Az örökítőanyag. I. A tulajdonságokat meghatározó örökítőanyag/információ átadható/ transzformálható.(fred Griffith kísérlet, 1928.

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Az örökítőanyag. I. A tulajdonságokat meghatározó örökítőanyag/információ átadható/ transzformálható.(fred Griffith kísérlet, 1928."

Gusztáv Csonka
6 évvel ezelőtt
Látták:

1 Az örökítőanyag I. A tulajdonságokat meghatározó örökítőanyag/információ átadható/ transzformálható.(fred Griffith kísérlet, 1928.) Kísérlet: Tüdőgyulladást okozó pneumococcus baktériumok vizsgálata. S típus: normális, fertőzőképes, (vad típus, wild type) R típus: poliszacharid kapszulát képző enzim hiányzik, nem fertőzőképes, (mutáns) hővel megölt S baktériumok esetén hővel megölt S baktériumok és élő R baktériumok közösen + Valahogy az örökítőanyag átjutott a mutáns baktériumba (in vivo transzformáció).

2 A fehérje vagy a DS az örökítőanyag? I.. Avery, C. Mac Leod, M. McCarty kísérletei Kísérlet: a Griffith kísérletet folytatták úgy, hogy az S-típusú (fertőző) baktériumok sejtmentes kivonatát komponenseire szétválasztották, (fehérjére és nukleinsavakra), majd a komponensekkel próbáltak R típusú sejteket fertőzőképessé alakítani ( transzformálni ) és vizsgálták, hogy mi az aktív transzformáló anyag. (Ekkor még ők is fehérje-pártiak voltak!) Eredmények: az aktív transzformáló anyag kémiailag DS (optikai, ultracentrifugás diffúziós és elektroforetikus tulajdonságok alapján, specifikus reagensekkel is) az anyag fehérje és lipidextrakció után is AKTÍV fehérjéket bontó tripszin és kimotripszin enzimekkel történő kezelés után is AKTÍV RS bontó Ribonukleáz(Rnáz) enzimekkel történő kezelés után is AKTÍV DS bontó Dezoxiribonukleáz(Dnáz) enzimekkel történő kezelés után viszont IAKTÍV! A transzformáló / örökítőanyag a DS! Ekkor ezt még sokan nem fogadták el amiatt, hogy valószínűleg fehérjével szennyezett volt a DS.

A fehérje vagy a DS az örökítőanyag? II. ershey-chase kísérlet 1952. Előzmény: Kísérlet: Eredmény: 1951. R.

3 A fehérje vagy a DS az örökítőanyag? II. ershey-chase kísérlet Előzmény: Kísérlet: Eredmény: R. erriott; a baktériumokat fertőző vírusok (bakteriofágok), mint injekciós tűk, képesek bejuttatni a transzformáció anyagát a baktériumokba anélkül, hogy maguk a vírusok bejutnának A. ershey és M. Chase; bakteriofág DS-ét radioaktív 32 -ral jelölték, a fág fehérjéjét meg 35 S-nel.(Szelektív, mert a DS-ben nincs S, a fehérjében meg.) A fertőzött baktériumoktól ultracentrifugával elválasztották a fágokat és vizsgálták a radioaktivitást. (Baktériumok az üledékbe, vírusok a felülúszóba kerültek.) A fágok 35 S es fehérjéi a felülúszóban voltak, a fágok 32 -tartalmú DS-e az üledékben, a baktériumokban! A transzformáló / örökítő anyag biztosan a DS! Innentől senki nem vonta kétségbe, hogy a DS az örökítőanyag!

4 1869. F. Miesher es évek A DS szerkezetének felderítése I. Előzmények Fehérvérsejtek sejtmagjából izolált egy savanyú jellegű, lúgokban oldódó savakban oldhatatlan foszfortartalmú anyagot. Ezután másból is izoláltak hasonlót (halsperma, tojássárgája, élesztő stb.) és a vizsgálatok nagy molekulasúlyúnak mutatták az anyagot. (1889. Altmann nevezte el nukleinsavnak.) A DS és RS alkotóelemeit és kémiai szerkezetét savas, lúgos és enzimatikus hasításokkal és egyéb kémiai szintetikus módszerekkel meghatározták. nukleozid, nukleotid Base: A, C, G, T(U)

5 A DS térbeli szerkezetének felderítése II. Későbbi vizsgálatok 1940-es évek vége Eredmények: (Chargaff-szabályok) E. Chargaff különböző fajokból származó DS-eket hidrolizált és vizsgálta a bázisösszetételüket papírkromatográfiával. a különböző fajok bázisösszetétele különböző ugyanazon faj egyedeinek bázisösszetétele nagyon hasonló és nem függ az életkortól, tápláltság mértékétől, környezeti különbségektől az adenin (A) mennyisége egyenlő a timin (T), a citozin (C) mennyisége egyenlő a guanin (G) mennyiségével, tehát A+G=T+C (purin bázisok = pirimidin bázisok) különböző fajoknál az (A+T)/(G+C) arány annál nagyobb eltérést mutat, minél távolabbi a fajok közti rokonság J. Donohue Röntgen és MR spektroszkópiai adatokból kiderült, hogy a nukleinsavakban a nukleobázisok a keto tautomer formában vannak R. Franklin Röntgendiffrakciós felvétel a DS-ről, ami helikális szerkezetű molekulára utal J. Watson és F. Crick

6 A B-DS szerkezete J. Watson és F. Crick Kettős spirál B-DS jobbmenetes antiparalel lefutású hélix -hidak a bázisok között (komplementaritás) hélix d ~ 20 Å menetemelkedés 10 nukleobázis=34 Å/menet cukor konformáció C(3 )-endo

A DS és RS szerkezete A és Z formák Többnyire az élő szervezetekben ez a B-DS szerkezet van, de vannak más szerkezetek is: A-DS: hasonló, mint a B-forma, de más a cukor konformációja C(2 )-endo és

7 A DS és RS szerkezete A és Z formák Többnyire az élő szervezetekben ez a B-DS szerkezet van, de vannak más szerkezetek is: A-DS: hasonló, mint a B-forma, de más a cukor konformációja C(2 )-endo és emiatt apróbb különbségek (11 bázis/menet ) Élő szervezetekben az RS-ek kettős szálú részein vagy a DS-RS heteroduplexekben, illetve a DS-DS palindrómák kettős hajtűinél ilyen a szerkezet. RS kettős szál DS kettős hajtű / palindrómák Z-DS: balmenetes, 12 bázis/menet (tömörebb, kompaktabb szerkezet), főleg az utólagosan metilált citozinok környezetében fordul elő. Szerepe valószínűleg a génátíródás szabályozásban van. Génszabályozás

8 További DS szerkezetek Triplex és kvadruplex -DS: hármas spirál (triplex), oogsteen-bázispárosodás T-A-T és protonált C*-G-C T C A T C quadruplex-ds: négyes spirál (quadruplex), polig szekvenciáknál fordul elő G

9 A DS/RS szerkezete A szerkezetek leírásának módjai ukleobázis 2 T 2 U ukleozid 2 A 2 A ukleotid G 2 G 2 5 -dtpdapdg-3 5 -TpApG-3 (dt) 20 3' T 5' 3' A 5' 3' G 5' 5 -TpApG-3 T 2' 3' 5' A 2' 3' 5' G 2' 3' 5' Megállapodás szerint: 5-3 irány, em csak oligomerekre: pl. pppt

A nukleinsavak tulajdonságai, stabilitása IV.

Denaturáció / renaturáció = hibridizáció DS UV spektruma Denaturált A 260 nm-en atív

Stabilitást befolyásoló tényezők: Szerves oldószerek (Me, Et) Tm csökken (hidrofób

10 A nukleinsavak tulajdonságai, stabilitása IV. A ukleinsavak tulajdonságai (fizikai stabilitás) 1. Denaturáció / renaturáció = hibridizáció DS UV spektruma Denaturált A 260 nm-en atív 260 nm Tm T ( ºC ) G+C 2. Stabilitást befolyásoló tényezők: Szerves oldószerek (Me, Et) Tm csökken (hidrofób kh-ok szerepe) Bázisösszetétel (G+C tartalom növeli a Tm-et) Alkálisók: a +, K +, Li + Tm nő (a foszfátok árnyékolása miatt) Kétértékű ionok: Mg 2+, Mn 2+, Ca 2+ Tm nő (100x,1000x hatás, mint alkáli ionok esetén) Tm

11 ukleinsavak izolálása ukleinsavak izolálása biológiai rendszerekből 1. Fehérjementesítés: Fenol v. kloroform + izoamilalkohol extrakció (keverés óvatosan, nehogy a nyíróerők eltörjék a DS-t), fehérjék kicsapódnak és centrifugálással ülepíthetők Detergenssel kezelés (szintén kicsapja a fehérjéket) cc. sóoldat vagy guanidin hidroklorid is kicsapja a fehérjéket Enzimes kezeléssel szintén lebonthatók a fehérjék (proteináz) 2. DS/RS kicsapás (töményebb etanollal pl. 70% vagy metanollal) Utána Dnázzal kezelés (pankreászból) RS izolálás Rnázzal kezelés DS izolálás Sterilitás fontos, mert az RS-ek lebomolhatnak (enzimek inaktiválhatók EDTA-val, mert pl. Mg 2+ megkötődik) 3. Ioncserés kromatográfiás elválasztástechnikai módszerek pozitív fehérjék a kationcserélő oszlopon megköthetők negatív nukleinsavak anioncserélő oszlopokon megköthetők, majd lemoshatók sóoldattal (Léteznek kész, egyszer használatos DS-tisztító oszlopok ilyen célra) 4. Ultracentrifuga (méret-tömeg szerinti szeparálás)

oliakrilamid (akrilamid + bisz-akrilamid kopolimerizátum) Kisebb mérető

12 A nukleinsavak vizsgálata Gélelektroforézis 1. Agaróz gél (főleg galaktóz alapú poliszacharid gél) nagyobb méretű nukleinsavakhoz 2. oliakrilamid (akrilamid + bisz-akrilamid kopolimerizátum) Kisebb mérető nukleinsavakhoz (DS szekvenálás) 3. DS megjelenítés (interkalálódó festékek) 2 2 C 2 5 ( 3 C) 2 (C 3 ) 2 + Etídium-bromid Akridin-narancs

13 A genetikai kód, centrális dogma Centrális dogma, DS -> RS -> fehérje (Előzmények: G. Beadle és E. Tatum: 1 gén - 1 enzim) 1953 Watson-Crick: centrális dogma (DS-RS-fehérje, bázistriplettek, degeneráció) 1953 G. Gamow (atomfizikus, nagy bumm, cseppmodell)->rs nyakkendő klub 20 tag cél: a genetikai kód megfejtése (bázistriplettek átfedő kódos elképzelése, degeneráció) 50-es évek eredményei mrs, ami kijut a sejtmagból és viszi az információt a fehérjeszintézishez (korábbról ismert volt, hogy a fehérje a sejtmagon kívül szintetizálódik, F. Jacob és J. Monod megjósolták az mrs létezését) sejtmentes fehérjeszintetizáló (in vitro transzlációs) rendszerek kidolgozása 60-as évek irenberg és mtsai: kód feltörése kémiailag szintetizált RS-ek használatával (fáradságos kísérletek radioaktívan jelölt aminosavakkal 19 hideg + 1 meleg, 20 párhuzamos kísérlet) először poliu->polifenilalanin, majd az összes RS előállítása Eredmény: kódtábla, folyamatos, nem átfedő és nincsenek elválasztójelek később a kép eukariótáknál árnyalódott (exon/intron) valamint a centrális dogma is a vírusoknál (4 féle vírus: DS-DS, RS-RS, DS, RS); {Illetve 1990-ben az RS enzimatikus (RS-hasító tulajdonsága, ribozimok) szintén borította a klasszikus centrális dogmát.}

14 Genetikai kódszótár Centrális dogma : DS RS fehérje

Hasonló dokumentumok

Nukleinsavak építőkövei

Nukleinsavak építőkövei ukleinsavak Szerkezeti hierarchia ukleinsavak építőkövei Pirimidin Purin Pirimidin Purin Timin (T) Adenin (A) Adenin (A) Citozin (C) Guanin (G) DS bázisai bázis Citozin (C) Guanin (G) RS bázisai bázis