét ismétlődést tartalmazó alléllal (7+ vagy 7 ), a többi polimorfizmus esetében a három genotípus-kategóriából (a rendelkezésre álló irodalmi adatok alapján) kettőt összevontunk. A migrén genetikai hátterének kutatása esetében családanalízist is végeztünk, melynek során a beteg gyermekeknek történő esetleges preferenciális allélátadást tanulmányoztuk az ETDT (Extended Transmission Disequilibrium Test) (150) program segítségével. A várható értéktől való eltérést itt is χ 2 -próbával vizsgáltuk. 56

59 Eredmények 5 EREDMÉNYEK 5.1 GENETIKAI ASSZOCIÁCIÓ-VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI A gyermekkori migrén genetikai tényezőinek vizsgálata A gyermekkori migrén genetikai hátterének vizsgálata során kontroll csoportként a Dr. Sasvári Mária laboratóriumában rendelkezésre álló 604 fős kontroll genetikai mintából a nemi arány illesztésével 464 személy (248 férfi, 216 nő) genotípus adatait használtuk fel. Az így kialakított kontroll csoportban a férfiak és a nők aránya megegyezett a klinikai minta nemi eloszlásával (46:40). Kor szerinti illesztés nem történt, mivel a genotípusok értéke kortól független A szerotonin transzporter polimorfizmusainak vizsgálata 87 migrénes gyermek esetében határoztuk meg a szerotonin transzporter két hosszúság polimorfizmusának (5-HTTLPR és STin2) genotípusát. A kapott eredményeket a 13. és 14. táblázat foglalja össze. Az asszociáció-vizsgálat első lépéseként a teljes migrénes csoport (M) allél- és genotípus-eloszlását hasonlítottuk a nem szerint illesztett kontroll populáció (K) genotípus adataihoz. Egyik polimorfizmus esetében sem kaptunk szignifikáns eltérést ebben a felosztásban (lásd a 13. és 14. táblázat első két sorát) [I]. A komplex kórképek heterogenitása miatt gyakori, hogy a betegség hátterében álló genetikai faktorok nem magára a betegség kialakulására hajlamosítanak, hanem csak annak egy altípusára vagy specifikus csoportjára nézve jelentenek rizikótényezőt. Ezért a további analízis során a teljes migrénes csoportot alcsoportokra osztottuk. Elkülönítettük a migrén diagnózis felállításakor, valamint a genetikai asszociációvizsgálatokban is használatos migrén aura nélkül (MO) illetve migrén aurával (MA) altípusokat. A migrén jellemzői és a genetikai faktorok közötti lehetséges összefüggés feltárására felállítottunk egy új alcsoportot, a súlyos, ismétlődő hányással és hasi fájdalommal járó migrénes roham jelenléte alapján (migraine with severe vomiting and abdominal pain - MwVA). Az 5-HTTLPR genotípus vonatkozásában továbbra sem tapasztaltunk a kontroll csoporttól való szignifikáns eltérést (13. táblázat), sem a vizsgált diagnosztikus kategó- 57

60 Eredmények riák (migrén aura nélkül, MO; illetve migrén aurával, MA), sem az új endofenotípus (súlyos hányással és hasi fájdalommal kísért migrén, MwVA) tekintetében. 13. táblázat. Az 5-HTTLPR polimorfizmus allél- és genotípus-eloszlása [I] A fenotípus csoportok rövidítése: K: kontroll; M: a teljes migrénes populáció, MO: migrén aura nélkül; MA: migrén aurával; MwVA: súlyos hányással és hasi fájdalommal kísért migrén. A genotípusok (14,14; 14,16; 16,16) és allélok (14 és 16) a szerotonin transzporter HTTLPR polimorfizmusának ismétlődési számát jelölik. 5-HTTLPR Genotípus-frekvencia (%) Allél-frekvencia (%) N 14,14 14,16 16, K ,6 44,4 36,0 41,8 58,2 M 87 16,1 44,8 39,1 38,5 61,5 MO 49 14,3 49,0 36,7 38,8 61,2 MA 38 18,4 39,5 42,1 38,2 61,8 MwVA 41 17,0 41,5 41,5 37,8 62,2 A STin2 allél- és genotípus-eloszlását az 14. táblázat mutatja. Látható, hogy a leggyakoribb 10, illetve 12 ismétlődést tartalmazó allélokon kívül megjelenik egy 9 ismétlődési számú forma is. Ez az allél meglehetősen alacsony frekvenciával (1,4-1,7%) fordul elő mind a kontroll, mind a beteg populációban, így feltételezhető, hogy nem játszik fontos szerepet a migrén kialakulásában. Ezért ezt a ritka allélt, valamint az ezt tartalmazó genotípusokat (amelyeket a táblázat Egyéb oszlopa foglalja magába) kizártuk az asszociáció-analízisből. Egy nemrégiben megjelent tanulmány (151) eredményei szerint a 10-es allél domináns hatású, így az asszociáció-vizsgálat során a genotípusokat a 10 ismétlődést tartalmazó allél jelenléte (10+) vagy hiánya (12,12) alapján is vizsgáltuk. A teljes migrénes csoporthoz hasonlóan az aura nélküli migrénesek esetében (MO) sem tért el a STin2 allél- és genotípus-eloszlása a kontrollétól, míg az aurás migrén (MA) esetében a 12,12 genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő (χ 2 =4,235; df=1; p=0,0396). Hasonló különbséget mutatott az allélok eloszlása is, a 12 ismétlődést tartalmazó allél frekvenciája az aurás migréneseknél magasabb volt, mint a kontroll csoportban, azonban ez az eltérés csak tendenciaszintű (χ 2 =3,528; df=1; p=0,0604). Az új fenotípus (MwVA) kategóriában a három genotípus megoszlása szignifikánsan különbözött a kontroll csoporttól (χ 2 =7,414; df=2; p=0,0246). Így sikerült egy genetikai faktort azonosítani az ismétlődő hányással és hasi fájdalommal kísért migrén 58

61 Eredmények hátterében, azaz létrehoztunk egy genetikailag meghatározott, a migrén lefolyására jellemző, új endofenotípus kategóriát (MwVA). A csoportosított genotípus-kategóriák elemzése megerősítette a fenti eredményeket. A 10-es allélt tartalmazó formák előfordulása ritkább, míg a 12,12-es genotípus frekvenciája magasabb az új endofenotípus kategóriában a kontrollhoz képest (χ 2 =7,322; df=1; p=0,0068). Az allélok megoszlásának vizsgálata is hasonló eredményt adott, a 12 ismétlődést tartalmazó allél gyakorisága 62%-ról (kontroll) 74,4%-ra (MwVA) emelkedett (χ 2 =4,934; df=1; p=0,0263). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a súlyos hányással és hasi fájdalommal kísért gyermekkori migrén kialakulásának esélye 2,43-szoros a STin2 12,12 genotípussal rendelkező személyek esetében, míg 1,8-szoros a 12-es allélt hordozók körében. 14. táblázat. A STin2 polimorfizmus genotípus- és allél-eloszlása [I] A fenotípus csoportok rövidítését lásd az 13. táblázatnál. A genotípus- és allél-kategóriák a szerotonin transzporter STin2 polimorfizmusának ismétlődési számára utalnak. A: Az Egyéb kategória a ritka 9,10-es és 9,12-es genotípust tartalmazza. B: A 10+ megnevezés a 10-es allélt tartalmazó, azaz a 10,10 és a 10,12 genotípusok összevont csoportját jelöli. STin2 Genotípus-frekvencia (%) Allélfrekvencia (%) N 10,10 10,12 12,12 Egyéb A 10+ B 12, K ,7 47,4 37,1 2,8 60,1 37,1 1,4 36,6 62,0 M 87 9,2 43,7 43,7 3,4 52,9 43,7 1,7 31,6 66,7 MO 49 10,2 51,0 36,7 2,0 61,2 36,7 1,0 36,7 62,2 MA 38 7,9 34,2 52,6 5,3 42,1 52,6 2 2,6 25,0 72,4 4 MwVA 41 9,8 29,3 58,5 1 2,4 39,1 58,5 3 1,2 24,4 74,4 5 A kontroll és a klinikai minta eltérésének szignifikancia szintjei (p) és a kockázati arány (odds ratio, OR): 1 χ 2 =7,414 df=2 p=0, χ 2 =4,235 df=1 p=0,0396 OR=2,028 3 χ 2 =7,322 df=1 p=0,0068 OR=2,433 4 χ 2 =3,528 df=1 p=0, χ 2 =4,934 df=1 p=0,0263 OR=1, A dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A gyermekkori migrén genetikai tényezőinek kutatása során megvizsgáltuk a dopamin rendszer legfontosabb kandidáns génjeinek polimorfizmusait is. Meghatároztuk a D4-es dopamin receptor 48 bp, illetve a dopamin transzporter 3 UTR hosszúság polimorfizmusok és a COMT G1947A egypontos polimorfizmus (SNP) genotípusát 59

62 Eredmények migrénes gyermekek valamint szüleik körében. A COMT enzim polimorfizmusának genotípus eloszlása a kontroll populációban nemi különbséget mutatott (χ 2 =7,862; df=2; p=0,02), így a migrénes fiúk és lányok genotípus eloszlását a nemek szerint bontott kontroll populációhoz hasonlítva is elemeztük [V]. Az iskolába kerüléssel számos újonnan megjelenő provokáló faktor fokozza a migrénes roham megjelenésének valószínűségét, így feltételeztük, hogy a hat éves kor előtt kezdődő betegség hátterében álló genetikai tényezők könnyebben definiálhatóak. A betegség kezdete szerint elkülönített 6 év alatti korosztály COMT allél- (χ 2 =6,482; df=1; p=0,0391) illetve genotípus-eloszlása (χ 2 =7,323; df=2; p=0,0257) szignifikánsan eltért a 6 évnél idősebb korban kezdődő migrénes populáció adataitól, így ezt a fenotípus kategóriát is felhasználtuk a további eset-kontroll és családvizsgálatokban. DRD4 48 bp VNTR A 15. táblázatban a DRD4 48 bp VNTR gyakoribb genotípusainak előfordulását tüntettük fel, a 3%-nál ritkább változatokat az Egyéb kategória tartalmazza. 15. táblázat. A D4-es dopamin receptor 48 bp hosszúság polimorfizmusának genotípuseloszlása a kontroll és a migrénes populációban [V] A fenotípus csoportok rövidítése: K: kontroll; M: a teljes migrénes populáció, MO: migrén aura nélkül; MA: migrén aurával; ME: hat éves kor előtt kezdődő migrén; ML: hat éves kor után kezdődő migrén. A genotípusok kategóriák neve a DRD4 III. exon 48 bp VNTR polimorfizmusának ismétlődési számát jelölik. Az Egyéb kategória a 3%-nál ritkább genotípusokat tartalmazza, a kontroll csoport esetében: 2,2 (N=1), 2,3 (N=1), 2,5 (N=1), 2,8 (N=2), 3,7 (N=10), 4,5 (N=7), 4,6 (N=3), 4,8 (N=10), 5,7 (N=1); a teljes migrénes populációban: 2,2 (N=1), 2,3 (N=2), 4,5 (N=1), 4,8 (N=1), 4,9 (N=1), 7,8 (N=1). Genotípus-frekvencia (%) N 2,4 2,7 3,4 4,4 4,7 7,7 Egyéb K ,1 3,5 4,3 42,2 26,5 3,7 7,7 M 87 16,1 1,1 3,4 43,7 25,3 2,3 8,1 MO 49 12,2 2,0 2,0 51,0 22,4 4,1 6,3 MA 38 21,1 0,0 5,3 34,2 28,9 0,0 10,5 ME 23 26,1 0,0 4,3 39,1 21,7 0,0 8,8 ML 64 12,5 1,6 3,1 45,3 26,6 3,1 7,8 K férfiak ,5 4,0 4,8 39,1 27,8 5,7 6,1 M férfiak 46 15,2 0,0 2,2 43,5 28,3 4,3 6,5 K nők ,6 2,8 3,7 45,8 25,0 1,4 9,7 M nők 41 17,1 2,4 4,9 43,9 22,0 0,0 9,7 60

63 Eredmények Mivel a 48 bp hosszúság polimorfizmusnak számos allél- és genotípus-változata fordul elő a populációban, a genetikai analízisek során rendszerint valamilyen elv szerinti csoportosítva vizsgálják az allélok, illetve genotípusok eloszlását. A legelterjedtebb módszer a 7 ismétlődést tartalmazó allél jelenléte szerinti felosztás (152), míg egy másik, korábban már migrénesek körében is vizsgált csoportosítás (153) a 4,4 homozigóták szembeállítása az összes többi genotípussal. Az általunk vizsgált 87 migrénes beteg, valamint alcsoportjaik DRD4 gén 48 bp polimorfizmusának allél- és genotípus-eloszlása egyik csoportosítás szerint sem tért el a kontroll populációétól. DAT 3 UTR VNTR A dopamin transzporter 3 UTR régió hosszúság polimorfizmusának allé-l és genotípus-frekvenciáit az 16. táblázat mutatja. Ebben az esetben is csak a leggyakoribb allél- és genotípus-kategóriák adatai vannak feltüntetve, a táblázat Egyéb oszlopai tartalmazzák a ritkább változatokat, amelyeket alacsony frekvenciájuk miatt kizártunk a statisztikai elemzésből. 16. táblázat. A dopamin transzporter 3 UTR hosszúság polimorfizmusának allél- és genotípus-eloszlása a kontroll és a beteg populációkban [V] A fenotípus csoportok rövidítése: lásd 15. táblázat. A genotípus- és allél-kategóriák a dopamin transzporter 3 UTR VNTR polimorfizmusának ismétlődési számára utalnak. Az Egyéb kategória tartalmazza a ritka allélokat és genotípusokat, ezek a kontrollban: 3,9 (N=1); 7,9 (N=1); 8,9 (N=1); 6,10 (N=2); 8,10 (N=2); 9,15 (N=1); 10,11 (N=4); 10,13 (N=1); 10,14 (N=1); és a klinikai mintában: 10,11 (N=1). Genotípus-frekvencia (%) Allélfrekvencia (%) N 9,9 9,10 10,10 Egyéb 9 10 Egyéb K 464 7,8 37,3 52,0 2,9 26,8 71,7 1,5 M 87 5,7 34,5 58,6 1,2 23,0 76,4 0,6 MO 49 4,1 36,7 59,2 0,0 22,4 77,6 0,0 MA 38 7,9 31,6 57,9 2,6 23,7 75,0 1,3 ME 23 0,0 26,1 73,9 0,0 13,0 87,0 1 0,0 ML 64 7,8 37,5 53,1 1,6 26,6 72,6 0,8 K férfiak 248 9,7 34,3 53,6 2,4 27,2 71,6 1,2 M férfiak 46 6,5 32,6 58,7 2,2 22,8 76,1 1,1 K nők 216 5,5 40,7 50,0 3,8 26,4 71,8 1,8 M nők 41 4,9 36,6 58,5 0,0 23,2 76,8 0,0 A kontroll és a klinikai minta eltérésének szignifikancia szintje (p): 1 χ 2 =6,800 df=1 p=0,033 (9 vs. 10 allél) 61

64 Eredmények A klinikai minta allél- és genotípus-eloszlását a megfelelő kontrollhoz hasonlítva nem kaptunk eltérést sem a teljes migrénes, sem a diagnosztikai kategóriák szerint osztott populációban, valamint a nemek között sem mutatkozott szignifikáns különbség. Hat év alatti betegségkezdet esetén (ME) a 10 ismétlődést tartalmazó allél feldúsulását tapasztaltuk (χ 2 =6,800; df=1; p=0,033; OR=2,496) a kontroll populáció alléleloszlásához hasonlítva. Ez a fenotípus kategória mindössze 23 embert tartalmaz, így a családokon belüli allélátadás vizsgálatával próbáltuk megerősíteni az asszociáció-analízis eredményét. A TDT teszt nem mutatott szignifikáns különbséget, a heterozigóta szülők 11 esetben adták át a 10-es allélt az érintett utódnak, míg 5 esetben nem adták át (p=0,134). COMT G1947A SNP A katekol-o-metiltranszferáz enzim 108/158 kodonjában található G1947A egypontos polimorfizmus allél- és genotípus-adatai az 17. táblázatban szerepelnek. A teljes migrénes csoport genotípus eloszlása szignifikánsan eltért a kontrollétól (χ 2 =5,786; df=1; p=0,055), az allélfrekvenciában azonban nem volt különbség. Amikor az eset és kontroll populációk adatait nem szerint bontva hasonlítottuk össze, csak a migrénes nők esetében kaptunk eltérést (χ 2 =8,108; df=2; p=0,017), az AA homozigóta genotípus jelentősen lecsökkent (AA vs. AG+GG: χ 2 =8,589; df=1; p=0,0136) a női kontrollhoz képest. Ez alapján a guanint tartalmazó alléllal rendelkező nők közel 3,5-szer (OR=3,486) nagyobb eséllyel szenvednek migrénes fejfájástól, mint az AA genotípusúak. A diagnosztikus kategóriák szerint elkülönített altípusok allél- és genotípusfrekvenciái megfeleltek a kontroll populáció eloszlásának. A diagnosztikus kategóriákat egymáshoz hasonlítva azonban megfigyelhető egy érdekes, bár statisztikailag nem szignifikáns eltérés, az aura nélküli migrénes csoportban a GG, míg aura jelenléte esetén az AA genotípus frekvenciája alacsonyabb a kontrollénál. A hat év alatti betegségkezdet szerint elkülönített migrénes gyerekek (ME) genotípus-eloszlása eltért a kontrollétól (χ 2 =7,983; df=2; p=0,018), amit a GG genotípus teljes hiánya magyaráz (AA+AG vs. GG: χ 2 =9,484; df=1; p=0,0087). Eredményeink szerint az adenint tartalmazó genotípussal rendelkező gyermekek esetében a migrén kialakulásának esélye közel 7-szer nagyobb (OR=6,978), mint a GG genotípusúak köré- 62

65 Eredmények ben. Az allélátadás vizsgálata megerősítette az A allél lehetséges szerepét ebben az alcsoportban, mivel a heterozigóta szülők 14 esetben átadták, míg csupán 5 esetben nem adták át az érintett utódoknak az adenint tartalmazó allélt (p=0,039). 17. táblázat. A COMT G1947A SNP allél- és genotípus-eloszlása a kontroll és a beteg populációkban [V] A fenotípus csoportok rövidítése: lásd 15. táblázat. Az A és G betűk az adenint illetve a guanint tartalmazó allélokat jelölik. Genotípus-frekvencia (%) Allélfrekvencia (%) N AA AG GG A G K ,4 49,3 23,3 52,0 48,0 M 86 18,4 63,2 18,4 1 50,0 50,0 MO 49 22,4 63,3 14,3 54,1 45,9 MA 38 13,2 63,2 23,7 44,7 55,3 ME 23 26,1 73,9 0,0 2 63,0 37,0 ML 64 15,6 59,4 25,0 45,3 54,7 K férfiak ,0 52,8 18,2 55,4 44,6 M férfiak 46 26,1 56,5 17,4 54,3 45,7 K nők ,5 45,4 29,1 48,1 51,9 M nők 41 9,8 70,7 19,5 3 45,1 54,9 A kontroll és a klinikai minta eltérésének szignifikancia szintjei (p): 1 χ 2 = 5,786 df=2 p=0,055 2 χ 2 = 7,983 df=2 p=0,018 3 χ 2 = 8,108 df=2 p=0, A drogfüggőség genetikai tényezőinek vizsgálata A drogfüggőség hátterében álló genetikai faktorok vizsgálata során 300 heroinfüggő személy valamint egy nemi megoszlás szerint illesztett 372 fős kontroll populáció allél és genotípus adatait hasonlítottuk össze kilenc polimorfizmus esetében A szerotonin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A 300 kábítószerfüggő személy esetében meghatároztuk a szerotonin transzporter két hosszúság polimorfizmusának (5-HTTLPR és STin2) genotípusát, majd az asszociáció-analízis során ezen polimorfizmusok allél- és genotípus-eloszlását hasonlítottuk a kontroll populáció hasonló adataihoz. Egyik polimorfizmus esetében sem kaptunk szignifikáns eltérést az allél- és genotípus-kategóriák, valamint ezek teoretikus alapú csoportosítása esetén sem (18. táblázat). 63

66 Eredmények 18. táblázat. A szerotonin és a dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata heroinfüggők körében Az allél-kategóriák a hosszúság polimorfizmusok ismétlődési számára utalnak, míg a COMT G1947A SNP esetében az A az adenint, a G a guanint tartalmazó allélt jelöli. Gén Polimorfizmus Allél kontroll N=372 SERT DRD4 DAT COMT 5-HTTLPR STin2 120 dup -616GC -615AG -521CT 48 bp VNTR 3 UTR VNTR G1947A SNP Allélfrekvencia (%) Heroinfüggők N= ,3 43,0 15 0,0 0, ,7 56,8 9 1,7 1, ,2 34, ,9 63,5 1 17,1 16,7 2 82,9 83,2 3 0,0 0,1 C 51,7 52,4 G 48,3 47,6 A 88,5 85,9 G 11,5 14,1 C 45,3 43,2 T 54,7 56,8 2 8,6 8,4 3 3,2 3,2 4 64,4 68,1 5 0,8 0,5 6 0,5 0,2 7 21,4 18,9 8 1,1 0,5 9 0,0 0,3 6 0,1 0,2 7 0,1 0,2 8 0,3 0,3 9 28,2 24, ,2 74,2 11 0,7 1,0 13 0,1 0,0 14 0,1 0,0 15 0,1 0,0 A 53,5 50,3 G 46,5 49,7 Szignifikancia p=0,430 p=0,837 p=0,529 p=0,825 p=0,156 p=0,435 p=0,408 p=0,674 p=0,251 64

67 Eredmények A dopamin rendszer polimorfizmusainak vizsgálata A kábítószerfüggőség dopaminerg tényezőinek kutatása során a dopamin rendszer három kandidáns génjének polimorfizmusait vizsgáltuk. Meghatároztuk a dopamin transzporter 3 UTR VNTR, a COMT G1947A SNP valamint a D4-es dopamin receptor esetében 5 polimorfizmus (120 bp duplikáció, -521CT, -615AG, -616CG és 48 bp VNTR) genotípusát. A DRD4 gén promoter polimorfizmusainak relatív kromoszomális elhelyezkedését direkt haplotipizáló módszerek segítségével állapítottuk meg. A heroinfüggő populáció allél-, genotípus- valamint haplotípus-eloszlása egyik vizsgált gén esetében sem tért el szignifikánsan a kontroll populáció hasonló értékeitől (18. és 19. táblázat). 19. táblázat. A dopamin rendszer négy polimorfizmusának haplotípus-frekvenciái és aszszociáció-analízise heroinfüggők körében Az haplotípus-kategóriák a 120 bp dup, a -616CG, a -615AG és a -521CT polimorfizmusok kromoszomális elrendezését jelölik. Gén Haplotípus kontroll N=372 DRD4 120 dup -616CG -615AG -521CT Haplotípus-frekvencia (%) Heroinfüggők N=300 1CAC 3,5 3,6 1CAT 4,3 6,6 1CGC 0,1 0,0 1GAC 3,5 2,4 1GAT 4,3 2,8 1GGC 0,8 0,3 1GGT 0,3 0,3 2CAC 16,1 14,5 2CAT 27,8 28,3 2CGC 0,0 0,2 2CGT 0,0 0,2 2GAC 14,1 12,2 2GAT 14,8 15,3 2GGC 7,0 9,8 2GGT 3,3 3,3 3GAT 0,0 0,2 Szignifikancia p=0,323 65

68 Eredmények A gyermekkori ADHD lehetséges hajlamosító szerepének vizsgálata Mivel a klasszikus eset-kontroll asszociáció-analízis esetén nem kaptunk szignifikáns hatást egyik vizsgált polimorfizmus esetén sem, így a meglehetősen heterogén kábítószerfüggő populáción belül megpróbáltunk standardizált mérőmódszerrel definiálható csoportokat kialakítani. Ezen kategóriák hátterében álló genetikai tényezők feltehetően kevésbé összetettek, mint a teljes heroinfüggő populáció esetében, ami megkönnyíti a hajlamosító faktorok azonosítását [IV]. A kábítószerfüggők körében a figyelemhiányos hiperaktivitási zavar (ADHD) lehetséges szerepének vizsgálatába 121 nem rokon heroinfüggő személyt vontunk be, kontrollként a korábban alkalmazottnál kisebb, korban és nemi arányában illesztett mintát használtunk. Erre azért volt szükség, mert mind az ADHD előfordulásának nemek közötti eltérése miatt (fiú: lány arány kb. 3:1), mind az önbeszámolós kérdőív jellegéből adódóan erős nemi hatás volt várható. Mivel a retrospektív kérdőív kitöltésénél az életkor is kritikus kérdés lehet, kor szerint szintén illesztettük a klinikai és egészséges csoportokat. A heroinfüggő populáció esetleges ADHD-s múltjának elemzésére az ADHD gyermekkori diagnózisánál használt ADHD Rating Scale (ADHD-RS) szülői beszámolón alapuló kérdőívét adaptáltuk. Így létrehoztunk egy visszaemlékezésen alapuló pontozási rendszert, mely 9-9 db 0-3-ig pontozható kérdés segítségével méri fel az esetleges gyermekkori hiperaktivitás (például: Elhagyta a helyét az osztályban, vagy más helyzetekben, amikor ülve kellett volna maradnia. ) és figyelemhiány (például: Nem figyelt akkor sem, amikor közvetlenül önhöz beszéltek. ) tünetek jelenlétét. A kérdőív megbízhatóságát és érvényességét mindkét populációnál megvizsgáltuk (20. táblázat). A belső konzisztencia mutatójaként mindkét alskála esetében a Cronbach alfa értékét használtuk, mely a figyelemhiány esetében 0,83, a hiperaktivitás alskálánál pedig 0,85 (megfelelő) volt. Ezek alapján a kérdőív a vizsgált kérdés eldöntésére felhasználható. 66

69 Eredmények 20. táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív validitás vizsgálatának statisztikai adatai [IV] FIGYELEMHIÁNY SKÁLA (Esetek száma: 206, itemek száma = 9) Megbízhatósági mutató: Cronbach Alfa = 0, tétel: Nem figyelt megfelelően a részletekre, vagy figyelmetlenségből hibákat vétett az iskolai munkájában. Item maradék korreláció Cronbach Alfa az adott tétel nélkül 0,59 0,82 3. tétel: Nehezen tudott koncentrálni a feladatra, vagy a játékra. 0,55 0,82 5. tétel: Nem figyelt akkor sem, amikor közvetlenül önhöz beszéltek. 0,42 0,83 7. tétel: Nem követte az utasításokat, és a feladatokat nem fejezte be. 0,58 0,82 9. tétel: Nehézségei voltak a feladatok és a tevékenységek megszervezésében. 11. tétel: Elkerülte azokat a feladatokat (pl. iskolában vagy otthon), amelyek tartós szellemi erőfeszítést igényeltek volna. 13. tétel: Elvesztette a feladatokhoz, vagy elfoglaltságokhoz szükséges dolgokat. 0,50 0,83 0,55 0,82 0,55 0, tétel: Figyelme könnyen elvonható volt. 0,63 0, tétel: Feledékeny volt a mindennapi tevékenységei során. 0,57 0,82 HIPERAKTIVITÁS SKÁLA (Esetek száma: 206, itemek száma = 9) Megbízhatósági mutató: Cronbach Alfa =0, tétel: Izgett-mozgott, kezével matatott, lábát váltogatta, fészkelődött a széken. 4. tétel: Elhagyta a helyét az osztályban, vagy más helyzetekben, amikor ülve kellett volna maradnia. 6. tétel: Rohangált, ugrált vagy mászott olyan helyzetekben, amikor az nem való. 8. tétel: Nem tudott csendben játszani, vagy más szabadidős tevékenységben csendben részt venni. 10. tétel: Állandóan ''mehetnékje'' volt, olyan volt, mint akit ''felhúztak''. Item maradék korreláció Cronbach Alfa az adott tétel nélkül 0,51 0,85 0,61 0,84 0,59 0,85 0,65 0,84 0,64 0, tétel: Szertelenül beszélt. 0,54 0, tétel: Rávágta a választ, mielőtt a kérdést befejezték volna. 0,52 0, tétel: Nem tudott várni a sorára. 0,63 0, tétel: Félbeszakított vagy zavart másokat. 0,62 0,84 A retrospektív kérdőív eredményei alapján a heroinfüggő populáció átlagos ADHD-RS skálaértéke 6 ponttal magasabb, mint a korban és nemben illesztett minta 67

70 Eredmények hasonló értékei. Ez a különbség kétmintás t-próbával tesztelve szignifikáns (p<0,0001). Az ADHD retrospektív kérdőív skáláit egyenként elemezve azt tapasztaltuk, hogy a kábítószerfüggő személyek mindkét skálán, a retrospektíven megjelölt gyermekkori hiperaktivitásban és figyelmi képességekben is szignifikánsan különböznek. A skálák átlagos csoportértékeit a 21. táblázat mutatja be, a klinikai és az egészséges minta átlagos pontszáma közötti különbség valamennyi esetben statisztikailag szignifikáns (p<0,001). 21. táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív adatainak statisztikai elemzése [IV] N Átlagos pontszám Szórás Standard hiba átlaga Figyelemhiány Heroinfüggő 121 8,9504 4, ,42863 kontroll 85 5,5412 3, ,38696 Hiperaktivitás Heroinfüggő 121 8,4711 5, ,49586 kontroll 85 5,9529 4, ,47128 ADHD-RS Heroinfüggő ,4215 9, ,83680 összpontszám kontroll 85 11,4941 6, ,74051 Az ADHD-RS retrospektív kérdőív összpontszámában jól kimutatható egy nemi főhatás (7. ábra). Eredményeink alapján a férfiak szignifikánsan nagyobb mértékben emlékeznek vissza gyermekkori ADHD tünetekre (mind a figyelemhiány, mind a hiperaktivitás tekintetében) a kontroll és a heroinfüggő populációban egyaránt. A nemek különbözősége azonban mindkét ADHD skálán, a vizsgált populációtól függetlenül kimutatható. Az újonnan validált retrospektív ADHD kérdőív olyan standardizált objektív módszer, amelyen a kábítószerfüggők szignifikánsan magasabb pontszámot érnek el, így a kérdőív alkalmas lehet a függőség egy lehetséges endofenotípusának megkülönböztetésére. 68

71 Eredmények 20 ADHD-RS retrospektív kérdőív ÖSSZÉRTÉK ADHD-RS retrospektív kérdőív Figyelemhiány skála ADHD-RS retrospektív kérdőív Hiperaktivitás skála Átlagos pontszám ffi nő Átlagos pontszám ffi nő Átlagos pontszám ffi nő kontroll heroinfüggő kontroll heroinfüggő kontroll heroinfüggő 7. ábra. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív összértékének valamint a figyelemhiány és a hiperaktivitás skáláinak átlagos pontszáma nemek szerint a kontroll és a heroinfüggő populációban [IV] A továbbiakban a szerotonin és dopamin rendszer általunk tanulmányozott polimorfizmusainak eloszlását vizsgáltuk a gyermekkori figyelemhiány és hiperaktivitás tünetek megjelenése szempontjából. A kérdőíves adatok kiértékelésénél egyváltozós (ANOVA) variancia-analízist használtunk, a genotípusokat csoportosító tényezőként alkalmazva. 22. táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív eredményei a -615AG SNP genotípusa szerint csoportosítva G : G allélt nem tartalmazó genotípusok; G +: G allélt tartalmazó genotípusok -615AG Átlag pontszám Szórás Esetszám Szignifikancia Figyelemhiány G 7,9470 4, G + 10,0217 4, Hiperaktivitás G 8,1591 5, G + 10,1087 6, ADHD-RS G 16,1061 8, összpontszám G + 20,1304 9, p=0,009 p=0,041 p=0,011 A vizsgálatba 182, korábban már genotipizált kábítószerfüggő személyt vontunk be. A DRD4 gén promoter régiójában található -615AG egypontos polimorfizmus valamint a kódoló régióban található 48 bp VNTR esetében a genotípus-csoportok és az ADHD-RS kérdőíven elért pontszám között szignifikáns összefüggést találtunk. Azok a 69

72 Eredmények személyek, akik rendelkeznek a -615G alléllal több gyermekkori figyelemhiány és hiperaktivitás tünetről számoltak be, így az alskálákon és az összesített ADHD pontszámban is magasabb értéket értek el, mint az AA genotípusú egyének (22. táblázat). A 48 bp VNTR hatásának elemzése során a genotípusokat a 7 ismétlődést tartalmazó forma jelenléte szerint csoportosítottuk. A 7-es allélt hordozó kábítószerfüggők körében fokozottabbnak tűnik a gyermekkori hiperaktivitás tünetek jelenléte, mint a többi genotípusú személy esetében, azonban ez az összefüggés statisztikai szempontból csak tendencia jellegű (p=0,051) (23. táblázat). 23. táblázat. Az ADHD-RS retrospektív kérdőív eredményei a 48 bp VNTR genotípusa szerint csoportosítva 7 : 7-es allélt nem tartalmazó genotípusok; 7 +: 7x allélt tartalmazó genotípusok 48 bp VNTR Átlag pontszám Szórás Esetszám Szignifikancia Figyelemhiány 7 8,4839 4, ,6379 5, Hiperaktivitás 7 8,1452 5, ,8621 6, ADHD-RS 7 16,6290 8, összpontszám , , p=0,835 p=0,051 p=0,202 A továbbiakban a két polimorfizmus együttes hatását kétszempontos (független szempontok szerinti) varianciaanalízissel (ANOVA) vizsgáltuk. Eredményeink szerint a figyelemhiány skála esetében a -615AG polimorfizmusra van szignifikáns főhatás F=4,29 (p=0,04), míg a 48 bp VNTR esetében nincsen főhatás F=0,579 (p=0,448). A két genotípus interakciója tendenciózus (F=3,05; p=0,083), vagyis a -615G allél hatása kifejezettebbnek látszik a 7 ismétlődést hordozó variáns hiányában, míg a hetes allél jelenlétében a guanint tartalmazó allél alig változtat az elért pontszámon. 70

73 Eredmények Átlagos figyelemhiány pontszám 11,00 10,00 9,00 8,00 G bp VNTR 48 bp VNTR AG G + Átlagos hiperaktivitás pontszám 12,00 11,00 10,00 9,00 8,00 G 7-615AG 8. ábra. A DRD4 gén -615AG és 48 bp VNTR polimorfizmusainak együttes hatása az ADHD-RS retrospektív kérdőív figyelemhiány és hiperaktivitás skálák esetében G + Ettől eltérő hatást mutat a hiperaktivitás skála vizsgálata, ebben az esetben a két polimorfizmus hatása additív jellegűnek tűnik és nem mutatható ki közöttük interakció. Mindkét kiemelt allél jelenléte növeli az elért pontszámot, így a legtöbb gyermekkori hiperaktivitási tünetről azok számolnak be, akik mind a -615G, mind a 7x 48 bp VNTR variánssal rendelkeznek (24. táblázat és 8. ábra). 24. táblázat. A DRD4 gén -615AG és 48 bp VNTR polimorfizmusok hatásának elemzése az ADHD-RS retrospektív kérdőív figyelemhiány és hiperaktivitás skálák tekintetében Átlag pontszám Figyelemhiány Hiperaktivitás ADHD-RS összpontszám -615 AG G G + G G + G G + 48 bp VNTR Szórás N Vizsgált változó F Szignifikancia 7 7,7097 4, AG 4,290 p=0, ,5128 5, bp VNTR 0,579 p=0, ,8214 4, ,7778 4, AG & 48 bp VNTR 3,050 p=0, ,7849 4, AG 3,970 p=0, ,0513 5, bp VNTR 3,608 p=0, ,1429 6, ,6111 4, AG & 48 bp VNTR 0,374 p=0, ,4946 8, AG 4,997 p=0, , , bp VNTR 0,584 p=0, ,9643 9, , , AG & 48 bp VNTR 0,254 p=0,615 71

74 Eredmények 5.2 ÚJ MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA A C4A ÉS C4B GÉNSZÁM MEGHATÁROZÁSÁRA A C4A és C4B gének vizsgálatára két új módszert dolgoztunk ki, amelyek a korábbiaknál egyszerűbben és szélesebb körben alkalmazhatók génszám-meghatározásra A C4 gének vizsgálata real-time PCR alkalmazásával A C4A és C4B génszám pontos meghatározására real-time PCR-en alapuló módszert fejlesztettünk ki, ami egyesíti a TaqMan rendszerrel történő SNP genotipizálás valamint a kvantitatív mérés alapelveit [II]. A TaqMan rendszerű SNP genotipizálás során a polimorf allélok megkülönböztetésére szekvencia specifikus jelölt próbákat alkalmaznak. Maga a TaqMan próba a primereknél rendszerint hosszabb oligonukleotid, melynek 5 végére a különböző alléloknak megfelelően eltérő színű fluoreszcens festéket, 3 végére pedig egy ún. csillapító (quencher) molekulát kötnek. Megvilágítás hatására a fluoreszcens festék gerjesztődik, de intakt próba esetén az így keletkező többletenergiát a közeli quencher elnyeli, így a készülék nem detektál fluoreszcens jelet. A polimeráz láncreakció során viszont az 5 nukleáz aktivitású DNS polimeráz elhasítja a megfelelő allélhoz betapadó próbát, ezáltal a festék eltávolodik a quenchertől és így az adott allélnak megfelelő jel intenzitása megnő. A real-time PCR-rel történő kvantitatív mérés elvi alapja, hogy a PCR kezdeti, exponenciális szakaszában a keletkező PCR termék mennyisége arányos a kiindulási DNS koncentrációval. A későbbiekben a reakció egyre kisebb hatásfokkal megy végbe, míg végül eléri a végső, ún. plató fázist. A PCR termék mennyiségének növekedésével arányosan nő az emittált fény intenzitása, így folyamatos detektálással nyomon követhető a reakció dinamikája. A kezdeti DNS koncentráció meghatározására egy olyan fluoreszcencia értéket választunk, amelyet minden reakció az exponenciális fázisban ér el. Így minden mintához hozzárendelhető egy küszöb-ciklusszám (C T ), melynek segítségével meghatározható a kiindulási DNS-templát abszolút vagy relatív mennyisége. A C4A és C4B génszám meghatározásához a TaqMan próbákat úgy terveztük meg, hogy azok a két izotípust (C4A és C4B) megkülönböztető 5 SNP-ből négyre illeszkedjenek, ami a hagyományos próbáknál nagyobb specificitást eredményez (9. áb- 72

75 Eredmények ra). Az abszolút C4 mennyiség meghatározáshoz referencia génként az Applied Biosystem (ABI) RNáz P gén specifikus TaqMan rendszerét használtuk GAGAAACTGC AGGAGACATC TAACTGGCTT CTGTCCCAGC AGCAGGCTGA CGGCTCGTTC CAGGACCTCT CTCCAGTGAT FAM ACATAGGAGC ATGCAGGTGC GGGCATGCTG MGB 9. ábra. A C4A és B génszám meghatározásra tervezett primerek és próbák pozíciója [II] Az ábra a C4B gén egy rövid szekvenciáját mutatja [GenBank: U24578], ahol a sötét hátterű betűk jelölik azt az öt nukleotidot, amelyek a C4A génben különböznek. A primerek pozícióját nyilak, a próba helyét az aláhúzott betűk jelölik. Az ábra a FAM-mal jelölt C4B specifikus próbát ábrázolja, a gének megkülönböztetésére a C4A specifikus próbát VIC fluoreszcens festékkel jelöltük. MGB: non-fluoreszcens minor-groove-binding quencher A módszer beállítása során a C4A és C4B géndózis meghatározása külön reakcióelegyben történt. A próbákat különböző színnel jelöltük, ezért a gének relatív menynyisége - szükség esetén - egy reakcióelegyben is meghatározható. Az első reakcióelegy a VIC festékkel jelölt C4A specifikus próbát (C4A (VIC)), valamint a FAM-mal jelölt RNáz P detektáló rendszert (RNáz P (FAM)), míg a második reakcióelegy a FAM-mal jelölt C4B (C4B (FAM)) és a VIC-kel jelölt RNáz P specifikus próbákat (RNáz P (VIC)) tartalmazta. A mért adatok értékelése során automatikus alapvonal meghatározást alkalmaztunk és a küszöb-ciklusszámot a lehető legkisebb értéknél (kb. 0,04 fluoreszcencia egység) határoztuk meg. A C4A és C4B génszámot a következő egyenletek alapján számoltuk ki: n C4A = 2 C + 1 T (RF) C T (C4A) q C4A:RF n C4B 2 = C + 1 T (RV) C T (C4B) q C4B:RV A C4A és C4B gének tényleges számát az n C4A illetve az n C4B értékek kerekítésével kapjuk meg. A C T (RF), C T (RV), C T (C4A) és C T (C4B) mutatja a FAM-mal és VIC-kel jelölt referencia gének, illetve a C4A (VIC) és C4B (FAM) esetében meghatározott küszöbciklusszám értéket. A q C4A:RF és a q C4B:RV az egy csőben végbemenő reakciók hatékonyságának hányadosát jelöli. 73

76 Eredmények A hatékonysági hányadosok kiszámolása A humán genomban azonos kópiaszámban jelen lévő génekről elméletileg azonos intenzitású fluoreszcens jel képződése várható, a gyakorlatban azonban a különböző gének esetében eltérő intenzitású de állandó arányú jelet detektálunk, amit a primerek betapadásának hatékonysága, a próbák szekvenciája közötti különbség valamint a riporter festékek eltérő jellegzetességei befolyásolnak. A különböző reakciók hatékonysági hányadosának meghatározása így a módszer beállításának elengedhetetlen feltétele volt, mivel a továbbiakban ezen alapult a tényleges C4 génszám meghatározása. A hatékonysági hányadosokat 65 minta 7 független kísérletben történő vizsgálata alapján, a következő szempontok figyelembe vételével határoztuk meg: Ha a C4 reakció esetében detektálható fluoreszcens jel, akkor a C4 szám legalább egy, így megállapítható az adott reakcióra jellemző q érték felső határa (túl magas q esetén kapott n C4 érték kerekítésével nullát kapnánk). Hasonló elven meghatározható a q értékek alsó határa, mivel irodalmi adatok alapján a C4 génszám a kaukázusi populációban nem lehet 6-nál nagyobb, túl alacsony q érték esetén viszont ennél magasabb génszámot is kapnánk. A C4A és C4B gének száma csak egész szám lehet, így azon q értékek alkalmazásával kapunk valós eredményt, amelyek esetében az n C4A illetve az n C4B értékek leginkább közelítenek egy egész számhoz. A 7 kísérlet egyesítésével meghatároztuk a C4A (VIC) RNáz P (FAM) valamint a C4B (FAM) RNáz P (VIC) reakciók hatékonysági hányadosát: q C4A:RF = 0,39 ± 0,04 q C4B:RV = 0,75 ± 0, A módszer reprodukálhatóságának vizsgálata A hét bevezető kísérlet hatékonysági hányadosai, feltehetően a technikai különbségek miatt, egy kísérleten belül valamint a kísérletek között kismértékű ingadozást mutattak. A módszer megbízhatóságának és reprodukálhatóságának ellenőrzésére a hét kísérlet eredményeit a kísérletenként külön számolt ( egyéni q ) valamint a kísérletek összevonásával ( egyesített q ) kapott q értékkel is kiértékeltük. A génszám meghatározás hibáját (e) a következő egyenlettel számoltuk ki: e = n C4 int( n C4 + 0,5), 74

77 Eredmények ahol az n C4 a kísérletek alapján számolt n C4A vagy n C4B értékét jelöli, míg az int(n C4 + 0,5) az n C4A vagy n C4B kerekítésével kapott egész számot jelenti. A 65 személy egyike nem rendelkezett C4A génnel, így 129 esetben tudtuk kiszámolni az egyesített és egyéni q értékekkel kapott C4A illetve C4B génszám meghatározás hibáját. A kapott értékeket a 10. ábra A és B része mutatja. Az egyesített q értékek alkalmazásánál a géndózis az esetek 60%-ában teljesen megbízhatóan megállapítható, mivel az n C4 és a génszám különbsége kevesebb, mint 0,15. Amennyiben ez a különbség nagyobb, mint 0,3, az eredmény megbízhatósága kétséges, ez 8%-os gyakorisággal fordult elő. Az egyéni q értékkel számolva a génszám meghatározás hibája az esetek 83%-ában 0,15 alatt maradt és csak 5%-os arányban kaptunk e >0,3 értékeket. Megállapítható tehát, hogy a génszám az egyéni q értékekkel pontosabban meghatározható, a különbség azonban nem számottevő, mivel a két módszerrel számolt C4A és C4B génszám minden esetben megegyezett. +0,45 A B N = 129 N = , , , ,30 0, ábra. A C4 génszám meghatározás reprodukálhatóságának vizsgálata [II] A: Az egyesített q értékek alkalmazásával kapott génszám meghatározás hibája B: Az egyéni q értékek alkalmazásával kapott génszám meghatározás hibája A négyzetek nullától való távolsága mutatja, hogy a kísérletek alapján számolt génszám menynyire tér el egy egész számtól. A zöld mezőbe eső hiba érték esetén biztonságosan megállapítható a génszám (e<0,15), a sárgában levő eredmények elfogadhatóak, míg e>0,3 esetén az eredmények megbízhatósága megkérdőjelezhető. 75

78 Eredmények A kiindulási DNS mennyiség hatásának vizsgálata A kvantitatív mérés megbízhatóságának elengedhetetlen feltétele, hogy a módszer a kezdeti DNS koncentrációtól függetlenül alkalmazható legyen. Ennek igazolására egy 6 pontból álló negyedelő hígítási sort készítettünk, amivel a 0,3-tól 300 ng-ig terjedő tartományban vizsgáltuk a különböző kiindulási DNS mennyiségek alkalmazhatóságát. Az 11. ábra a DNS koncentráció logaritmusának függvényében ábrázolja a kapott C T értékeket, az A rész a C4A (VIC) és RNáz P (FAM) (első reakcióelegy), míg a B rész a második reakcióelegy, azaz a C4B (FAM) és az RNáz P (VIC) esetén mért eredményt mutatja. A C T 3 C4A (VIC) RNase P (FAM) 2 2 y = 3,53x + 32,76 R 2 = 0,999 y = 3,53x + 34,09 R 2 = 0,999 B 1 C T log c rel C4B (FAM) RNase P (VIC) 2 2 y = 3,52x + 33,74 R 2 = 0,999 y = 3,57x + 34,34 R 2 = 0, log c rel 11. ábra. A C4A és C4B génszám meghatározás DNS koncentráció-függésének vizsgálata [II] A: Az első reakcióelegy (C4A (VIC) és RNáz P (FAM)) standard görbéi; B: A második reakcióelegy (C4B (FAM) és RNáz P (VIC)) standard görbéi. A relatív DNS koncentráció függvényében ábrázolt C T értékekre illesztett egyenes egyenlete valamint a korrelációs együttható négyzete az egyenesek mellett található. 76

79 Eredmények A C T értékekre illesztett egyenesek meredeksége a négy reakcióban közel azonos, az R 2 értéke (0,999) pedig azt bizonyítja, hogy a hat koncentráció három párhuzamos mérése minimális szórással illeszkedett az egyenesre (11. ábra). Ez alapján megállapítható, hogy a módszer 0,3-300 ng/reakcióelegy kiindulási DNS koncentráció tartományban megbízhatóan alkalmazható Az újonnan kidolgozott módszer alkalmazása A real-time PCR-rel kapott C T értékek elemzésének megkönnyítésére munkacsoportunk két programot fejlesztett ki ( Additional Material). Az MHC.EXE feldolgozza a real-time készüléken alkalmazott szoftver (Sequence Detection Software) által készített, az adott kísérlet eredményeit tartalmazó CSV kiterjesztésű file adatait. A C T értékek alapján megkeresi a legoptimálisabb q értékeket, és ezek alapján meghatározza a minták C4A és C4B génszámát. Az MHC.EXE által megfelelő formátumba hozott adatokat az MHC.XLS excel program segítségével még pontosabban elemezhetjük. Ez a szoftver az előzőhöz hasonló elven működik, azzal a különbséggel, hogy a génszám meghatározás során alkalmazott hatékonysági hányados értékek itt a felhasználó által módosíthatók, ezáltal megtalálható az adott kísérletre jellemző egyéni q érték, ami tovább növeli az eredmények megbízhatóságát. 25. táblázat. A korábban publikált (120) és az újonnan kidolgozott módszerrel meghatározott C4A és C4B géndózisok előfordulási gyakoriságának összehasonlítása *:χ 2 próba C4A gén C4B gén Génszám Real-time PCR Yang 2003 Génszám Real-time PCR Frekvencia (%) Frekvencia (%) Yang (1,7) 2 (1,6) 0 1 (0,8) 1 (0,8) 1 18 (15,3) 26 (20,3) 1 24 (20,3) 26 (20,3) 2 65 (55,1) 73 (57,0) 2 75 (63,6) 90 (70,3) 3 30 (25,4) 24 (18,8) 3 18 (15,3) 10 (7,8) 4 3 (2,5) 3 (2,3) 4 0 (0,0) 1 (0,8) Összesen 118 (100) 128 (100) 118 (100) 128 (100) p=* 0,7023 0,

80 Eredmények Meghatároztuk 118 egészséges személy C4A és C4B génszámát az újonnan kidolgozott kvantitatív real-time PCR módszerrel. Az így kapott frekvenciaértékeket öszszehasonlítottuk a hagyományos, Southern-bloton alapuló technikával genotipizált magyar személyek adataival (120). A 25. táblázat mutatja, hogy a két módszerrel kapott génszám gyakoriság értékek között nincs szignifikáns különbség. Mivel az eredmények között kis mértékű eltérés mégis megfigyelhető, az új módszer megbízhatóságának közvetlen ellenőrzésére 33 Southern-blottal genotipizált DNS mintát real-time PCR-rel is megvizsgáltuk. A kétséges eredményű minták analízisének megismétlése után az újonnan kidolgozott kvantitatív real-time PCR-rel meghatározott génszám minden esetben megegyezett a hagyományos módszer eredményével A C4 gének vizsgálata kapilláris elektroforézis alkalmazásával A C4 géndózis vizsgálatára egy másik módszert is kidolgoztunk, ebben az esetben a C4A és C4B génszám meghatározása egyetlen reakcióelegyben zajlik. A módszer két lépésből áll, a vizsgált génszakaszok felsokszorozása multiplex PCR reakció alkalmazásával, míg a mennyiségi mérés lézer-indukált fluoreszcencia (LIF) elvén működő, két csatornában detektáló kapilláris elektroforézis készülékkel történik [III]. 1. csatorna C4A CGT G C AF488 AF csatorna RP1 207 bp C4B 169 bp TCA C T Cy5 Cy5 206 bp 169 bp 12. ábra. A C4A és C4B génszám meghatározására tervezett multiplex PCR rendszer vázlata [III] Az ábra felső részén láthatók a kapilláris elektroforézis készülék első csatornájában detektálható Alexa Fluor 488-cal jelölt PCR termékek, az alsó mutatja a Cy5 fluoreszcens festékkel a második csatornában láthatóvá tett szakaszokat. A 207 bp hosszúságú termék a C4A és C4B gén megegyező szakaszáról, míg a 206 bp méretű kontroll fragmentum egy 2 kópiában jelen lévő génről (RP1) képződik. A 169 bázispár hosszúságú gén-specifikus termékek a színük alapján különböztethetők meg, C4A gén jelenléte esetén az Alexa Fluor 488-cal jelölt primer tapad be, míg a C4B génről képződő termékek Cy5-tel jelöltek. A nyilak a primerek betapadásának helyét, az oválisok a C4A és C4B gének különböző nukleotidjait reprezentálják. 78

81 Eredmények A multiplex PCR rendszer két specifikus valamint két referencia PCR termék párhuzamos amplifikációját foglalja magába (12. ábra). A C4A és B gének megkülönböztetése gén-specifikus primerek alkalmazásával történik, a primereket úgy terveztük, hogy azok 3 vége a két gén öt nukleotid variációjából a harmadikon végződjön. A primerek 5 végéhez különböző fluoreszcens festék van kapcsolva, a C4A-specifikus oligonukleotid Alexa Fluor 488 (AF488), míg a C4B specifikus szulfoindocianin szukcinimidil észter (Cy5) festékkel jelölt. A két gén-specifikus primerhez azonos antisense primer tartozik, így mindkét génről 169 bázispár hosszúságú termék keletkezik. A PCR rendszer a specifikus reakciók mellett két kontrollt is tartalmaz. Az egyik referencia a C4 gének teljes számával arányosan keletkező PCR termék (C4össz), amely a C4A és C4B gének megegyező szekvenciájú szakaszáról képződik, így a génspecifikus PCR belső kontrolljának tekinthető. A második, az RP1 gén egy olyan szakaszáról íródik át, amely az RCCX modulok számától függetlenül mindig két kópiában van jelen, mivel a részlegesen duplikálódott RP2 gén ezt nem tartalmazza. Ez a referencia fragmentum belső standardként alkalmazható az abszolút génszám meghatározás során. A kontroll PCR termékeket úgy terveztük, hogy méretük alapján (206 és 207 bp) könnyen elválaszthatóak legyenek a C4A és C4B-specifikus amplikonoktól. A referencia PCR termékek egymástól való megkülönböztetését a kétféle fluoreszcens jelölés (C4össz esetében AF488, RP1-nél Cy5) teszi lehetővé. A multiplex PCR reakció során képződő termékek tehát méretük (C4-specifikus: 169 illetve a referenciák: 206 és 207) vagy jelölésük (C4A és C4össz: Alexa Fluor 488 illetve C4B és RP1: Cy5) alapján könnyen megkülönböztethetőek a két hullámhosszon párhuzamosan detektáló kapilláris elektroforézis készülékben. Az így kialakított multiplex PCR rendszer egyik nagy előnye, hogy a négy génszakasz amplifikálása egy reakcióelegyben történik, ezáltal a technikai hibák (például a pipettázási különbségek) kiküszöbölhetők. A másik fontos pozitívum, hogy minden reakcióelegy tartalmaz egy belső kontrollt, ami egyben az elektroforézis kontrolljaként is szolgál, így kivédhetők az eltérő injektálásból vagy elválasztásból eredő problémák A polimeráz láncreakció körülményeinek optimalizálása A C4A és C4B-specifikus termékek kiegyensúlyozott képződéséhez nélkülözhetetlen az optimális anneálási (primer betapadási) hőmérséklet meghatározása. A prime- 79

82 Eredmények rek olvadáspontja alapján az 50 C-tól 65 C-ig terjedő hőmérséklet tartomány alkalmazhatóságát gradiens PCR-rel vizsgálatuk. C4A illetve a C4B gént nem tartalmazó minták segítségével megállapítottuk, hogy a gén-specifikus primerek hatékonysága és szelektivitása C között a legmagasabb. Két C4A és két C4B génnel rendelkező templát DNS analízise alapján a két génről képződő PCR termékek mennyisége 56 C-on a leginkább kiegyenlített, így a további kísérletek során ezt az anneálási hőmérsékletet alkalmaztuk. A polimeráz láncreakció hatékonysága az exponenciális fázis után folyamatosan csökken, így mennyiségi mérés csak a reakció kezdeti szakaszában valósítható meg. A megbízható kvantitatív méréshez tehát olyan ciklusszámot kellett választanunk, ahol a PCR termékek mennyisége még exponenciális növekszik, így a keletkezett amplikonok mennyisége arányos a kiindulási DNS mennyiségével. Az optimális ciklusszám meghatározására egy DNS mintából három különböző koncentrációjú (45, 90 és 180 ng/µl) hígítást készítettünk, majd ezeket a mintákat különböző ciklusszámok (24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 és 38) alkalmazásával amplifikáltuk ciklusszám DNS templát mennyisége (ng) 169 bp ciklusszám DNS templát mennyisége (ng) 169 bp 13. ábra. A polimeráz láncreakció dinamikájának vizsgálata 3 DNS koncentráció és 8 különböző ciklusszám alkalmazásával A ciklusszám alkalmazásával, 45, 90 illetve 180 ng kiindulási DNS templát esetén képződő PCR termékeket hagyományos agaróz gélelektroforézissel választottuk el. Az ábrák felső részében lévő szám az alkalmazott ciklusok számát, míg az alattuk lévők a DNS mennyiségét mutatják. 80