SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ÍZÜLETI GYULLADÁS ÁLLATKÍSÉRLETES MODELLJEIBEN. Doktori (PhD) - értekezés. dr.

Átírás

1 SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ÍZÜLETI GYULLADÁS ÁLLATKÍSÉRLETES MODELLJEIBEN Doktori (PhD) - értekezés dr. Borbély Éva Doktori Iskola vezetője, programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika Témavezető: Prof. Dr. Helyes Zsuzsanna Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Pécs, 2015.

2 Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 4 ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, KUTATÁSI KONCEPCIÓ KRÓNIKUS ÍZÜLETI GYULLADÁS ELŐFORDULÁSA, KIALAKULÁSÁBAN SZEREPET JÁTSZÓ PATOMECHANIZMUSOK, JELENLEGI KEZELÉSI STRATÉGIÁK KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK, NEUROGÉN GYULLADÁS PROTEÁZ-AKTIVÁLT RECEPTOROK TACHYKININEK, TACHYKININ RECEPTOROK CÉLKITŰZÉSEK KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK KÍSÉRLETI ÁLLATOK KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI PARADIGMÁK K/BxN szérum-transzfer artritisz PAR2 aktiváció által kiváltott ízületi gyulladás CFA-indukált artritisz FARMAKOLÓGIAI MÓDSZEREK RTX-deszenzibilizáció PAR2 aktiváció VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Mechanonociceptív küszöb mérése eszteziométerrel Mechanonociceptív küszöb mérése analgeziméterrel Spontán súlyeloszlás mérése incapacitance teszterrel Fájdalmas hőküszöb mérése emelkedő hőmérsékletű forró lapon (hot plate) Lábduzzadás mérése pletizmométerrel Térdátmérő mérése mikrométerrel Ízületi gyulladás megítélése szemikvantitatív pontozással Ízületi funkció megítélése (horizontal wire grid test) In vivo imaging Szövettani vizsgálat Gyulladásos citokinek koncentrációinak meghatározása Etikai vonatkozások EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK FONTOS SZABÁLYOZÓ SZEREPET JÁTSZANAK SZÉRUM-TRANSZFER ARTRITISZ EGÉRMODELLJÉBEN Eredmények Összefoglalás, megbeszélés, következtetések A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA PROTEÁZ-AKTIVÁLT RECEPTOR 2 ÁLTAL KIVÁLTOTT ÍZÜLETI GYULLADÁSBAN ÉS FÁJDALOMBAN Eredmények Összefoglalás, megbeszélés, következtetések TACHYKININEK ÉS TACHYKININ NK1 RECEPTOROK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ADJUVÁNS-INDUKÁLT ARTRITISZ EGÉRMODELLJÉBEN Eredmények Összefoglalás, megbeszélés, következtetések

3 ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS EGYSÉGES ÉRTELMEZÉSE IRODALMI HIVATKOZÁSOK AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK EGYÉB EREDETI PUBLIKÁCIÓK IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK KONGRESSZUSI SZÓBELI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 12-HPETE: 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav AEA: endokannabinoid N-arachidonoil-etanolamin CFA: komplett Freund adjuváns CGRP: kalcitonin gén-rokon peptid DMARD: disease-modifying antirheumatoid drug = betegség lefolyását módosító szer EKA/B/C/D: endokinin A/B/C/D ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay i.a.: intraartikuláris IL: interleukin i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris HK-1: hemokinin-1 KO: knockout = génhiányos KRN: T sejt receptor transzgenikus egértörzs NADA: N-arachidonoil-dopamin NK1/2/3: tachykinin NK 1/2/3 receptor NKA/B: neurokinin A/B RA: reumatoid artritisz SP: P-anyag SRIF: somatotropine release inhibitory factor = szomatotropin felszabadulást gátló hormon RIA: radioimmunoassay ROI: Region of Interest = érdeklődésre számottartó terület TAC1/3/4: tachykinin 1/3/4 gén Th1/2: T helper 1/2 TNFα: tumor nekrózis faktor α TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 receptor 4

5 ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, KUTATÁSI KONCEPCIÓ 1. Krónikus ízületi gyulladás előfordulása, kialakulásában szerepet játszó patomechanizmusok, jelenlegi kezelési stratégiák A reumatoid artritisz (RA) szerteágazó és súlyos klinikai képpel járó betegség, számos vonatkozásban még ma sem teljesen ismert kialakulása és pontos patomechanizmusa. Magyarországon összesen mintegy ezer beteg (nők és férfiak aránya 3:1) érintettségével számolhatunk. Az RA egy autoimmun eredetű, krónikus progresszív sokízületi gyulladás (poliartritisz), mely elsősorban a kéz és a láb kis ízületeit érinti, és az ízületek destrukciója és deformitása révén a betegek fájdalmát, mozgáskorlátozottságát és életminőségük jelentős romlását idézi elő (Jones és mtsai., 2003; Harris, 2005; Kourilovitch és mtsai., 2014). Gyakorisága, a nem kellőképp megoldott kezelés és a várható élettartamra gyakorolt kedvezőtlen hatásai miatt kiemelkedő jelentőségű népegészségügyi probléma. A betegség előidézésében a genetikai háttér mellett különböző infektív antigéneknek is szerepük lehet (Smith és Haynes, 2002), valamint számos egyéb tényezőt azonosítottak, melyek a betegséget súlyosbítani képesek (pl. dohányzás, hormonális eltérések, környezeti ártalmak). A betegség népegészségügyi jelentősége miatt világszerte igen intenzív kutatás folyik a molekuláris patomechanizmus felderítése érdekében. Egyre részletesebben ismert a kórállapot immunológiai háttere: a szinoviális membránon a T helper sejtek aktiválódása két irányba történik. A celluláris (T helper 1, Th1) vonalon a makrofágok/monociták jelentős mennyiségű proinflammatorikus citokint, közülük is elsősorban tumor nekrózis faktor α (TNFα)-t termelnek. A humorális (T-helper 2, Th2) vonalon az interleukin-4 (IL-4), -10, -13 közreműködésével a B limfociták, majd a plazmasejtek aktiválódnak. Jelen ismereteink szerint a reumatoid artritisz egyértelműen Th1 túlsúlyú, TNFα dominanciájú kórkép. A TNFα-nak és az általa beindított citokin kaszkádnak a különböző effektor molekulák (pl.: prosztanoidok, kemokinek, adhéziós molekulák stb.) révén kulcsszerepe van a krónikus ízületi destrukcióban (Venkatesha és mtsai., 2014). Fontos szerepet játszik még az interleukin-1β (IL-1β), amely hozzájárul az immunválasz patológiás módosításához és az oszteoklasztok aktivációjához (1., 2. ábra). 5

6 forrás: Gonzalez-Rey, E. és mtsai. (2007), Nat Rev Immunol. 1. ábra Az RA-s ízület szerkezete 1. Iniciáció Lokális sérülés Autokrin aktiváció Fertőzés 2. Gyulladás szinoviális membrán citokin hálózat (TNFα, IL-6, 23) Saját antigének bemutatása (citrullinált peptidek) T sejt keringő monociták aktiválódása autoantigének módosítása APC aktiválás és következményként az adaptív immunrendszer sejtjeinekek aktiválása természetes immunválasz aktiválása adaptív immunválasz aktiválása Csökkent TREG sejtszám B sejt T és B sejtek poliklonális aktivációja Gyulladásos citokinek termelődése Szinoviális invázió 3. Önfenntartás porc eredetű autoantigének Porc lebomlás termékei Proteoglikánok 4. Destrukció B sejt szinoviális makrofág membrán antigének porcsejt környezeti faktorok proteázok, citokinek B sejt kollagén kollagenáz Pannuszképződés Oszteoklaszt aktiválás Oszteoklasztok autoantitestek általi aktiválása Csont forrás: Burmester és mtsai. (2014), Nat Rev Rheumatol. 2. ábra Az RA lefolyása és mechanizmusai 6

7 Az alapfolyamat a krónikus szinoviális proliferáció, mely az ún. pannuszképződéshez vezet, ráterjedve az ízületeket alkotó porcfelszínre és csontvégekre, azok károsodását, adott esetben pusztulását hozza létre. Az RA-hoz társuló porckárosodásban a termelt citokinek a porcsejtek katabolizmusát fokozzák, a metalloproteináz enzimek elsősorban a porcmátrix degradációját idézik elő. Az ismert immunológiai folyamatokon kívül fontos megemlíteni, hogy az ízületi tok és a szinovium gazdag szenzoros innervációt kap. Ezen idegvégződések a feszülést és a fájdalmat közvetítik, valamint a perifériás idegrendszer többi területéhez hasonlóan lokális és szisztémás efferens funkcióval is rendelkeznek. Számos irodalmi adat (Levine és mtsai., 1985; Ferrel és mtsai., 1996) igazolja ezen idegvégződések részvételét a krónikus gyulladásos folyamatban egyrészt az ereken, másrészt a gyulladásos sejteken kifejtett hatással. A betegség kezelésében ennek ellenére mindmáig nincs olyan szer, ami ezen idegvégződések működését befolyásolná. Prereumatoid állapot Korai reumatoid állapot Kifejlett reumatoid állapot Kovencionális terápia Szteroidok, DMARD Szteroidok, DMARD monoterápia, DMARD kombinációban DMARD monoterápia, DMARD kombinációban Biológiai terápia T sejt kostimuláció gátlása citokinek gátlása, T sejt kostimuláció gátlása, B sejt gátlás citokinek gátlása, T sejt kostimuláció gátlása, B sejt gátlás forrás: Scott (2012), Clin Pharmacol Ther. 3. ábra A reumatoid artritisz kezelésének alapelvei 7

8 Az RA gyógyszeres kezelésében jelenleg tüneti és a betegség progresszióját befolyásoló szereket különböztetünk meg, melyeket a tünetektől, súlyosságtól és a betegség előrehaladottságától függően különböző kombinációkban alkalmaznak (3. ábra). A tüneteket enyhítő szerek közé tartoznak a nem-szteroid illetve a szteroid típusú gyulladáscsökkentők, melyek alkalmazását súlyos mellékhatásaik korlátozzák. A betegség kezelésében helyet kapnak még a bázisterápiás szerek, ún. DMARD-ok, melyek a tünetek enyhítése mellett a strukturális károsodás progressziójának lassítására is szolgálnak, azonban ezen szerek is számos mellékhatással bírnak (1. táblázat). DMARD (Hidroxi)klorokin Szulfaszalazin Metotrexát Leflunomid Ciklofoszfamid D-penicillamin Arany (po., im.) Ciklosporin gyakori mellékhatások hasi fájdalom, kiütés, retinopátia, cornea károsodás gasztrointesztinális erózió/fekély, folsavhiány, vérképzési zavarok, anafilaxiás reakció hányinger, gasztrointesztinális fekélyek, hepatotoxicitás hasmenés, hajhullás, májenzim-, vérnyomás emelkedés csontvelődepresszió, alopecia, hemorrágiás cisztitisz anorexia, proteinuria, trombocitopénia perifériás neuropátia, vesekárosodás, hepatitisz, vérképzési zavarok nefrotoxicitás 1. táblázat DMARD terápia legfontosabb mellékhatásai 8

9 B sejt Mezenhimális sejt T sejt Plazmasejt Oszteoklaszt prekurzur sejtek Oszteoklaszt forrás: Schett és Gravallese (2012), Nat Rev Rheumatol. 4. ábra A biológiai terápia képviselői és hatásmechanizmusuk Ma a legfontosabb biológiai terápiás vonalat a celluláris (Th1) immunválaszban kulcsszerepet játszó TNFα blokkolása, valamint a humorális immunválaszban meghatározó B sejtek (CD20+) gátlása jelenti. Az anti-tnfα-terápia részben monoklonális ellenanyagok (infliximab, adalimumab), részben szolubilis TNFα receptor (etanercept) révén kivitelezhető (Nash és Florin, 2005) (4. ábra). Fokozott infekcióveszély, elsősorban lappangó tuberkulózis fellángolása lehet a potenciális mellékhatása ezen szereknek (Hochberg és mtsai., 2005), de nem zárható ki hosszabb alkalmazás után a daganatok keletkezésére való fokozott hajlam sem. Egyéb hátrányként említhető még, hogy a kezelés a többi szernél jelentősen magasabb költségeket jelent. 2. Kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, neurogén gyulladás A primér szenzoros neuronok 40-50%-át kitevő kapszaicin-érzékeny, azaz Vanilloid Receptor 1 (VR1), vagy más néven Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1)- et expresszáló populációjába tartoznak a C-polimodális nociceptorok és az A - 9

10 polimodális nociceptorok exteroceptív területeken, valamint a nyálkahártyák és viszcerális szervek kemonociceptorai az interoceptív területeken. A TRPV1 egy ligand-függő nem szelektív kation-csatorna, melynek aktiválódásakor a sejtbe Na + - és Ca 2+ -ionok áramlanak be, melyet K + -ion sejtből való kiáramlása követ. A Na + -ion főként az akciós potenciál generálásáért felelős, aminek következményeként kialakul a fájdalomérzet. A Ca 2+ -ion beáramlása pedig elsősorban a szenzoros neuropeptidek idegvégződésekből való felszabadulásához vezet. A receptor többféle módon, fizikai vagy kémiai ingerekkel aktiválható intra- és extracellulárisan is, ezen aktivátorok közé tartozik a fájdalmas, 43ºC feletti hőinger (Tominaga és mtsai., 1998), valamint a ph 6 alatti proton-koncentráció. Számos növényi eredetű vanilloid (pl.: reziniferatoxin, piperin, zingeron) képes nyitni az ioncsatornát, de léteznek a receptornak endogén ligandjai is (endokannabinoid N-arachidonoil-etanolamin: AEA, 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav: 12-HPETE, N-arachidonoil-dopamin: NADA) (Yoo és mtsai., 2014). Továbbá ismert még számos olyan vegyület, melyek saját receptoraikon hatva érzékenyíteni képesek a TRPV1 receptorokat és ezáltal az idegvégződés ingerelhetőségét megnövelik. Ezen vegyületekről (bradykininek, prosztaglandinok, proteázok, szerotonin) tudjuk, hogy gyulladásos körülmények között igen magas koncentrációkat érnek el, és fontos mediátorai a proinflammatorikus folyamatoknak, így logikus az a következtetés, hogy az általuk kiváltott TRPV1 szenzibilizáció is részt vesz a gyulladás patomechanizmusában (5. ábra). bradykininek proteázok prokineticinek prosztaglandinok szerotonin fájdalmas hő kapszaicin/rtx protonok arachidonsav metabolitok protein-kináz aktiváció forrás: Szállási és mtsai. (2007), Nat Rev Drug Discov. 5. ábra A TRPV1 aktivátorai (fekete folytonos vonalak), érzékenyítő ágensei (fekete szaggatott vonalak), gátlói (piros vonalak), és a kísérleteinkben vizsgált vegyületek (piros keret) 10

11 A TRP receptorcsalád fontos tagja a TRPA1 receptor is, mely receptor altípus nagy százalékban koexpresszálódik a TRPV1-gyel, azonban jellemző aktivátorai (fahéjaldehid, allicin, acrolein) és érzékenyítői (bradykinin, hidrogén-szulfid) különböznek a TRPV1 receptorétól. Aktivációjakor, a TRPV1-hez hasonlóan fájdalomérzet és neuropeptid felszabadulás következik be (Banzawa és mtsai., 2014). 6. ábra A kapszaicin-érzékeny idegvégződések hármas funkciója Napjainkban már kísérletekkel is alátámasztott és általánosan elfogadott tény, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződések a klasszikus afferens funkciójukon kívül melynek során a szenzoros idegvégződések a központi idegrendszer felé idegaktivitást közvetítenek, és létrejön a fájdalomérzet/nocicepció - lokális és szisztémás efferens funkciókkal is rendelkeznek. Antigén, vagy nem-immun gyulladásos provokáció hatására történő aktiváció következtében gyulladás- illetve fájdalomkeltő hatású szenzoros neuropeptidek, tachykininek (pl. P-anyag) és kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) szabadulnak fel. A CGRP artériás vazodilatáció előidézésével megnöveli a helyi vérátáramlást az innervációs területen, míg a P-anyag (SP) és a neurokinin A (NKA) plazmaprotein extravazációt okoz a megnövekedett mikrovaszkuláris 11

12 permeábilitásnak és a gyulladásos sejtek (leukocita, hízósejt, makrofág) akkumulációjának köszönhetően. Ezt a folyamatot nevezzük neurogén gyulladásnak, amely tehát az érző idegvégződések lokális efferens működésének következménye (Jancsó és mtsai., 1967; Holzer, 1988; Helyes és mtsai., 2003) (6. ábra). A neurogén gyulladás jelentős szerepet tölt be számos betegség patomechanizmusában, ilyenek a reumatoid artritisz, asztma, allergiás rinitisz, konjunktivitisz és dermatitisz, ekcéma, migrén vagy a gyulladásos bélbetegségek (Pintér és mtsai., 2014). Ugyanezen idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin és ópioid peptidek, melyek a vérárammal a test távolabbi részeire is eljuthatnak, gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek (Szolcsányi, 1998a, b). A szomatosztatin (somatotropine release inhibitory factor, SRIF) 14 illetve 28 aminosavból álló ciklikus peptid formában fordul elő, befolyásolja számos sejttípus működését, közöttük vaszkuláris simaizom és endotél sejteket, gyulladásos és immunsejteket, fibroblasztokat vagy neuronokat. Élettani hatásai közé tartozik többek között a növekedési hormon, hasnyálmirigy enzimek vagy a kalcitonin felszabadulásának gátlása, az értágulat és hízósejt degranuláció, valamint a citokin felszabadulás és sejtproliferáció gátlása. Fontos kiemelni a neuronális transzmisszióban betöltött gátló szerepét. Ezen hatásait saját G i -proteinhez kapcsolt receptorain keresztül fejti ki (sst 1 -sst 5 ). A receptorokat két csoportba osztják a szomatosztatin szintetikus analóg iránti affinitásuk szerint. Az SRIF1 csoportba tartoznak az sst 2, sst 3 és sst 5 receptorok, melyek főként az endokrin hatásért felelősek. Az SRIF2 csoport tagjai az sst 1 és sst 4 receptorok. A fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatás a SRIF2 csoporthoz, vagyis az sst 1 és sst 4 receptorokhoz köthető (Pintér és mtsai., 2006). Az ízületi tok és a szinovium is gazdagon innervált kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződésekkel. A rajtuk található TRPV1 és TRPA1 aktiválásának köszönhetően felszabaduló gyulladás- és fájdalomkeltő, valamint gyulladásgátló és fájdalomcsillapító mediátorok szerepe megkérdőjelezhetetlen a betegségben, ugyanis RA-ban szenvedő betegek szérumában illetve szinoviális folyadékában kimutatható volt a megnövekedett proinflammatorikus, valamint a lecsökkent antiinflammatorikus neuropeptid mennyiség (Anichini és mtsai., 1997; Larsson és mtsai., 1991; Denko és Malemud, 2004). Bár az utóbbi évek intenzív kutatásainak köszönhetően, egyre növekszik tudásunk a reumatoid artritisz patomechanizmusával kapcsolatban, a kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződések és neuro-immun interakciók szabályozó szerepe a mai napig nem teljesen tisztázott (Levine és mtsai., 2006; Pongratz és Straub, 2010; Meinel és mtsai., 2013; Stangelberg és mtsai., 2014). 12

13 3. Proteáz-aktivált receptorok trombin tripszin A receptorok proteáz-aktivált (PAR) családja 4 tagból áll: 3 receptor kötésére trombin alkalmas (PAR1, PAR3 és PAR4) és főleg koagulációs folyamatokban vesznek részt, míg a tripszin/hízósejt triptáz főként a PAR2-höz képes kötődni és rajta keresztül hatást kiváltani. A PAR-ok a heptahelikális G- proteinhez-kapcsolt receptorokhoz tartoznak és proteolítikus hasítás útján aktiválódnak, melyet számos proteáz képes kiváltani (Molino és mtsai., 1997; Macfarlane és mtsai., 2001; Hollenberg and Compton, 2002; 7. ábra). A PAR2 mind lokalizációjában mind pedig funkciójában elkülönül a család többi tagjától. Megtalálható az ízületben (Ferrell és mtsai., 2003; Boileau és mtsai., 2007; Nakano és mtsai., 2007), a bőr epiteliális és endotél sejtjein (Steinhoff és mtsai., 1999), a szív-érrendszerben, a gyomor-bél traktusban és a légzőrendszerben (D Andrea és mtsai., 1998; Cocks és mtsai., 1999; Kawabata és mtsai., 2002), valamint a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződéseken is (Steinhoff és mtsai., 2000; Vergnolle, 2005). Ezen kívül ismert még, hogy a szerin proteázok fontos szerepet töltenek be számos gyulladásos (Schmelz és mtsai., 1999; Kanke és mtsai., 2005; McIntosh és mtsai., 2007) és fájdalom folyamatban (Vergnolle és mtsai., 2001a, b; Coelho és mtsai., 2003). Számos új eredmény arra utal, hogy a különböző szervek gyulladásos folyamataiban és a következményes fájdalom kialakulásában a PAR2 agonisták hatásaikat a TRPV1-en keresztül tudják kifejteni, mivel e folyamatok kapszaicin deszenzitizációval gátolhatók voltak (Su és mtsai., 2005; Gu és Lee, 2006; Shimizu és mtsai., 2007; Paszcuk és mtsai., 2008; 29. ábra). gátlók trombin forrás: Noorbakhsh és mtsai. (2003), Nat Rev Neurosci. 7. ábra PAR család és aktiválásuk PN1: proteáz nexin-1, AT3: antitrombin 3 13

14 TRPV1 antagonisták, illetve TRPV1 génhiányos állatok segítségével bizonyították ezen ioncsatornák szerepét a PAR2-kiváltott hőhiperalgézia (Amadesi és mtsai., 2004) és hólyagkontrakciók (Shimizu és mtsai., 2007) valamint primer mechanikai hiperalgézia (Dai és mtsai., 2004) kiváltásában. Mivel a PAR2 stimuláció egér térdízületben szinoviális hiperémiát és duzzadást képes létrehozni (Ferrell és mtsai., 2003; Busso és mtsai., 2007), feltételezhető, hogy ezen receptorok szerepet játszanak az ízületi gyulladásos megbetegedések patogenezisében. 4. Tachykininek, tachykinin receptorok Az emlős tachykinineket tradicionálisan a neurotranszmitterekhez soroljuk. A tachykinin családnak 2000-ig 3 jelentős képviselője volt: a P-anyag, a neurokinin A és a neurokinin B (NKB), melyek mind rövid, aminosavból álló peptidek és mind rendelkeznek ugyanazon hidrofób C-terminális régióval, amely központi szerepet tölt be mindhárom tachykinin receptor aktivációjában. Két tachykinin prekurzor gént azonosítottak eredetileg: a preprotachykinin-a (TAC1) és a preprotachykinin-b (TAC3) géneket (Nawa és mtsai., 1983; Kotani és mtsai., 1986). A TAC1 génnek alternatív splicing révén 4 variánsa van (α, β, γ és δtac) (Nawa és mtsai., 1985; Harmar és mtsai., 1990). Mind a 4 splice-variáns kódolja az SP-t, míg a β és γtac1 felelős az NKA kódolásáért ben klónozták a 3. emlős tachykinin gént (PPT-C/TAC4) egérből. Miután eredetileg a B limfocitákban történő expresszióját írták le, az általa kódolt neuropeptidet hemokinin-1 (HK-1)-nek nevezték el (Zhang és mtsai., 2000). Ezután a TAC4 gén cdns szekvenciájának és génstruktúrájának meghatározása számos fajból (egér, patkány, ember) megtörtént (Page, 2004). Ezen kutatások számos fajspecifikus P- anyag-szerű peptid jelenlétét igazolták, ez egérben és patkányban a HK-1, emberben pedig a humán HK-1 és az endokinin A, B, C és D (EKA-D) (Steinhoff és mtsai., 2014). Sok évvel ezelőtt a tachykinineket majdnem kizárólagosan neuronális eredetű peptideknek tekintették. Az SP és az NKA a központi idegrendszerben és a primer afferens szenzoros neuronokban található, ellátva ezáltal számos perifériás szövetet, míg az NKB a központi idegrendszerben és a gerincvelőben van jelen (Lundberg, 1996). Az SP és az NKA mind a gerincvelőben, mind a periférián az idegvégződésekből szabadul fel, és excitátoros transzmitterként működik (Otsuka és Yoshioka, 1993). Újabb bizonyítékok azonban azt támasztják alá, hogy a tachykinineknek számos egyéb neuronális és nem-neuronális forrásai léteznek a periférián. Tachykinin expressziót találtak kapszaicin-rezisztens vastag Aβ-rostokkal bíró neuronokban (Neumann és 14

15 mtsai., 1996), más típusú kapszaicin-rezisztens neuronokban, a légutakban (Carr és mtsai., 2002) és az enterális idegrendszerben (Holzer és Holzer-Petsche, 1997). Az SP megtalálható ezenkívül az emberi endotél sejtekben (Linnik és Moskowitz, 1989), és különböző típusú gyulladásos és immunsejtekben (Pascual és Bost, 1990; Lai és mtsai., 1998). Ezzel szemben a HK-1 és az endokininek elsősorban nem-neuronális sejtekben expresszálódnak, illetve génjeik centrális és perifériás expressziójának mintázata és mértéke is igen eltérő az SP génjétől (Page és mtsai., 2003, Duffy és mtsai., 2003). Számos korábbi kísérleti adat bizonyította, hogy az SP/NKA illetve az NK1 receptorok fontos mediátorai a neurogén gyulladásnak (Cao és mtsai., 1998; De Felipe és mtsai., 1998). Továbbá, részt vesznek a vérképzés szabályozásában (Rameshwar, 1997; Zhang és mtsai., 2000; Bandari és mtsai., 2003a,b) és expressziójuk emelkedett különböző gyulladásos és fertőző betegségekben (Kennedy és mtsai., 2003). Ezért joggal feltételezhető, hogy ezek a molekulák parakrin vagy endokrin módon hatnak és szerepet játszanak a neuro-immun modulációban. A tachykinin receptorok a membrán-kötött G-proteinhez kapcsolt receptorok családjába tartoznak. Jelenleg 3 különböző tachykinin receptort, tachykinin NK1, NK2, és NK3, sikerült elkülöníteni különböző fajokban. A 3 tachykinin receptor különböző szelektivitással bír az endogén tachykininek iránt. Az SP, az NKA és az NKB is teljes agonista mindhárom receptoron, bár a receptorok eltérő erősséggel kötik a különböző tachykinineket az SP legnagyobb affinitással az NK1 receptorhoz kötődik, az NKA leginkább az NK2 receptorhoz kapcsolódik, míg az NKB-nek fő receptora az NK3. Farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az egér és patkány HK-1, illetve az emberi EKA és EKB hatásaikat főként a P-anyaghoz hasonlóan, NK1 receptort preferáló agonistaként fejtik ki, bár teljes agonisták mind az NK2 mind az NK3 receptorokon. Feltételezhető, hogy az EKA és EKB lehet a perifériás tachykinin NK1 receptornak a fő ligandja, különösen a nem-innervált szövetekben (Morteau és mtsai., 2001; Page és mtsai., 2003) (8. ábra). A tachykinin receptorcsalád a közeljövőben újabb taggal bővülhet, mivel több olyan kísérleti eredmény látott napvilágot, amelyeket nem lehet a 3 jelenleg ismert tachykinin receptor jelenlétével magyarázni. Például, hogy az SP NK receptoroktól-független módon tudja aktiválni a hízósejteket (Lau és mtsai., 2001), illetve hogy a Tac4-kódolt EKC és D, mely peptidek a C-terminális 2 aminosavban különböznek a többi tachykinintől, nagyon enyhe affinitással bírnak mind a 3 eddig ismert NK receptor iránt (Page és mtsai., 2003; Page, 2005). 15

16 Receptorok Preprotachykinin gének és a kódolt peptidek NK1 PPT-A/ Tac1 SP NKA NK2 PPT-B/ Tac3 NKB NK3 PPT-C/ Tac4 HK-1 HK 8. ábra TAC gének a kódolt tachykininekkel és azok receptorai (a nyilak a peptidek legnagyobb affinitással való kötődését mutatják) Ízületi gyulladásos kórképekben való vizsgálatukat indokolja, hogy a kapszaicinérzékeny érzőideg-végződésekben található gyulladáskeltő neuropeptidek jelentős részét a tachykininek teszik ki. Ezen idegvégződések aktivációjakor felszabaduló, Tac1 gén-kódolt SP és NKA illetve NK receptoraik gyulladásos sejteket aktiváló, értágító és fájdalomkeltő funkciójára vonatkozóan számtalan irodalmi adat áll rendelkezésünkre (Schaible és mtsai., 2010; Graham és mtsai., 2004; Longmore és mtsai., 1997; Pernow, 1983), valamint szerepüket több gyulladásos kórképben is igazolták (Helyes és mtsai., 2010; Weinstock., 2014). Emellett az utóbbi időben több adat is bizonyítja a Tac1 gén nem-neurális expresszióját (gyulladásos sejtekben, kondrocitákban, epiteliális sejtekben), mely jelenség szintén hozzájárulhat a különböző típusú gyulladások elindításához és súlyosbításához (Stewart és mtsai., 2008; Millward-Sadler és mtsai., 2003; Howard és mtsai., 2008; Ho és mtsai., 1997). Artritiszben betöltött szerepüket ezenkívül alátámasztja az a tény is, hogy RA-ban szenvedő betegek szérum és szinoviális mintáiban (Anichini és mtsai., 1997; Larsson és mtsai., 1991) illetve artritisz állatmodelljeiben (Bileviciute és mtsai., 1993) is emelkedett SP-szerű immunreaktivitást mutattak ki. Ezzel megegyezően, korábbi kísérleteinkben azt találtuk, hogy CFA-indukált artritiszben a TRPV1 génhiányos 16

17 egerekben a gyulladás és a fájdalom is kisebb mértékű volt (Szabó és mtsai., 2005), ami arra utal, hogy az idegvégződésekből felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek fontos szerepet játszanak ebben a modellben. A fent említett, jól körülírt és részletesen tanulmányozott hatások ismeretében a tachykinin kutatás és az arra épülő gyógyszerfejlesztés éve élte virágkorát. Az SP hatását kivédő NK1 antagonisták állatkísérletekben igen jó hatékonyságú gyulladás-, és fájdalomcsökkentő vegyületeknek bizonyultak, de a klinikai vizsgálatok során nem váltották be a hozzájuk fűzött reményeket (Hill, 2000; Urban és Fox, 2000). Ennek oka azóta is ismeretlen. A tachykinin kutatásnak azonban néhány éve új lendületet adott a Tac4 gén és az általa kódolt HK-1 és endokininek felfedezése. Bár egyre növekvő mennyiségű információval rendelkezünk ezen peptidek lokalizációjára vonatkozóan (központi idegrendszer, gyulladásos sejtek -B és T limfociták, makrofágok, dendritikus sejtek (Zhang és mtsai., 2000; Metwali és mtsai., 2004; Nelson és Bost, 2004), azonban az ízületekben való expresszióra egyáltalán nem áll rendelkezésre irodalmi adat. Mindezek, valamint a jelentős NK1 receptor-preferencia alapján joggal feltételezhetjük, hogy a Tac4-kódolt tachykininek gyulladásos folyamatokban és a neuro-immun interakciókban fontos szerepet töltenek be. 17

18 CÉLKITŰZÉSEK A reumatoid artritisz terápiájában nem szerepel olyan gyógyszer, amely gátolni tudná a betegség neurogén gyulladásos komponensét. Kísérleteinkkel ízületi gyulladás állatkísérletes modelljeiben igyekeztünk a neurogén gyulladás és a neuro-immun interakciók szerepét feltárni, kulcsmechanizmusokat, célmolekulákat azonosítani, és ezzel olyan új hatásmechanizmusú gyógyszerek kifejlesztését megalapozni, amelyek hatékonyak lehetnek a kezelésben és emellett kevesebb mellékhatással bírnak. Munkám általános célkitűzései ezért a következők voltak: I. A kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések szerepének komplex vizsgálata az eddig kizárólag immun-mediált patomechanizmusúnak ismert egér szérumtranszfer artritisz modellben II. A TRPV1 receptorok részvételének vizsgálata a PAR2-indukált artritisz mechanizmusmodelljeiben III. A tachykininek és receptoraik szerepének vizsgálata adjuváns-indukált krónikus artritisz modellben 18

19 KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 1. Kísérleti állatok Kísérleteinkben g súlyú, azonos korú hím és nőstény C57BL/6J törzshöz tartozó (vad típusú, WT) egereken (Jackson Laboratories, Egyesült Államok), valamint g súlyú hím Wistar patkányokon végeztük. PAR2 és CFA-indukált artritisz modellekben a kontrollként használt C57Bl/6J egerekkel azonos korú Trpv1 génhiányos (Trpv1 -/- ; Jackson Laboratories, Egyesült Államok), illetve Tac1 (Tac1 -/- ), Tac4 (Tac4 -/- ) és NK1 receptor génhiányos (Tacr1 -/- ) illetve kettős génhiányos (Tac1 -/- /Tac4 -/- ) megfelelőit használtuk. Ezen egereket Prof. John Quinn (Liverpool, Zimmer és mtsai, 1998) és Alexandra Berger (Toronto, Berger és mtsai., 2010) bocsátotta rendelkezésünkre, munkacsoportunkkal való kollaboráció keretein belül. Az állatok tenyésztése és tartása minden esetben a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének Állatházában történt C-on, normál élelemmel és vízzel korlátlanul ellátva. 2. Kísérleti modellek és vizsgálati paradigmák 2.1. K/BxN szérum-transzfer artritisz A poliartritiszt KRN és NOD egerek artritisz tüneteit mutató leszármazottaitól gyűjtött szérum (K/BxN) beadásával váltottuk ki, míg a kontroll állatok a nem-artritiszes alomtestvérektől gyűjtött szérumot (BxN) kaptak. A K/BxN (pozitív) szérum tartalmazza az anti-gpi IgG antitestet. Az anti-gpi IgG egy anti-gpi B-sejtek által termelt glükóz-6-foszfát izomeráz autoantigén ellen termelt ellenanyag, melyről ismert, hogy az állatoknak beadva immunartritiszt idéz elő (9. ábra). A BxN (negatív) szérum ezen antitesttől mentes, de minden egyéb tekintetben megegyezik a K/BxN szérummal. A K/BxN modell az emberi betegség több tünetét is mutatja: fájdalom, mind a 4 végtagra kiterjedő disztális kisízületi duzzadás, ízületi funkcióvesztés. Molekuláris szinten fontos szerephez jutnak a neutrofil granulociták, makrofágok és a komplement rendszer tagjai mind a folyamat elindításában, mind pedig annak fenntartásában (Kouskoff és mtsai., 1996; Korganow és mtsai., 1999; Fukushima és mtsai., 2010). Antitestek bevitelével kiváltott artritisz modell lévén, kiválóan alkalmas a gyulladásért felelős immunológiai résztvevők azonosítására (Németh és mtsai., 2010; Hickman- Brecks és mtsai., 2011), azonban az idegvégződések szerepét még soha nem vizsgálták (2. táblázat). 19

20 RNáz T sejt Anti-GPI antitestek 9. ábra A K/BxN modell molekuláris mechanizmusa (TCR: T sejt receptor, GPI: glükóz-6-foszfát izomeráz, APC: antigén prezentáló sejt) APC Plazmasejt B sejt forrás: Ditzel (2004), Trends Mol Med. Az artritogén vagy kontroll szérumot ( µl) i.p. adtuk a 0. és 3. napon. A lábtérfogatot pletizmométerrel, az érintési érzékenységet eszteziométerrel, a fájdalmas hőköszüböt emelkedő hőmérsékletű forró lapon mértük. A hidegtoleranciát 0 C-os vízfürdőben lábkihúzási latenciával, az ízületi funkciót kapaszkodási teszttel, az artritisz súlyosságát a súlyvesztés mértékével és szemikvantitatív pontozással vizsgáltuk két héten keresztül. A csontkárosodást microct-vel, az ízületi mátrix metalloproteináz (MMP)-aktivitást fluoreszcens molekuláris tomográfiával, a mieloperoxidáz (MPO)- aktivitást Luminol módszer segítségével mértük. A tibiotarzális ízületekből szemikvantitatív szövettani pontozást illetve radioimmunoassay (RIA) módszerrel szomatosztatin szint meghatározást végeztünk (10. ábra). 10. ábra K/BxN modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia, ödéma, súlyvesztés és ízületi funkcióvesztés eredményeink esetén Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t; a klinikai súlyossági és a szövettani szemikvantitatív pontszámok esetén Dunn-féle posztteszttel kiegészített Kruskal-Wallis tesztet; míg a micro-ct-vel nyert eredmények esetén Dunett és Tukey poszttesztekkel kiegészített kétutas ANOVA-t alkalmaztunk. A biolumineszcens és - 20

21 fluoreszcens képalkotás és a szomatosztatin koncentrációk mérésének eredményeit Student-féle t-teszttel értékeltük. Minden esetben a pozitív szérumot kapott, RTXelőkezelt vs. nem előkezelt csoportok összehasonlításakor a *p<0.05, **p<0.01 és ***p<0.001, illetve a pozitív vs. negatív szérumot kapott csoportok összehasonlításakor a ## p<0,01 és ### p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. A negatív szérummal kezelt állatok száma 4-5, a pozitív szérummal kezelteké 6-8 volt csoportonként PAR2 aktiváció által kiváltott ízületi gyulladás Az akut ízületi gyulladást PAR2 agonista térdízületbe illetve talpba történt beadásával váltottuk ki. források: Cottrell és mtsai. (2003), Biochem Soc Trans.; Paus és mtsai. (2006), J Clin Invest. 11. ábra A PAR-2 indukált gyulladás mechanizmusa A PAR2 szerepe gyulladásos reakciók kiváltásában és fenntartásában ismert tény (Lindner és mtsai., 2000). A bőrben PAR2 agonista beadásának hatására gyulladásos változások jönnek létre (Seelinger és mtsai, 2003), melyeknek hátterében idegi mechanizmusok állnak a folyamatot P-anyag és CGRP felszabadulás kíséri a kapszaicin-érzékeny, TRPV-1-et expresszáló idegelemekből (Steinhoff és mtsai., 2000; Coelho és mtsai., 2003). A beidegzett területen a CGRP felelős a jelentős értágulat létrejöttéért, valamint elősegíti az SP ödémaképző, leukocita kitapadást és plazma 21

22 extravazációt kiváltó hatását (11. ábra, 2. táblázat). A PAR2 aktiváció ízületekben betöltött szerepéről azonban igen kevés in vivo adat áll rendelkezésünkre (Russell and McDougall, 2009). Egerek esetében a mechanikai hiperalgéziát, patkányoknál a mechanikai allodíniát mértük eszteziométer segítségével a PAR2 agonista beadása után 6 órán keresztül, óránként. Patkányoknál a hiperalgézia meghatározására a Randall-Sellitto teszt szolgált. A fájdalom hatására kialakuló végtagok közötti spontán súlyeloszlásváltozás mértékét incapacitance teszterrel határoztuk meg, a lábduzzadás mértékét pletizmométerrel, míg a térdátmérő változásait mikrométerrel tudtuk detektálni. A kísérlet végén az eltávolított hátsó végtagok/térdízületek homogenizátumaiból a gyulladásos citokinek közül a TNFα és IL-1β koncentrációi kerültek meghatározásra ELISA módszerrel (12. ábra). 12. ábra PAR-2 agonista által kiváltott ízületi gyulladás modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia, allodínia, spontán fájdalom és ödéma eredményeink értékelésénél Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t alkalmaztunk, míg a gyulladásos citokin-koncentrációk mérésének eredményeit Student-féle t-teszttel értékeltük. Patkányok esetében az aktív vs. inaktív peptiddel kezelt csoportok összehasonlításakor a *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ill. az aktív peptiddel vs. aktív peptiddel + antagonistával kezelt csoportok összehasonlításakor a # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. Egerek esetében az aktív vs. inaktív peptiddel kezelt WT csoportok összehasonlításakor a *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, az aktív peptiddel kezelt WT vs. TRPV1 -/- csoportok összehasonlításakor a # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001, illetve az aktív vs. inaktív peptiddel kezelt TRPV1 -/- csoportok összehasonlításakor a + p<0,05, ++ p<0,01 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. Az állatok száma 7-11 volt csoportonként. 22

23 2.3. CFA-indukált artritisz A reumatoid artritisz nemzetközileg elfogadott állatkísérletes modelljét alkalmaztuk (Hietala és mtsai., 2002). A krónikus ízületi gyulladást komplett Freund-adjuváns (CFA: complete Freund s adjuvant; 1 mg/ml hővel elölt Mycobacterium tuberculosis paraffinolajos szuszpenziója) faroktőbe, valamint intraplantárisan történő adásával váltottuk ki az egerekben. A komplett adjuváns adásával a szervezet immunválaszkészsége stimulálható. A baktérium sejtfalában található muramil-dipeptid aktiválja a makrofágokat és a dendritikus sejteket, amely IL-12, IL-6, TNFα, IFN- fokozódó termeléséhez vezet. Ennek hatására poliklonális T limfociták aktiválódnak, elsősorban Th1 (CD4+) irányba differenciálódnak és limfokineket termelnek. Az adjuváns alkalmazásának helyén a sajtos granulóma képződésért a makrofágok fokozott mértékű antigén-feldolgozása felelős, a krónikus poliartritisz kialakulásában CD4+ T sejt klónok aktiválódása játszik szerepet (Joe és Wilder 1999; Billiau és Matthys 2001). Bár a CFAadás oldalán súlyosabb ízületi gyulladás alakul ki, az ellenoldalon is megfigyelhetők az artritisz jellemző tünetei (13. ábra, 2. táblázat). CFA mikobaktériumok kemokinek Fibroblasztok, stróma sejtek 13. ábra A CFA modell molekuláris mechanizmusa (IFN-γ: interferongamma, MPC: mononukleáris sejt, DC: dendritikus sejt, NK: natural killer sejt) NK sejt forrás: Billiau és Matthys (2001), J Leukoc Biol. A gyulladást CFA faroktőbe, valamint intraplantárisan történő adásával (50-50 μl) váltottuk ki az egerekben. A szisztémás hatás fokozása érdekében a faroktőbe történő CFA-adást a következő napon megismételtük, ezt a napot tekintettük a kísérlet első napjának (14. ábra). A mechanonociceptív küszöböket eszteziométerrel, a lábtérfogatot pedig pletizmométer segítségével mértük a kísérlet előtt, majd 21 napon keresztül a CFA-adás után. A kísérlet végén az állatok Na-pentobarbitallal (Nembutal, 100 mg/kg i.p.) történő túlaltatása után a tibiotarsalis ízületeket kimetszettük. Az így nyert 23

24 preparátumok egy részéből szövettani metszeteket készítettünk, másik részét citokinmeghatározás céljából feldolgoztuk (14. ábra). 14. ábra CFA modell vizsgálati elrendezése Statisztikai módszerek: A hiperalgézia és ödéma eredményeink értékelésénél Bonferroni módosított posztteszttel kiegészített kétutas ANOVA-t, míg a gyulladásos citokin-koncentrációk és szövettani szemikvantitatív pontszámok esetén Dunn-féle posztteszttel kiegészített Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. Minden esetben a génhiányos vs. WT csoportok összehasonlításakor a *p<0.05, **p<0.01 és ***p<0.001, illetve az intakt vs. CFAkezelt C57Bl/6 csoportok összehasonlításakor a +++ p<0.001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak. Az intakt állatok száma 4, a CFA-kezelteké 9-24 volt csoportonként. Szérumtranszfer artritisz PAR2- indukált artritisz CFA-indukált artritisz lefolyás krónikus akut krónikus érintett ízületek száma poliartritisz monoartritisz döntő mértékben monoartritisz kiváltó antigén G6PI - Hsp65 legfontosabb résztvevő sejttípusok legfontosabb résztvevő citokin(ek) neutrofil granulociták, makrofágok IL-1, TNF (változó) idegsejtek, hízósejtek IL-1 makrofágok, T és B sejtek TNF, IL-1, IL-6 2. táblázat Kísérleti modelljeink főbb jellemzői 24

25 forrás: Anand és Bley (2011), Br J Anaesth. 15. ábra Az RTX-előkezelés molekuláris hatása 3. Farmakológiai módszerek 3.1. RTX-deszenzibilizáció Az egerek egy csoportjának a kísérlet előtt resiniferatoxin (RTX, Sigma- Aldrich) emelkedő dózisait (30, 70, 100 μg/kg s.c. 3 egymást követő napon) adtuk, ezzel a kapszaicinérzékeny érzőidegvégződéseket testszerte működésképtelenné tettük (deszenzibilizáció; 15. ábra) (Szolcsányi, 1990). 14 nappal később a deszenzibilizáció sikerességét kapszaicin (50 μl, 0.1%) szembe cseppentésével ellenőriztük (wiping test) (Helyes és mtsai., 2004) PAR2 aktiváció Az akut ízületi gyulladást PAR2-aktiváló peptid, SLIGRL-NH 2 (Sigma-Aldrich, Magyarország) segítségével váltottuk ki, melyet egerek talpába (s.c injekció formájában, 100 µg/50 µl), illetve egerek (100 µg/50 µl) és patkányok (100 µg/100 µl) térdízületébe adtunk izoflurán anesztézia mellett. A kontroll csoport állatainak lábába/térdébe inaktív peptidet, LRGILS-NH 2 -t adtunk az aktív peptiddel megegyező koncentrációban és térfogatban. Patkányok egy csoportját szelektív TRPV1 antagonista, SB gyel (50 µg/kg i.p.; Varga és mtsai., 2005) kezeltük elő 15 perccel az intraartikuláris SLIGRL-NH 2 injekció, illetve az egyes mérések előtt, a TRPV1 receptorok szerepének vizsgálata érdekében. 25

26 4. Vizsgálati módszerek 4.1. Mechanonociceptív küszöb mérése eszteziométerrel A talp érintési érzékenységét Ugo Basile dinamikus plantáris eszteziométerrel (Olaszország) (16. ábra) mértük. 16. ábra Ugo Basile eszteziométer Az egerek/patkányok szabadon mozoghattak egy alul rácsos plexiketrecben, amiben a kísérlet előtt kb percig kondícionáltuk őket. Ezután a tükörrel ellátott stimulátoregység segítségével az állatok talpának középső részét egy tompahegyű tűvel fokozódó erőhatásnak tettük ki. A maximális erőhatást egerek esetén 10 grammban, patkányok esetén 50 grammban határoztuk meg, az erőhatás növekedési dinamikáját 2 g/s értékre állítottuk be. Amikor az állat elrántja a lábát, a számláló leáll, és a kijelzőről grammban leolvasható az erőhatás mértéke, ami megfelel a mechanonociceptív küszöbnek. A gyulladás hatására létrejövő küszöbcsökkenés mértékét, melyet az egerek vizsgálatánál hiperalgéziának (enyhe fájdalmat kiváltó inger hatására fokozódó fájdalomérzet), míg patkányok esetén allodíniának (alapvetően nem fájdalmas stimulus hatására kialakuló érzékenység fokozódás) nevezünk, a kísérlet előtt meghatározott kontrollértékekhez viszonyítva, százalékban adtuk meg (Bölcskei és mtsai., 2005) Mechanonociceptív küszöb mérése analgeziméterrel Patkányok hátsó lábán a mechanikai hiperalgéziát Ugo Basile analgeziméter 17. ábra Ugo Basile analgeziméter segítségével (Olaszország) határoztuk meg (Randall-Sellitto teszt) (17. ábra). Ebben az esetben egy tompahegyű plexikúppal fokozódó erőhatásnak tesszük ki az patkány lábhátát. Amikor az állat kirántja a lábát a kúp alól, a műszerről leolvasható a mechanonociceptív küszöb. A hiperalgéziát százalékban fejeztük ki a kontroll értékekhez viszonyítva (Sándor és mtsai., 2006). 26

27 4.3. Spontán súlyeloszlás mérése incapacitance teszterrel Egerek illetve patkányok hátsó lábaikra való spontán nehézkedés mértékét a Linton 18. ábra Linton Instrumentation Incapacitance teszter Instrumentation incapacitance teszter (Norfolk, Anglia) nevű készülékével állapítottuk meg (18. ábra). A készülékbe beépített két kis mérlegre állítottuk az állatokat, melyek külön-külön mérték a jobb és bal lábra eső terhelést grammban. A jobb lábak kezelése után, az erre eső százalékos terheléscsökkenést a következő egyenlet segítségével számoltuk ki: [jobb láb terhelés/(jobb láb terhelés+bal láb terhelés)] x 100. Az így kapott értékeket ábrázoltuk a kiindulási értékekhez viszonyítva Fájdalmas hőküszöb mérése emelkedő hőmérsékletű forró lapon (hot plate) 19. ábra IITC Life Sciences emelkedő hőmérsékletű forró lap A talp fájdalmas hőküszöb értékét IITC Life Science emelkedő hőmérsékletű forró lap (increasing temperature hot plate) (Woodland Hills, Egyesült Államok) segítségével határoztuk meg, mely fokozatosan, előre meghatározott dinamikával növeli a fűthető lap hőmérsékletét (19. ábra). A vizsgált állatok egy plexidobozban szabadon mozoghatnak, miközben a doboz alatt elhelyezkedő fém lapot melegítjük. A fájdalmas hőküszöb elérésekor az állatok rázzák, emelik vagy nyalogatják a fájdalmas végtagot. Ekkor a mérést leállítjuk és a műszer kijelzőjéről leolvasható a fájdalom létrejöttéhez szükséges küszöbhőmérséklet 0 C-ban. A gyulladás hatására megváltozott hőküszöb értékeket a kísérlet előtt felvett kontroll értékekhez viszonyítjuk, így megkapjuk a fájdalmas hőküszöb csökkenésének mértékét (Almási és mtsai., 2003). 27

28 4.5. Lábduzzadás mérése pletizmométerrel 20. ábra Ugo Basile pletizmométer A lábtérfogatot Ugo Basile Plethysmometer (Olaszország) (20. ábra) segítségével mértük, amely műszer a közlekedőedények elve alapján működik. A műszerhez tartozó, folyadékkal telt hengerbe merítjük az egerek hátsó lábát egy meghatározott jelig. A hengerhez csatlakozó szintén folyadékkal telt edényben ezáltal folyadéktérfogat-változás jön létre, melynek mértékét a benne található transzducer érzékeli. Így a láb térfogatát cm 3 -ben leolvashatjuk a digitális kijelzőről. A létrejött lábtérfogat változást, azaz ödémát, az artritisz kiváltása előtt mért kontrollértékekhez viszonyítva, százalékban adtuk meg (Helyes és mtsai., 2004) Térdátmérő mérése mikrométerrel 21. ábra Mitutoyo digitális mikrométer A térdek anteroposterior és mediolaterális átmérőit Mitutoyo digitális mikrométer (Japán) segítségével határoztuk meg (21. ábra). Az állatok térdét a műszer két kis karja közé illesztve a digitális kijelzőn leolvasható a térd átmérője mm-ben. A gyulladás hatására kialakuló térfogatnövekedést százalékosan ábrázoltuk a kiindulási értékekhez viszonyítva Ízületi gyulladás megítélése szemikvantitatív pontozással A mellső és hátsó lábakat is érintő gyulladás esetén a végtagokat az ödéma és a pirosság mértéke alapján szemikvantitatívan pontoztuk 0 és 10 pont között. 0-0,5 pont tartozott a legenyhébb, míg 10 pont a legsúlyosabb elváltozásokhoz (Jakus és mtsai., 2010). 28

29 4.8. Ízületi funkció megítélése (horizontal wire grid test) 4.9. In vivo imaging A vizsgálat során az állatok ízületeinek funkcióját monitorozzuk. A kísérleti állatok egy rácson lefelé lógva eltöltött idejét mérjük (22. ábra), maximum 30 másodpercig. Az ízületek funkcionális zavara esetén ez az idő jelentősen lerövidülhet. A vizsgálat során mért eredményeket összehasonlítva a kísérlet előtti kontroll értékekkel a funkcióban bekövetkezett változás mértéke meghatározható (Botz és mtsai., 2014). Ezen vizsgálatok elvégzése nem saját, hanem Dr. Botz Bálint kollégám munkája. Elvük bemutatására a velük kapott eredmények értelmezhetősége céljából kerül sor In vivo mieloperoxidáz aktivitás mérés A B 23. ábra MPO aktivitás (A) kontroll körülmények között és (B) artritiszes állatokban A luminol (5-Amino-2,3-dihidro-1,4- ftálazindion) biolumineszcencia szoros korrelációt mutat az atritisz során megfigyelhető neutrophil mieloperoxidáz aktivitással (Chen és mtsai., 2004; Gross és mtsai., 2009). A PBS-ben oldott Na-luminolt (Sigma-Aldrich, Magyarország) intraperitoneálisan alkalmaztuk 150 mg/kg dózisban, majd a biolumineszcencia mértékét a luminol beadását követően 10 perccel IVIS Lumina II (PerkinElmer, Waltham, Egyesült Államok) készülékkel mértük (23. ábra). A bokák felett meghatározott területeken (Regions of Interests) a lumineszcencia mértékét teljes sugárzásként adtuk meg (total flux/s). 22. ábra Grid teszt In vivo mátrix-metalloproteináz aktivitás mérés A matrix-metalloproteináz (MMP) aktivitás mérése MMPSense680 (PerkinElmer) festék segítségével történt 2 nmol/egér dózisban. Ez egy aktiválható fluoreszcens festék, mely az MMP-2, -3, -9 és -13 kimutatására alkalmas. A méréseket az FMT 2000 fluoreszcens molekuláris tomográf rendszer (PerkinElmer) segítségével végeztük el 24 29

30 A B 24. ábra MMP aktivitás (A) kontroll körülmények között és (B) artritiszes állatokban órával a festék beadása után. A bokák területéről háromdimenziós rekonstrukciós felvételek készültek (24. ábra), és a meghatározott területek felett mérhető MMP aktivitást pmol fluorofór mértékegységgel adtuk meg A periartikuláris csontstruktúra in vivo vizsgálata micro-ct segítségével 25. ábra Bokaízület 3D rekonstrukciós felvéte Szövettani vizsgálat A tibiotarzális ízületet SkyScan 1176 in vivo micro-ct (Bruker, Kontich, Belgium) segítségével vizsgáltuk (voxel méret: 17.5 μm). Az artritisz hatására a csontstruktúrában bekövetkezett változásokat CT Analyser software használatával elemeztük (25. ábra). Egységes méretű ROI-kat alkalmaztunk a tibia és a fibula periartikularis régióiban illetve a tibiotarzális és tarzometatarzális ízületek felett. A csonttérfogatot (bone volume; BV) μm 3 -ben meghatároztuk és százalékos arányban ábrázoltuk a teljes ROI térfogathoz (total volume; TV) képest (BV/TV). A kísérletek végén, a túlaltatás után, a tibiotarsalis ízületeket kimetszettük. A mintákat fixáltuk - 8 órára 4%-os pufferolt formalinba helyeztük. Ezután következett a dekalcinálás 4 C-on, 8 órán keresztül, 7 V/V% AlCl 3 -ot, 5 V/V% hangyasavat, és 8,5 V/V% sósavat tartalmazó oldat segítségével (Schwab és mtsai., 1997). Amikor az ízületek kellően felpuhultak, Sörensen-féle foszfát-pufferben 8 órán keresztül mostuk, majd dehidráltuk a mintákat 8-8 óráig 4 C-on V/V%-os szacharóz-oldatokban. Végül paraffinba ágyaztuk, mikrotómmal 5-7 μm-es szeletekre vágtuk és hematoxilineozinnal vagy safraninnal megfestettük (Helyes és mtsai., 2004). A metszeteken látható, gyulladás okozta elváltozásokat a kísérletektől független patológus értékelte előre meghatározott paraméterek alapján, melyek komplett Freundadjuvánssal kiváltott gyulladás esetén: - a szinovium mononukleáris sejtes infiltrációja - a szinoviális sejtréteg hiperpláziája 30

31 - a porcdestrukció mértéke - a csonterózió mértéke, míg szérum-transzfer artritisz esetén: - a szinovium mononukleáris sejtes infiltrációja - a szinoviális sejtréteg hiperpláziája - a fibroblaszt képződés és kollagén lerakódás mértéke voltak. Minden paraméter esetén 0-3-ig terjedő skálán történt a pontozás, 0 pont tartozott a legenyhébb, míg 3 pont a legsúlyosabb elváltozásokhoz. A vizsgálat végén a pontszámokat összeadtuk, így az egyes metszetekhez, és ezáltal az egyes állatcsoportokhoz tartozó összetett artritisz pontszámot kaptuk meg (Weinberg és mtsai., 2003) Gyulladásos citokinek koncentrációinak meghatározása A tibiotarsalis ízületeket 80 o C-on tároltuk a vizsgálat megkezdéséig. A feldolgozást megelőzően a minták tömegét fagyottan megmértük, majd homogenizáló oldatba helyeztük őket. Az oldat 100:1 arányban tartalmazott RPMI 1640 tápoldatot (Biochrom Ltd., Berlin, Németország) és proteáz gátlót (fenil-metil-szulfonil-fluorid, PMSF, Sigma-Aldrich Kft.). Ezután késes homogenizátor (Kika Labortechnik, Németország) segítségével egyenként 3-3 percig fordulat/perc sebességgel homogenizáltuk. A homogenizátumokat 10 percig, fordulat/perc sebességgel 0 o C-on centrifugáltuk (Janetzky K24), a felülúszókat -20 o C-on tároltuk. A gyulladásos citokinek koncentrációi ELISA módszerrel kerültek meghatározásra. Végül 450 nm-en optikai denzitásértékeket mértünk, majd egy standard sor segítségével számoltuk ki a koncentrációértékeket, pg/g nedves szövet egységben megadva Etikai vonatkozások Kísérleteink minden esetben megfelelnek az állatkísérletek végzéséről szóló 1998/XXVIII. számú kormányrendelet előírásainak, és igazodnak a fájdalom tanulmányozására létrehozott nemzetközi tanács javaslataihoz. A kísérleti eljárásokat a Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottsága engedélyezte (engedélyszám: BA 02/2000 2/2012). 31