A terápiarezisztencia vizsgálata lymphomás kutyák kemoterápiás kezelése során

Átírás

1 Szent István Egyetem, Állatorvos-tudományi Kar, Belgyógyászati Tanszék és Klinika A terápiarezisztencia vizsgálata lymphomás kutyák kemoterápiás kezelése során Koltai Zsófia V. évf. Konzulensek: dr. Vajdovich Péter, egyetemi docens dr. Szécsényi Dóra, PhD-hallgató Budapest 2005.

2 A hipotézis kifejtése A kemoterápiás kezelések során a (daganatos) sejtek ellenállást fejthetnek ki a citosztatikumokkal szemben. Ez a multidrog rezisztencia (MDR). Az MDR kiváltásáért nagyrészt ATP-függı pumpafehérjék felelısek. Ilyen pl. a P-glycoprotein (Pgp). no978/k_zu1.jpg

3 Vizsgálataink célja A Pgp szerepének hazai megállapítása lymphomás kutyák terápiarezisztenciájában (MDR-jében). A Pgp kórjóslati jellegének megállapítása. Annak felderítése, hogy a vér- és nyirokcsomó-paraméterek milyen kapcsolatban állnak a rossz kemoterápiás válasszal (MDR-rel).

4 A kutyák lymphomája Bevezetés Gyakori kórkép (a daganatos betegségek 7-24%-a). Kezelése citosztatikus terápiával történik, teljes gyógyulás: 10-15%. Az MDR kialakulására vezetı külsı és belsı tényezık - a kemoterápia aluldozírozása vagy nem megfelelı ütemezése; - nem megfelelı abszorpció vagy hasznosulás a po. adott gyógyszerek esetében; - csökkent gyógyszeraktiválódás; - fokozott DNS-repair mechanizmus (topoizomerázok); - a gyógyszer rossz penetrációja a daganatszövetbe; - antioxidáns rendszer kóros mőködése (glutation-rendszer) - a gyógyszer fokozott kijuttatása a sejtbıl (Pgp, MRP, LRP). (Bergman, P. J )

5 A P-glycoprotein mediálta MDR A Pgp leírása kda mérető, transzmembrán fehérje. A Pgp-gének filogenetikailag erısen konzerváltak. A klasszikus Pgp az mdr1 gén terméke. (Bergman, P. J ) A Pgp helyezıdése Számos ép és daganatos sejt membránjából, ill. citoplazma vezikulumaiból mutatták ki. (Hammerle, S. P. és mtsai, 1996.) Higgins, C.F., Callaghan, R., Linton, K.J., Rosenberg, M.F. and Ford, R.C. (1997) Seminars in Cancer Biology 8, Élettani körülmények között Pgp található pl. a vesében, májban, vastagbélben, tüdıben, agyban, perifériás vérben, csontvelı sejtjeiben és a legtöbb magzati sejtvonalban. (Bergman, P. J )

6 A Pgp funkciója ATP-függı membránpumpa, amely hidrofób molekulákat pumpál ki a sejtbıl. Védelmet nyújt a komplementfüggı citotoxicitás ellen. A Pgp fokozott mőködése okozza többek között a daganatos sejtek MDR-jét. Elektrokémiai áramlásokat koordinál a plazmamembránon keresztül. (Bergman, P. J ) Image 1998 Linda S. Nye at all.,

7 A Pgp-nek az MDR kialakításában betöltött szerepe Káros molekuláktól védi az ép és daganatos sejteket, bizonyos citosztatikumokat aktívan kipumpál a sejtbıl, ilyenek pl.: Doxorubicin Vinkrisztin Vinca rosea Aktinomycin-D Mitoxantron (Bergman, P. J ).

8 A Pgp-mutáció jelentısége skótjuhász kutyában Ismert ivermektin-érzékenység (GABA-blokkoló inszekticid). 1 v. 2 mutáns allél az mdr1 génben. (Mealy, K. L ) A Pgp csökkent mőködése okozza az ivermektin fokozott toxicitását.

9 Anyag és módszer Vizsgálatunkban 31 különbözı korú, fajtájú és ivarú non- Hodgkin típusú lymphomában szenvedı kutya szerepelt, melyek közül 13 nıstény és 18 hím volt. A lymphoma kórjelzése és a betegek WHO-stádiumok szerinti besorolása részletes klinikai vizsgálatok alapján történt. A vizsgálatok egyik célja a prognózis meghatározása. Stádiumok, alstádiumok

10 Lymphomák stádiumbeli megoszlása 6% 23% 3% III/a 26% III/b IV/a IV/b V/b. stádium, uveitis 19% 23% V/a V/b Lymphomák szövettani megoszlása diffúz nagy B-sejtes 10% 10% 3% diffúz follikuláris centrumsejtes Burkitt-like 10% 51% B-lymphoblastos Diffúz nagy B-sejtes lymphoma 16% T-lymphoblastos Mantle-sejtes

11 A kemoterápiás kezelések során az ún. COPAprotokollt (ciklofoszfamid, vinkrisztin, prednizolon, doxorubicin) alkalmaztuk. Az állatok 18 héten keresztül hetente jártak kezelésre. Hetek doxo vink vink vink vink vink vink vink vink doxo ciklo ciklo pred pred pred pred pred

12 Mintavétel A kutatásainkhoz felhasznált vérmintákat a betegek elsı vizsgálatakor, a kemoterápiás kezelés megkezdése elıtt vettük. A rutin szövettani és az immun-hisztokémiai festésekhez felhasznált nyirokcsomó-mintákat a bal oldali praescapularis nyirokcsomó teljes kimetszésével nyertük. (A beavatkozást a SZIE, ÁOTK Sebészeti és Szemészeti Tanszékén és Klinikáján végezték).

13 A vérmintákból az alábbi paramétereket határoztuk meg: Hematológiai paraméterek vörösvérsejtszám (vvs-szám) hemoglobinkoncentráció (Hb) hematokrit érték (Ht) a vörösvérsejtek átlagos térfogata (MCV) fehérvérsejtszám (fvs-szám) stab formájú neutrophil granulocyták abszolút száma (absz. stab) szegment formájú neutrophil granulocyták abszolút száma (absz. szegm.) eosinophil granulocyták abszolút száma (absz. eo.) lymphocyták abszolút száma (absz. lymph.) thrombocyta-szám (th. cyta)

14 Biokémiai paraméterek albuminkoncentráció összfehérje-koncentráció (TP) alanin-aminotranszferáz-aktivitás (ALT) alkalikus foszfatáz-aktivitás (ALKP) γ-glutamil-transzferáz-aktivitás (GGT) α-amiláz-aktivitás lipázaktivitás triglicerid-koncentráció (triglic.) összkoleszterin-koncentráció (koleszt.) karbamidkoncentráció kreatininkoncentráció foszforkoncentráció összkalcium-koncentráció (T. Ca) kreatin-kináz-aktivitás (CK) laktát-dehidrogenáz-aktivitás (LDH)

15 A Pgp immun-hisztokémiai festése

16 Pozitív kontroll Kutyából származó, ép máj- és veseszövet.

17 Negatív kontroll Egészséges nyirokcsomó Belsı negatív kontroll, a primer ellenanyagot foszfátpufferrel helyettesítettük.

18 A Pgp-expresszió értékelése Négypontos skálán a pozitív sejtek számának becslése alapján: 0-10% Pgp- pozitivitás (törzssz rzsszám: ) % Pgp- pozitivitás (törzssz rzsszám:12063) % Pgp- pozitivitás (törzssz rzsszám: ) % Pgp- pozitivitás (törzssz rzsszám: ) 1 pont 2 pont 3 pont 4 pont A t-próba során felhasznált adatokat double blind - módszerrel végzett eredmények átlagértékeként kaptuk.

19 Statisztikai vizsgálatok A csoportosítás alapja Nem-MDR csoport: a visszaesés a kezelés befejezése után több mint 6 hónappal következett be (n=17) MDR csoport: 6 hónapon belüli recidíva vagy nem következett be 100%-os remisszió (n=14)

20 Statisztikai vizsgálati módszerek kétmintás (nem egyenlı varianciájú elemeket vizsgáló) t-próba, χ 2 -próba, lineáris regressziós analízis.

21 Eredmények A Pgp-expresszió mértékének összehasonlítása a Nem-MDR és MDR csoportban (kétmintás t-próba) Pgp-expresszió* 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Nem-MDR MDR * p<0,05

22 A vizsgált paraméterek relatív átlageredményeinek összehasonlítása a Nem-MDR és az MDR csoportokban (a Nem-MDR csoport átlagértékei képezik a 100%-ot) (kétmintás t-próba) 140% 120% * * * 100% 80% 60% 40% 20% 0% T v. B- sejtes* Grade Ki67% Stádium alstádium* Ivar* Kor Nem-MDR MDR *p<0,05 A hematológiai és biokémiai paraméterek vizsgálatakor egyetlen esetben sem találtunk szignifikáns különbséget a két csoport között.

23 Immunfenotípus, vagyis T-, ill. B-sejtes jelleg (A χ 2 -próba eredményei) Immunfenotípus* db T-sejtes B-sejtes *p<0,05 Nem-MDR MDR Alstádiumok* 20 db "b" "a" *p<0,05 Nem-MDR MDR

24 Pgp-expresszió* db Nem-MDR MDR 10% fölötti Pgp-expresszió 10% alatti Pgp-expresszió *p<0,05 20 Ivar* 15 5 db Nem-MDR 9 5 MDR nıstény hím *p<0,05

25 Valamennyi beteg valamennyi paramétere között kerestünk kapcsolatot. Csak a Pgp-expresszióval kapcsolatos eredményeket ismertetem. A nyirokcsomók Pgp-expressziója és a recidívamentes túlélési idı (remission free period, RFP) összefüggése (lineáris regressziós analízis) Pgp 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, RFP (hónap) p<0,05 r=-0,595

26 A nyirokcsomók Pgp-expressziója és a vér fehérvérsejtszáma közötti összefüggése (lineáris regressziós analízis) 35 Fvs-szám (G/l) Pgp p<0,05 r= -0,542

27 További összefüggések (lineáris regressziós analízis) Negatív korreláció a nyirokcsomók Pgp-expressziója és a vér absz. stab száma között. (p<0,05 és r= -0,649) Negatív korreláció a nyirokcsomók Pgp-expressziója és a vér absz. szegment száma között. (p<0,05 és r=-0,592) Negatív korreláció a nyirokcsomók Pgp-expressziója és a vér absz. eosinophil száma között. (p<0,05 és r=-0,716)

28 A nyirokcsomók Pgp-expressziója és a vérplazma ALT- és ALKP-aktivitása közötti összefüggések (lineáris regressziós analízis) 500 ALT (U/l) p<0,05 r= 0, Pgp 2500 ALKP (U/l) p<0,05 r=0, Pgp

29 Következtetések T-, ill. B-sejtes jelleg: Nem-MDR csoportban egyáltalán nem volt T-sejtes forma. Egybevág az irodalmi adatokkal - a T- sejtes lymphomák rosszabb prognózisúak (Fournel-Fleury, C. és mtsai , Vail. D. M. és mtsai ). Alstádium: Az MDR csoportban több állapotromlást mutató klinikai tünetben szenvedı ( b alstádiumú) beteget találtunk, mely igazoltan rövidebb túlélési idıvel jár (Vail, D. M. és mtsai , Teske-van, E. és Heerde, P ). V/b. stádium, precavalis szindróma

30 Pgp-expresszió: Az MDR csoportban szignifikánsan magasabb Pgp-expressziót mértünk. A megnövekedett Pgp-expresszió a terápiarezisztencia kialakítása révén rosszabb prognózissal jár együtt (Bergman, P. J , Lee, J. J. és mtsai , Rosenberg, M. P. és mtsai ). Ivar: Az MDR csoportban szignifikánsan több nıstény fordult elı, ez megfelel az ivar és a kórjóslat között összefüggést keresı irodalmi adatoknak (Greenle, P. G. és mtsai , Keller, E. T. és mtsai 1993.).

31 Kapcsolatot találtunk a Pgp-expresszió és az alábbi paraméterek között: Negatív korreláció a recidívamentes túlélési idıvel Negatív korreláció az fvs-számmal Negatív korreláció az absz. szegm. számmal Negatív korreláció az absz. stab számmal Negatív korreláció az absz. eosinophil számmal Az MDR-es betegek eleve rosszabb csontvelıfunkcióval rendelkeztek, GM-CSF termelésének csökkenése miatt terápiarezisztens sejtek szelektálódhattak (Saeki, K. és mtsai., 2002). Pozitív korreláció a plazma ALT-aktivitásával Pozitív korreláció a plazma ALKP-aktivitásával A fokozottabb Pgp-expresszióval rendelkezı betegekben elırehaladottabb kórkép volt tapasztalható, amely a máj kifejezettebb érintettségével járt együtt.

32 Összefoglalás Vizsgálataink alapján a következı esetekben várható MDR: T-sejtes eredető lymphomákban, Súlyos, általános tünetekben is megnyilvánuló kórkép esetén ( b alstádium), Szukák esetében. Vizsgálataink bebizonyították azt is, hogy a P-glycoprotein az egyik legmegbízhatóbb kórjóslati faktor.

33 Köszönetnyilvánítás Köszönöm konzulenseimnek, dr. Vajdovich PéternekP és dr. Szécs csényi Dórának önzetlen segítségüket és hogy erejüket és szabadidejüket nem kímélve segítették ennek a dolgozatnak a létrejöttét. Köszönet illeti a SZIE, ÁOTK Belgyógyászati Tanszékén és Klinikáján mőködı Klinikai Laboratórium valamennyi munkatársát, különösen Ribiczeyné Szabó Piroskát. Köszönöm dr. Perge elkészítését. Edinának nak a lymphomák kórszövettani besorolásának Köszönöm a Sebészeti Tanszék munkatársainak, Dr. Németh N Tibornak és s dr. Arany-Tóth Attilának a lymphomás betegek vizsgálata során nyújtott mőtéti beavatkozások kivitelezését. Köszönet illeti dr. Péteri P Ilonát (Országos Onkológiai Intézet) az immunhisztokémiai festés elbírálásában nyújtott segítségért. Ezúton szeretném megköszönni Mészáros Ágnesnek (OÁI, Emlıskórbonctani Osztályának Szövettani Laboratóriuma) hasznos tanácsait, valamint a metszetek elkészítésében nyújtott segítségét. Végezetül köszönöm Szüleimnek és Testvéremnek türelmüket és hogy biztosították az ezen dolgozat létrejöttéhez szükséges körülményeket.

34 Önöknek pedig köszönöm megtisztelı figyelmüket!