(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 31/198 ( ) A61K 31/33 ( ) A61K 31/37 ( ) A61K 31/401 ( ) A61K 33/04 ( ) A61K 33/06 ( ) A61K 33/32 ( ) A61K 33/34 ( ) A61K 36/82 ( ) A61P 9/00 ( ) A61P 9/ ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 04/ (30) Elsõbbségi adatok: US US (72) Feltalálók: Rath, Matthias, 6422 PC Heerlen (NL); NIEDZWIECKI, Aleksandra, San Jose, CA 9129 (US); IVANOV, Vadim, Castro Valley, CA 942 (US); ROOMI, Waheed, Sunnyvale, CA (US) (73) Jogosult: Rath, Matthias, 6422 PC Heerlen (NL) (74) Képviselõ: Schläfer László, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Gyógyszerkészítmény, amely többek között C-vitamint, magnéziumot, zöldtea-kivonatot tartalmaz, kardiovaszkuláris betegségek (SMC proliferáció) késleltetésére HU T2 A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A jelen találmány tárgya gyógyszerkészítmény kardiovaszkuláris betegségek emlõsben történõ enyhítésére vagy késleltetésére, amelyekre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja, ahol a készítmény tartalmaz lizint, prolint, arginint, C¹vitamint, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet, mangánt, és egy hordozóanyag, egy hígítószer és egy kötõanyag közül megválasztott gyógyszerészetileg alkalmazható komponenst, ahol a gyógyszerkészítmény a gyógyszerészetileg alkalmazható komponens nélkül tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. A kardiovaszkuláris betegségek képezik a halálozás fõ okát a nyugati országokban és szerte a világon. A káros kardiovaszkuláris események többségét az okozza, hogy ateroszklerotikus sérülések alakulnak ki a koronáriás és cerebrális artériákban. Az artériás simaizomsejtek abnormális növekedése az egyik legfontosabb lépés az ateroszklerózis kialakulásában. Patológiás stimulálás hatására a simaizomsejtek elõször az artériás érfal középsõ rétegébõl az intimarétegbe migrálnak, és azután az intimarétegben proliferálódnak. Ezek az események döntõ jelentõségûek az ateroszklerotikus plakkok kezdeti kialakulásában. Az ateroszklerotikus sérüléseknek az intimarétegben történõ kialakulása sok kardiovaszkuláris betegségnél megjelenik, melyekre példaként említhetõ a hipertenzió, ateroszklerózis, miokardiális ischaemia, infarktus és stroke [R. Ross: Cellular Mechanisms of Atherosclerosis, Atherosclerosis Review, 3(2) ]. Ezért szükség van arra, hogy megelõzzük a simaizom növekedésének patológiás stimulálását. A gyulladásos válasz, akár akut, akár krónikus alacsony szintû, egy súlyosbító faktor, ami stimulálja és gyorsítja az ateroszklerotikus sérülések kialakulását. Az ateroszklerotikus folyamat részeként monociták szûrõdnek be a véredények falába, köztük az endotéliumba. Az artéria falán belül maradó monociták oxidált lipideket halmoznak fel, a lipidekkel túltöltõdnek, és habsejtekké alakulnak. A habsejtek az ateroszklerotikus sérülések egyik fõ jellemzõi. Szükség van ezért arra, hogy csökkentsük vagy késleltessük az ilyen habsejtek kialakulását az artériák falában, és a monocitáknak a véráramból az artériák falába történõ beépülését. A monocitáknak az artériák falához való közeledését inflammatorikus közvetítõknek az artériás simaizomsejtekben történõ kiválasztódása váltja ki. Az ilyen közvetítõk közé tartozik az MCP 1. Adhéziós molekulák, így P¹szelektin és ICAM 1 expressziója elõsegíti a monociták kezdeti adhézióját az artériák falán, és ennek következtében az artéria falának belsõ oldalára történõ penetrációt. Az inflammatorikus válasz kaszkád részét képezi az interleukin 6 (IL 6) és interleukin 1 (IL 1) expressziója és kiválasztódása. Ezek a közvetítõk legalább két funkcióért felelõsek. Kiváltják a szisztémiás inflammatorikus választ, beleértve monociták további behatolását. A másik hatás, hogy a citokinok a simaizomsejteket autokrin válaszra késztethetik, ami azt jelenti, hogy a sejtek folyamatosan szabadítják fel ezeket az inflammatorikus közvetítõket, ami a patológiás sejt stimulálás visszatérõ ciklusát váltja ki. Ezért arra is szükség van, hogy csökkentsük az inflammatorikus válasz közvetítõk, így az IL 1, IL 6, MCP 1 és hasonlók expresszióját és felszabadulását. Régóta szükség van olyan biztonságos és hatásos gyógyszerkészítmény és módszer kidolgozására, amely lehetõvé teszi emlõsökben patológiás folyamatok, elsõsorban a kardiovaszkuláris rendellenességek, és krónikus vagy alacsony szintû inflammatorikus válasszal összefüggõ folyamatok enyhítését. Szükség van továbbá olyan vegyületekre és anyagokra, amelyek lehetõvé teszik az ateroszklerózis és gyulladás mellékhatások nélküli kezelését. Ezenkívül szükség van olyan vegyületekre és anyagokra, amelyek lehetõvé teszik ateroszklerózis, arterioszklerózis kialakulásának késleltetését és a krónikus és alacsony szintû inflammatorikus válasz késleltetését, költséges gyógyszerhatóanyagok helyett olcsó, és gyógyszernek nem minõsülõ anyagok és vegyületek alkalmazásával. A WO 03/07201 számú irat egy élelmiszerként alkalmazható gyógyszerkészítményt ismertet, amely egy aszkorbinsavvegyületet, egy lizinvegyületet, egy prolinvegyületet és egy polifenolvegyületet tartalmaz, és felhasználható rák, valamint inflammatorikus betegségek kezelésére. Ivanov és munkatársai egy International Congress in Washington DC, USA ülésen július 14¹én egy poszteres bemutatón aszkorbinsav, lizin, prolin, arginin, cisztein és zöldtea-kivonat keverékét ismertették, amely simaizomsejtekben elnyomja az autokrin inflammatorikus választ. Ennek megfelelõen a jelen találmány alapját képezõ technikai probléma úgy tekinthetõ, mint olyan eszközök és módszerek biztosítása, amelyek megfelelnek a fent említett igényeknek. Közelebbrõl a jelen találmány feladata olyan gyógyszerkészítmény kidolgozása, amely alkalmas kardiovaszkuláris betegségek emlõsben történõ enyhítésére vagy késleltetésére, melyekre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja, amely tartalmaz lizint, prolint, arginint, C¹vitamint, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet, mangánt és egy hordozóanyag, egy hígítószer és egy kötõanyag közül megválasztott gyógyszerészetileg alkalmazható komponenst, ahol a gyógyszerkészítmény a gyógyszerészetileg alkalmazható komponens nélkül tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. A kardiovaszkuláris betegségekre példaként említhetõ az ateroszklerózis és arterioszklerózis. A technikai probléma megoldását, vagyis a kardiovaszkuláris betegségek kezelését jelentik az igénypontban megadott és a késõbb ismertetett megvalósítási formák. A találmány oltalmi körét az igénypontok határozzák meg. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgyát képezik gyógyszerkészítmények és módszerek kardiovaszkuláris betegségek kezelésére, melyekre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgya gyógyszerkészítmény kardiovaszkuláris betegségek emlõsben történõ enyhítésére vagy késleltetésére, melyekre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja, amely 2

3 1 HU T2 2 tartalmaz lizint, prolint, arginint, C¹vitamint, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet, mangánt és egy hordozóanyag, egy hígítószer és egy töltõanyag közül megválasztott gyógyszerészetileg alkalmazható komponenst, ahol a gyógyszerkészítmény a gyógyszerészetileg alkalmazható komponens nélkül tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. A jelen találmánnyal összefüggésben hivatkozott emlõs elõnyösen ember, kutya, macska vagy ló. Különösen elõnyösen az ember egy menopauza utáni nõ. A jelen találmány tárgya eljárás ateroszklerózissal, arterioszklerózissal összefüggõ patológiás állapotok emlõsben történõ enyhítésére, melynek során a kezelést igénylõ emlõsnek hatékony mennyiségben olyan gyógyszerkészítményt adagolunk, amely a következõ vegyületeket tartalmazza az alábbi arányokban: mintegy rész lizin, mintegy 000 rész prolin, mintegy 8000 rész arginin, mintegy rész aszkorbinsav, mintegy rész magnézium, mintegy rész zöldtea-kivonat, mintegy 000 rész N¹acetil-cisztein, mintegy rész szelén, mintegy 0 rész réz és mintegy 200 rész mangán, ahol a gyógyszerkészítmény tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. Megjegyezzük, hogy a találmánnyal kapcsolatban hivatkozott rész kifejezések nem jelentenek abszolút értékeket. Inkább azokat az arányokat definiálják, amelyekben az anyagoknak jelen kell lenniük. Így például abban az esetben, ha egy készítmény 12, rész lizint és 7, rész prolint tartalmaz, akkor a készítmény a lizint és a prolint olyan arányban tartalmazza, amely megfelel rész lizinnek (12, 2000) és 000 rész prolinnak (7, 2000), ahogy a jelen találmánnyal kapcsolatban megadjuk. A fent említett módon adagolandó gyógyszerkészítmény különösen elõnyösen tartalmaz mintegy 2 mg lizint, mintegy mg prolint, mintegy 8 mg arginint, mintegy 80 mg aszkorbinsavat, mintegy 30 mg magnéziumot, mintegy 0 mg zöldtea-kivonatot, mintegy mg N¹acetil-ciszteint, mintegy mcg szelént, mintegy 0 mcg rezet és mintegy 200 mcg mangánt, ahol a gyógyszerkészítmény tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. A jelen találmány tárgya eljárás ateroszklerózissal, arterioszklerózissal összefüggõ patológiás állapotok emlõsben történõ enyhítésére, melynek során a kezelést igénylõ emlõsnek hatékony mennyiségben olyan gyógyszerkészítményt adagolunk, amely tartalmaz lizint, prolint, arginint, C¹vitamint, magnéziumot, zöldteakivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet, mangánt, és egy hordozóanyag, egy hígítószer és egy kötõanyag közül megválasztott gyógyszerészetileg alkalmazható komponenst, ahol a gyógyszerkészítmény tartalmaz 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot. Adott esetben a készítmény hatékony mennyisége az alábbi napi dózis: mintegy 0,3 mg/kg lizin, 0,2 mg/kg prolin, 0,1 mg/kg arginin, 1,1 mg/kg C¹vitamin, 0,4 mg/kg magnézium, 0,7 mg/kg zöldtea-kivonat és 0,2 mg/kg N¹acetil-cisztein. A gyógyszerkészítmény elõnyösen orális vagy parenterális formában van. Az orális forma különösen elõnyösen tabletta vagy kapszula. A gyógyszerkészítmény elõnyösen adagolható orálisan, intravénásan vagy parenterálisan. A jelen találmány tárgya készítmény krónikus vagy alacsony szintû inflammatorikus válasszal összefüggõ patológiás állapotok kezelésére, amely tartalmaz lizint, prolint, arginint, aszkorbinsavat, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet és mangánt. Egyetlen pirula vagy kapszula adagolásával a készítmény az alábbi dózist adja le: mintegy 0,3 mg/kg lizin, 0,2 mg/kg prolin, 0,1 mg/kg arginin, 1,1 mg/kg C¹vitamin, 0,4 mg/kg magnézium, 0,7 mg/kg zöldtea-kivonat és 0,2 mg/kg N¹acetil-cisztein. A pirula vagy kapszula adagolását adott esetben naponta ismételjük krónikus vagy alacsony szintû gyulladás hatékony késleltetéséhez. A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények hatékonyan gátolják a simaizomsejtek proliferációját. A készítmények ezért klinikailag alkalmazhatók, például antihipertenziós szerként. A simaizomsejtek proliferációjának csökkentésével a készítmények értágítóként mûködnek, és csökkentik a teljes perifériás érrendszer ellenállását. Ezenkívül a jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények gátolják a simaizomsejtek proliferációját, ami ateroszklerózis kialakulását és kifejlõdését okozza. A jelen találmány alapját képezõ in vitro kísérletek igazolják a készítmények potenciális hatását a proliferáció gátlásában ( 3 H-timidin beépülése alapján mérve). Ezáltal a készítmények enyhítik az ateroszklerózis kialakulását. A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények ezenkívül gátolják a simaizomsejtek migrálását, és így enyhítik az ateroszklerózis kialakulását és kifejlõdését. A középsõ simaizomsejtek intimába történõ kemotaktikus migrálása egy fontos elsõ lépés a neointima képzõdés patogenezisében az ateroszklerózis folyamán. A feltételezések szerint a PDGF az egyik legfontosabb anyag a simaizomsejtek migrálódásának elõsegítésében [Russel R: N. Engl. J. Med., 314, (1986)]. Az ismertetett készítmények a miointima képzõdését in vivo gátló képessége részben összefügghet azzal, hogy közvetlenül gátolják a vaszkuláris simaizomsejtek fizikai migrálását a középsõ hártyából az intimahártyába. Ennek megfelelõen egy másik megvalósítási mód értelmében a jelen találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely tartalmaz lizint, prolint, arginint, aszkorbinsavat, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet és mangánt és egy gyógyszerészetileg alkalmazható kötõanyagot, simaizomsejtek proliferációjának emlõsben, elõnyösen emberben történõ gátlására, elõnyösen a véredényekben történõ proliferáció gátlására olyanoknál, akik ki vannak téve szívbetegség kialakulása veszélyének; ateroszklerózis kialakulásának gátlására. Egy másik megvalósítási mód értelmében a jelen 3

4 1 HU T2 2 találmány tárgya továbbá eljárás simaizomsejtek proliferációjának és migrálásának emlõsben, elõnyösen emberben történõ gátlására, elõnyösen eljárás a vérerekben történõ proliferáció megelõzésére olyanoknál, akik ki vannak téve szívbetegség kialakulása veszélyének, ateroszklerózis kialakulásának gátlására, melynek során ezt igénylõ betegnek hatékony mennyiségben ismertetett gyógyszerkészítményt adagolunk, amely tartalmaz lizint, prolint, arginint, aszkorbinsavat, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet és magnéziumot és gyógyszerészetileg alkalmazható kötõanyagot. A jelen találmány szerinti készítmények hatékonyan gátolják a vaszkuláris simaizomsejtek proliferációját és migrációját, amit különbözõ mitogének széles köre közvetíthet. A jelen találmány szerinti készítmények hatékonyan gátolják simaizomsejtek ösztrogén által kiváltott proliferációját és invázióját. Szabályozzák a vérnyomást, valamint ateroszklerotikus plakkok kialakulását. A komponensek, így például a lizin és prolin kombinált hatása megelõzi a kötõszövetek súlyos degradálódását, ami viszont gyengíti a proliferáció és invázió folyamatát. Emellett a zöldtea-kivonat és C¹vitamin tompítják a kötõszövetek degradálódását antioxidáns tulajdonságaik alapján. Meglepõ módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményben jelen lévõ komponensek szinergetikus módon hatva közömbösítik az ösztrogén hatását a kardiovaszkuláris degradálódásra és rák kifejlõdésére. Elõnyös módon egy biztonságos és hatékony gyógyszerkészítményrõl és terápiás módszerrõl van szó a fent említett patológiás állapotok emlõsben történõ enyhítésére anélkül, hogy a találmány szerinti vegyületek és anyagok kimutatható mellékhatásokat váltanának ki. Emellett a találmány szerinti készítményekben és terápiás módszerekben drága gyógyszerhatóanyagok helyett olcsó, és gyógyszernek nem minõsülõ anyagokat és vegyületeket alkalmazunk. Ahogy itt alkalmazzuk, az enyhítjük kifejezés azt jelenti, hogy a jelen találmánnyal összefüggésben említett patológiás állapotokhoz társult szindrómákat csökkentjük, gátoljuk, gyengítjük vagy kezeljük. Az enyhítés nyilvánvalóvá válik a kezelõorvos számára, ha követi az adott patológiás állapothoz társult szimptómákat. A szimptómákat részletesen ismertetik a szokásos kézikönyvek, így például Stedman vagy Pschyrembel. Az enyhítés elõnyösen szignifikáns csökkentést, gátlást, gyengítést vagy kezelést jelent. A szignifikancia a statisztika szokásos módszereivel meghatározható, melyekre példaként említhetõ a Student-féle t¹teszt, a legkisebb négyzetek módszere és hasonlók. A jelen találmánnyal kapcsolatban említett szindrómák elõnyösen az ösztrogénterápiával kezelt menopauza utáni nõknél szokásos szindrómák. Az ösztrogénterápia szindrómái általánosan ismert kifejezés, és itt fõként az ösztrogénpótlással kezelt nõknél jelentkezõ kardiovaszkuláris és neoplasztikus problémákat jelenti, melyekre példaként említhetõ a hipertenzió, ateroszklerózis és mellrák. A hatékony mennyiség kifejezés a jelen találmány szerinti készítmény azon mennyiségét jelenti, amely képes az itt ismertetett különbözõ patológiás állapotok szimptómáinak enyhítésére. A gyógyszerészetileg alkalmazható kifejezés a hordozóanyagokkal, hígítószerekkel és töltõanyagokkal kapcsolatban azt jelenti, hogy ezek kompatibilisek a készítmény további komponenseivel, és nem károsak a kezelt egyénre. A tömeg% kifejezés egy komponens százalékos mennyiségét jelenti a készítmény teljes tömegére vonatkoztatva; így például 2 tömeg% lizin azt jelenti, hogy a készítmény teljes tömegének 2%¹át lizin teszi ki. A mintegy kifejezés azt jelenti, hogy a hivatkozott érték bizonyos mértékekben változhat. Ennek az értéknek azonban elegendõnek kell lenni jelen találmánnyal kapcsolatban hivatkozott készítmény hatásának kiváltásához. Az a tény, hogy egy vegyület adott értéke kiváltja¹e ezt a hatást, szokásos technikákkal meghatározható, melyekre említhetõk a késõbbi példákban ismertetett vizsgálatok. Az értékek változása elõnyösen a jelen találmánnyal kapcsolatban említett statisztikai módszerekkel számolt standard deviáción belül marad. Különösen elõnyösen az értékek változása ±20%, ±%, ±%, ±%, ±2%, ±1% vagy ±0,%. Különösen elõnyösen a mintegy kifejezés a specifikus értékre vonatkozik. Az alkalmazott lizin kifejezés kiterjed lizinsókra, elõnyösen hidroxi-lizinre és hidroxi-lizin-sókra. Általában az L¹lizint adagoljuk napi mintegy 0,3 mg/kg dózisban. Az L¹lizin adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a lizin ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásonként mintegy 2 milligramm (mg). Az alkalmazott prolin kifejezés kiterjed a prolinra, prolinsókra, hidroxi-prolinra és hidroxi-prolin-sókra. Általában az L¹prolint adagoljuk napi mintegy 0,2 mg/kg dózisban. Az L¹prolin adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a prolin ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy milligramm (mg). Az alkalmazott arginin kifejezés kiterjed az argininre és argininsókra. Általában az L¹arginint adagoljuk napi mintegy 0,1 mg/kg dózisban. Az L¹arginin adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál az arginin ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy 8 mg. Az alkalmazott C¹vitamin kifejezés kiterjed az aszkorbinsavra, aszkorbátsókra és ezek származékaira. Az aszkorbinsav és C¹vitamin kifejezéseket egymással felcserélhetõ módon használjuk, és ilyenek közé tartozik elõnyösen a kalcium-aszkorbát, magnézium-aszkorbát vagy aszkorbil-palmitát. Általában az aszkorbinsavat adagoljuk napi mintegy 0,4 mg/kg dózisban. Az aszkorbinsav adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál az aszkorbinsav ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy 80 mg. A jelen bejelentésben igényelt különbözõ vegyületek alkalmazhatók együtt kovalens kötésû vegyületek formájában vagy fizikai keverék formájában vagy bármilyen más kombinációban. 4

5 1 HU T A jelen találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely tartalmaz egy aszkorbát vegyületet, prolint, lizint vagy ezek tetszõleges kombinációját. Ezért a jelen találmány nem korlátozódik az aszkorbátra, prolinra vagy lizinre, hanem kiterjed minden olyan ekvivalens struktúrára, amely a jelen találmány elõnyös alkalmazásaival kapcsolatban alkalmazható. Az alkalmazott zöldtea-kivonat kifejezés a zöld teában jelen lévõ polifenolos vegyületekre utal. A polifenolos vegyületek akár 30% mennyiségben elõfordulhatnak a zöld tea száraz tömegére vonatkoztatva. Ezek közé tartoznak különbözõ flavanolok, flavandiolok, flavonoidok és fenolsavak. A flavanolok fordulnak elõ a legnagyobb mennyiségben a zöld tea polifenoljai között, és általában katechinek néven ismertek. A zöldtea-kivonatban elõforduló fõ katechinek közé tartozik: 1) ( )-epikatechin, 2) ( )-epikatechin-3-gallát, 3) ( )- epigallokatechin és 4) ( )-epigallokatechin-3-gallát (EGCG). A katechinek közül az EGCG a fõ komponens a zöld teában jelen lévõ polifenolok között. Ahogy itt alkalmazzuk, a zöldtea-kivonat mintegy 80 tömeg% polifenolt tartalmaz, és koffeintõl mentes. A zöldtea-kivonat adagolható mintegy 0,7 mg/kg napi dózisban. A zöldtea-kivonat adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a zöldtea-kivonat ajánlott teljes mennyisége napi adagolásnál mintegy 0 mg. Az alkalmazott N¹acetil-cisztein kifejezés kiterjed ciszteinre vagy cisztinre (cisztein dimer) és ciszteinsókra. Az N¹acetil-cisztein adagolható mintegy 0,2 mg/kg napi dózisban. Az N¹acetil-cisztein adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál az N¹acetil-cisztein ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy mg. A jelen találmány kiterjed továbbá ásványi anyagok és/vagy nyomelemek alkalmazására. A nyomelemek elõsegítik a kötõszövetekhez szükséges makromolekulák termelésének katalizálását. A jelen találmány értelmében elõnyös nyomelemek a vas, réz, cink, mangán, kobalt, molibdén, szelén, króm, nikkel, ón, fluor vagy vanádium. A magnézium adagolható mintegy 0,7 mg/kg napi dózisban. A magnézium adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a magnézium ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy 30 mg. A szelén adagolható mintegy 0,00007 mg/kg napi dózisban. A szelén adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a szelén ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mcg. A réz adagolható mintegy 0,0007 mg/kg napi dózisban. A réz adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a réz ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál mintegy 0 mcg. A mangán adagolható mintegy 0,04 mg/kg napi dózisban. A mangán adagolható orálisan naponta egyszer, kétszer vagy háromszor. Egy 72 kg tömegû átlagos alanynál a mangán ajánlott teljes mennyisége egyszeri adagolásnál 200 mcg. A jelen találmány értelmében a készítmény egyes komponensei nagy mennyiségben vannak jelen. A C¹vitamin mennyisége tömeg% a teljes készítményre vonatkoztatva (a hordozóanyagot, kötõanyagot, töltõanyagot, adalékot és hasonló anyagot nem tartalmazó teljes készítményre vonatkoztatva). A zöldtea-kivonat mennyisége 11 2 tömeg% (a teljes készítményre vonatkoztatva), és a magnézium mennyisége 7 9% (a teljes készítményre vonatkoztatva). A készítmény adott esetben tartalmaz egy vagy több alábbi anyagot: A¹vitamin, D3¹vitamin, E¹vitamin, B1¹vitamin, B2¹vitamin, niacin, B6¹vitamin, folsav, B12- vitamin, biotin, pantoténsav, kalcium, foszfor, cink, króm, molibdén, kálium, citrus bioflavonoidok, inozitol, L¹karnitin, Q koenzim, glükózamin, taurin és kondroitin-szulfát. Az adott készítményben ezek az anyagok elõnyösen az alábbi arányokban fordulnak elõ: 191 IU (International Unit, nemzetközi egység) A¹vitamin, 20 IU D3¹vitamin, IU E¹vitamin, 00 rész B1¹vitamin, 00 rész B2¹vitamin, 000 rész niacin, 00 rész B6¹vitamin, 7 rész folsav, 3,3 rész B12-vitamin, rész biotin, 000 rész pantoténsav, 000 rész kalcium, 200 rész foszfor, 200 rész cink, rész króm, 0, rész molibdén, 000 rész kálium, 000 rész citrus bioflavonoidok, 000 rész inozitol, 000 rész L¹karnitin, 200 rész Q koenzim, rész glükózamin (N¹acetil-D-glükózamin), rész taurin és 000 rész kondroitin-szulfát. Különösen elõnyösen a fenti anyagok mennyisége adott esetben megközelítõleg a következõ: 191 IU (International Unit, nemzetközi egység) A¹vitamin, 20 IU D3¹vitamin, IU E¹vitamin, 1, mg B1¹vitamin, 1, mg B2¹vitamin, mg niacin, 1, mg B6¹vitamin, 7 mcg folsav, 3,3 mcg B12-vitamin, mcg biotin, mg pantoténsav, mg kalcium, 2, mg foszfor, 2, mg cink, mcg króm, 0, mcg molibdén, mg kálium, mg citrus bioflavonoidok, mg inozitol, mg L¹karnitin, 2, mg Q koenzim, 2 mg glükózamin (N¹acetil-Dglükózamin), 0 mg taurin és mg kondroitin-szulfát. A jelen találmány szerinti készítmények alkalmazhatók kardiovaszkuláris betegségek kezelésére vagy gátlására, melyekre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja (a simaizomsejtek hiperproliferációja). Az a tény, hogy egy betegségre jellemzõ a simaizomsejtek túlzott proliferációja, az orvos által szokásos technikákkal meghatározható. Az ilyen szokásos technikák közé tartoznak az antitesten alapuló in vivo technikák, a biopszia és ezt követõ szövettani analízis vagy a szövetminták áramló citometriás vizsgálata. A készítmények különösen alkalmasak hipertenzió és ateroszklerózis kezelésére, amelyek gyakran jelentkeznek a simaizomsejtek hiperproliferációja miatt. Az ateroszklerózis a koleszterinmetabolizmussal van összefüggésben. Ismert, hogy a legyengült kötõszövet elõsegíti a plakk-képzõdést az artériák falában. Ezért a jelen találmány hatékony mennyiségben egy aszkorbátvegyületet, lizint és prolint biztosít a kötõszövetek megerõsítésére. Ismert, hogy az aszkorbát stimulálja a kollagén,

6 1 HU T2 2 elasztin és más kötõszöveti makromolekulák szintézisét a fibroblasztoknál és más rokon sejteknél. A lizin és prolin aminosavak a kötõszövetet képzõ molekulák szintéziséhez szükséges domináns aminosavak. A dózisigény változik az adagolás módjával, a kezelt szimptómák súlyosságával és a kezelést igénylõ adott alannyal. A készítmény ajánlott napi dózisát orálisan adagoljuk. Az ajánlott napi dózis mintegy 0,3 mg/kg lizin, 0,2 mg/kg prolin, 0,1 mg/kg arginin, 1,1 mg/kg C¹vitamin, 0,4 mg/kg magnézium, 0,7 mg/kg zöldtea-kivonat és 0,2 mg/kg N¹acetil-cisztein. A pirula vagy kapszula adagolását adott esetben naponta ismételjük a krónikus vagy alacsony szintû gyulladás hatékony késleltetéséhez. A jelen találmány szerinti készítmények különbözõ módokon adagolhatók, amelyekre nem korlátozó példaként említhetõ az orális, intravénás vagy parenterális adagolás. Az orális, intravénás vagy parenterális adagolás pontos dózisa változhat, és a kezelt alannyal kapcsolatban szerzett tapasztalatok alapján meghatározható. A gyógyszerkészítményt elõnyösen dózisegységek formájában szereljük ki, melyekre példaként említhetõk a tabletták vagy kapszulák. Ebben a formában a készítményt a hatóanyag megfelelõ mennyiségeit tartalmazó dózisegységekre osztjuk; a dózisegységformák lehetnek csomagolt készítmények, például csomagolt porkészítmények, fiolák vagy ampullák. A dózisegységforma lehet például egy kapszula, egy pirula vagy maga a tabletta, vagy bármely ilyen készítmény megfelelõ számának csomagolt formája. A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények elõállíthatók az általánosan ismert módszerek és könnyen hozzáférhetõ komponensek alkalmazásával. Így például a jelen készítmények komponensei kiszerelhetõk a szokásos töltõanyagok, hígítószerek és hordozóanyagok alkalmazásával, és tablettákká, kapszulákká, szuszpenziókká, porkészítményekké és hasonló készítményekké alakíthatók. Az ilyen készítmények elõállításához alkalmazható töltõanyagokra, hígítószerekre és hordozóanyagokra példaként említhetõk a töltõanyagok, így keményítõ, cukor, mannitol és kovasavszármazékok; kötõanyagok, így karboxi-metil-cellulóz és más cellulózszármazékok; alginátok, zselatin és poli(vinil-pirrolidon); nedvesítõszerek, így glicerin; szétesést elõsegítõ szerek, így kalcium-karbonát és nátrium-hidrogén-karbonát; az oldódást késleltetõ szerek, így paraffin; a felszívódást elõsegítõ szerek, így kvaterner ammóniumvegyületek; felületaktív anyagok, így cetil-alkohol és glicerin-monosztearát; adszorpciós hordozóanyagok, így kaolin és bentonit; és csúsztatószerek, így talkum, kalcium- és magnézium-sztearát és szilárd polietilénglikolok. A jelen találmány szerinti terápiás vegyületek kiszerelhetõk olyan gyógyszerkészítmények formájában, amelyek optimalizálják vagy elõsegítik ezek alkalmazását. Közelebbrõl a gyógyszerkészítmények az ateroszklerózis, arterioszklerózis kezelésére és a krónikus vagy alacsony szintû gyulladásos válasz késleltetésére alkalmas hatékony mennyiségeket tartalmazzák. Az ilyen gyógyszerkészítmények gyakran tartalmaznak gyógyszerészetileg alkalmazható hordozóanyagot vagy hígítószert, és szükség esetén töltõanyagot. A készítmények kiszerelhetõk orális adagolásra alkalmas elixír vagy oldat formájában vagy parenterális adagolásra alkalmas oldat formájában, például intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás adagolásra. Ideális esetben a készítmény formája pirula, tabletta, kapszula, szopogatós tabletta, folyékony vagy hasonló adagolási forma. A készítmények kiszerelhetõk továbbá nyújtott hatóanyag-leadású és hasonló formákban. A készítmények megvalósíthatók úgy, hogy a hatóanyagot csak vagy elõnyösen meghatározott fiziológiai környezetben, lehetõleg meghatározott idõ alatt adják le. A bevonó¹, burkoló- és védõmátrixok elõállíthatók például polimer anyagokból vagy viaszokból. A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények általánosan ismert módszerekkel és könnyen hozzáférhetõ komponensekbõl elõállíthatók. Így például az I képletû vegyületek adott esetben ösztrogén- vagy progeszterinvegyülettel együtt kiszerelhetõk a szokásos töltõanyagok, hígítószerek vagy hordozóanyagok alkalmazásával tabletták, kapszulák, szuszpenziók, porkészítmények és hasonló készítmények formájában. Az ilyen készítményekhez alkalmazható töltõanyagokra, hígítószerekre és hordozóanyagokra példaként említhetõk a következõk: töltõanyagok, így keményítõ, cukor, mannitol és kovasavszármazékok; kötõanyagok, így karboxi-metil-cellulóz és más cellulózszármazékok, alginátok, zselatin és poli(vinil-pirrolidon); nedvesítõszerek, így glicerin; szétesést elõsegítõ szerek, így kalcium-karbonát és nátrium-hidrogén-karbonát; oldódást késleltetõ szerek, így paraffin; felszívódást elõsegítõ szerek, így kvaterner ammóniumvegyületek; felületaktív anyagok, így cetil-alkohol és glicerin-monosztearát; adszorpciós hordozóanyagok, így kaolin és bentonit; és csúsztatószerek, így talkum, kalcium- és magnézium-sztearát és szilárd polietilénglikolok. A vegyületek kiszerelhetõk továbbá orális adagolásra alkalmas elixír vagy oldat formájában vagy parenterális adagolásra alkalmas oldat formájában, például intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás adagoláshoz. Emellett a vegyületek könnyen kiszerelhetõk nyújtott hatóanyag-leadású készítmények és hasonló készítmények formájában. A készítmények kialakíthatók úgy, hogy a hatóanyagot csak vagy elõnyösen meghatározott fiziológiai környezetben, és lehetõleg meghatározott idõ alatt adják le. A bevonó¹, burkoló- és védõmátrixok kialakíthatók például polimer anyagokból vagy viaszokból. Ellenkezõ értelmû megjelölés hiányában valamennyi alkalmazott tudományos kifejezés a területen jártas szakember számára ismert általános jelentéssel értelmezhetõ. Az alábbiakban példaszerûen mutatjuk be a módszereket és anyagokat, és alkalmazhatók ezek ekvivalensei is. Az ábrák ismertetése: Az 1. ábra XR296 hatását mutatja simaizomsejtek növekedésének gátlásában ekvivalens koncentrációban alkalmazott EGCG hatóanyaghoz viszonyítva. A [ 3 H]timidin beépü- 6

7 1 HU T2 2 lése a humán simaizomsejtekbe indikátorként szolgál a megújult DNS-szintézis és sejtnövekedés kimutatásához. A timidin beépülését a kontrollcsoporthoz (0%) viszonyítva százalékban fejezzük ki. A 2. ábra XR296 hatását mutatja a simaizomsejtek növekedésének gátlásában ekvivalens koncentrációban alkalmazott aszkorbinsavhoz viszonyítva. A [ 3 H]timidin beépülése a humán simaizomsejtekbe indikátorként szolgál a megújult DNS-szintézis és sejtnövekedés kimutatásában. A timidin beépülését a kontrollcsoporthoz (0%) viszonyítva százalékban adjuk meg. A 3. ábra szerinti grafikon a jelen találmány szerinti készítmény (XR296) (0 mcg/ml) hatását hasonlítja össze néhány egyedi, az XR296 készítményben jelen lévõ koncentrációban alkalmazott komponens hatásával az IL 6 TNF által stimulált kiválasztódásán simaizomsejtekben. A 4. ábra szerinti grafikon a jelen találmány szerinti készítmény (XR296) (20 mcg/ml) hatását hasonlítja össze az XR296 készítményben alkalmazotthoz képest négyszeres koncentrációban (80 mcg/ml) alkalmazott egyedi komponensek hatásával az IL 1 lipopoliszacharid által kiváltott kiválasztódásában simaizomsejtekben. Az. ábra szerinti grafikon a jelen találmány szerinti készítmény (XR296) (20 mcg/ml) hatását hasonlítja össze 160 mcg/ml XR296 készítménnyel ekvivalens koncentrációban alkalmazott egyedi komponensek hatásával az MCP 1 ng/ml TNF által stimulált kiválasztódására simaizomsejtekben. A 6. ábra szerinti grafikon a jelen találmány szerinti készítmény (XR296) (2,2 mcg/ml, 6,7 mcg/ml és 20 mcg/ml) hatását hasonlítja össze az XR296 készítményben alkalmazotthoz képest négyszeres koncentrációban (80 mcg/ml) alkalmazott egyedi komponensek hatásával a P¹szelektin lipopoliszacharid által kiváltott kiválasztódására simaizomsejtekben. A 7. ábra szerinti grafikon a jelen találmány szerinti készítmény (XR296) (20 mcg/ml) hatását hasonlítja össze 160 mcg/ml XR296 készítménnyel ekvivalens koncentrációban alkalmazott egyedi komponensek hatásával az ICAM 1 ng/ml TNF által kiváltott kiválasztódására simaizomsejtekben Példa: Kísérleti alapok és eljárások Simaizomsejtek növekedési sebességének vizsgálata Alapok: Mint fent ismertettük, a simaizomsejtek túlzott növekedési sebessége közvetlenül összefügg a felgyorsult ateroszkletorikus folyamattal. Tenyésztett sejtek növekedési sebességét a megújult DNS-szintézis alapján becsüljük meg, amit a celluláris DNS¹be az inkubációs periódus alatt beépülõ, tríciummal jelölt metabolikus prekurzor mennyisége alapján (például [ 3 H]timidin beépülés) végzünk. Simaizomsejtek növekedése mint a kardiovaszkuláris betegség kialakulásának indikátora Patológiás stimulálás hatására a simaizomsejtek elõször az artériás fal középsõ rétegébõl az intimarétegbe migrálnak, majd az intimarétegen belül proliferálódnak. Ezek az események döntõek az ateroszklerotikus plakkok kezdeti kialakulásában. Az ateroszklerotikus sérüléseknek az intimarétegben történõ kialakulása sok kardiovaszkuláris betegségnél megjelenik, amelyekre példaként említhetõ a hipertenzió, ateroszklerózis, miokardiális ischaemia, infarktus és stroke [R. Ross: Cellular Mechanisms of Atherosclerosis, Atherosclerosis Review, 3(2), ]. A jelen készítmények úgy vannak kialakítva, hogy gátolják a simaizomsejtek invázióját és proliferációját, és ezáltal késleltetik az ateroszklerózis és arterioszklerózis folyamatát. A következõ kísérletekben alkalmazott készítmény olyan készítmény, amely a következõ meghatározott komponenseket tartalmazza meghatározott mennyiségekben: lizin, melynek mennyisége 1 g, prolin, melynek mennyisége 70 mg, arginin, melynek mennyisége 00 mg, aszkorbinsav, melynek mennyisége 7 mg, magnézium, melynek mennyisége 0 mg, zöldtea-kivonat, melynek mennyisége 1 g, N¹acetil-cisztein, melynek mennyisége 200 mg, szelén, melynek mennyisége 30 mcg, réz, melynek mennyisége 2 mg és mangán, melynek mennyisége 1 mg. A fent említett készítményt tartalmazó kapszulákat elõször tenyészközegben feloldjuk, és alkalmazás elõtt megfelelõ koncentrációra hígítjuk. Az 1. ábra simaizomsejteken végzett in vitro kísérletek eredményeit mutatja. Az 1. ábra az XR296 hatását mutatja simaizomsejtek növekedésének gátlására az azonos koncentrációban alkalmazott EGCG hatóanyaghoz viszonyítva. A [ 3 H]timidin beépülése a humán simaizomsejtekbe indikátorként szolgál a megújult DNS-szintézis és sejtnövekedés kimutatására. A 2. ábra XR296 hatását mutatja simaizomsejtek növekedésére azonos koncentrációban alkalmazott aszkorbinsavhoz viszonyítva. A [ 3 H]timidin beépülése humán simaizomsejtekbe indikátorként szolgál a megújult DNS-szintézis és sejtnövekedés kimutatására. A timidin beépülését a kontrollcsoporthoz (0%) viszonyítva százalékban fejezzük ki. Simaizomsejtek növekedési sebességének vizsgálata Humán aorta simaizomsejtek (SMC) sejttenyészetét a Clonetics cégtõl szerezzük be. Az SMC-sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-közegben tenyésztjük, amely 0 egység/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml sztreptomicinnel (továbbiakban DMEM) és térfogat% FBSkomponenssel van kiegészítve. A tenyésztést 37 C hõmérsékleten végezzük % CO 2 -tartalmú nedves légkörben, és összefolyás után 1:3 1: arányban meg- 7

8 1 HU T2 2 osztjuk. A kísérletekhez az 8. szakaszbeli SMC-sejteket alkalmazzuk. Az SMC-sejtek proliferációját [ 3 H]timidinnek a celluláris genetikai anyagba történõ beépülése alapján mérjük. A sejteket 24 mérõhelyes lemezekre visszük 000 sejt/cm 2 sûrûséggel 0, ml DMEM közegben, amely 2% FBS-komponenssel van kiegészítve. A megtapadt sejteket minden 24 órában friss tápközeggel és adalék anyaggal látjuk el az eljárás ismertetésénél megadott módon. Az XR296 készítmény törzsoldatát naponta állítjuk elõ közvetlenül a sejtkultúrához történõ hozzáadás elõtt, amelyhez DMEM közegben oldjuk mg/ml koncentrációban, 1 percen keresztül intenzíven kevertetjük, majd 0,2 m steril szûrõn szûrjük. A sejtproliferációt 3 nappal 1 Ci/ml [ 3 H]timidinnek a kísérlet utolsó 24 órájában a sejttenyészethez történõ hozzáadása után mérjük. A sejteket háromszor hideg foszfátpufferolt sóoldattal (PBS), ph=7,2, mossuk, % triklór-ecetsavval percen keresztül 4 C hõmérsékleten inkubáljuk, hideg etanollal mossuk, levegõn szárítjuk, 0, N nátrium-hidroxid-oldatban szolubilizáljuk, majd sósavval semlegesítjük. A mintákat szcintillációs folyadékkal keverjük, és folyadékszcintillációs számlálón (600 LS, Beckman Instruments, USA) számoljuk. A celluláris DNS¹be beépült radioaktivitást d/perc/mérõhely értékekben fejezzük ki. Citokinok expressziója simaizomsejtekben mint az autokrin inflammatorikus válasz indikátora Alapok: Ismert a citokin expressziója, és az inflammatorikus válaszokban való részvétele. Nemrég felismerték, hogy a kardiovaszkuláris betegségekben megjelenõ vaszkuláris és simaizom-patológiák az inflammatorikus válaszok részét képezik az ateroszklerózis és hipertenzió esetén. Az interleukin 6 az egyik legfontosabb citokin, amely gyulladásos folyamatot vált ki. Az interleukin 6-nak a simaizomsejtekben patológiás stimulálás hatására bekövetkezõ túlzott expressziója tovább fokozhatja az inflammatorikus sérüléseket. A jelen készítmények úgy vannak kialakítva, hogy alkalmasak a citokin (elõnyösen interleukin 6) simaizomsejtekben bekövetkezõ túlzott expressziójának gátlására. Az interleukin 6 simaizomsejtekben történõ expressziójának gátlásával a jelen készítmények felhasználhatók az ateroszklerózis kezelésére és alacsony szintû krónikus gyulladás és inflammatorikus válaszok hatásának késleltetésére. A 3. ábráról látható, hogy annak ellenére, hogy egyes komponensek, így az aszkorbinsav, N¹acetilcisztein, zöldtea-kivonat és az aminosavak, így a prolin, lizin és arginin, viszonylag nagyobb mennyiségben vannak jelen a találmány szerinti XR296 készítményben, mint más komponensek, a gyakorlatban a magnézium, mangán, réz és szelén jelenléte kiegészítõ elõnyös hatást biztosít. Ezért valamennyi érintett komponens jelenléte, beleértve az ásványi anyagokat is, olyan szinergetikus hatást vált ki, amely nem érhetõ el a többi komponenssel önmagában vagy egymással, de magnézium, szelén, mangán és réz nélkül képzett kombinációival Citokinexpressziós vizsgálat A citokinok (IL 6, IL 1 béta, MCP 1, P¹szelektin és ICAM 1) celluláris termelõdésének szintje indikátorként mutatja az inflammatorikus válasz stimulálását. Ezenkívül az ilyen citokinok termelõdése egy inflammatorikus válasz különbözõ fázisait stimulálja. Így például az IL 6 és IL 1 béta az alapvetõ inflammatorikus válasz közvetítõi, az MCP 1 egy kemoattraktáns, amely a monocitákat a véráramból az artériás falhoz irányítja, és a P¹szelektin és ICAM 1 közvetíti a leukociták megtapadását az artériák falán (endotélium és simaizomsejtek). A sejttenyésztéshez szükséges mûanyagárukat a Costar cégtõl, a sejtközeg komponenseit a GIBCO cégtõl szerezzük be. Más reagenseket a Sigma cégtõl szerzünk be. Humán aorta simaizomsejteket (SMC; Clonetics) DMEM közegben tenyésztünk, amely penicillin/sztreptomicin és % magzati borjúszérum (FBS) komponensekkel van kiegészítve. A tenyésztést 37 C hõmérsékleten és % CO 2 jelenlétében végezzük, és a kísérletekhez az 8. szakaszokat alkalmazzuk. A citokinexpressziós vizsgálatokhoz az SMC-sejteket 24 mérõhelyes mûanyag lemezekre visszük mérõhelyenként sejt sûrûségben, és összefolyásig növesztjük. A sejttenyésztõ közeget 0, ml szérummentes DMEM közegre cseréljük, amely 0,1% borjúszérum proteint és megadott mennyiségû tápanyagkeveréket tartalmaz. Az inkubációs közeget 24 óra után lecseréljük friss DMEM/BSA közegre, amely azonos mennyiségû tápanyagkeveréket és egy stimulátort, ng/ml alfa-tumornekrózisfaktort (TNF ) vagy 0,1 mg/ml bakteriális lipopoliszacharidot (LPS) tartalmaz vagy kontrollként stimulátortól mentes. Az inkubálást 24 órán keresztül végezzük, majd a kondicionált közeget összegyûjtjük, és egyenként 80 C hõmérsékleten fagyasztjuk a citokinvizsgálathoz. A sejtproteint BCA protein mikromódszerrel (Pearce) mérjük azután, hogy a sejtréteget foszfátpufferolt sóoldattal (PBS) mossuk, és 0,1 N NaOH-oldatban 2 órán keresztül 37 C hõmérsékleten oldjuk. A mérõhelyenként mért sejtprotein-tartalom nem mutat szignifikáns eltérést a minta nélküli kontrollhoz viszonyítva egyetlen kísérleti körülmény között sem, ami arra utal, hogy a sejtek életképessége nem csökken. A citokinok mennyiségét a sejtkondicionált közegben ELISA vizsgálattal (Quantikine, R&D Systems) mérjük a gyártó elõírásai szerint. Valamennyi kísérletet legalább kétszer végezzük, egyenként három párhuzamosban. Egy reprezentatív kísérlet eredményeit a kísérleti mintában mért átlagos citokinkoncentrációban (+/ SD) fejezzük ki. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Egy készítmény alkalmazása, amely lizint, prolint, arginint, C¹vitamint, magnéziumot, zöldtea-kivonatot, N¹acetil-ciszteint, szelént, rezet, mangánt és egy hordozóanyag, egy hígítószer és egy kötõanyag közül megválasztott, gyógyszerészetileg alkalmazható komponenst tartalmaz, ahol a készítmény a gyógyszeré- 8

9 1 HU T2 2 szetileg alkalmazható komponens nélkül 7 9 tömeg% magnéziumot, tömeg% aszkorbinsavat és 11 2 tömeg% zöldtea-kivonatot tartalmaz, kardiovaszkuláris betegségek enyhítésére vagy késleltetésére alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítására, amelyekre a simaizomsejtek túlzott proliferációja jellemzõ. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a betegség ateroszklerózis. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerkészítmény orálisan, intravénásan vagy parenterálisan adagolható. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény a következõ vegyületeket az alábbi arányokban biztosítja: mintegy rész lizin, mintegy 000 rész prolin, mintegy 8000 rész arginin, mintegy rész aszkorbinsav, mintegy rész magnézium, mintegy rész zöldteakivonat, mintegy 000 rész N¹acetil-cisztein, mintegy rész szelén, mintegy 0 rész réz és mintegy 200 rész mangán.. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény az alábbi dózist biztosítja: mintegy 2 mg lizin, mintegy mg prolin, mintegy 8 mg arginin, mintegy 80 mg aszkorbinsav, mintegy 30 mg magnézium, mintegy 0 mg zöldtea-kivonat, mintegy mg N¹acetil-cisztein, mintegy mcg szelén, mintegy 0 mcg réz és mintegy 200 mcg mangán. 6. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény az alábbi napi dózist biztosítja: mintegy 0,3 mg/kg lizin, 0,2 mg/kg prolin, 0,1 mg/kg arginin, 1,1 mg/kg C¹vitamin, 0,4 mg/kg magnézium, 0,7 mg/kg zöldtea-kivonat és 0,2 mg/kg N¹acetil-cisztein. 7. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény továbbá egy vagy több következõ anyagot tartalmaz: A¹vitamin, D3¹vitamin, E¹vitamin, B1¹vitamin, B2¹vitamin, niacin, B6¹vitamin, folsav, B12-vitamin, biotin, pantoténsav, kalcium, foszfor, cink, króm, molibdén, kálium, citrus-bioflavonoidok, inozitol, L¹karnitin, Q koenzim, glükózamin, taurin és kondroitin-szulfát. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az anyagok az említett készítményben az alábbi arányokban vannak jelen: 191 IU (International Unit, nemzetközi egység) A¹vitamin, 20 IU D3¹vitamin, IU E¹vitamin, 00 rész B1¹vitamin, 00 rész B2¹vitamin, 000 rész niacin, 00 rész B6¹vitamin, 7 rész folsav, 3,3 rész B12-vitamin, rész biotin, 000 rész pantoténsav, 000 rész kalcium, 200 rész foszfor, 200 rész cink, rész króm, 0, rész molibdén, 000 rész kálium, 000 rész citrus-bioflavonoidok, 000 rész inozitol, 000 rész L¹karnitin, 200 rész Q koenzim, rész glükózamin, elõnyösen N¹acetil-D-glükózamin, rész taurin és 000 rész kondroitin-szulfát. 9. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény egy vagy több következõ anyagot tartalmaz az alábbi mennyiségekben: mintegy 191 IU A¹vitamin, mintegy 20 IU D3¹vitamin, mintegy IU E¹vitamin, mintegy 1, mg B1¹vitamin, mintegy 1, mg B2¹vitamin, mintegy mg niacin, mintegy 1, mg B6¹vitamin, mintegy 7 mcg folsav, mintegy 3,3 mcg B12-vitamin, mintegy mcg biotin, mintegy mg pantoténsav, mintegy mg kalcium, mintegy 2, mg foszfor, mintegy 2, mg cink, mintegy mcg króm, mintegy 0, mcg molibdén, mintegy mg kálium, mintegy mg citrusbioflavonoidok, mintegy mg inozitol, mintegy mg L¹karnitin, mintegy 2, mg Q koenzim, mintegy 2 mg glükózamin, elõnyösen N¹acetil-D-glükózamin, mintegy 0 mg taurin és/vagy mintegy mg kondroitin-szulfát.. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény orális formában van. 11. A. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az orális forma tabletta, pirula vagy kapszula. 12. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény parenterális formában van. 9

10 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198

11 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198 11

12 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198 12

13 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198 13

14 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198 14

15 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198

16 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/198 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest