Nukleinsavak SZERKEZET, SZINTÉZIS, FUNKCIÓ

Átírás

1 Nukleinsavak SZERKEZET, SZINTÉZIS, FUNKCIÓ

2 Nukleinsavak, nukleotidok, nukleozidok 1869-ben Miescher a sejtmagból egy savas természetű, lúgban oldódó foszfortartalmú anyagot izolált, amit később, eredetére utalva nukleinsavnak neveztek el. Kiderült, hogy a nukleinsavak és különböző származékaik minden sejtben előfordulnak és nélkülözhetetlen feladatokat látnak el. A nukleinsavak, a dezoxiribonukleinsav (DNS) és a ribonukleinsav (RNS) nagy molekulatömegű polimer molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkipció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, és így a sejt összes fehérjéje szintetizálható. A különféle sejtekből nyert nukleinsavak teljes hidrolízisével pentózokat, purin- és pirimidinbázisokat, valamint foszforsavat lehet izolálni. A hidrolízis körülményeinek (savas, lúgos vagy enzimatikus) változtatásával részleges lebontás is megvalósítható. Az így nyerhető összetett építőegységek közül a nukleotidokban a cukormolekulához szerves bázis és foszforsav kapcsolódik, a nukleozidokban pedig a cukor szerves bázissal képez vegyületet. Nukleinsavak Nukleotidok Részleges hidrolízis 1N NaOH, 25 C Részleges hidrolízis cc. NH 3, 180 C Nukleozidok + foszforsav Hidrolízis H + DNS: dezoxiribonukleinsav - cukor komponense a dezoxiribóz RNS: ribonukleinsav cukor komponense a ribóz Pentózok + purin vagy pirimidin bázis 2

3

4 A nukleinsavak monomerjei; a nukleotidok DNS RNS

5

6 Nukleinsav építőelemek: a D-ribóz és a 2-dezoxi-D-ribóz D-ribóz 2-dezoxi-D-ribóz A D-ribóz és a 2-dezoxi-Dribóz a nukleozidokban mindig az 5 tagú gyűrű (furanóz) formájában van jelen.

7 A nukleinsavakat felépítő bázisok szerkezete Bázisként pirimidin- és purinvázas vegyületek izolálhatók, mégpedig az előbbiek uracil, timin vagy citozin lehetnek, az utóbbiak adenin vagy guanin. A vegyületek jelölésére gyakran nevük kezdőbetűjét (U, T, C, A, G) használjuk. A bázisok jelenléte nem teljesen tetszőleges. Az uracil csak az RNS-ben, a timin csak a DNS-ben fordul elő, a további három bázis pedig mindkét nukleinsavban megtalálható. A nukleozidok nevét a bázisok nevéből képezzük úgy, hogy pirimidinbázis esetén idin végződést (pl. timidin), purinbázis esetén pedig ozin végződést (pl. adenozin) illesztünk a bázis nevének első részéhez. A DNS-ből nyert nukleozidok nevéhez dezoxi előtag járul (pl. dezoxiadenozin). RNS DNS 7

8 Pirimidinszármazékok, nukleinsav építőelemek uracil pirimidin-2,4-diol Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái timin 4-amino-pirimidin-2-ol citozin 5-metil-pirimidin-2,4-diol Az N-glikozid kötés miatt csak a laktimlaktám és a dilaktám forma jöhet szóba

9 Purinszármazékok, nukleinsav építőelemek Purin 9H-purin adenin 6-amino-purin guanin 2-amino-6-hidroxi-purin Az guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái

10 A nukleobázisok Purin származékok N N Pirimidin származékok N csak DNS-ben N H N N Imidazo[4,5-d]pirimidin Kapcsolódási pont a pentofuranóz egység anomer szénatomjához. csak RNS-ben

11 A nukleobázisok stabilis tautomerjei és részvételük H-hidakban laktám laktim kcal/mól s C-O 91 p C-O 96 s C-N 75 p C-N 74 s H-O 110 s H-N 93

12 Nukleozidok előállítása, fizikai és kémiai sajátsága A nukleinsavak szerkezetfelderítése szempontjából jelentős a nulkleozidok szintetikus úton történő előállítása is. Ennek egyik lehetséges és gyakori módja, amikor acilezett -Dribofuranozil-kloridból és a megfelelően védett purin- vagy pirimidinszármazék klórmerkuri sójából kiindulva alakítják ki a -glikozidos kötést. triacetil- -D-ribofuranozil-klorid 6-acetilaminopurin-klórmerkuri-só A nukleozidok magas olvadáspontú, vízben jól oldódó színtelen kristályos vegyületek. A glikozidos kötés lúggal szemben ellenálló, míg híg savval könnyen hidrolizálható, miközben pentóz és bázis képződik. A dezoxiribonukleozidok esetében kíméletes körülményeket kell alkalmazni, mivel a képződő 2-dezoxi-D-ribóz savérzékeny. 12

13 A nukleotidok szerkezete, fizikai és kémiai sajátságaik A nukleotidok a nukleinsavak háromrészes építőegységei. Foszforsavészterek, melyek a nukleinsavakból enyhe lúgos vagy enzimatikus hidrolízis hatására képződnek. A hidrolízistermékek között a ribonukleinsavak esetében 2 -, 3 - és 5 -foszfátok, a dezoxiribonukleinsavak esetében pedig 3 - és 5 - foszfátok fordulnak elő. A nukleotidok nevét a nukleozidok nevéből képezzük úgy, hogy megjelöljük az észteresített hidroxilcsoport helyét. Szokásos a nukleotidok nevét rövidítve megadni, például uridin-5 -foszfát = 5 UMP. 13

14 Híg sav (0,01 n HCl) hatására a 3 -foszfátok átizomerizálódhatnak 2 -foszfátokká. Az átalakulás ciklusos köztitermék (2,3 -ciklofoszfát) képződésén keresztül játszódik le. HO H 2 C O N H / H 2 O - HO H 2 C O N H / + H 2 O HO H 2 C O N O O P OH OH OH H / H 2 O + O O P O OH H / H 2 O - HO HO O P O OH nukleozid-3'-foszfát nukleozid-2',3'-ciklofoszfát nukleozid-2'-foszfát Ez a folyamat ad magyarázatot arra, hogy miért található ribonukleozid-2 -foszfát is a ribonukleinsavak hidrolízistermékei között.

15 A nukleotidok magas olvadáspontú, vízben oldódó kristályos vegyületek. A dihidrogénfoszfát csoport jelenléte miatt erős savak. A nukleotidok óvatos savas hidrolízise a glikozidos kötés hasadásával bázist és pentózfoszfátot eredményez, lúgos hidrolízissel pedig a foszforsav sója mellett a megfelelő nukleozidot lehet izolálni. HO H 2 C O N H / H 2 O O OH P OH O OH ribonukleotid-3'-foszfát NaOH / H 2 O HO H 2 C O OH O O P OH OH OH + HN Na 3 PO 4 HO H 2 C HO O N OH riboz-3'-foszfát bázis ribonukleozid

16 A DNS-t alkotó nukleotidok

17 A RNS-t alkotó nukleotidok

18 A nukleotidok előállítása dibenzil-foszfokloridát izopropilidénnel védett cukor A nukleotidok szintézise ugyanúgy, mint a nukleozidoké a nukleinsavak szerkezetfelderítése szempontjából fontos. Gyakori reakcióút, hogy a cukrok hidroxilcsoportját dibenzil-foszfokloridát reagens segítségével alakítják foszforsavészterré. Például, a 2,3 hidroxilcsoportján védett ribonukleozidból 5 -foszfát nyerhető.

19 A nukleinsavak elsődleges szerkezete A nukleinsavak nukleotidokból épülnek fel úgy, hogy a polinukleotid láncban a pentózok 5 és 3 hidroxilcsoportja foszforsavdiészter-kötéssel kapcsolódik össze. A pentózok 2 szénatomján a DNS-ben hidrogén, az RNS-ben pedig szabad hidroxilcsoport található. Tehát a polimer molekula gerincét, primer szerkezetét mind a DNS-ben, mind az RNS-ben a pentóz-foszfát lánc alkotja, melynek változékonyságát a cukorrészhez kapcsolódó bázisok jelentik. 5'-láncvég HO cukor-foszfát lánc O HO H 2 C 5, P O H 2 C 5, O HO O 3, O P HO 3, O O O H 2 C 5, P O 3, O R N O R O N H 2 C 5, R 3, HO N O R N 3'-láncvég R = OH, H nukleotid egységek Foszforsavdiészter típusú kötések, nem-elágazó, lineáris polimer, amit 5 3 irányba írunk:.. 5 -C-G-T-A

20 A nukleinsavakat alkotó nukleotidegységek kapcsolódási módjának felismerését többek között az tette lehetővé, hogy találtak olyan specifikus enzimeket, melyek a polinukleotid lánc észterkötését csak az 5 -helyzetű vagy csak a 3 -helyzetű hidroxilcsoportnál hasítja el.

21 A bázissorrend meghatározása A nukleotidok kapcsolódási sorrendjét (szekvenciáját) ugyancsak enzimek segítségével derítették fel. Az ún. restrikciós enzimek meghatározott szekvenciájú kisebb nukleotid láncokat hasítanak ki a polimerből. A szétszabdalt láncok újra egyesíthetők a DNS ligáz enzim segítségével, a DNS polimeráz enzim pedig a DNS szintézist katalizálja. A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározására a Maxam és Gilbert (1977)-féle kémiai degradáló és a Sänger és Coulson-féle láncterminációs módszer ismert (1975), amelyek közül jelenleg a láncterminációs módszert használják. A DNS bázissorrendjének meghatározása Sanger nevéhez fűződik: szekvenálási eljárás alapelve nem a lebontás, hanem az enzimkatalizált DNS-szintézis irányított megszakítása. A szintézis megszakítására 2,3 -didezoxi-ribózt alkalmazott, ami a 3 láncvégen nem tud észteresedni, ezért az eljárás didezoxi módszer néven vált ismertté. Frederick Sanger ( ) Nobel díj 1958: inzulin aminosav sorrendjének meghatározása Nobel díj 1980: DNS szekvencia meghatározásáért

22 A láncterminációs módszer során a vizsgálandó DNS-t először egyszálúvá teszik. A folyamat kulcsenzime, a DNS-polimeráz I alkalmas arra, hogy az egyszálú DNS kiegészítő szálát elkészítse, de ehhez szükség van egy rövid kétszálas szakaszra is, amely az indító szerepét játssza. Az egyszálú DNS-hez tehát egy rövid oligonukleotid primert hibridizálnak, amelytől kezdődően elindulhat a második szál szintézise. A szekvenáláshoz négy reakció készül, ezek mindegyike tartalmazza a mintául szolgáló egyszálú DNS-t és a hozzá hibridizált primert, valamint tartalmazzák a négyféle nukleozid-trifoszfátot (datp, dctp, dgtp és dttp) is. A nukleozid-trifoszfátok közül az egyiket radioaktívan jelölik, hogy a termék később kimutatható legyen. Tartalmaznak az elegyek továbbá didezoxi-nukleozidtrifoszfát (ddntp), de mindegyik elegy csak egyfélét. A DNS-lánc felépülését katalizáló polimeráz enzim jelenlétében megindul a mintának megfelelő komplementer szál szintézise. Azok a mesterségesen felépülő szálak azonban, amelyekbe nem dezoxinukleozid-trifoszfát (dntp), hanem ddntp épül be, nem tudnak tovább gyarapodni, mert a rossz nukleozid-trifoszfát ribóz részének 3 -helyzetű szénatomján nincs hidroxilcsoport, így ehhez nem tud kapcsolódni a következő nukleotid. Ha a ddntp és a dntp aránya megfelelő, akkor a ddntp beépülésekor létrejövő lánctermináció statisztikusan úgy oszlik el, hogy az összes lehetséges vég képviselve lesz. A négyféle reakciót párhuzamosan végzik, és az elegyeket poliakril-amid gélre viszik, ahol elektroforézist végeznek. A gél felbontóképessége maximális, azaz már egy nukleotid különbséget is ki tud mutatni. A négy elegynek megfelelően négy oszlop fut párhuzamosan, s a kapott csíkok magasságából megállapítható, hogy melyik szakasz zárult adeninnel, melyik guaninnal, melyik timinnel és melyik citozinnal; ebből pedig összeállítható a vizsgált DNS bázissorendje. A szekvencia-adatokat nemzetközi számítóközpontokban, ún. génbankokban helyezik el. A saját szekvencia gyors komputeres programok segítségével összehasonlítható a génbankban levő ismert szekvenciákkal (Sain és Erdei, 1985). Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard Mezőgazda Kiadó Láncterminációs módszer

23 Láncterminációs módszer

24 Chargaff szabályok A különböző eredetű DNS-molekulák hidrolizátumában a purinbázisok (adenin és guanin) moláris mennyisége mindig azonos a pirimidinbázisokéval (timin és citozin), sőt további szabályosság, hogy az adenin mennyisége a timinével, valamint a guanin mennyisége a citozinéval azonos (Chargaff-szabályok 1950). Ezek okára csak a szerkezet megfejtése adott magyarázatot (1953. James D. Watson és Francis Crick). Az RNS-ek esetében nincs ilyen szabályserűség. Erwin Chargaff ( )

25 Chargaff szabályok 1. T+C (pirimidinek) = A+G (purinok) 2. A = T és G = C 3. A+T nem = G+C Egyes fajok AT/GC aránya nagyon eltérő lehet. Fajon belül a különböző szervekben mindig azonos.

26 Bázispárok között kialakuló hidrogénkötések

27 A DNS térszerkezete DNS röntgen krisztallogramja. A keresztet formáló foltok a helikális struktúrára jellemző kép, míg a kép jobb és baloldalán látható sávok a bázisoktól származnak. Az 51-es fotó adatai alapján Watson és Crick nem csak azt tudták megállapítani, hogy a távolság a két szál között állandó, hanem a pontos 2 nanométeres értékét is meg tudták mérni. Ugyanaz a fotó adta meg nekik az hélix 3,4 nanométer/10 bázispár sűrűségét Röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatok: Rosalind Franklin, Maurice Wilkins az 1950 körül kezdték a kikristályosított DNS röntgendiffrakciós szerkezetelemzését. Az eredmények (röntgendiffrakciós felvételek) kiértékelhetősége erősen függött a kristályosítás sikerétől. Franklin egyre jobb felvételeket készített, melyek igazolták a molekula helikális szerkezetét.

28 3,4 nm A DNS másodlagos szerkezete nm Francis H.C. Crick ( ) Nobel díj: Nukleinsavak szerkezetének meghatározásáért James D. Watson (1928 -) Nobel díj: Nukleinsavak szerkezetének meghatározásáért

29 A Watson - Crick modell: a DNS szerkezetének megfejtéséhez James D. Watson és Francis Crick 1950-ben fogott neki, mert meg voltak róla győződve, hogy a DNS az örökítő anyag és a szerkezet megfejtése alapvetően rávilágít az öröklődés molekuláris mechanizmusára. Riválisuk Linus Pauling volt, aki elsősorban a fehérjék szerkezetét kutatta, és akkoriban állította fel, majd később részletesen igazolta is munkatársaival, hogy a fehérjék felépítésében lényeges szerepe van az alfa-helix szerkezetnek. A két rivális csoport több modellt állított fel, melyek rövid időn belül tévesnek bizonyultak. Végül a versenyt Watson és Crick (illetve Franklin és Wilkins) nyerték meg 1953-ban, amikor közölték híres, egy oldalas cikküket a NATURE folyóiratban ben Nobel díjjal jutalmazták ezt az "egy oldalnyi" elméleti megfontolást.

30 A DNS jobbmenetes kettős hélix téralkatú, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. a hidrofil és negatív töltésű foszfodezoxiribóz gerinc kifelé mutat a bázisok befelé állnak, intermolekuláris H-hidakkal stabilizáltak, vagyis a spirálokat H-hidak tartják össze, az egyik a kódoló a másik a templát szál. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3-H híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson és Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban Rosalind Franklin diffrakciós méréseinek köszönhetően. a cukor-foszforsav diésztergerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak, bázispárok miatt a DNS két szála komplementer jellegű a heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt. timin

31 Szerkezeti jellemzők és következményeik: kettős hélix, melyben a két szálon lévő bázisok egymással H-hidak segítségével kapcsolódnak : A:T - 2db, G:C - 3 db H-híd egymással szemben komplementer bázispárok, A:T és G:C helyezkednek el, így a párosok térkitöltése megegyezik. replikáció (másolás) lehetősége, genetikai kód - egy szálon belül nem kötött a sorrend = nem monoton! egy "csavarmenet" 34 A, 10 bázispár / 1 csavar, 36 o / bp lefutás antiparallel, 5' - 3' irány háromdimenziós szerkezet - nagy és kis árok, (major groove, minor groove)

32 A DNS kettős spirál stabil szerkezet, amelynek kialakulását az alábbi tényezők befolyásolják: A bázisok közötti hidrogén hidak. A hidrogén híd kötés összetartó ereje ugyan a kovalens kötéseknek csak néhány százaléka, azonban sok van belőle, és a kötést létesítő bázisok rögzítettek, ami fokozza a kapcsolat stabilitását. Az egymás felett elhelyezkedő, lapos, hidrofób bázisok között hidrofób kölcsönhatás, a stacking is fontos tényező. Ez úgy működik, mint amit akkor tapasztalunk, amikor két egymásra fektetett üveglapot próbálunk víz alatt szétválasztani. Ezeket könnyebb egymáson elcsúsztatni, mint szétválasztani. További kölcsönhatás a cukorfoszfát gerinc foszfát csoportjainak egymásra gyakorolt elektrosztatikus taszító hatása. Ezekből következik: A kettős spirál alakja vagy stabilitása független a nukleotidok sorrendjétől. Kitűnően alkalmas ezért információ tárolásra. A szerkezet alapján könnyen elképzelhető annak megkettőződése, olyan módon, hogy széttekeredik, és az új szálak a régiek nukleotid sorrendjével komplementer módon jönnek létre.

33 A DNS-t alkotó két polinukleotid lánc kettős helixet alkotva egymás mellé csavarodik. A hélix külső palástját a pentózfoszfát polimer lánc alkotja, a paláston belül pedig a bázisok páronként hidrogénkötésekkel kapcsolódnak össze. E szabályos szerkezet kialakulásához az szükséges, hogy a két összecsavarodó lánc szerkezete pontosan megfeleljen egymásnak. A két szál bázissorrendje egymást kiegészítő, azaz komplementer szerkezetű, tehát az egyik szál bázissorrendje szigorúan megszabja a másik szál szekvenciáját A hélix szerkezet rögzítéséhez a bázispárok hidrogénkötésein kívül, a síkban egymás felett elhelyezkedő bázisok heteroaromás gyűrűi közötti erős van der Waals-kölcsönhatások is hozzájárulnak. A DNS külső palástján a poláris pentózfoszfát láncok vízoldhatóvá teszik a makromolekulát, ugyanakkor megvédik a belső apoláris bázisokat a külső behatástól. 33

34 A DNS szerkezet változatai B-forma (balra) A B forma jobban hidratált, kevéssé kompakt, mint az A forma. A B forma állhat legközelebb az élő sejtben található szerkezethez. A-forma (középen) Z-forma (jobbra) A Z forma ellentétes lefutású, torzult szerkezet (zig-zag DNA), mely speciális esetekben jöhet létre. A-forma B-forma Z-forma B-forma A-forma Z-forma

35 A DNS szerkezetek adatai

36 DNS szuperszerkezetek Schematic illustration of closed circular DNA in open conformation (left) and then in a negative supercoiled conformation (middle) and positive supercoiled conformation (right).

37 A DNS harmadlagos szerkezete A DNS-molekula óriási méretű, a legkisebbek 5000 bázispárból (5 kb; kilobázis) állnak és 1700 nm hosszúak. Az emberi DNS a teljes humán genom közel 6 millió kb-ból épül fel és teljes hossza eléri a 2 m-t. A szabályos kettős helix természetesen meghajlik, összetekeredik és ezt tekintjük a harmadlagos szerkezetnek. A DNS-molekula szervezettségének a legmagasabb szintje a kromoszóma, ami már fehérjéket is tartalmaz a DNS mellett. A teljes DNS lánc egy-egy rövidebb szakaszát tekintjük géneknek, a gének sorrendjét pedig genetikai térképnek nevezzük. Az 1990-ben elindított átfogó kutatás, a humán genom (HUGO) program elvezetett mind a 23 emberi kromoszóma teljes nukleotidsorrendjének feltárásához. 37

38 A DNS megkettőződése Szemikonzervatív replikáció Az -helix struktúra a DNS topoizomeráz és helikáz enzimek hatására megszűnik, majd a DNS polimeráz a szétcsavarodott szálak mellé kiépíti azok komplementerét. Így az eredetivel teljesen azonos két új szálat kapunk. A DNS polimeráz mindig csak az 5 3 irányba képes felépíteni az új szálat. Így míg az egyik szál kiépülése folyamatos az 5 vége felől ( leading-vezető ), addig a másik szál (lagging - követő) felépülése a széttekeredés felől történik, és a keletkező fragmenseket (Okazaki fragmensek) a DNS ligáz enzim kapcsolja össze egységes szállá. 38

39 Mismatch repair MMR DNS replikáció során bekövetkezett mutációk (1 hiba / 10 7 nukleotidra). Össze nem illő párok javítása (mismatch repair MMR), amely a DNS-replikáció és az azt követő rekombináció során keletkező hibás nukleotidpárokat javítja ki. Ez a mechanizmus nagyjából ezredrészére csökkenti a DNS-replikáció folyamán bekövetkezett hibák gyakoriságát. 99%-os precizitás 1 hiba / 10 9 replikált nukleotidra

40 A DNS-javító mechanizmus tanulmányozásáért hárman kapták a 2015-ös kémiai Nobel-díjat A 2015-ös kémiai Nobel-díjat Tomas Lindahl, Paul Modrich és Aziz Sancar kapta azért, mert molekuláris szinten feltérképezték, hogyan javítja a sejt a károsodott DNS-t, és őrzi meg ily módon a pontos genetikai információt. A három tudós munkája alapvető tudást adott arról, hogyan működik az élő sejt, és megnyitotta a gyakorlati alkalmazás lehetőségét is, például új rákkezelési módszerek kifejlesztéséhez.

41 A DNS biológiai funkciója transzkripció transzláció DNS mrns Fehérjék (átírás) (dekódolás) A molekuláris biológia centrális dogmája a DNS, az RNS és a fehérjék közötti információáramlással foglalkozik. A sejtek e három építőköve között kilenc lehetséges irányban mozoghat az információ; a centrális dogma szerint ebből négy irány gyakori (DNS DNS, DNS RNS, RNS RNS, RNS fehérje), két irány csak rendkívüli esetekben fordul elő (RNS DNS, DNS fehérje) a maradék három irányban, vagyis fehérjéből fehérjébe és fehérjéből nukleinsavba pedig soha nem íródik át információ. (Más megfogalmazásokban az RNS RNS információközlést is a ritka esetekbe sorolják.) A tételt Francis Crick angol molekuláris biológus, a DNS struktúrájának egyik felfedezője fogalmazta meg, először valamivel gyengébb formában (a gyakori és a rendkívüli esetet nem megkülönböztetve) 1958-ban, majd a fenti alakban 1970-ben. Az információáramlás útjai: DNS DNS: DNS replikáció DNS RNS: transzkripció RNS fehérje: transzláció RNS RNS: RNS replikáció RNS DNS: reverz transzkripció A DNS szerepe a biológiai információ hordozásában van. Ez kódolja az élő szervezet felépítéséhez szükséges fehérjék szerkezetét. A DNS a sejtmagban található, a fehérjeszintézis viszont a sejtplazmában játszódik le. A fehérjeszintézis feladatát az RNS-molekulák látják el. Egyetlen sejten belül többféle RNS található, melyek funkcióik szerint különböztethetők meg. 41

42 RNS fajták és funkciójuk kódoló RNS: mrns: hírvivő (messenger) RNS: DNS-ből másolt RNS, amely a genetikai információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ alapján a fehérjék szintetizálódnak. Három egymás melletti bázis alkot egy-egy kodon-t, amely egy-egy aminosavat kódol pre-mrns: éretlen mrns. Az érés során a nem kódoló részek (intronok) kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mrns-ben. nem-kódoló RNS: trns: transzfer RNS: segít az mrns-en található kód (kodon) leolvasásában. Minden létező kodonhoz külön trns tartozik, mely a kodonnak megfelelő aminosavat hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a fehérjeszintézisben rrns: riboszomális RNS: a riboszóma alkotóeleme, mely a fehérjeszintézis katalitikus centrumát alkotja léteznek további nem-kódoló RNS-ek is, mint például: sirns: (small interfering RNA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RNS részek (a DNS-hez kötődnek, és így meggátolják annak átíródását)

43 RNS féleségek Funkció szerinti csoportok RNS típusok Kódoló Nem kódoló Fehérjeszintézis Genetikai szabályozás RNS érés export DNS szintézis Transzpozon kontroll Enzim # mrns trns Fehérje szintézis rrns # Az enzim funkcióval a ribozimek rendelkeznek, ezek az RNS-ek szerepelnek más kategóriákban is.

44 Az RNS-családok hagyományos felosztása szerint megkülönböztetünk trns-eket, amelyek a transzlációban kulcsszerepet töltenek be transzfermolekulaként, mrns-eket, amelyek a genetikai információt közvetítik a génektől a riboszómáig, és az rrns-eket, amelyek a riboszómák funkcionális egységei, a kis magi RNS-eket (snrns, small nuclear RNA), amelyek a splicing folyamatában vesznek részt, valamint a kis magvacskai RNS (snorns, small nucleolar RNA), amelyek a fenti RNS-ek utólagos modifikációját (metiláció, pszeudouridiláció) végzi. Az utóbbi évek felfedezése alapján az RNS-világ családjait tovább bővíthetjük a szabályozó funkciót betöltő, népes mikro-rns-ek (mirns) és a kis interferáló RNS-ek (sirns) csoportjával. Az utóbbi évtized felismerése, hogy nem transzlálódó kis RNS-molekulák fontos szabályozó szerepet töltenek be befolyásolva a transzláció folyamatát és a messenger RNS-turnovert a sejt fehérjekészletének poszttranszkripciós szintű szabályozásában. Az RNS csendesítés jelenségének kihasználásával lehetővé vált a kutatásban a gének funkciójának tanulmányozása, gyógyszercélpontok validálása, és felmerült a betegségek gyógyításának lehetőségé is, mint például különböző daganatos megbetegedések, autizmus, Alzheimerkór, Prader-Willi szindróma, stb. Nem kódoló genom és mikro-rns-ek: új fejezet a genetika történetében Molnár Viktor, Bakos Beáta, Hegyesi Hargita, Falus András LAM 2008;18(8 9):

45 A hírvivő (messenger) RNS (mrns) A hírvivő RNS vagy mrns az RNS-molekulák azon csoportjába tartozik, amely a sejtekben a legkisebb arányban fordul elő. Az mrns-en tárolt információ meghatározza, hogy a különböző aminosavak milyen sorrendben épüljenek be a készülő polipeptid láncba. 45

46 A szállító (transzfer) RNS (trns) A trns a legkisebb RNS-molekula: általában nukleotid egységből épül fel, így tömege is a legkisebb. Szerepe a fehérjék építőegységeinek, az aminosavaknak a riboszómákhoz való szállítása. Mind a 20 fehérjékben előforduló aminosavat legalább egy specifikus trns köt meg. Funkcionális szempontból két legfontosabb molekularészletük az aminosav-kötőhely és a templát-felismerőhely. Az aminosavak kötése a molekula ún. 3 végén történik (az egyes nukleotidegységek kapcsolódása a ribóz 3 szénatomjához és 5 szénatomjához kapcsolódó OH- ill. PO 4 -csoportokon keresztül történik. 3 végnek nevezzük a lánc azon végét, ahol a nukleotid 3 szénatomján elhelyezkedő OH-csoporthoz nem kapcsolódik foszfát). A templát-felismerőhelyet antikodonnak is szokták nevezni. A mrns molekula három nukleotidjához (egy kodonjához) kapcsolódik. A kodont alkotó nukleotidok sorrendjének megfelelően egy specifikus trns kötődik a riboszómához, és szállítja a növekvő polipeptidlánc (fehérje) soron következő aminosavegységét. Az RNS-molekulák össztömegének 15%-át adja. 46

47 A riboszóma RNS (rrns) Az összes RNS tömegének 85%-át e típus adja. A riboszómák felépítésében vesznek részt (a fehérjék mellett). Az RNS-molekulák szintézisét specifikus enzimek, az RNSpolimerázok katalizálják. A polimerázok működéséhez a következő összetevőkre van szükség: templátmolekula: templátnak nevezzük általános értelemben a képződő makromolekula szerkezetét meghatározó információt hordozó molekulát, jelen esetben a DNS-t. a nukleotidok aktivált előalakjai (prekurzorai): a négyféle bázist tartalmazó nukleozid-trifoszfátok, fémionok (E. coliban: Mg2+ vagy Mn2+) 47

48 Minden hírvivő RNS egyetlen génre vonatkozó információt kódol és szállít, ami egy darab polipeptidlánc felépítéséhez elegendő. Minden egyes bázishármas egy meghatározott aminosavat (vagy STOP-jelet) kódol (l. aminosav-kódszótár). A riboszóma ezt az aminosavat fogja a láncba építeni. Az mrns-en a leolvasás egy START-jellel indul. Ez a bázishármas az AUG, ami a metionint kódolja. Van három STOP-jel is, amik leállítják a folyamatot. Ezek nem kódolnak aminosavakat. Az információ "pont-, vessző- és átfedésmentes". Ez annyit tesz, hogy a START- és STOP-jel között nem állhat meg a leolvasás, egyetlen bázis sem maradhat ki a leolvasásból, és nem lehet bázist kétszer olvasni. A kód (majdnem) univerzális, mert ugyanazok a bázishármasok ugyanazokat az aminosavakat kódolják minden élőlényben. A kód degenerált, azaz egy aminosavat több bázishármas is kódolhat. A kód lötyög. Ez azt jelenti, hogy gyakran elég az első kettő bázist leolvasni, mert nem számít, hogy mi a harmadik. (Mindenképp ugyanazt az aminosavat kódolja.)

49 Aminosav kódszótár 49

50 Az RNS térszerkezete: általában egyszálú, de a Watson-Crick-féle párképzés a szálon belül itt is kialakulhat. A-típusú kettős helix

51 RNS típusok jellemzői

52 Nuleotid koenzimek A nukleotidok nemcsak a nukleinsavak alkotórészeként fordulnak elő az élő természetben, hanem szabad állapotban vagy egyszerűbb vegyületek formájában is. Fontos származékaik az egyes anyagcserefolyamatokat katalizáló enzimek koenzimjei. Az ATP ADP átalakulás során felszabaduló energia fedezi az élő szervezetben lejátszódó szintézisfolyamatok energiaigényét, ugyanakkor az anyagcsere során a lebomlási folyamatokban képződő energia az ADP ATP átalakulás során elraktározódik. A ciklikus adenozin-monofoszfát (camp) ugyan nem képes átjutni a sejtmembránon, de másodlagos hírvivő (second messenger) molekulaként fontos szerepet játszik a sejten belüli jelátviteli (szignál transzdukció) folyamatokban. Olyan hormonok hatásának kiváltásában vesz részt, mint például a glukagon és az adrenalin. Fő hatása a proteinkináz enzimek aktiválása, és szabályozza a Ca + ionok ioncsatornákon keresztüli áthaladásának mértékét is. 52

53 53

54 FOGALMAK

55 nukleinsav nucleic acid DNS DNA RNS RNA nukleobázis nucleobase nukleozid nucleoside nukleotid nucleotide Watson-Crick-modell Watson-Crick model bázispár base pair foszfodiészter kötés phosphodiester bond purin bázisok purine bases pirimidin bázisok Nukleotidokból, mint monomer egységekből felépülő lineáris biopolimerek, melyek a genetikai információ tárolásáért és kifejezéséért felelősek. Dezoxi-ribonukleinsav: 2-dezoxi-D-ribózt tartalmazó nukleinsav, amely a genetikai információt tárolja. Ribonukleinsav: D-ribózt tartalmazó nukleinsavak, melyek három típusa (hírvivő messenger, mrns; szállító transzfer, rrns; riboszomális, rrns) a genetikai információ továbbításában és a fehérjeszintézisben játszik alapvető szerepet. Nitrogén-heterociklusos vegyületek, amelyek a nukleotidok felépítésében vesznek részt. Típusaik a pirimidin (citozin, timin csak DNS-ben, uracil csak RNS-ben) és a purinvázas (adenin, guanin) származékok. N-Glikozid típusú vegyületek, melyekben a nukleobázisok egyik nitrogénatomjához (pirimidinekben N1, purinokban N9) 2-dezoxi-β- D-ribofuranosyl- (DNS) vagy β-d-ribofuranosyl csoport (RNS) kapcsolódik. Típusaik: citidin C, timidin T, uridin U, adenosin A, guanozin G. A nukleozidok cukorrészének 5 -OH csoportján foszfátésztert tartalmazó vegyületek. A monofoszfátok a nukleinsavak monomerjei. Di- és trifoszfát származékaik fontos metabolitok. A DNS első publikált szerkezeti modellje (a ma ismert formák, az A, B és Z változatok közül a B), amely meghatározott geometriai paraméterekkel leírható, jobbmenetű, ellentétes irányba haladó, egymás körül felcsavarodó két helikális cukor-foszfát lánc között hidrogénkötésekkel kapcsolódó bázispárokkal jellemezhető. A DNS szerkezetek jellegzetessége, amely szerint a nukleotidok meghatározott párokba rendeződnek a nukleobázisok mérete/váza és a hidrogénkötések száma szerint (adenin-timin, A-T és guanin-citozin G-C). A DNS-RNS átíráskor is ezek a szerkezeti jellemzők határozzák meg a létrejövő RNS-t (G-C helyett G-U párral). Nukleinsavak cukor-foszfát láncában található kötések, melyek az egyes nukleotid monomerek 3 - és 5 -OH csoportjait kapcsolják össze. A nukleobázisok kondenzált gyűrűs vázat (imidazo[4,5-d]pirimidint) tartalmazó típusai (adenin, guanin). A nukleobázisok pirimidin (1,3-diazin) vázat tartalmazó típusai (citozin, timin, uracil). pyrimidine bases

56 hírvivő RNS messenger RNA (mrna) riboszomális RNS ribosomal RNA (rrna) szállító RNS transfer RNA (trna) retroszintézis retrosynthesis szétkapcsolás disconnection barbitursav (barbiturátok) barbituric acid (barbiturates) A DNS-RNS átírás (transzkripció) során keletkező RNS molekula, melynek szerepe a fehérjeszintézisre vonatkozó információk továbbítása a riboszómákhoz. A fehérjeszintézist végző sejtszervecske, a riboszóma legfontosabb alkotórésze. A riboszómán történő fehérjeszintézis során az egyes aminosavakat a polipeptidlánc továbbépítési pontjához szállító molekulák. Szerves szintézisek tervezésére szolgáló módszer (retroszintetikus analízis), melynek során a célvegyületet kisebb részekre bontjuk az ún. szétkapcsolások (disconnection) révén mindaddig, amíg egyszerűen hozzáférhető építőkövekhez, kiindulási anyagokhoz jutunk. A retroszintetikus analízis során alkalmazott művelet, melynek során a célmolekula kötéseit (pl. a polarizációjának megfelelően) elhasítva szintonokhoz jutunk. Utóbbiak szintézis-ekvivalensei azok a vegyületek, amelyekben a szintonra jellemző polaritású atomok találhatók, és amelyek felhasználásával a szintézis megvalósítható. 2,3,6-Trihidroxi-pirimidin, melynek 5-helyzetben szubsztituált származékai (a barbiturátok) között számos nyugtató, altató, görcsoldó hatású gyógyszer található. Függőség kialakulása miatt ma inkább csak intravénás narkotikumként és antiepileptikumként használatosak.

57 molekuláris biológia központi dogmája central dogma of molecular biology fehérjeszintézis protein synthesis transzkripció transcription genetikai kód genetic code replikáció replication transzláció translation Francis Crick által lefektetett elv, amely a szekvenciális információ továbbításának sejten belüli irányát adja meg: DNS RNS fehérje. Ezzel ellentétes (valamint fehérje fehérje) irányú információátadás nem történik. Az a folyamat, amellyel a sejtek felépítik a működésükhöz szükséges fehérjéket. Főbb részei a transzkripció (DNS-RNS átírás) és a transzláció (a polipeptidlánc szintézise a riboszómán). A fehérjék biológiailag aktív formái a legtöbbször további (ún. poszttranszlációs) módosulásokkal és feltekeredéssel (folding) jönnek létre. A sejtmagban végbemenő folyamat, melynek során a DNS kettős hélixe felnyílik, és az ún templát szálról RNS másolat készül. Azon szabályszerűségek összessége, amelyek meghatározzák, hogy a DNS-ben tárolt genetikai információ hogyan határozza meg a fehérjék aminosav sorrendjét. A nukleinsavakban három nukleotidból álló részlet (bázistriplet vagy kodon) határoz meg egy aminosavat. A biológiai öröklődés alapvető folyamata, melynek során a DNS megkettőződik. A fehérjeszintézisnek a sejtplazmában végbemenő részfolyamata, melyben a hírvivő RNS által kódolt aminosav szekvencia szerint a riboszómán létrejön a fehérjemolekula.