A nukleinsavkémiai kisszótár:

Átírás

1 A nukleinsavkémiai kisszótár: DS: dezoxiribonukleinsav, DA <ang.>: olyan nukleotidegységekből felépülő nukleinsavak gyűjtőneve, amelyek dezoxiribóz cukorrészt tartalmaznak. A gének kódolására, és továbbadására szolgálnak. RS: ribonukleinsav, RA <ang.>: olyan nukleotid egységekből felépülő nukleinsav, amely cukorrészként ribózt tartalmaz, előfordul minden élő sejtben, valamint egyes vírusokban. ukleotidok: (= bázis + cukor + foszfát) a nukleozidok foszforsav-észtereinek gyűjtőneve. A bennük szereplő cukorrész (D-ribóz v. 2-dezoxi-D-ribóz) alapján megkülönböztetik a ribonukleotidok és a dezoxiribonukleotidok csoportját. ukleozidok: (= bázis + cukor) szűkebb értelemben a nukleinsavakban előforduló pirimidin- és purinbázisok -ribozid, ill. -2 -dezoxiribozid típusú glikozidjainak gyűjtőneve ( citidin, uridin, timidin, adenozin, guanozin). A ~okban a cukorrész mindig furanóz szerekezetű, a glikozidos szénatom pedig β-konfigurációjú. ukleinsavak (DS, RS): <lat. nucleus mag >: (= bázis+cukor+foszfát -> polimer) nukleotidokból felépülő óriásmolekulák (biopolimerek), amelyek minden sejtben és a virusokban is megtalálhatók, azoknak esszenciális alkotórészei. ~akat először F. Miescher (1869) különített el a genny fehérvérsejtjeiből. Watson rick-modell: a DS térszerkezetét leíró térszerkezeti modell. A ~ szerint a DS-molekula kettős hélixét két, ellentétes lefutású (antiparalel) polinukleotid-lánc alkotja. A két láncot a komplementer bázispárok (adenin timin, guanin citozin) között létrejött hidrogénkötések tartják össze. A kettőshélix-szerkezetet J. D. Watson és F. rick javasolta 1953-ban. A ~ szerint a polinukleotid-láncokat helikális szerkezetű cukorfoszfátváz építi fel; a hélix tengelyére merőleges irányban, a hélix belseje felé helyezkednek el a nukleinsavbázisok. A ~ alapján jól magyarázható a genetikai információ megőrzése és átadása. DS kettős hélix/spirál: Két komplementer DS szál Watson-rick-modell szerint alkotott térszerkezete. DS-replikáció: A DS mindkét szálának megduplázódása, amely során egy DS kettős spirálból létrejön kettő, az eredetivel azonos DS kettős spirál. Transzkripció: Atírás (DS->RS) amely során a DS-függő RS polimeráz a rendelkezésére álló nukleozid 5 -trifoszfátokból RS-t hoz létre. Fontosabb lépései: iniciáció, elongáció és termináció. Transzláció: Fehérje bioszintézis (RS->Fehérje), amely során a riboszóma az RS alapján, a rendelkezésre álló (és megfelelő aminosavat hordozó) trs-ek segítségével megszintetizálja az adott fehérjét.

2 Mutáció: Az eredetihez képesti elváltozás a DS-ben (más vagy hiányzó nukleotid(ok)) Riboszóma: A fehérjeszintézist = transzlációt végző ribozim, mely 2 rrs és több fehérjéből áll. Ribozim: Egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (egy bizonyos reakciót katalizáló) RS. Enzim: Egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (bizonyos reakciót katalizáló) fehérje. mrs: hírvivő RS: átmeneti adathordozóként szolgál (DS -> mrs -> Fehérje) rrs: riboszomális RS: a riboszóma fő alkotóeleme, a katalitikusan aktív része. trs: átvivő RS: Antikodont és annak megfelelő aminosavat (ill. kötőhelyét) tartalmazó RS A genetikai kód: Kodon: ukleotid-hármas a DS/RS-en, mely egy-egy aminosavat kódol Antikodon: ukleotid-hármas a trs-en, mely reverz-komplementje a kodonnak (tehát Watson- rick párosítással illeszkedik a kodonhoz transzláció közben) Gén: Az öröklődő DS egy fehérjét kódoló része. Genom: A gének összesége (egy egyedben/fajban), pl. a humán (emberi) genom. Exon: Egy gén/mrs azon része(i), mely(ek) tényleges fehérjeszekvenciát kódól(nak) Intron: Egy gén/mrs azon része(i), mely(ek) nem kódolnak fehérjeszekvenciát, és az RS érés során (transzkripció és transzláció között) kivágódnak, pre-mrs -> m-rs. Restrikciós endonukleáz: DS-hasító enzim, mely csak egy meghatározott szekvencia egy meghatározott pontján hasítja a DS-t. alindrom szekvencia: DS szekvencia, mely megegyezik a reverz-komplementjével, pl. AATT, GGAT, stb. Antiszensz oligonukleotid: A kódoló DS szálhoz kapcsolódó oligonukleotid, amely speciális szakaszhoz kötődve gátolhatja a DS átíródását (transzkipciót). R: olimerase-hain-reaction: polimeráz-láncreakció, egy eljárás a sejten-kívüli (in vitro) DS sokszorosítására. (templát DS + primer + polimeráz + + nukleotidok(monomerek) + hőmérsékletváltakozás = sokszorozódás)

3 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai: Francis arry James Dewey ompton rick Watson Maurice ugh Frederick Wilkins Friedrich Miescher német orvos-kémikus 1869-ban felfedezi és izolálja a DS-t. Lord Alexander R. Todd (angol biokémikus) 1957 obel-díj A nukleotidok és a nukleotid koenzimek felfedezéséért 1962 obel-díj a DS molekuláris szerkezetének felismeréséért Luis Federico Leloir (argentín biokkémikus) 1970 obel-díj a cukor nukleotidok felfedezéséért és a szénhidrátok bioszintézise kapcsán elért eredményeiért

4 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi obel-díjak: Stanford Moore és William. Stein amerikai biokémikusok 1980 aul Berg Walter Gilbert rekombináns-ds Frederick Sanger A nukleinsavak szekvenálásáért 1972 obel-díj a ribonukleáz aktív centrumának katalitikus aktivitása és kémiai szerkezete közötti kapcsolat feltárásáért Aaron Klug (angol kémikus ) 1982 obel-díj a kristálygráfiai elektronmikroszkóp kifejlesztéséért illetve a bilológiai szempontból fontos nukleinsavfehérjekomplexek szerkezetfelderítéséért

5 Sir James W. Black Gertrude B. Elion George. itchings 1988 obel-díj a purin alapú kemoterápiás gyógyszerek kifejlesztéséért Sidney Altman és Thomas R. ech Amerikai/kanadai és amerikai kémikus 1989 obel-díj az RS katalitikus tulajdonságainak felfedezéséért. Kary B. Mullis Michael Smith 1993 obel-díj olimeráz Irányított láncreakció (R) mutagenezis

6 UKLEISAVAK - dezoxiribonukleinsavak (DS) - ribonukleinsavak (RS) memo: nucleus = sejtmag lyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek eredményeként a sejt összes fehérjéje megszintetizálódik. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.) Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok 4' 5' 3' 2' heterociklusos bázis β--glikozidos kötés 1' egy nukleotid hidrolízis heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz foszfátion

7 146 bázispár 8 histon fehérje és ezt is - hidak tartják össze. A nukleoszóma komplexet stab. a 1 linker fehérje A supercoiling 15000* kondenzációt tesz lehetővé mindig jobb menetes, antiparallel, Z-DS az egészet a -hidak tartják egyben Eukarióta sejtek génjében van nemkódoló rész; intronok. (rokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során az kivágódik.

8 Foszforsavészterek hidrolízise: 2 Q Q= adenozin-5'-monof oszf át Q= dezoxiadenozin-5'-monof oszf át 2 ukleinsav (polinukleotid) nukleáz ukleotid (monomer) nukleotidáz enyhe degradáció 1 a, 25 cc. 3, 180 Q= Q= Q A -glikozidkötés hidrolízise: adenozin dezoxiadenozin ukleozid (glikozid) purin nukleozid foszforiláz* + ukleotidbázis + pentóz (nucleobase) * Ez a foszforiláz az valójában egy hidroláz

9 A cukorrész: D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz memo: pirán furán tetrahidro-2 -pirán tetrahidrofurán iklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat: A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi nyílt láncú D-ribóz nyílt láncú D-ribóz 2 1 ukleozidokban mindig 5 tagú (furanóz) gyűrű formájában van a cukor jelen β-d-ribofuranóz α-d-ribof uranóz 2 1

10 memo.: eterociklusos szénvegyületek: két heteroatomos hattagú gyűrűk (Bruckner. III/1.) Aromás vegyületek: em aromás származékok memo: gyenge bázisok: a piperazin 10%-os vizes oldatának p-ja

11 A nukleinsav építőelemek; a heterociklus: irimidinszármazékok Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái: memo: csak a laktim-laktám vagy a dilaktám forma jöhet szóba, az -glikozid kötés miatt.

12 A nukleinsav építőelemek; a heterociklus: urinszármazékok 2 6-amino-purin adenin A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái: 2 2-amino-6-hidroxi-purin guanin Melyik tautomer forma a stabilabb?

13 em-rs és -DS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: áz:= urin nukleozid foszforiláz AM nukleotidáz GM Adenozin dezamináz áz purinvázas alkaloidok: di- és trimetil xantinok:

14 ukleotidok: A nukleozidok foszforsavészterei 2 Q= Q= Q adenozin-5'-monofoszf át dezoxiadenozin-5'-monofoszf át ukleozidok: A megfelelő purinés pirimidinbázisok -glikozidjai Q Q= Q= 2 adenozin dezoxiadenozin

15 2 2 adenozin RS építőelem adenozin 9-(β-D-ribofuranozil)-adenin op= 235 o 2 2 adenozid - - adenozin-5'-foszfát 5'-AM - - adenozin-3'-foszfát 3'-AM dezoxiadenozin 2 2 DS építőelem dezoxiadenozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-adenin op= 190 o 2 2 dezoxiadenozid - - dezoxiadenozin-5'-foszfát 5'-dAM - - dezoxiadenozin-3'-foszfát 3'-dAM

16 guanozin 2 2 RS építőelem guanozin 9-(β-D-ribof uranozil)-guanin op= 240 o guanozid guanozin-5'-foszfát 5'-GM - DS építőelem - guanozin-3'-foszfát 3'-GM dezoxiguanozin 2 dezoxiguanozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-guanin 2 dezoxiguanozid dezoxiguanozin-5'-foszfát 5'-dGM - - dezoxiguanozin-3'-foszfát 3'-dGM

17 2 citidin 2 RS építőelem citidin 3-(β-D-ribof uranozil)-citozin op= 230 o citidinf oszfátok citidin-5'-foszfát 5'-M - DS építőelem - citidin-3'-f oszf át 3'-M dozoxicitidin 2 2 dezoxicitidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-citozin dezoxicitidinfoszf átok dezoxicitidin-5'-foszfát 5'-dM - - dezoxicitidin-3'-f oszfát 3'-dM

18 uridinn RS építőelem uridin 3-(β-D-ribofuranozil)-uracil op= 165 o uridinnfoszfátok - - uridin-5'-foszfát 5'-UM - DS építőelem - uridin-3'-foszfát 3'-UM timidin 3 3 timidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-timin op= 183 o timidinf oszfátok timidin-5'-foszfát 5'-TM - - timidin-3'-f oszfát 3'-TM

19 A DS kémiai szerkezete 2 citidin 5' 3' foszforsavdiészter típusú, nem-eléágazó, lineáris polimer, amit az 5 3 irányba írunk: 5 -A-T-G--3 guanozin Az RS kémiai szerkezete 5' 3' 3 2 timidin 5 5' 3' adenozin 2 5' 3' 3

20 is G is amino-laktám forma T dilaktám, míg az A amino (aromás) forma ribóz citozin ribóz amino-laktám-f orma guanin amino-laktám-f orma ukleotidok belső arányai a DS-ben; a hargaff-szabály (E. hargaff, 1940s): Σ(pur.)/Σ(pir.) (G+A)/(+T) 1 és A/T 1 és G/ 1 memo: (G+)/(A+T) változik (DS stabilitás) - A bázispárok miatt a DS két szála komplementer jellegű, - az intermolekuláris -hidak jelentősége nagy, - a cukor-foszforsav diészter gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak, - a heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt. A kettős hélix (double hélix) 1953 Francis arry James Dewey ompton rick Watson

21 A DS térszerkezete: jobbmenetes kettős hélix, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat -hidak tartják össze. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3- híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis rick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban. citozin 2,8 Â guanin timin 2,8 Â adenin 3,0 Â 3,0 Â ribóz citozin ribóz amino-laktám-f orma guanin amino-laktám-f orma

22 Mutáció I: ormális és abnormális bázispárok Rib guanin laktám tautomerje STABILABB Rib citozin amino-latkám f orma Replikáció #1 Replikáció #2 -G- -szülő gyerek -G- -- -G- -- unoka 3 mutáció Rib guanin laktim tautomerje LABILIS Rib timin dilaktámf orma -G*- -T- memo: ugyanúgy megvan a 3. -híd is, ám míg a normál esetben (felső) a purin bázis a 3. - hídban az akceptor, addig a mutációra vezető esetben ugyanitt a -híd donor szerepét tölti be. A két tautomer eltérő -híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez W párt. -G- -- -G- -- -G- -- -G- -- -G- -- -A- -T-

23 Mutáció II: a kémiai reagensek indukálta mutációk Salétromossav a 2 + l magyarázat: mutáció indukált mutáció: memo: ugyanúgy megvan a 2. -híd, ám míg a normál esetben (alsó) a purin bázis a 2. -hídban donnor, addig a mutációra vezető esetben (felső eset) az akceptor szerepét tölti be. A két tautomer eltérő -híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez W párt. -A- -T- -A- -T- -A- -A- -T- -Tszülő gyerek unoka -*- -- -A- -T- -A- -T- -G- -- -A- -T- -A- -T-

24 em-klasszikus DS szerkezetek: triplex DS: háromszálú DS quadruplex DS: négyszálú DS. pl. telomerek (kromoszómavégek) 4xG: négy guanidin helyezkedik el egy síkban, egy kation + 4x 2 hidrogénhíd (a purinváz 7-es -jével is) stabilizálja a szerkezetet.

25 A DS térszerkezete: A leggyakoribb forma a B-DS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű 3 nagyárok kisárok 5 A G G G T 5 3 memo: Az A olyan mint a B-forma, csak tömörebb.

26 jobbmenetes hélix jobbmenetes hélix Az A-DS hélix tömzsibb és rövidebb, mint a B-DS, a főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 19 o ). R -3' a sík felett -3' endo balmenetes hélix Az Z-DS hélix karcsúbb, főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 9 o ). Az B-DS hélixben a főtengelyhez képest a bázispárok síkja merőleges ( képest 1 o ). R -2' a sík felett -2' endo

27 A DS hőstabilitása tétel: A DS T m pontja nő a G frakció növekedésével; T m1 < T m2 ha G 1 /total<g 2 /total! memo: mivel a G-ben 3- míg az AT-párban csak 2 -híd van bázispáronként. kérdés: mennyi a T m pont ha G = 0,4? válasz: T m 340K (ha c(al =0)) kérdés: mennyi a T m pont ha G = 0,4, de teszünk mellé al? válasz:t m 360K (ha c(al =150 mmol)) kérdés: miért nő a T m pont ugyanolyan G frakció mellett akkor, ha magasabb az oldat só koncentrációja? válasz: a DS felszíni negatív töltései - kompenzálódnak. Tm (K) ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma 0 al 150mM al Lineáris (0 al) Lineáris (150mM al) ribóz 3 ribóz timin oxo-f orma adenin ribóz DS termostabilitás y = 39,7x R 2 = 0,996 y = 39,7x R 2 = 0,996 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 G- frakció megjegyzés: - Minnél több a belső -híd a DS 2 szála között az annál stabilabb dimert képez. (Fehérjék esetében ez nem igaz, ott a belső -hidakkal nem nő lineárisan a fehérje termostabilitása!) - A DS T m (60-80 o ) pontja lényegesen magasabb mint a testhőmérsékletünk, és jelentősen magasabb mint a legtöbb fehérjénkké! Atkins de aula 118

28 DS és RS hidrolízisének részletei: 1) Savas hidrolízis l. depurinálás (A v. G) memo: az RS és a DS kb. egyformán hidrolízál savban kérdés: a ribóz félacetálja savban felnyílik-e?

29 2) Lúgos hidrolízis (az RS lúgos hidrolízise): eredmény: lánchasadás memo: ezért az RS kevésbé, míg a DS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek memo: azért van DS és nem csak RS(?), mert az előbbi jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek, azaz stabilabb!

30 DS szilárdfázisú szintézise: egyszerű észter kötés(ek) kialakítása, azaz ezek egyszerű S reakciók foszfor centrumon. Védőcsoportok I: a bázisok védelme permanens csoportokkal él a primer aminok védelme, avagy a nukleofil csoportok álcázása, hogy a majdani kapcsolásnál már csak a ribóz 5 legyen csupán az egyetlen u. A G Rib Rib 4 -benzoilezés Rib 6 -benzoilezés vagy 2 -izobutiril 3 4 -acetilezés Rib T 3 nem kell védeni Rib

31 Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme permanens csoporttal B cianoetilészter formában E B Mindkét típusú permanens védőcsoport típus (-benzoil vagy -acetil és a E) is eltávolítható: memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoportot vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható vizes 3 -val

32 Védőcsoport: az 5 - csoport ideiglenes védelme Dmtr Me Me (enyhén savas rendszer) B 2 l 2 + 3% l 3 - Me B narancs szín Me

33 Szilárd hordozó: G (controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg -kémiailag inert -nem duzzad -amino funkcionalizált G Me Si ( 2 ) n 2 Me Linker : l. borostyánkősav 2 ( 2 ) n Me Si 3 / 2 hasító hely Me G 2

34 DS szintézis: -szilárdfázisú szintézis 3 -től 5 irányba a aruthers -módszer Dmtr B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba 1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) ( 2 ) n Me Si Me G 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 enyhe savas detritilezés (3% TA) ( 2 ) n Me Si Me G

35 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba ( 2 ) n Me Si Me G Dmtr foszforamidit B 2 E Me + S (5' S reakciója) tetrazol (gyenge sav)

36 3. Lánczárás (az elreagálatlan 5 --t acetilezzük) 4. xidálás I 2 ( 2 vagy TF) iklus végén 4 -val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás Legvégén: kromatográfiás tisztítás

37 Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr B 3 R B 2 G B 1 DMTr R i r 2 tetrazol B 3 1. lépés Kapcsolás R R B 2 G B 1 B 1,B 2,B 3 : védett bázisok R: 2 2 β-cianoetil egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport DMTr : tetrazol: G: "controlled pore glass" (porózus üveg) dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport

38 DMTr B 3 B 3 R B 2 R B 2 I 2 R B 1 A R B 1 2. lépés xidáció G 3. lépés Védõcsoport eltávolítása G 1., 2. és 3. lépés ismétlése 4 hasítás a szilárd hordozóról, a foszfát-észterek és a bázisok védõcsoportjainak egyidejû eltávolítása szintetikus uligonukleotid olimeráz láncreakció (R) egyszerű és hatékony módszer a DS-molekulák számának növelésére

39 Ízelítő a nukleotidok és nukleozidok laboratóriumi szintéziséből: 1) ilbert-johnson-nukleozid szintézisből -Bz: BSA: Si Si benzoilcsoport,-bisz(trimetilszilil)acetamid nukleofil - ill.-atomok szililezõ reagense

40 2) Ribozilaminhoz kapcsolás A reakció javasolt mechanizmusa: Bz 2 Bz Bz 2,3,5-tri--benzoil- -D-ribofuranózilamin + Michael addíció Et Et Et -etoxi--etoxikarbonil-akrilamid Rib Et gyûrûzáródás -Et Et Rib Et limináció -Et Rib Bz Bz benzoilcsoporttal védett uridin

41 l 3) Szubsztituált purinszármazékok továbbalakítása: 3 2 S 2 / i 2 S R R R adenozin R: β-d-ribofuranozil

42 4) Foszforilezés: dibenzil-foszfokloridáttal rvosi alkalmazások: S 6-merkapto-purin Gyerekeknél akut leukémia kezelésére 80%-os gyógyulás allopurinol köszvény kezelésére 2 l 2 2 dibenzil-foszfokloridát aciklovir erpes virus kezelésére 2 -atom hiányzik a ribózból

43 SZERKEZET A DS, RS építőelemei: bázisok, pentóz, foszfát (nukleozid nukleotid) Kétszálú DS szerkezete: Watson-rick párosítás em-klasszikus DS szerkezetek: triplex, quadruplex DS DS sokszorosítás: ÉLETTAI SZERESZTÁS a sejtben: replikáció A DS mint információhordozó: transzkripció (-> RS) transzláció (-> fehérje) RS fajták és funkciójuk a kémcsőben: szilárdfázisú DS szintézis R = DS másolás DS szekvenálás, leolvasás BIEERGETIKA AT / GT mint a sejt energiahordozója: elem akkumulátor

44 A DS replikációja A genetikai kód megkettőződése: A kettős hélix az egyik vége felől letekeredik, majd a templátok mentén a komplemnter szálak megszintetizálódnak.

45 DS polimeráz: 5 => 3 irányban szintetizálja az új láncot. Leading strand = vezető szál, folyamatos szálszintézis Lagging strand = sántikáló szál, darabonkénti szálszintézis, majd utólagos összekötés (DS ligáz)

46 Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr B 3 R B 2 G B 1 DMTr R i r 2 tetrazol B 3 1. lépés Kapcsolás R R B 2 G B 1 B 1,B 2,B 3 : védett bázisok R: 2 2 β-cianoetil egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport DMTr : tetrazol: G: "controlled pore glass" (porózus üveg) dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport

47 DMTr B 3 B 3 R B 2 R B 2 I 2 R B 1 A R B 1 2. lépés xidáció G 3. lépés Védõcsoport eltávolítása G 1., 2. és 3. lépés ismétlése 4 hasítás a szilárd hordozóról, a foszfát-észterek és a bázisok védõcsoportjainak egyidejû eltávolítása szintetikus uligonukleotid olimeráz láncreakció (R): ha van templát DS egyszerű és hatékony módszer a DS-molekulák számának növelésére

48 R: olymerase hain Reaction = olimeráz láncreakció egyszerű és hatékony módszer a DS-molekulák számának növelésére, (adott láncvégek primerek között) VIDE!

49 SZERKEZET A DS, RS építőelemei: bázisok, pentóz, foszfát (nukleozid nukleotid) Kétszálú DS szerkezete: Watson-rick párosítás em-klasszikus DS szerkezetek: triplex, quadruplex DS DS sokszorosítás: ÉLETTAI SZERESZTÁS a sejtben: replikáció A DS mint információhordozó: transzkripció (-> RS) transzláció (-> fehérje) RS fajták és funkciójuk a kémcsőben: szilárdfázisú DS szintézis R = DS másolás DS szekvenálás, leolvasás BIEERGETIKA AT / GT mint a sejt energiahordozója: elem akkumulátor

50 A DS mint információhordozó: A gének leolvasása: DS (transzlokáció és mrs érés) mrs 1. transzkripció átírás, másolás RS polimeráz (enzim) fehérje 2. transzláció fordítás, dekódolás riboszóma (ribozim)

51 1. Transzkripció: RS polimeráz iniciáció: promoter régió elongáció termináció: terminátor

52 Ribonukleinsav (RS) és fehérjeszintézis A genetikai kód áramlásának irány: transzkripció transzláció DS RS fehérje gén: olyan DS szegmens amely tartalmazza mindazon információk összességét amely az adott polipeptid vagy fehérje szintéziséhez szükséges. (pl egy egyszerű bacilus DS-e is legalább 3000 különböző enzimfehérjét kódol.) 1. lépés: a transzkripció: a hírvivő-rs (messenger-rs, mrs) szintézise A színdarab szereplői : RS- polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DS kettős spirált romoter: a DS-nek az a része ahova az RS-polimeráz kötődik és ahol megkezdi a transzkripciót RS nukleotidok, mint építőelemek Terminátor: prokarióták azon DS része ami jezi a transzkripció végét Transzkripciós egység: Az a DS darab ami RS-é átíródik. Transzkripcós factorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az RS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik. Transzkripciós Iniciációs Komplex: A transzkripciós faktorok és a promoter régióhoz kapcsolódó RS-polimeráz II együttese. TATA Box: A DS promoter része

53 A hírvivő-rs (messenger-rs, mrs) szintézise: etc. DS A G Dezoxiribóz: G U G ribóz: RS polimeráz etc. DS A G U G G etc. láncszétválás komplementer RS etc. DS A G U G G etc. komplementer RS. Transzkripció a sejtmagban történik, a szintetizálódott RS-nek van fehérjét kódoló (exon: expressed sequence ) és nem-kódoló része (intron: intervening sequence.) Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során az kivágódik. A kész m-rs elvándoról a citoplazmába ahol a fehérjeszintézis templátja lesz..

54 protein sequence DS: - nem kódoló részek - kódoló részek (gének) >>>>>> mrs: - nem kódoló részek (intron) - kódoló részek (exon) >>>>>>>>>> fehérje 1. transzkripció - mrs érés - 2. transzláció sejtmag - transzlokáció - citoplazma

55 RS fajták és funkciójuk: kódoló RS: mrs: hírvivő (angol: messenger) RS: DS-ből másolt RS, mely a genetikai információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ alapján a fehérjék szintetizálódnak. árom egymás melletti bázis alkot egy-egy kodon-t, mely egy-egy aminosavat kódol. pre-mrs: éretlen mrs. Az érés során a nem-kódoló részek (intronok) kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mrs-ben. nem-kódoló RS: trs: transzfer RS: segít az mrs-en található kód (kodon) leolvasásában. Minden létező kodonhoz külön trs tartozik, mely a kodonnak megfelelő aminosavak hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a fehérjeszintézisben rrs: riboszomális RS: a riboszóma alkotoeleme, mely a fehérjeszintézis katalitikus centrumát alkotja. léteznek további nem-kódoló RS-ek is, mint például: sirs: (small interfering RA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RS részek (a DS-hez kötődnek, és így meggátolják annak átíródását)

56 Az RS szerkezete: hairpin RS szerkezet Watson-rick párosítás, saját magával (az RS általában egyszálú) trs szerkezete E.coli rrs szerkezete, (kis alegység)

57 Szállító RS (transzfer RS, trs) feladata: hogy a megfelelő helyre eljuttassa az aminosavat aminosav akceptor kar antikodon hurok

58 Szállító RS (transzfer RS, trs) jellemzői: nukleotidból áll, -mindig a A- véghez kapcsolódik észterkötéssel az aminosav (pl. Tyr), -minden aminosavnak saját trs-e van, amelyen az annak az aminosavnak megfelelő antikodon található (egy vagy akár több trs is lehet/aminosav) - például: Met UA.tRS: antikodon (AU) AUG.mRS: kodon

59 A m-rs tripletjei a genetikai kód: egy aminosavhoz egynél több kodon (egynél több antikodonnal ellátott t-rs) tarozik: As. m-rs As. m-rs As. m-rs Ala GA is A Ser AG G AU AGU GG Ile AUA UA GU AU UG Arg AGA AUU U AGG Leu UA UU GA U Thr AA G UG A GG UU AG GU UUA AU Asn AA UUG Trp UGG AAU Lys AAA Tyr UA Asp GA AAG UAU GAU Met AUG Val GUA ys UG he UUU GUG UGU UU GU Gln AA ro A GUU AG Glu GAA G lánckezdő GAG U fmet AUG Gly GGA GG lánczárás UAA GGG UAG GGU UGA antikodon hurok S -formil-metionin (fmet)

60 Transzláció: Lefordítás fehérje nyelvre codon mrs anticodon trs aminosav fehérje

61 codon mrs anticodon trs aminosav fehérje

62 2. lépés: a transzláció a citoszólban a ribószóma által katalizált folyamat, a fehérjeszintézis. a ribószóma egy RS-fehérje komplex: két alegység: 30S és 50S, molekulaméret: MW= 2.6*10 6, funkció: 30S; köti az m-rs-t 50S; katalitikus aktivitás, fehérjét is tartalmaz a komplex. memo: nem a fehérje hanem az RS rész végzi a katalízist. Ezért a riboszóma nem enzim hanem ribozim! 50S

63 Transzláció (1 perc alatt kb.150 peptidkötés formálódik): 1. lépés: (itt kezdődjön a transzláció) mindig az AUG mrs triplet. 2. ide mindig az -For-Met aminosav kerül 3. szintézis irány -term.től a -term. felé 4. Lánczáró kodonok az mrs-en: UAA, UAG és UGA. ( a mondat végi pontot jelölik ) 5. a szintézis legvégén a For-csoportot egy enzim lehidrolizálja. 2 S 2 Lys For-Met trs Lys U U U trs For-Met m-rs U A A U G A A A G U A U U U G G A A G A

64 2 Lys 2 Val For-Met 2 trs Lys trs Val S A U trs For-Met U A U U U A U G A A A G U A U U U G G A A G A

65 Lys 2 Val 2 he For-Met 2 trs he S trs Val trs Lys A A A U U U A U A U G A A A G U A U U U G G A A G A

66 A ribozim katalizálta peptidszintézis elemi kémiai lépései: 2 2 riboszóma + tetraéderes intermedieren keresztül riboszóma trs peptidndbas. peptidndbas. R trs tetraéderes intermedier: A nukleofil addiciót segíti az 50S alegység 2486 adeninje: 1) Az adenin nemkötő elektronpárjának protonvonzása részlegesen deprotonálja az aminocsoportot, ezzel fokozva annak nukleofil jellegét. 2) A tertaéderes köztitermék elbomlását a proton visszaadása iniciálja, kialakítva így a peptidkötést. 2 trs R trs trs R 2 trs (Science 289; , 2000) R peptid

67 Transzláció áttekintése:

68 DS szekvenálás: A DS bázissorrendjének meghatározása első két szekvenálási módszer: Maxam-Gilbert módszer > a lánc (5 ) elejét jelöli ( 32 ) > 4-féle kémiai módszerrel bázisspecifikusan elhasítja a láncot > méret szerint elválaszt Walter Gilbert Frederick Sanger Sanger: didesoxy / láncterminációs módszer óbel díj 1980

69 Maxam Gilbert Method (Maxam, A., Gilbert, W.: AS, 1977, 74, 560.) Walter Gilbert obel-díj, ' 3' alkaline phosphatase polynucleotide kinase AT M e 2 S M l G A/G /T iperidine (leaves after modification site) AGE Autoradiography

70

71

72 DS szekvenálás: A DS bázissorrendjének meghatározása első két szekvenálási módszer: Maxam-Gilbert módszer > a lánc (5 ) elejét jelöli ( 32 ) > 4-féle kémiai módszerrel bázisspecifikusan elhasítja a láncot > méret szerint elválaszt Walter Gilbert Frederick Sanger Sanger: didesoxy / láncterminációs módszer óbel díj 1980 > 3 -véghez párosuló primerel és DS polimerázzal lemásolja a DS-t > az egyik bázisból didesoxynukleotidot is ad hozzá -> korai láncterminációt okoz annál a bázisnál (4x) > méret szerint elválaszt

73 Dideoxy Method hain Termination Method (Sanger, F., et al: AS, 1977, 74, 5463.) 5' 3' rimer DA polymerase I (Klenow fragment) no nuclease activity dat 32 dt dgt dtt ddat dat dt 32 dgt dtt ddt dat dt dgt 32 dtt ddgt dat dt dgt dtt 32 ddtt AGE Autoradiography

74 A DS bázissorrendjének meghatározása: A lánczáró didezoxynukleotid módszer Láncterminációs eljárás: festékkel jelölt didezoxi-nukleotidok 2 linker 2',3'-didezoxicitozin-trifoszfát a 3'-hidroxil hiánya lánctörést okoz

75 linker: nukleotid festék festék: linker + fluoreszcens donorcsoport donor-akceptor fluoreszcens festék fluoreszcens akceptorcsoport

76

77 1996. új módszer: piroszekvenálás egyetlen immobilizált DS szál a templát DS polimeráz + egyenként adagoljuk a dezoxi-nukleotidokat a megfelelő nukleotid adagolásakor fényfelvillanás, aminek intenzitása arányos a beépített bázisok számával al yrén / Mostafa Ronaghi (Stockholm)

78 SZERKEZET A DS, RS építőelemei: bázisok, pentóz, foszfát (nukleozid nukleotid) Kétszálú DS szerkezete: Watson-rick párosítás em-klasszikus DS szerkezetek: triplex, quadruplex DS DS sokszorosítás: ÉLETTAI SZERESZTÁS a sejtben: replikáció A DS mint információhordozó: transzkripció (-> RS) transzláció (-> fehérje) RS fajták és funkciójuk a kémcsőben: szilárdfázisú DS szintézis R = DS másolás DS szekvenálás, leolvasás BIEERGETIKA AT / GT mint a sejt energiahordozója: elem akkumulátor

79 AT: adenozin -5 - trifoszfát foszforanhidrid foszforészter A szervezetben az ELEM AT és GT G~ 30.5 kj G~ mol kj mol -1 AT + 2 AD + i AT + 2 AM + i G = 30.5 kj/mol ( 7.3 kcal/mol) G = 45.6 kj/mol ( 10.9 kcal/mol)

80 AT és GT mint energiahordozók: elem / akkumulátor (újrafeltölthető!) felhasználás: dirkekt módon: kapcsolt reakció A sejtben igényelt anyagok szintézisében az endoterm ill. endergonikus reakciókhoz a kapcsolódó AT/GT hidrolízis adja a megfelelő hajtóerőt a reakció lefutásához. pl. transzláció (fehérjeszintézis) kreatin (energiaraktár az izomban) feltöltés: dirkekt módon: szubsztrát szintű foszforiláció: a metabolizmus (ételek, raktározott zsírsavak, egyéb anyagok lebontása) során az exoterm ill. exergonikus reakciókban történő AD/GD foszforilációja. indirekt módon: oxidatív foszforiláció a metabolizmus során redox-reakciókban redukált koenzimek keletkeznek: AD + és FAD 2 Ezek a redukált koenzimek elektrontranszporttal egybekötött, szabályozott regenerálása (oxidációja) során keletkezik AT.

81 Biomolekulák energetikája: Atkins & de aula 99 kérdés: mennyi glükóz elégetése teszi lehetővé egy 30 g össztömegű madár számára hogy 10 m magasra repüljön? tapasztalat: 1 mol szilárd glükóz 2 gázzá és folyékony vízzé való oxidációja 25 -on ~ 2828 kj szabadentalpia ( G) felszabadulást eredményez. válasz: az elvégezendő munka nagysága mgh= (30*10-3 kg)* (9,81*ms -2 )* (10 m) = 2,943 kg m 2 s -2 = 2,943 J mivel 1 mol glükóz G ~ 2, J munka végzéséhez elegendő, 2,943 J munka elvégzéséhez 2,943 / 2, mol glükózra van szükség, ami 1,04 µmol cukrot jelent. Mivel a glükóz M W -je ~180g mol -1 ezért ez hozzávetőlegesen (180 gmol -1 * 1,04*10-6 mol) = 0,19 mg kérdés: a koncentráló emberi agy ~25 J energiát igényel másodpercenként. Mennyi cukor (glükóz) elégetése szükséges ehhez óránként? tapasztalat: 1 mol glükóz oxidációja 25 -on ~ 2828 kj szabadentalpia ( G) felszabadulását eredményezi. válasz: az elvégezendő munka nagysága óránként = (25 Js -1 )* (3,6*10 3 s) = J = 90 kj mivel 1 mol glükóz G ~ 2, kj munka végzéséhez elegendő, 90 kj munka elvégzéséhez 90 / 2, mol glükózra van szükség, ami 32 mmol glükózt jelent. Mivel a glükóz M W -je ~180g mol -1 ezért ez hozzávetőlegesen (180 * 32*10-3 g ) = 5,7 g/óra Tehát az emberi agy naponta ~ 24 * 5,7g ~140g glükózt igényel.

82 A napi g glükóz többsége AT-vé alakul és így hasznosul a sejtekben. Aerob körülmények között 1mol glükóz mintegy 38 mol AT eredményez. mivel M w (AT)/ M w (glükóz) 507/180 = 2,82 ezért 2,82 * 38 * 160g 17,1 kg AT Ténylegesen egy 70 kg-os ember napi AT fogyasztása ~ 145 kg (mivel nem csak szénhidrátot, de zsírt és fehérjét is fogyasztunk!) Ám a szervezetben egyszerre kb. 51 g össz AT áll rendelkezésre, ami a teljes szükséglet (51 g /1, g) kb. 0,035% -a. Ez az tartalékolt AT mennyiség tehát kb. (24* 3600s) * (3, ) ~ 30 s-ra elegendő mindössze! Tehát az ember AT szükséglete ~ 100g / perc (aktív mozgás esetén 500g /perc) AD/AT ciklus (a foszforiltranszfer) A kémiai reakció: AT 4 (aq) + 2 AD 2 (aq) (aq) G~ 30 kj mol -1 A biokémiai rész ciklus: ½ 2 2 AD AT 4 + G

83 A teljes biokémiai ciklus: 2 G +2 2 AD + + AD + FAD 2 FAD elektronátvitel AD + (ikotinamid-adenin-dinukleotid) ½ 2 2 AD AT 4 foszforilátvitel + G FAD (Flavin-adenin-dinukleotid)

84 éhány fontosabb foszfátvegyület foszfátcsoport(jai) hidrolízisének G- értékei 37 o -on: memo: foszfoenol-piruvát G~ 62 kj mol -1 AT AD G~ 31 kj mol -1 AD AM G~ 28 kj mol -1 AM G~ 14 kj mol -1 -D-(+)-glükopiranóz-1-f oszf át -D-(+)-glükopiranóz-6-foszfát glükóz-1-foszfát G~ 21 kj mol -1 glükóz-6-foszfát G~ 14 kj mol -1 fruktóz-6-foszfát G~ 16 kj mol D-(+)-fruktofuranóz-6-foszfát kérdés: mit takar az AT G~ 31 kj mol -1? A hidrolízis exergonikus G< 0 és éppen 31 kj mol -1 energiát ad más csatolt, esetleg endergonikus reakciók lefolytatásához. Ezért hívjuk a megfelelő savanhidrid kötést nagyenergiájú kötésnek. 2 2 memo: vegyük észre hogy az AT középen helyezkedik el, ezért lehet foszfát donor és akceptor is.

85 AT 4 (aq) + 2 AD 2 (aq) (aq) tény: az AT G~ 31 kj mol -1 valamint a ~ 20 kj mol -1 és S~ +34 JK -1 mol -1 memo: mivel G = T S T S~ 310 K *34 JK -1 mol -1 ~ +11 kj mol -1 ) memo: az 1 mol víz a hidrát burok része mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a formális mólszám növekedés (1-ből 2-ő), emiatt van az entrópia növekedés, avagy a komplexitás csökkenése is. A G értéke ( 31 kj mol -1 ) ezért is ilyen kedvező. Az AT hidrolízise felhasználható olyan csatolt endergonikus reakciókhoz amelyek G nem nagyobb mint +31 kj mol -1. pl. a peptidkötés szintézise erősen endergonikus: G~ +17 kj mol -1 memo: az 1 mol víz a hidrát burok része mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a nagy entrópia csökkenés (2-ből 1), a komplexitás növekedés. G ezért is ilyen kedvezőtlen. memo: nem csak az entalpiaváltozás, de az entrópia csökkenés (komplexitás növekedése) is jelentős! kérdés: hogy mehet végbe a reakció 37 o -on? válasz: AT csatolt a reakció. memo: a csatolt rendszer értelmében a két reakció össze van kapcsolva! (a a két reakció elkülönítve (2 edényben) megy végbe, vagy ha csak úgy összeöntjük a reagenseket akkor a folyamat nem fog végbemenni.)

86 megfigyelés: Itt nem részletezett okok miatt 1 peptidkötés kialakításához 3 AT szükséges. kérdés: hány gramm glükóz kell 1mol mioglobin bioszintéziséhez, ha az 153 aminosabvól épül fel? válasz: 153*3 = 459 AT szükséges. 1 mol glükóz 38 AT eredményez, tehát 459/38~ 12 mol glükóz szükséges. tehát: (12*180g)~ 2,2kg cukor kell 1 mol (16,7 kda) fehérje szintéziséhez (~16,7 kg)

87

88 ow to safely store genetic material: cable reels in the cell nucleus... Legend: The nucleosome ucleosomes are cable reels for genetic material. In the cell s nucleus, the genetic material (DA) is organized in different chromosomes and protectively packaged. In this storage packing, the DA is wound around nucleosomes, just as a cable on a reel. Each nucleosome consists of four pairs of proteins called histones. Apart from their role as cable reels, nucleosomes are also involved in gene regulation as they prevent DA from being read at wrong positions.

89 I am not giving away the original data! A copy is good enough... Legend: RA polymerase RA polymerase is essential for each cell. This protein reads the genetic code from the genetic material in the cell nucleus and copies it onto so-called mra molecules. These copies are then shipped to the ribosomes where they serve as blueprints for proteins. Thus, the precious original always stays in the vault of the nucleus, and only copies are

90 DA is long where does a gene begin and how to find it? Legend: The TATA-box binding protein (TB) in yellow The repetition of the amino acids threonine (T) and alanine (A) T-A-T-A marks the beginning of a TATA-box binding protein (TB) recognizes this specific genetic start sequence and allows correct RA polymerase. Without TB, genes could not be copied to mra and would, hence, not be read of TB is too long, it causes some of the most severe neurodegenerative diseases