A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi Nobel-díjak:

Átírás

1 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi obel-díjak: Francis arry James Dewey ompton rick Watson Maurice ugh Frederick Wilkins 1962 DS molekuláris szerkezetének felismeréséért aul Berg 1980 rekombináns-ds Walter Gilbert Frederick Sanger ukleinsavak szekvenálásáért Kary B Mullis olimeráz láncreakció (R) Michael Smith Irányított mutagenezis Sir James W. Black Gertrude B. Elion George. itchings 1988 urin alapú kemoterápiás gyógyszerek

2 UKLEISAVAK - dezoxiribonukleinsavak (DS) - ribonukleinsavak (RS) memo: nucleus = sejtmag lyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek eredményeként a sejt összes fehérjéje megszintetizálódik. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.) Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok 4' 5' 3' 2' heterociklusos bázis β--glikozidos kötés 1' egy nukleotid hidrolízis heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz foszfátion

3 146 bázispár 8 histon fehérje és ezt is - hidak tartják össze. A nukleoszóma komplexet stab. a 1 linker fehérje A supercoiling 15000* kondenzációt tesz lehetővé mindig jobb menetes, antiparallel, Z-DS az egészet a -hidak tartják egyben Eukarióta sejtek génjében van nemkódoló rész; intronok. (rokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során az kivágódik.

4 Foszforsavészterek hidrolízise: 2 Q Q= adenozin-5'-monof oszf át Q= dezoxiadenozin-5'-monof oszf át 2 ukleinsav (polinukleotid) nukleáz nukleotidáz enyhe degradáció 1 a, 25 ukleotid (monomer) cc. 3, 180 Q= Q= Q A -glikozidkötés hidrolízise: adenozin dezoxiadenozin ukleozid (glikozid) purin nukleozid foszforiláz* + ukleotidbázis + pentóz (nucleobase) * Ez a foszforiláz az valójában egy hidroláz

5 A cukorrész: D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz memo: pirán furán tetrahidro-2 -pirán tetrahidrofurán iklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat: A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi nyílt láncú D-ribóz nyílt láncú D-ribóz 2 1 ukleozidokban mindig 5 tagú (furanóz) gyűrű formájában van a cukor jelen β-d-ribofuranóz α-d-ribof uranóz 2 1

6 A nukleinsavak építőelemei: a heterociklusok irimidinszármazékok: 2 3 barbitursav pirimidin-2,4,6-triol uracil pirimidin-2,4-diol citozin 4-amino-pirimidine-2-ol timin 5-methyl-pyrimidine-2,4-diol Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái: dilaktim f orma laktim-laktám forma dilaktám forma legstabilabb

7 urinszármazékok: amino-purin adenin A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái: 2-amino-6-hidroxi-purin guanin Melyik tautomerforma a stabilabb?

8 em-rs és -DS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: áz:= urin nukleozid foszforiláz AM nukleotidáz GM Adenozin dezamináz áz purinvázas alkaloidok: di- és trimetil származékok

9 2 ukleozidok: A megfelelő purin- és pirimidinbázisok -glikozidjai Q= Q= Q adenozin dezoxiadenozin 2 ukleotidok: A nukleozidok foszforsavészterei Q Q= Q= adenozin-5'-monofoszf át dezoxiadenozin-5'-monofoszf át

10 2 2 adenozin RS építőelem adenozin 9-(β-D-ribofuranozil)-adenin op= 235 o 2 2 adenozid - - adenozin-5'-foszfát 5'-AM - - adenozin-3'-foszfát 3'-AM dezoxiadenozin 2 2 DS építőelem dezoxiadenozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-adenin op= 190 o 2 2 dezoxiadenozid - - dezoxiadenozin-5'-foszfát 5'-dAM - - dezoxiadenozin-3'-foszfát 3'-dAM

11 guanozin 2 2 RS építőelem guanozin 9-(β-D-ribof uranozil)-guanin op= 240 o guanozid guanozin-5'-foszfát 5'-GM - DS építőelem - guanozin-3'-foszfát 3'-GM dezoxiguanozin 2 dezoxiguanozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-guanin 2 dezoxiguanozid dezoxiguanozin-5'-foszfát 5'-dGM - - dezoxiguanozin-3'-foszfát 3'-dGM

12 2 citidin 2 RS építőelem citidin 3-(β-D-ribof uranozil)-citozin op= 230 o citidinf oszfátok citidin-5'-foszfát 5'-M - DS építőelem - citidin-3'-f oszf át 3'-M dozoxicitidin 2 2 dezoxicitidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-citozin dezoxicitidinfoszf átok dezoxicitidin-5'-foszfát 5'-dM - - dezoxicitidin-3'-f oszfát 3'-dM

13 uridinn RS építőelem uridin 3-(β-D-ribofuranozil)-uracil op= 165 o uridinnfoszfátok - - uridin-5'-foszfát 5'-UM - DS építőelem - uridin-3'-foszfát 3'-UM timidin 3 3 timidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-timin op= 183 o timidinf oszfátok timidin-5'-foszfát 5'-TM - - timidin-3'-f oszfát 3'-TM

14 A DS kémiai szerkezete 2 citidin foszforsavdiészter típusú lineáris polimerek Az RS kémiai szerkezete guanozin 3 2 timidin adenozin 2

15 is G is amino-laktám forma T dilaktám, míg az A amino (aromás) forma 3 ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma ribóz ribóz timin oxo-f orma adenin ribóz ukleotidok belső arányai a DS-ben: Σ(pur.)/Σ(pir.) G+A/(+T) 1 és A/T 1 és G/ 1 - A bázispárok miatt a DS két szála komplementer jellegű -Az intermolekuláris -hidak jelentősége -A cukor-foszforsav diészter gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak A heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt Francis arry James Dewey ompton rick Watson

16 A DS térszerkezete: jobbmenetes kettős hélix, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat -hidak tartják össze. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3- híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis rick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban. citozin 2,8 Â guanin timin 2,8 Â adenin 3,0 Â 3,0 Â 3 ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma ribóz ribóz timin oxo-f orma adenin ribóz

17 Mutáció I: ormális és abnormális bázispárok Rib guanin laktám tautomerje STABILABB Rib citozin amino-latkám f orma szülő gyerek -G- -- -G- -- -G- -- unoka -G- -- -G mutáció Rib guanin laktim tautomerje LABILIS Rib timin dilaktámf orma -G*- -T- -G- -- -G- -- -A- -T- -G- --

18 Mutáció II: Kémiai reagensek indukálta mutációk Salétromossav magyarázat: mutáció indukált mutáció: -A- -T- -A- -T- -A- -A- -T- -Tszülő gyerek unoka -*- -- -A- -T- -A- -T- -G- -- -A- -T- -A- -T-

19 A DS térszerkezete: A leggyakoribb forma a B-DS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű nagyárok kisárok memo: Az A olyan mint a B-forma, csak tömörebb.

20 jobbmenetes α-hélix jobbmenetes α-hélix Az A-DS hélix tömzsibb és rövidebb, mint a B-DS, a főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 19 o ). R -3' a sík felett -3' endo balmenetes α-hélix Az Z-DS hélix karcsúbb, főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 9 o ). Az B-DS hélixben a főtengelyhez képest a bázispárok síkja merőleges ( képest 1 o ). R -2' a sík felett -2' endo

21 DS és RS hidrolízisének részletei: 1) Savas hidrolízis l. depurinálás (A v. G) memo: az RS és a DS kb. egyformán hidrolízál savban kérdés: a ribóz félacetálja savban felnyílik-e?

22 B R (RS) B B 3 R- R- memo: ezért az RS kevésbé, míg a DS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek eredmény: lánchasadás 2) Lúgos hidrolízis (az RS lúgos hidrolízise):

23 DS szilárdfázisú szintézise: észter kötés kialakítása (egy S reakció foszfor centrumon) Védőcsoportok I: a bázisok védelme permanens csoportokkal él a primer aminok védelme, avagy a nukleofil csoportok álcázása, hogy a kapcsolásnál az 5 legyen már csak az egyetlen u. A G Rib Rib 4 -benzoilezés Rib 6 -benzoilezés vagy 2 -izobutiril 3 4 -acetilezés Rib T 3 nem kell védeni Rib

24 Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme permanens csoporttal B cianoetilészter formában E B Mindkét típusú permanens védőcsoport eltávolítható: memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoportot vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható vizes 3 -val

25 Védőcsoport: az 5 - csoport ideiglenes védelme Dmtr Me Me (enyhén savas rendszer) B 2 l 2 + 3% l 3 - Me B narancs szín Me

26 Szilárd hordozó: G (controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg -kémiailag inert -nem duzzad -amino funkcionalizált G Me Si ( 2 ) n 2 Me Linker : l. borostyánkősav 2 ( 2 ) n Me Si 3 / 2 hasító hely Me G 2

27 DS szintézis: -szilárdfázisú szintézis 3 -től 5 irányba a aruthers -módszer Dmtr B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba 1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) ( 2 ) n Me Si Me G 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 enyhe savas detritilezés (3% TA) ( 2 ) n Me Si Me G

28 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba ( 2 ) n Me Si Me G Dmtr foszforamidit B 2 E Me + S (5' S reakciója) tetrazol (gyenge sav)

29 3. Lánczárás (az elreagálatlan 5 --t acetilezzük) 4. xidálás I 2 ( 2 vagy TF) Dmtr iklus végén 4 -val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás Legvégén: kromatográfiás tisztítás E B 2 B 1 ( 2 ) n Me Si G Me

30 Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr B 3 R B 2 G B 1 DMTr R i r 2 tetrazol B 3 1. lépés Kapcsolás R R B 2 G B 1 B 1,B 2,B 3 : védett bázisok R: 2 2 β-cianoetil egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport DMTr : tetrazol: G: "controlled pore glass" (porózus üveg) dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport

31 DMTr B 3 B 3 R B 2 R B 2 I 2 R B 1 A R B 1 2. lépés xidáció G 3. lépés Védõcsoport eltávolítása G 1., 2. és 3. lépés ismétlése 4 hasítás a szilárd hordozóról, a foszfát-észterek és a bázisok védõcsoportjainak egyidejû eltávolítása szintetikus uligonukleotid olimeráz láncreakció (R) egyszerű és hatékony módszer a DS-molekulák számának növelésére

32 Ízelítő a nukleotidok és nukleozidok laboratóriumi szintéziséből: 1) ilbert-johnson-nukleozid szintézisből -Bz: BSA: Si Si benzoilcsoport,-bisz(trimetilszilil)acetamid nukleofil - ill.-atomok szililezõ reagense

33 2) Ribozilaminhoz kapcsolás A reakció javasolt mechanizmusa: Bz 2 Bz Bz 2,3,5-tri--benzoil- -D-ribofuranózilamin + Michael addíció Et Et Et -etoxi--etoxikarbonil-akrilamid Rib Et gyûrûzáródás -Et Et Rib Et limináció -Et Rib Bz Bz benzoilcsoporttal védett uridin

34 l 3) Szubsztituált purinszármazékok továbbalakítása: 3 2 S 2 / i 2 S R R R adenozin R: β-d-ribofuranozil

35 4) Foszforilezés: dibenzil-foszfokloridáttal l 2 2 rvosi alkalmazások S 6-merkapto-purin Gyerekeknél akut leukémia kezelésére 80%-os gyógyulás allopurinol köszvény kezelésére 2 dibenzil-foszfokloridát aciklovir erpes virus kezelésére 2 -atom hiányzik a ribózból

36 A DS replikációja A genetikai kód megkettőződése: A kettőshélix az egyik vége felől letekeredik, majd a templátok mentén kialakulnak a komplemnter szálak.