A nukleinsavkémiai kisszótár: aminoacil-trns szintetáz: adott aminosavat a megfelelő trns-hez kapcsoló enzim DNS: dezoxiribonukleinsav, DNA <ang.

Átírás

1 1

2 A nukleinsavkémiai kisszótár: aminoacil-trs szintetáz: adott aminosavat a megfelelő trs-hez kapcsoló enzim DS: dezoxiribonukleinsav, DA <ang.>: olyan nukleotidegységekből felépülő nukleinsavak gyűjtőneve, amelyek dezoxiribóz cukorrészt tartalmaznak. A gének kódolására, és továbbadására szolgálnak. RS: ribonukleinsav, RA <ang.>: olyan nukleotid egységekből felépülő nukleinsav, amely cukorrészként ribózt tartalmaz, előfordul minden élő sejtben, valamint egyes vírusokban. ukleotidok: (= bázis + cukor + foszfát) a nukleozidok foszforsav-észtereinek gyűjtőneve. A bennük szereplő cukorrész (D-ribóz v. 2-dezoxi-D-ribóz) alapján megkülönböztetik a ribonukleotidok és a dezoxiribonukleotidok csoportját. ukleozidok: (= bázis + cukor) szűkebb értelemben a nukleinsavakban előforduló pirimidin- és purinbázisok -ribozid, ill. -2 -dezoxiribozid típusú glikozidjainak gyűjtőneve (citidin, uridin, timidin, adenozin, guanozin). A ~okban a cukorrész mindig furanóz szerekezetű, az -glikozidos szénatom pedig -konfigurációjú. ukleinsavak (DS, RS): <lat. nucleus mag >: (= bázis+cukor+foszfát -> polimer) nukleotidokból felépülő óriásmolekulák (biopolimerek), amelyek minden sejtben és a virusokban is megtalálhatók, azoknak esszenciális alkotórészei. ~akat először F. Miescher (1869) különített el a genny fehérvérsejtjeiből. Watson Crick-modell: a DS térszerkezetét leíró térszerkezeti modell. A ~ szerint a DS-molekula kettős hélixét két, ellentétes lefutású (antiparalel) polinukleotid-lánc alkotja. A két láncot a komplementer bázispárok (adenin timin, guanin citozin) között létrejött hidrogénkötések tartják össze. A kettőshélix-szerkezetet J. D. Watson és F. Crick javasolta 1953-ban. A ~ szerint a polinukleotid-láncokat helikális szerkezetű cukorfoszfátváz építi fel; a hélix tengelyére merőleges irányban, a hélix belseje felé helyezkednek el a nukleinsavbázisok. A ~ alapján jól magyarázható a genetikai információ megőrzése és átadása. DS kettős hélix/spirál: Watson Crick-modell DS-replikáció: A DS mindkét szálának megduplázódása, amely során egy DS kettős spirálból létrejön kettő, az eredetivel azonos DS kettős spirál. Transzkripció: Atírás (DS->RS) amely során a DS-függő RS polimeráz a rendelkezésére álló nukleozid 5 -trifoszfátokból RS-t hoz létre. Fontosabb lépései: iniciáció, elongáció és termináció. Transzláció: Fehérje bioszintézis (RS->Fehérje), amely során a riboszóma az RS alapján, a rendelkezésre 2 álló (és megfelelő aminosavat hordozó) trs-ek segítségével megszintetizálja az adott fehérjét.

3 Mutáció: Az eredetihez képesti elváltozás a DS-ben (más vagy hiányzó nukleotid(ok)) Riboszóma: A fehérjeszintézist = transzlációt végző ribozim, mely 2 rrs és több fehérjéből áll. Ribozim: sejtszervecske, ribonukleo-protein komplex: egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (egy bizonyos reakciót katalizáló) RS. Enzim: Egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (bizonyos reakciót katalizáló) fehérje. mrs: hírvivő vagy messenger RS: átmeneti adathordozóként szolgál (DS -> mrs -> Fehérje) feladata: a fehérje aminosavsorrendjét a genetikai kód által meghatározó RS, amely a megfelelő DS-ről szintetizálódik és a riboszóma fordítja le ezt az információt fehérjévé. rrs: riboszomális RS: a riboszóma fő alkotóeleme, a katalitikusan aktív része. trs: átvivő vagy transzfer RS: Antikodont és az annak megfelelő aminosavat (ill. kötőhelyét) tartalmazó RS. Az aminosavakat a riboszómához szállítja, az mrs-en lévő kodonokat antikodonja segítségével ismeri fel (bázispárosodás elve) aminoacil-trs szintetáz: adott aminosavat a megfelelő trs-hez kapcsoló enzim genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára fordítását meghatározó szabályrendszer, az mrs 3 bázisa alkot egy kodont, ami egy aminosavat határoz meg oly módon, hogy adott antikodonú trs ismeri fel a transzláció során Kodon: ukleotid-hármas a DS/RS-en, mely egy-egy aminosavat kódol Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DS, amely számos gént, szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz. Kromatin: a kromoszóma anyaga, mely eukarióta sejtekben DS (rendszerint kettős szálú) és fehérje komplexe. (Festhető, innen a neve.) Antikodon: ukleotid-hármas a trs-en, mely reverz-komplementje a kodonnak (tehát Watson- Crick párosítással illeszkedik a kodonhoz transzláció közben) Gén: Az öröklődő DS egy fehérjét kódoló része. genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára fordítását meghatározó szabályrendszer, ahol az mrs 3 bázisa alkot egy kodont, amely egy fehérjeépítő aminosavat határoz meg oly módon, hogy azt a transzláció során egy adott antikodonú trs felismeri. 3

4 Genom: A gének összesége (egy egyedben/fajban), pl. a humán (emberi) genom. Exon: Egy gén/mrs azon része(i), mely(ek) tényleges fehérjeszekvenciát kódól(nak) Intron: Egy gén/mrs azon része(i), mely(ek) nem kódolnak fehérjeszekvenciát, és az RS érés során (transzkripció és transzláció között) kivágódnak, pre-mrs -> m-rs. Restrikciós endonukleáz: DS-hasító enzim, mely csak egy meghatározott szekvencia egy meghatározott pontján hasítja a DS-t. Palindrom szekvencia: DS szekvencia, mely megegyezik a reverz-komplementjével, pl. AATT, GGATCC, stb. Antiszensz oligonukleotid: A kódoló DS szálhoz kapcsolódó oligonukleotid, amely speciális szakaszhoz kötődve gátolhatja a DS átíródását (transzkipciót). PCR: Polimerase-Chain-Reaction: polimeráz-láncreakció, egy eljárás a sejten-kívüli (in vitro) DS sokszorosítására. (templát DS + primer + polimeráz + nukleotidok(monomerek) + hőmérsékletváltakozás = sokszorozódás) RS- polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DS kettős spirált Promoter: a DS-nek az a része ahova az RS-polimeráz kötődik és ahol megkezdi a transzkripciót riboszóma: a fehérjeszintézist végző sejtszervecske, egy ribonukleoprotein komplex RS nukleotidok, mint építőelemek Terminátor: prokarióták azon DS része ami jezi a transzkripció végét Transzkripciós egység: Az a DS darab ami RS-é átíródik. Transzkripcós factorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az RS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik. Transzkripciós Iniciációs Komplex: A transzkripciós faktorok és a promoter régióhoz kapcsolódó RS-polimeráz II együttese. TATA Box: A DS promoter része 4

5 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai: Johannes Friedrich Miescher svájci orvos-kémikus 1869-ban felfedezi és izolálja a DS-t. Lord Alexander R. Todd (angol biokémikus) 1957 obel-díj A nukleotidok és a nukleotid koenzimek felfedezéséért Francis arry Compton Crick James Dewey Watson 1962 obel-díj a DS molekuláris szerkezetének felismeréséért Maurice ugh Frederick Wilkins Picture 51 Rosalind Franklin 5 swald T. Avery (DS a kromószóma anyaga)

6 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi obel-díjak: Stanford Moore és William. Stein amerikai biokémikusok 1972 obel-díj a ribonukleáz aktív centrumának katalitikus aktivitása és kémiai szerkezete közötti kapcsolat feltárásáért 1980 Paul Berg Walter Gilbert rekombináns-ds Frederick Sanger A nukleinsavak szekvenálásáért Luis Federico Leloir (argentín biokkémikus) 1970 obel-díj a cukor nukleotidok felfedezéséért és a szénhidrátok bioszintézise kapcsán elért eredményeiért Aaron Klug (angol kémikus ) 1982 obel-díj a krisztallográfiai elektronmikroszkóp kifejlesztéséért illetve a bilológiai szempontból fontos nukleinsavfehérjekomplexek 6 szerkezetfelderítéséért

7 Sir James W. Black Gertrude B. Elion George. itchings 1988 obel-díj a purin alapú kemoterápiás gyógyszerek kifejlesztéséért Sidney Altman és Thomas R. Cech Amerikai/kanadai és amerikai kémikus 1989 obel-díj az RS katalitikus tulajdonságainak felfedezéséért. Kary B. Mullis 1993 obel-díj Polimeráz láncreakció (PCR) Michael Smith Irányított mutagenezis Venkatraman Ramakrishnan Thomas Steitz 2009 obel-díj a riboszóma szerkezetének és funkciójának tanulmányozásáért Ada Yonath 7

8 Tomas Lindahl, Paul Modrich és Aziz Sancar 2015 obel-díj A DS-javítás mechanizmusának tanulmányozásáért

9 9

10 ukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DS- RS építőelemek: ukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak em-rs és -DS alkotó purinszármazékok A DS térszerkezete, a bázispárok 3) DS nanorendszerek 4) DS (RS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 10

11 1) A kromoszóma és felépítése A prokarióták, körülhatárolt sejtmag nélküli élőlények, tipikusan egysejtűek, ilyenek az archeák és a baktériumok Az eukarióták olyan élőlények, amelyek valódi sejtmaggal (a mag anyagát a citoplazmától egy maghártya választja el) rendelkező sejtekből épülnek fel (eu = valódi, karyon = sejtmag). Mind a prokatiota-, mind az eukariótasejtekben az információtárolásra a DS hivatott. Escherichia coli baktérium papucsállatka Egy eukarióta sejt genetikai anyagának többsége 11 a sejtmagban, kromoszómák formájában van tárolva.

12 Fajfüggő az eukarióta sejtek kromoszómáinak a száma: rozs 14 galamb 16 giliszta 36 mezei nyúl 46 ember 46 csimpánz 48 kutya 78 ponty 104 pillangó 380 páfrány 1200 Egy férfi diploid sejt kariogramja: 22*2 testi kromoszóma = 44 2 nemi kromoszóma: X és Y = 2 Σ= 46 A szexuális úton szaporodó fajok mind 1) diploid (két kromoszómakészlet; 44+2) vagy poliploid (több készlet; triploid magnélküli dinnye, stb.) testi, mind 2) haploid (egy készlet; 22+1) ivari sejtekkel rendelkeznek. Egy női diploid sejt kariogramja: 22*2 testi kromoszóma = 44 2 nemi kromoszóma: X + X = 2 Σ= 46

13 Egy női diploid sejt kariogramja: 22*2 testi kromoszóma = 44 2 nemi kromoszóma (X és X) = 2 örökségünk : minden diploid sejt kromoszóma-párja egy anyai és egy apai kromoszómát tartalmaz apai anyai kromoszóma gének száma bázispárok száma X (ivari kromoszóma) Y (ivari kromoszóma) összesen = 46 ~ ~3, ,2 gigabyte-nyi betűt A biblia 3,5 millió karakter aza kb 800 biblia a genetikai kód 13

14 Egy eukarióta sejtciklusa: a sejtosztódás lépései: A G 0 fázisban a sejtek változatlan állapotba kerülnek, várva a sejtciklusba vezető jelre. - G 1 fázis: első növekedési szakasz, - S fázis: a DS replikálódik (46-ból 92 kromószóma lesz) - G 2 fázis: második növekedési szakasz, és felkészülés az osztódásra, - M fázis (vagy mitózis + citokinezis): a sejt két utódsejtre válik szét replikáció 14

15 0,2-2 μm A kromoszómapár hierarchikus szerkezeti elrendeződése. A feladat: az eukarióta sejtek mintegy 3.2 milliárdnyi bázispárját feltekerve, azt néhány mikrométerbe tömöríteni. histon

16 centromer kromatin telomer régiók megkettőződött kromoszóma a metafázisban A kódolo DS aránya a teljes genomhoz viszonyított (%) A supercoiling szeres kondenzációt tesz lehetővé a nukleoszóma a 8 histon fehérjét körülölelő 146 bázispárnyi DS-ből áll. A komplexet a 1 linker fehérjék stabilizálják. mindig jobb menetes, antiparallel, (kivéve a Z-DS) az egészet a -hidak tartják egyben. Eukarióta sejtek génjében van nemkódoló rész; intronok. (prokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során az kivágódik. 16

17 Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DS, amely számos gént, szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz. 1) Giemsa-festés: a bázikus festék a P- gerinchez kötődik, de különösen az A-T bázispárban gazdag régiókhoz (A-T résznél sötétebb a szín) 2) Quinacrine-festés fluoreszcens festés Gustav Giemsa ( ), német mikrobiológus 17

18 2) DS- RS építőelemek memo: nucleus = sejtmag A nukleinsavak két fő fajtája a - dezoxiribonukleinsavak (DS) - ribonukleinsavak (RS) - savanyú jellegű (híg lúgban oldódó), nagy molekulasúlyú polimer vegyület - molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek köszönhetően a sejt összes fehérjéje meg tud szintetizálódni. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.) Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok P 4' 5' 3' 2' heterociklusos bázis --glikozidos kötés 1' egy nukleotid hidrolízis heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz foszfátion 18

19 Foszforsavészterek hidrolízise: ukleinsav (polinukleotid) nukleáz enyhe degradáció 1 a, 25 C ukleotid (monomer) 2 nukleotidáz cc. 3, 180 C Q= Q= A -glikozidkötés hidrolízise: Q adenozin dezoxiadenozin ukleozid (glikozid) + 3 P 4 purin nukleozid foszforiláz* + ukleotidbázis + pentóz (nucleobase) * ez a foszforiláz valójában egy hidroláz

20 ukleinsav építőelemek; a D-ribóz D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz memo: pirán furán tetrahidro-2 -pirán tetrahidrofurán Ciklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat: C C C C C 2 A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi 4 C 3 C 5 C 2 nyílt láncú D-ribóz 2 C C 1 C C 3 C 2 C C nyílt láncú D-ribóz C 2 C1 4 C C C -D-ribofuranóz C 2 C C C 1 C -D-ribofuranóz 2 ukleozidokban mindig 5 tagú (furanóz) gyűrű formájában van a ribóz vagy dezoxi-ribóz jelen. 20

21 ukleinsav építőelemek; a heterociklus Aromás vegyületek: két heteroatomos hattagú gyűrűk (Bruckner. III/1.) em aromás származékok memo: gyenge bázisok: a piperazin 10%-os vizes oldatának p-ja

22 a barbitursav fontosabb tautomerjei Pirimidinszármazékok, nukleinsav építőelemek; Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái: memo: csak a laktimlaktám vagy a dilaktám forma jöhet szóba, az -glikozid kötés miatt. 22

23 ukleinsav építőelemek; purinszármazékok A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái: Melyik tautomer forma a stabilabb? 23

24 2 2 adenozin adenozin 9-( -D-ribofuranozil)-adenin op= 235 o C RS építőelem 2 2 adenozid - P - adenozin-5'-foszfát 5'-AMP P - - adenozin-3'-foszfát 3'-AMP dezoxiadenozin 2 2 dezoxiadenozin 9-(2'-dezoxi- -D-ribofuranozil)-adenin op= 190 o C 2 2 dezoxiadenozid DS építőelem - P - dezoxiadenozin-5'-foszfát 5'-dAMP P dezoxiadenozin-3'-foszfát 3'-dAMP

25 guanozin guanozin 9-( -D-ribof uranozil)-guanin op= 240 o C 2 2 RS építőelem guanozid P - guanozin-5'-foszfát 5'-GMP P - - guanozin-3'-foszfát 3'-GMP dezoxiguanozin 2 2 dezoxiguanozin 9-(2'-dezoxi- -D-ribofuranozil)-guanin DS építőelem dezoxiguanozid - P - dezoxiguanozin-5'-foszfát 5'-dGMP 2 2 P dezoxiguanozin-3'-foszfát 3'-dGMP

26 2 citidin 2 RS építőelem citidin 3-( -D-ribof uranozil)-citozin op= 230 o C citidinf oszfátok P - citidin-5'-foszfát 5'-CMP P - - citidin-3'-foszfát 3'-CMP dozoxicitidin 2 2 dezoxicitidin 3-(2'-dezoxi- -D-ribofuranozil)-citozin dezoxicitidinfoszfátok 2 2 DS építőelem - P - dezoxicitidin-5'-foszfát 5'-dCMP P dezoxicitidin-3'-foszfát 3'-dCMP

27 RS építőelem timidin 3 C timidin 3-(2'-dezoxi- -D-ribofuranozil)-timin 3 C op= 183 o timidinfoszfátok 3 C 3 C DS építőelem - P - timidin-5'-foszfát 5'-TMP P timidin-3'-foszfát 3'-TMP

28 em-rs és -DS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: PPáz:= Purin nukleozid foszforiláz AMP nukleotidáz GMP Adenozin dezamináz PPáz memo: purinvázas alkaloidok: di- és trimetil xantinok: 28

29 A DS kémiai szerkezete foszforsavdiészter típusú, nem-elágazó, lineáris polimer, amit az 5 3 irányba írunk:..-5 -C-G-T-A Az RS kémiai szerkezete

30 A Chargaff-szabály megadja a nukleotidok belső arányait a DS-ben: Σ(pur.)/Σ(pir.) (G+A)/(C+T) 1 és A/T 1 és G/C 1 memo: (G+C)/(A+T) változik: ez adja a DS termostabilitását (lásd később) 5 Erwin Chargaff P P P P 3 C G T A T A C G 3 P P P P 5 30

31 A DS térszerkezete, a bázispárok A DS jobbmenetes kettős hélix téralkatú, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat -hidak tartják össze, az egyik a kódoló a másik a templát szál. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3- híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban Rosalind Franklin diffrakciós méréseinek köszönhetően. 31

32 oogsteen párképzés Watson-Crick párképzés A DS térszerkezete, a bázispárok interface: kedvező elektrosztatikus kcs. parciális töltés színkódja: d- d+ G C A T interface: kedvezőtlen elektrosztatikus kcs. interface: kedvező elektrosztatikus kcs. 32

33 Watson-Crick oogsteen 33

34 Watson-Crick oogsteen 34

35 Watson-Crick párképzés: fontos, ez található elsősorban a duplexekben G is C A amino (aromás) míg T dilaktám forma is amino-laktám forma - a hidrofil és negatív töltésű foszfodezoxiribóz gerinc kifelé mutat - a bázisok befelé állnak, intermolekuláris -hidakkal stabilizáltak, - a cukor-foszforsav diészter gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak, - a bázispárok miatt a DS két szála komplementer jellegű - a heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt. krisztallográfia (1952) DS elektronsörűségeloszlása Rosalind Franklin A kettős hélix (double helix, duplex) 1953 Francis arry James 35 Dewey Compton Crick Watson

36 Mutáció I: ormális és abnormális bázispár képzés Replikáció #1 Replikáció #2 -G- -Cszülő gyerek unoka -G- -C- -G- -C- mutáció -G*- -T- memo: ugyanúgy megvan a 3. -híd is, ám míg a normál esetben (felső) a purin bázis a 3. - hídban az akceptor, addig a mutációra vezető esetben ugyanitt a -híd donor szerepét tölti be. A két 36 tautomer eltérő -híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez WC párt. -G- -C- -G- -C- -G- -C- -G- -C- -G- -C- -A- -T-

37 37

38 Mutáció II: a kémiai reagensek kiváltotta mutációk: Pl. salétromossav (a 2 + Cl) magyarázat: mutáció -*- -G- -C- -C- -A- -A- -T- -T- gyerek unoka -A- -A- -T- -T- indukált mutáció: memo: ugyanúgy megvan a 2. -híd, ám míg a normál esetben ( =C) a purin bázis a 2. -hídban donor, addig a mutációra vezető esetben az akceptor (C= ) szerepét tölti be. A két purin származék eltérő -híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez WC párt. -A- -T- -A- -Tszülő -A- -T- -A- -T- 38

39 A DS térszerkezete, a bázispárok A leggyakoribb forma a B-DS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű 3 nagyárok kisárok 5 P P P P A C C C G G G T P P P P 5 memo: Legtöbb DS téralkata a B-forma amikor vízzel egyensúlyt tart a molekula. a lecsökken a víz tenziója (pl. tömény acl oldattal tart egyensúlyt a DS, s ezért kisebb a tenzió), akkor megjelenhet az A-forma. kérdés: mi lehet a helyzet a kromoszómába becsomagolt DS esetén? 39 memo: Az A olyan mint a B-forma, csak tömörebb. 3

40 jobbmenetes hélix jobbmenetes hélix Az A-DS hélix tömzsibb és rövidebb, mint a B-DS, a főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 19 o ). R C-3' a sík felett C-3' endo balmenetes hélix Az Z-DS hélix karcsúbb, főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 9 o ). Az B-DS hélixben a főtengelyhez képest a bázispárok síkja merőleges ( képest 1 o ). R 40 C-2' a sík felett C-2' endo

41 A DS 3 fő formájának szerkezeti jellemzői: kérdés: milyen hosszú az emberi genom (kihúzva és egyesítve )? válasz: a teljes genom (44 +2 kromoszóma) összesen mintegy 3,2 milliárd bázispárból épül fel: 3, * m = 1, 06 m gemetriai jellemzők: A-DS B-DS Z-DS hélix típús jobbmenetes jobbmenetes balmenetes ismétlödő egység 1 bp 1 bp 2 bp bp-onkénti elcsvarodás /2 1 menetre eső bp száma főtengelytől vett eltérés emelkedés/bp 2.3 Å (0.23 nm) 3.32 Å (0.332 nm) 3.8 Å (0.38 nm) menethossz 28.2 Å (2.82 nm) 33.2 Å (3.32 nm) 45.6 Å (4.56 nm) átmérő 23 Å (2.3 nm) 20 Å (2.0 nm) 18 Å (1.8 nm) 41

42 A DS hőstabilitása / denaturálása tétel: A DS T m -pontja nő a GC-frakció növekedésével; T m1 < T m2 ha GC 1 /total<gc 2 /total! indoklás: a GC-ben 3, míg az AT-párban csak 2 - híd van bázispáronként. kérdés: mennyi a T m -pont ha GC= 0,4? válasz: T m 340K ha c(acl= 0) kérdés: mennyi a T m -pont ha GC = 0,4, de teszünk mellé acl? válasz:t m 360 K ha c(acl= 150 mmol) kérdés: miért nő a T m -pont ugyanolyan GC frakció mellett akkor, ha magasabb az oldat só koncentrációja? válasz: a DS felszíni negatív töltései P- kompenzálódnak. megjegyzés: - Minnél több a belső -híd a DS 2 szála között az annál stabilabb dimert képez. (Fehérjék esetében ez nem igaz, ott a belső -hidakkal nem nő lineárisan a fehérje termostabilitása!) - A DS T m (60-80 o C) pontja lényegesen magasabb mint a testhőmérsékletünk, és jelentősen magasabb mint a legtöbb fehérjénkké! Atkins de Paula 118 Tm (K) ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma 0 acl 150mM acl Lineáris (0 acl) Lineáris (150mM acl) ribóz 3 C ribóz timin oxo-f orma adenin 42 ribóz DS termostabilitás y = 39,7x R 2 = 0,996 y = 39,7x R 2 = 0,996 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 GC- frakció A-T gazdag régió memo: - magas p - magas T (K)

43 em-klasszikus DS szerkezetek: triplex DS: háromszálú DS quadruplex DS: négyszálú DS előfordul: pl. telomerek (kromoszómavégek) 4xG: négy guanidin helyezkedik el egy síkban, egy kation + 4x 2 hidrogénhíd (a purinváz 7-es -jével is) stabilizálja a szerkezetet. 43

44 ukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DS- RS építőelemek: ukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak em-rs és -DS alkotó purinszármazékok A DS térszerkezete, a bázispárok 3) DS nanorendszerek 4) DS (RS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 44

45 ) DS nanorendszerek I: olliday-junction, -elágazás ( kocka csúcsa ) hogyan csináljunk ilyen alakzatot? 1) vegyünk egy tompa végű DS kettős hélixet: helikáz olliday, R. (1964). A mechanism for gene conversion in fungi. Genetical Research, 5, azonos helikáz TCTGCACATA AGACGTGTAT memo: a kétszálú hélix és a kereszt forma egyensúlyban lehet, (DS!) 45

46 ) A DS két szála nem feltétlenül egyforma hosszú: ilyenkor van túlnyúló szakasz (3 overhang, 5 overhang): Az ilyen DS is továbbalakítható: 3) Készíthetünk olyan DS-t melynek 1) egy részében a két szál egymásnak nem komplementere, a szétszedéshez tehát nem kell a helikáz,valamint 2) amelynek mindkét oldalán van egy-egy túlnyúló szakasz: 5 3 Az ilyen DS is továbbalakítható: 5 Az összes -hidak száma: CG =3 4*(CG =3) 12 AT=2 6*(AT =2) *(CG =3) 30 10*(AT =2) 20 46

47 4) Készítsünk olyan DS szálakat, ahol a túlnyúló szakaszok szekvenciáit alkalmasan választjuk meg: barna-tompavég barna-hegyesvég 4.1) barna-barna (a 8 -híd összetartja majd a ligáz összeköti) 4.2) lila-lila (a 12 -híd összetartja majd a ligáz összeköti) 4.3) fekete-fekete (a 10 -híd összetartja, ligáz összeköti) 47

48 5) Készítsünk ennek fényében olyan DS szálakat amelyek spontán módon, s a túlnyúló szakaszaik révén egyértelműen asszociálódnak: 6) Készíthetünk ilyen módon kockát, vagy komplexebb idomokat, minden csak tervezés kérdése ezután? : a) DS nano-kocka, b) poliéder, c) csomó, stb..c.seeman, 48 MolBiotechnol, 2007,37,246-57

49 DS nanorendszerek II: T-elágazás ( kocka csúcsa ) 5 3 TAGCAGTTCCTATGAG 5 3 ACGACGTCAACTGCTA 5 TAGCAGTT AACTGCTA 3 5 TAGCAGTT AACTGCTA CTCATAGGGACGTCGT 5 3 CTCATAGGGACGTCGT CTCATAGGGACGTCGT 5 3 Összefoglalva: 3 CCTATGAG CTCATAGG 5 49

50 50

51 DS és RS hidrolízise: 1) Savas hidrolízis az eredmény: depurinálás (A v. G) memo: az RS és a DS kb. egyforma sebességgel hidrolízál savban kérdés: a 2-deoxi D-ribóz félacetálja savban felnyílik-e? 51

52 2) Lúgos hidrolízis (az RS lúgos hidrolízise): eredmény: lánchasadás memo: ezért az RS kevésbé, míg a DS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek memo: azért tárol a DS és nem csak RS alapinformációt, mert az előbbi jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek, azaz stabilabb! 52

53 DS, RS építőelemek kémiai szintézise: 1) ukleozid szintézis I: a ilbert-johnson-nukleozid szintézis T.B. Johnson, G. E. ilbert, Science 69, 579 (1929) G. E. ilbert, T. B. Johnson, J. Am. Chem. soc. 52, 2001, 4489 (1930). 53

54 2) ukleozid szintézis II: kapcsolás ribozilaminnal A reakció javasolt mechanizmusa: 54

55 3) Szubsztituált nukleozid (purin) származékok továbbalakítása: Cl 3 2 S 2 / i 2 S R R R adenozin R: -D-ribofuranozil 55

56 4) ukleotid szintézis: nukleozidok foszforilezése (pl. dibenzil-foszfokloridáttal) rvosi alkalmazások: S 6-merkapto-purin Gyerekeknél akut leukémia kezelésére 80%-os gyógyulás 2 C P Cl 2 C dibenzil-foszfokloridát 2 allopurinol köszvény kezelésére aciklovir erpes virus kezelésére 2 C-atom hiányzik a ribózból 56

57 ligonukleotid szintézis:foszforamidit kapcsolási módszer McBridge és Caruthers Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) 2. Aktiválás és kapcsolás xidálás I2 (2 vagy TF) Lánczárás (az elreagálatlan 5 --t acetilezzük) 3.

58 DS kémiai (szilárdfázisú) szintézise: észter kötés(ek) kialakítása, S foszfor centrumon Védőcsoportok I: a bázisok védelme permanens csoportokkal Cél: a primer aminok védelme, avagy a nukleofil csoportok álcázása, hogy a majdani kapcsolásnál már csak a ribóz -5 legyen csupán az egyetlen u. A G C Rib Rib 4 -benzoilezés C Rib C C 6 -benzoilezés vagy 2 -izobutiril C C3 4 -acetilezés Rib T C 3 nem kell védeni Rib 58

59 Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme permanens csoporttal B C cianoetilészter formában CE P B Mindkét típusú permanens védőcsoport típus (-benzoil vagy -acetil és a CE) is eltávolítható: vizes 3 -val memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoport vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható 59

60 Védőcsoportok III: az 5 - csoport ideiglenes védelme Me Dmtr Me (enyhén savas rendszer) C P B C 2 Cl 2 + 3% CCl 3 -C Me C P B narancs szín Me 60

61 A szilárd hordozó: CPG (controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg -kémiailag inert -nem duzzad -amino funkcionalizált CPG Me Si (C 2 ) n 2 Me A linker : Pl. borostyánkősav 2 C C C C (C 2 ) n Me Si 3 / 2 hasító hely Me CPG 2 C C 61

62 A DS szintézis lépésről lépésre : -szilárdfázisú szintézis 3 -től 5 irányba halad a Caruthers -módszer Dmtr B 1 memo: a bioszintézis menete az 5 -től 3 irányba halad 1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) C C (C 2 ) n Me Si Me CPG B 1 enyhe savas detritilezés (3% TCA) 2. Aktiválás és kapcsolás C C (C 2 ) n Me Si Me CPG 62

63 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 C C (C 2 ) n Me Si CPG Me Dmtr foszforamidit B 2 P CE MeC + S (5' S reakciója) tetrazol (gyenge sav) 63

64 3. Lánczárás (az elreagálatlan 5 --t acetilezzük) 4. xidálás I 2 ( 2 vagy TF) Ciklus végén 4 -val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás Legvégén: kromatográfiás tisztítás 64

65 Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr B 3 R P B 2 CPG B 1 DMTr R P i Pr 2 B 3 tetrazol 1. lépés Kapcsolás R P R P B 2 CPG B 1 B 1,B 2,B 3 : védett bázisok R: C C 2 C 2 -cianoetil egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport DMTr : tetrazol: CPG: "controlled pore glass" (porózus üveg) dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport 65

66 DMTr B 3 B 3 R P B 2 R P B 2 I 2 R P B 1 A R P B 1 2. lépés xidáció CPG 3. lépés Védõcsoport eltávolítása CPG memo: A PCR-től eltérően a kémiai szintézis nem igényel templátot 66

67 A szintetikus biológia hajnala J. Craig Ven Science 2 July 2010: Vol. 329 no pp Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome íme az első olyan élő szervezet amely atyja egy számítógép, s amely megalkotása az emberi elme és egynéhány robot műve volt 2003-ban még csak egy alig több mint 5000 bázispárt, 2010-ben már 1 millió bázispárt lehet szintetikusan összerakni! Aldous uxley Szép új világ 67

68 A DS enzimatikus szintézis: a replikáció cél: a genetikai kód megkettőződése: A kettős hélix az egyik pontján kitekeredik, majd a templátok mentén a komplementer szálak megszintetizálódnak. 68

69 A DS enzimatikus szintézis: a replikáció DS polimeráz I: 5 => 3 irányba szintetizál (lassabb, de pontosabb, javítani is tud.) DS polimeráz II: 5 => 3 irányba szintetizál (alig ismert még) DS polimeráz III: 5 3 irányban szintetizálja az új láncot, ATP, GTP, CTP és TTP melyek magukon hordozzák az aktiváláshoz szükséges energiát. Leading strand = vezető szál, folyamatos szálszintézis Lagging strand = követő, sántikáló szál, darabonkénti szálszintézis, majd utólagos összekötés (DS ligáz) Primer: alkalmas RS Primase: RS primert hozza létre amely kell ahhoz hogy a DS polimerázok el tudjanak kezdeni dolgozni. DS ligáz: csak összekapcsol két láncot 69

70 PCR vagy Polymerase Chain Reaction (magyar polimeráz láncreakció) egyszerű és hatékony enzimatikus módszer a DS-molekulák számának - adott láncvégek (primerek ) közötti növelésére. (VIDE) A feladat: [ ] n 1. ciklus fütés T=95 C és alkalmas 2 primer hozzáadása T=55 C: a primerek helyrekerülnek (letapadnak, annelláció) 5 5 T=72 C: nukleotidok egyesévél bekapcsolódnak, majd a polimeráz enzim egy lánccá kapcsolja össze, a szintézis iránya 5 3 csak! 70

71 2. ciklus fütés T=95 C és alkalmas primerek hozzáadása T=55 C (helyre kerülnek az új primerek) T=72 C-on a nukleotidok bekapcsolódnak, s a polimeráz összeligálja az új szálakat memo: 4 kópia van de ebből még mind csak közti termék, tehát egyik sem jó még! memo: azért lesz rövidülés, mert a polimeráz szintézis iránya 5 3 csak! 71

72 3. ciklus végén 8 kópia van s ebből már 2 jó! 4. ciklus végén 16 kópia van, ebből 8 rossz, de 8 jó! 5. ciklus végén 32 kópia van, ebből 10 rossz, 22 jó! 6. ciklus végén 64 kópia van, ebből 12 rossz 52 jó! 10. ciklus végén 1024 kópia van, ebből 20 rossz, 1004 jó! összes kópiák száma: 2 n, ebből rossz 2n, jó (2 n 2n) Kary B. Mullis USA biokém ban kifejleszti a PCR-t, ban megkapja a obel-d.

73 30. ciklus után a helyes kópiák száma (a várt termék) >1 milliárd tehát: *30 [ ] n>10 9 Lényegében tiszta terméket kapunk, mert 2n << (2 n 2n) 73

74 ukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DS- RS építőelemek: ukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak em-rs és -DS alkotó purinszármazékok A DS térszerkezete, a bázispárok 3) DS nanorendszerek 4) DS (RS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 74

75 5) Transzkripció A DS-ről mint információhordozóról a gének leolvasása, a hírvivő RS szintézise: DS (transzlokáció és mrs érés) mrs transzkripció átírás, másolás RS polimeráz (enzim) fehérje transzláció fordítás, dekódolás riboszóma (ribozim) A DS-ről RS-re átírás kezdete: RA-Polimerase Transzkripciós faktor (fehérje complex) Folyamata: a bioszintézis menete az 5 -től 3 irányba halad 75

76 RS polimeráz Transzkripció lépései: iniciáció: promoter régió elongáció terminálás 5 CATCCAATTGG 3 kódoló DS szál 5 CAUCCAAU 3 születő RS szál 3 GTAGGTTAACC 5 templát DS szál A transzkripció iránya 76

77 Ribonukleinsav (RS) és fehérjeszintézis gén: olyan DS szegmens amely tartalmazza mindazon információk összességét amely az adott polipeptid vagy fehérje szintéziséhez szükséges. (pl. egy egyszerű bacilus DS-e is legalább 3000 különböző enzimfehérjét kódol.) A transzkipció folyamatának szereplői: RS-polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DS kettős spirált Promoter: a DS-nek az a része ahova az RS-polimeráz kötődik és ahol megkezdi a transzkripciót RS nukleotidok, mint építőelemek Terminátor: prokarióták azon DS része ami jelzi a transzkripció végét Transzkripciós egység: az a DS darab amely RS-é átíródik. Transzkripcós faktorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az RS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik. Transzkripciós iniciációs komplex: a transzkripciós faktorok és a promoter régióhoz kapcsolódó RS-polimeráz II együttese. TATA box : A DS promoter része 77

78 RS polimeráz láncszétválás A hírvivő-rs (messenger-rs, röviden mrs) szintézise: etc. P P P DS A C C G dezoxiribóz: P G P C P U P G ribóz: etc. P P P DS A C C G U G G C etc. P P P komplementer RS etc. P P P DS A C C G U G G C etc. P P P komplementer RS. Transzkripció a sejtmagban történik, a szintetizálódott RS-nek van fehérjét kódoló (exon: expressed sequence ) és nem-kódoló része (intron: intervening sequence ). Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során kivágódik. A kész m-rs elvándorol a citoplazmába ahol a fehérjeszintézis templátjaként szerepel. 78

79 fehérje DS: - nem kódoló részek - kódoló részek (gének) >>>>>> mrs: - nem-kódoló részek (intron: intervening sequence ) - kódoló részek (exon: expressed sequence ) >>>>>>> fehérje 79

80 RS fajták és funkciójuk: kódoló RS: mrs: hírvivő (angol: messenger) RS: DS-ből másolt RS, mely a genetikai információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ alapján a fehérjék szintetizálódnak. árom egymás melletti bázis alkot egy-egy kodon-t, amely egy-egy aminosavat kódol. pre-mrs: éretlen mrs. Az érés során a nem-kódoló részek (intronok) kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mrs-ben. nem-kódoló RS: trs: transzfer-rs: segít az mrs-en található kód (kodon) leolvasásában. Minden létező kodonhoz külön trs tartozik, mely a kodonnak megfelelő aminosavat hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a fehérjeszintézisben rrs: riboszomális RS: a riboszóma alkotóeleme, mely a fehérjeszintézis katalitikus centrumát alkotja. léteznek további nem-kódoló RS-ek is, mint például: sirs: (small interfering RA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RS részek, amelyek a DS-hez kötődve meggátolják az adott rész átíródását. 80

81 Az RS térszerkezete: - általában egyszálú, de - Watson-Crick-féle párképzés az egy szálon belül, azaz önmagával is kialakulhat: egy hairpin RS téralkat trs térszerkezete E.coli rrs kisalegységének téralkata 81

82 Szállító RS (transzfer-rs, trs) feladata: hogy a megfelelő helyre eljuttassa az aminosavat, felépítése: A,U,C,G mellett módosított nukleotidok is: PSU, RT, stb. 3 A trs aminosav akceptor karja antikodon hurok 82

83 Szállító RS (transzfer-rs, trs) jellemzői: nukleotidból áll, - mindig a CCA- véghez kapcsolódik észterkötéssel az aminosav (pl. Tyr), - minden aminosavnak saját trs-e van, amelyen az annak az aminosavnak megfelelő antikodon található (egy aminosavhoz egy vagy akár több trs is tartozhat) - például: Met UAC.tRS: antikodon (CAU) AUG.mRS: kodon 83

84 A mrs tripletjei a genetikai kód: egy aminosavhoz egynél több kodon (egynél több antikodonnal ellátott t-rs) tarozik: As. m-rs As. m-rs As. m-rs Ala GCA is CAC Ser AGC GCC CAU AGU GCG Ile AUA UCA GCU AUC UCG Arg AGA AUU UCC AGG Leu CUA UCU CGA CUC Thr ACA CGC CUG ACC CGG CUU ACG CGU UUA ACU Asn AAC UUG Trp UGG AAU Lys AAA Tyr UAC Asp GAC AAG UAU GAU Met AUG Val GUA Cys UGC Phe UUU GUG UGU UUC GUC Gln CAA Pro CCA GUU CAG CCC Glu GAA CCG lánckezdő GAG CCU fmet AUG Gly GGA GGC lánczárás UAA GGG UAG GGU UGA kodon X Y Z antikodon 84

85 Transzláció, az információ lefordítása fehérje nyelvre, mely lépés során a citoszólban a ribószómán megtörténik a fehérjeszintézis. A szintézis - résztvevői: mrs (kodon) + trs (antikodon + aminosav) - helyszíne: a riboszóma - eredménye: a fehérje 85

86 Összefoglaló: az információáramlás hierarchiája: DS kodon mrs kodon trs antikodon aminosav 5 ACCTTTCTAAAG ACCTTTCTAAAG UGGAAAGAUUUC 5 UGGAAAGAUUUC 5 ACCUUUCUAAAG ACCUUUCUAAAG TrpLysAspPhe Kodon táblázat az mrs tripletjeinek kódját rendeli az aminosavakhoz 86

87 a riboszóma egy RS-fehérje komplex: két alegység funkciója: kisalegység: köti az mrs-t nagy alegység: katalitikus aktivitás, fehérje szintézis mérete: - prokarióta esetén 70S (30S és 50S), MW~ 2.6MDa, - eukarióta esetén 80S (40S és 60S), MW~ 4MDa, Prokarióta riboszóma térszerkezete összetétele: RS és fehérje (L1,..L34) szintézis sebessége: amidkötés/sec szintézis megbízhatósága: ~1 hiba/10 6 amidkötés memo: nem az L1,..L34 fehérjék hanem az RS végzi a katalízist, ezért a riboszóma nem enzim hanem ribozim. 30S 50S S: (Svedberg egység) centrifugálás során a szedimentációs sebesség 87

88 Transzláció 1. lépés: (itt kezdődjön a transzláció) mindig az AUG mrs triplet. 2. ide mindig az -For-Met aminosav kerül 3. szintézis irány -term.-től a C-term. Felé ( C) 4. lánczáró kodonok az mrs-en: UAA, UAG és UGA. ( a mondat végi pontot jelölik ) 5. a szintézis legvégén a For-csoportot egy enzim lehidrolizálja. 88

89 Az amid szintézis mechanizmusát lásd később 89

90 90

91 A ribozim katalizálta peptidszintézis elemi kémiai lépései: az 50S alegység 2486 adeninje segíti a nukleofil addiciót : 1) Az adenin nemkötő elektronpárjának protonvonzása részlegesen deprotonálja az aminocsoportot, ezzel fokozva annak nukleofil jellegét. 2) A tertaéderes köztitermék elbomlását a proton visszaadása iniciálja, kialakítva így a peptidkötést. (Science 289; , 2000) 91

92 Transzláció lépéseinek áttekintése: - ciklusonként 3 db. GTP-t használ fel 92

93 Kérdés: mi a következő DS templáthoz szekvenciához tartozó fehérje aminosav-sorrendje? DS: 5 TGA TTC GTA TTG CTC GTG 3 DS: 5 TGA TTC GTA TAG CTC GTG 3 mrs:3 ACU AAG CAU AUC GAG CAC 5 Peptid: Ser -Glu -Tyr - Leu - Glu - is S - E - Y - L - E - kérdés: helyes-e ez az átírás? DS mrs 5 A 3 T 5 U T A A G C C 3 C 5 G 3 G memo1: Ügyeljünk tehát a bázissorrend irányultságára ( ) memo2: minden enzim az 5 oldal felől olvas! 93

94 Az antibiotikumok egy jelentős hányada a riboszómához kötve fejti ki szelektív hatását: Az Erythromycin A kölcsönhat az 50S (nagy alegység) 2058-as adeninjével, s igy beül és blokkolja azt a csatornát amelyen keresztűl bújik ki a fehérje. Meggátolja tehát a bakteriális fehérje szintézisét és a baktérium elpusztúl. A Eukarióták riboszómájának 2058 nukleotidja nem A hanem G, s ehhez nem köt az antibiotikum, igy lesz szelektív a hatás A Clindamycin az amidkötés kialakítását gátolja meg a ribószóma felületén erre a helyre kötődve ature 413, (2001) 94

95 ukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DS- RS építőelemek: ukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak em-rs és -DS alkotó purinszármazékok A DS térszerkezete, a bázispárok 3) DS nanorendszerek 4) DS (RS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 95

96 7) DS analitika: a szekvenálás cél egy DS fragmens bázissorrendjének meghatározása: megoldás: A lánczáró festékkel jelölt didezoxynukleotid (ddtp) vagy Sanger-féle módszer alapgondolata: a 3'-hidroxi-csoport hiánya megakadályozza a PCR-ezés során a lánc továbbépülését: lánctörést okoz. Frederick Sanger Chain Termination Method (Sanger, F., et al: PAS, 1977, 74, 5463.) A szekvenálandó (templát) DS 3 C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T 5 amelyre mint templátra PCR rel komplementer szálakat fogunk előállítani, de szintézis során nem csak a szokásos ATP, GTP, CTP és TTP nukleotidokat használunk, hanem ddatp, ddgtp, ddctp és ddttp-t is. 96

97 templát DS és alatta a különböző PCR termékek amelyek rendre a ddtp-k beépülése miatt terminálódtak: 3 C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T 5 G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T G-C-T G-C-T-T-A G-C-T-T-A-T-A-C G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G G-C G-C-T-T G-C-T-T-A-T-A-C-G-C G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C G-C-T-T-A-T-A-C-G-C stb. minden lehetséges fragmenst előállítunk agaróz gélen (oszlopon) megfuttatjuk, amely méret szerint szeparál, s az oszlop alján az éppen kifolyó fragmenst színe alapján azonosítjuk G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T-T-G-A bizonytalan szegmens 97

98 egy valódi szekvenálás végeredménye: 98

99 8) Bioenergetika Elektromágneses energia forrása hőerőgép és belsőégésű motor lehet, amelyekben a hőenergia égésből, azaz kémiai átalakulásból származik. Ezek rendre az atomok és molekulák elektronszerkezetéhez köthető átalakulások, azaz elektromágneses folyamatok. Az élőlények számára is kémiai folyamatok, azaz az elektromágneses kölcsönhatás biztosítja az energiatárolást és energiafelhasználást, tehát a biológiai energiák is elektromágneses eredetűek. memo: Az energiaformákat vissza lehet vezetni a fizika négy alapvető kölcsönhatásának valamelyikére. A négy alapvető kölcsönhatás 1) a gravitációs, 2) az elektromágneses, 3) a gyenge (β-bomlás (elektron, ill. pozitron emisszió), illetve az elektronbefogás) 4) az erős kölcsönhatás. 99

100 8) Bioenergetika ATP: adenozin -5 - trifoszfát foszforsavanhidrid foszfátészter DG~ 30.5 kj DG~ mol kj mol -1 ATP + 2 ADP + P i ATP + 2 AMP + PP i ΔG = 30.5 kj/mol ( 7.3 kcal/mol) ΔG = 45.6 kj/mol ( 10.9 kcal/mol) 100

101 8) Bioenergetika ATP és GTP mint energiahordozók: elem / akkumulátor (újrafeltölthető!) (ATP) felhasználás: direkt módon: kapcsolt reakció A sejtben igényelt anyagok szintézisében az endoterm ill. endergonikus reakciókhoz a kapcsolódó ATP/GTP hidrolízis adja a megfelelő hajtóerőt a reakció lefutásához. pl.a felhasználásra: - transzláció (fehérjeszintézis) - kreatin (energiaraktár az izomban) - (ATP) feltöltés: direkt módon: szubsztrát szintű foszforiláció: a metabolizmus (ételek, raktározott zsírsavak, egyéb anyagok lebontása) során az exoterm ill. exergonikus reakciókban történő ADP/GDP foszforilációja. indirekt módon: oxidatív foszforiláció a metabolizmus során redox-reakciókban redukált koenzimek keletkeznek: AD + és FAD 2 Ezek a redukált koenzimek elektrontranszporttal egybekötött, szabályozott regenerálása (oxidációja) során keletkezik ATP. 101

102 8) Bioenergetika Atkins & de Paula 99 kérdés: mennyi glükóz elégetése teszi lehetővé hogy egy 30 g össztömegű madár számára, hogy 10 m magasra repüljön? tapasztalat: 1 mol szilárd glükóz x C 2 gázzá és y folyékony 2 való oxidációja 25 C-on ~ 2828 kj (2,8 MJ) szabadentalpia (DG) felszabadulást eredményez. válasz: az elvégezendő munka nagysága mgh= (30*10-3 kg)*(9,81*ms -2 )*(10 m) = 2,943 kg m 2 s -2 = 2,943 J mivel 1 mol glükóz DG ~ 2, J munka végzéséhez elegendő, 2,943 J munka elvégzéséhez 2,943 / 2, mol glükózra van szükség, ami 1,04 μmol cukrot jelent. Mivel a glükóz M W -je ~180 g/mol ezért ez hozzávetőlegesen (180 g/mol * 1,04*10-6 mol) = 0,19 mg kérdés: a koncentráló emberi agy ~25 J energiát igényel másodpercenként. Mennyi cukor (glükóz) elégetése szükséges ehhez óránként? tapasztalat: 1 mol glükóz oxidációja 25 C-on ~ 2828 kj szabadentalpia (DG) felszabadulását eredményezi. válasz: az elvégezendő munka nagysága óránként = (25 Js -1 )* (3,6*10 3 s) = J = 90 kj mivel 1 mol glükóz DG ~ 2, kj munka végzéséhez elegendő, 90 kj munka elvégzéséhez 90 / 2, mol glükózra van szükség, ami 32 mmol glükózt jelent. Mivel a glükóz M W -je ~180g mol -1 ezért ez hozzávetőlegesen (180 * 32*10-3 g ) = 5,7 g/óra Tehát az emberi agy naponta ~ 24 * 5,7g ~140g glükózt igényel. 102

103 A napi g glükóz többsége ATP-vé alakul és így hasznosul a sejtekben. Aerob körülmények között 1 mol Glc (glükóz) mintegy 38 mol ATP eredményez. mivel M w (ATP)/ M w (glükóz) 507/180 = 2,82 ezért 2,82 * 38 * 160g 17,1 kg ATP Ténylegesen egy 70 kg-os ember napi ATP fogyasztása ~ 145 kg (nem csak szénhidrátot, de zsírt és fehérjét is fogyasztunk!) Ám a szervezetben egyszerre kb. 51 g össz ATP áll rendelkezésre, ami a teljes szükséglet (51 g /1, g) kb. 0,035% -a. Ez az tartalékolt ATP mennyiség tehát kb. (24* 3600s) * (3, ) ~ 30 s-ra elegendő mindössze! Tehát az ember ATP szükséglete ~ 100g / perc (aktív mozgás esetén 500g /perc) ADP/ATP ciklus (a foszforiltranszfer) A kémiai reakció: ATP 4 (aq) + 2 ADP 2 (aq) +P 4 2 (aq) DG~ 30 kj mol -1 A biokémiai rész ciklus: ½ 2 2 ADP 2 + P 4 2 ATP 4 DG 103

104 A teljes biokémiai ciklus: C 2 C +2 2 DG égetés pl. D-Glc + DG AD + + AD + FAD 2 FAD AD + (ikotinamid-adenin-dinukleotid) DG elektron-átvitel ½ 2 + DG 2 ADP 2 + P 4 2 ATP 4 foszfor-átvitel DG memo: a félkövér résztvevők ( C, AD+ +, FAD 2, ATP) azok a nagyobb energiájú molekulák a megfelelő párokban. memo: A negatív DG-s reakciók hajtják a velük összekapcsolt ( csatolt ) pozitív DG-s (piros nyíl) reakciókat. Tűz, a levessel a levegőn keresztül csatolódik FAD (Flavin-adenin-dinukleotid)

105 éhány fontosabb foszfátvegyület foszfátcsoport(jai) hidrolízisének DG- értékei 37 o C-on: memo: foszfoenol-piruvát DG~ 62 kj mol -1 ATP ADP DG~ 31 kj mol -1 ADP AMP DG~ 28 kj mol -1 AMP DG~ 14 kj mol -1 glükóz-1-foszfát DG~ 21 kj mol -1 glükóz-6-foszfát DG~ 14 kj mol -1 fruktóz-6-foszfát DG~ 16 kj mol -1 kérdés: mit takar az ATP DG~ 31 kj mol -1 információ? A hidrolízis exergonikus DG< 0 és éppen 31 kj mol -1 energiát ad át más vele csatolt - esetleg endergonikus - reakciók lefolytatásához. Ezért becézzük a megfelelő savanhidrid kötést gyakran nagyenergiájú kötésnek. memo: vegyük észre hogy DG sorozatban az ATP és ADP középen helyezkednek el, ezért lehet foszfát donor és akceptor is. 105

106 ATP 4 (aq) + 2 ADP 2 (aq) +P 4 2 (aq) tény: az ATP DG~ 31 kj mol -1 valamint a D~ 20 kj mol -1 és DS~ +34 JK -1 mol -1 memo: mivel DG = D TDS TDS~ 310 K *34 JK -1 mol -1 ~ +11 kj mol -1 ) memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a reakció nem vákuumban megy (ezért nem számít ). Tehát formálisan mólszám növekedés van (1-ből 2 mol lesz), s emiatt jár ez a reakció entrópia növekedéssel, avagy a komplexitás csökkenésével, amely egy további kedvező tény. A DG értéke ( 31 kj mol -1 ) ezért is ilyen kedvező. Az ATP hidrolízise felhasználható olyan csatolt endergonikus reakciókhoz, amelyek DG-je nem nagyobb mint +31 kj mol -1. pl. egy peptidkötés szintézise amely erősen endergonikus: DG~ +17 kj mol -1 memo: az 1 mol víz a hidrát burok része lesz, mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a nagy entrópia csökkenés (2-ből 1-re), a komplexitás növekedés. DG ezért is ilyen kedvezőtlen. memo: nem csak az entalpiaváltozás, de a szintézis entrópia csökkenése (komplexitás növekedése) is jelentős! kérdés: hogy mehet végbe a reakció 37 o C-on? válasz: úgy hogy ATP csatolt ez a folyamat. memo: a csatolt rendszer értelmében a két reakció ATP hidrolíziseé és amidkötés kialakítása össze van kapcsolva! (a e két reakció elkülönítve (2 edényben) menne végbe, vagy ha csak úgy összeöntenénk a reagenseket, akkor a folyamat nem menne végbe.) Csatolást végzi a ribozim (riboszóma)

107 megfigyelés: Itt nem részletezett okok miatt 1 peptidkötés kialakításához 3 ATP (v. GTP) szükséges. kérdés: hány gramm glükóz kell 1 mol hemoglobin bioszintéziséhez, ha az 153 aminosavból épül fel? válasz: 153*3 = 459 ATP szükséges. 1 mol glükóz 38 ATP eredményez, tehát 459/38~ 12 mol glükóz szükséges. tehát: (12*180 g)~ 2,2 kg cukor kell 1 mol (16,7 kda) fehérje szintéziséhez (~16,7 kg) A vörösvértest szárazanyag-tartalmuk 90%-a hemoglobin 107

108 Érdekes nano-rendszerek ow to safely store genetic material: cable reels in the cell nucleus... Legend: The nucleosome ucleosomes are cable reels for genetic material. In the cell s nucleus, the genetic material (DA) is organized in different chromosomes and protectively packaged. In this storage packing, the DA is wound around nucleosomes, just as a cable on a reel. Each nucleosome consists of four pairs of proteins called histones. Apart from their role as cable reels, nucleosomes are also involved in gene regulation as they prevent DA from being read at wrong positions. 108

109 Érdekes nano-rendszerek I am not giving away the original data! A copy is good enough... Legend: RA polymerase RA polymerase is essential for each cell. This protein reads the genetic code from the genetic material in the cell nucleus and copies it onto so-called mra molecules. These copies are then shipped to the ribosomes where they serve as blueprints for proteins. Thus, the precious original always stays in the vault of the nucleus, and only copies are shipped. Because RA polymerase is so important, its function is constantly monitored and controlled by a multitude of other molecules. 109

110 Érdekes nano-rendszerek DA is long where does a gene begin and how to find it? Legend: The TATA-box binding protein (TBP) in yellow The repetition of the amino acids threonine (T) and alanine (A) T-A-T-A marks the beginning of a gene. The TATA-box binding protein (TBP) recognizes this specific genetic start sequence and allows correct positioning of RA polymerase. Without TBP, genes could not be copied to mra and would, hence, not be read out. If the tail of TBP is too long, it causes 110 some of the most severe neurodegenerative diseases

111 Replikáció Ismétlés Szemidiszkontinuus Azaz a DS megkettőződése mindkét fonal mellett, ugyanabba az irányba történik Ez azt feltételezi, hogy a replikációs mechanizmus mind 5 ->3, mind 3 ->5 irányban képes DS-t szintetizálni De a DS-polimeráz csak 5 ->3 irányban képes haladni, vagyis elsőként az 5 helyen levő nukleotidot építi be, majd 3 irányba folytatja a láncot Vezető szál: folyamatosan szintetizálódik Követő szál: szakaszosan szintetizálódik (kazaki-fragmentumok) Itt a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa mozgásának irányával A követő szál a villától távolodva szintetizálódhat 111

112 Transzkripció Ismétlés Iniciáció Az RS polimeráz felismeri a DS promoter szakaszát, hozzákötődve szétválaszt 12bp-nyi szakaszt, és megkezdi az RS szál felépítését: ATP, UTP, GTP, CTP Elongáció Az RS-polimeráz 5 ->3 irányban építi be a ribonuleotidokat, működése során a DS-lánc mentén mozog Termináció A terminátor szakaszok lényegében lazítják a DS és RS közötti kapcsolatot memo: a folyamat aszimmetrikus: csak az egyik szál másolódik, a DS két szála csak rövid ideig távolodik el egymástól 112

113 Transzláció Ismétlés Iniciáció Egy riboszóma, amelyik már befejezte egy másik mrs transzlációját, alegységeire disszociál (IF-3) IF-3 kötődik 30S-hez és egy új RS-hez IF-2 hozzákapcsolja 30S-hez az első aminoacil-trs-t Ehhez az iniciációs komplexhez kötődik GTP, majd 30S, ezután IF-3 leválik GTP -> GDP: IF-2 is leválik 113

114 Transzláció Ismétlés Elongáció A transzláció iránya = transzkripció iránya = 5 -> 3 Az aa-trs minőségét az mrs második kodonja határozza meg, amely az üres A-helyen van (Katalizátor: EF-Tu, Energia: GTP A peptidil transzferáz az fmet-t a P-helyen levő trs-ről az A-helyen levő aa-trs-re kapcsolja, így egy dipeptid alakul ki az A hely trs-én A transzlokáció során az mrs az A-helyre kapcsolódó peptidil-trs-sel együtt egy kodonnal továbblép balra (EF-G) A P-helyen levő dezacilált trs leválik a riboszómáról Az A-helyen levő dipeptidil-trs az A-helyre lép A következő kodon az A-helyre kerül 114

115 Transzláció Ismétlés Termináció RF-1 és RF-2 ismeri fel a STP kodonokat RF-3-mal és GTP-vel leállítják a transzlációt 115