Genetikai térképezés, gén azonosítás Mészáros Klára, Karsai Ildikó

Átírás

1 Genetikai térképezés, gén azonosítás, Karsai Ildikó

2 Növénynemesítés feladatai Termésbiztonság növelése, nagy szezonális szélsőségek csökkentése Biotikus és abiotikus stresszrezisztencia növelése Funkcionális élelmiszer alapanyag előállítására alkalmas növényfajta Bioenergetikai célra alkalmas növények nemesítése Vízhasznosítás (WUE) és nitrogén hasznosítás (NUE) javítása Technológiai rendszerekre adaptált és/vagy nemesített fajták

3 Hasznos gének növénytermesztés hatékonyságának növelése speciális termesztési rendszerek biztosítása (herbicid tolerancia) abiotikus, biotikus stressz tolerancia fokozása környezeti adaptáció módosítása végtermék, mint élelmiszer alapanyag minőségi paramétereinek módosítása szerves vegyületek termeltetése (gyógyszer alapanyag, oltóanyag) sejt fermentorokban szántóföldi növénytermesztésben

4 Gén azonosítás tulajdonságok fenotípusos megnyilvánulásában meghatározó szerepet játszó genetikai komponensek, szabályozó mechanizmusok, biokémiai folyamatok megértése diagnosztikai markerek, módszerek kidolgozása természetes variabilitás tesztelése vad és termesztett fajtákon belül, valamint a rokon fajok csoportjában hasznos gének, gén allélek beépítése a nemesítési alapanyagokba marker szelekcióval egybekötött hagyományos keresztezések során gén transzformációs technikák alkalmazásával

5 Minőségi és mennyiségi tulajdonságok Azok a tulajdonságokat amelyek mértékegységgel nem, vagy csak nehezen mérhetők, kialakulásuk kevéssé függ a környezet hatásától, minőségi tulajdonságoknak nevezzük. Kialakulásukat egy vagy néhány gén határozza meg. A mértékegységgel mérhető tulajdonságok, amelyek kialakulásában a környezet hatása szerepet játszik: mennyiségi tulajdonságok. (kialakulásuk általában sok gén kölcsönhatásának eredménye)

6 Gén azonosítás tulajdonságok fenotípusos megnyilvánulásában meghatározó szerepet játszó genetikai komponensek, szabályozó mechanizmusok, biokémiai folyamatok megértése diagnosztikai markerek, módszerek kidolgozása természetes variabilitás tesztelése vad és termesztett fajtákon belül, valamint a rokon fajok csoportjában hasznos gének, gén allélek beépítése a nemesítési alapanyagokba marker szelekcióval egybekötött hagyományos keresztezések során gén transzformációs technikák alkalmazásával

7 Gén azonosítás főbb módszerei marker kapcsoltsági térképek és pozicionális klónozás Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör jelölt gén megközelítés Genom pozíció függő stratégiák Összehasonlító genomikai stratégiák mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) génfunkció és fenotípus közti kapcsolat Gén expressziós mintázatok elemzése

8 Gén azonosítás főbb módszerei marker kapcsoltsági térképek és pozicionális klónozás Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör jelölt gén megközelítés Genom pozíció függő stratégiák Összehasonlító genomikai stratégiák mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) génfunkció és fenotípus közti kapcsolat Gén expressziós mintázatok elemzése

9 Marker kapcsoltsági térképek Térképező populáció Molekuláris marker technikák Számítógépes térképező programok

10 Térképező populáció Két homozigóta szülő keresztezéséből származó utódok a térképező populáció, amelynek minden egyedéről meghatározható, hogy a szülőktől milyen kombinációt örökölt két vizsgált allélpárra, P vagy R típust. Ennek ismeretében a rekombináció gyakorisága meghatározható akár közvetlenül (r=r/p+r), akár LOD számítással. Ezt az r (rekombinaciós gyakoriság) értéket genetikai térképezésre használhatjuk.

11 Térképező populáció Keresztezési partnerek kiválasztása: távoli vagy speciális Populáció típusa: hasadó F2 populáció homozigóta populációk (DH, RIL, SSD) egyéb speciális populációk (NIL, egy kromoszómára rekombináns stb.) Populáció mérete Marker kapcsoltsági térképek DNS izolálás markeres vizsgálatok Genom szintű különbségek

12 Öntermékenyülő növények térképezési populációinak főbb típusai

13 Marker kapcsoltsági térképek Genetikai markerek A genetikai markerek az vizsgált szervezetek közötti genetikai különbségeket teszik láthatóvá. Morfológiai marker Biokémiai markerek Molekuláris markerek Számuk korlátozott megnyilvánulásuk környezeti hatástól és fejlődési állapottól függő Nukleotid azaz DNS szintű variabilitás vizsgálatára alkalmasak. Számuk korlátlan, megnyilvánulásuk nem függ a környezeti hatásoktól. Az ideális DNS markerre jellemző a nagyfokú polimorfizmus koddomináns öröklődés Gyakori előfordulás Könnyű hozzáférhetőség Reprodukálhatóság Kódoló Genom Nem kódoló Morfológiai marker Biokémiai marker Molekuláris marker

14 Oregon Wolf Barley Morfológiai markerek

15

16

17 Marker kapcsoltsági térképek Genetikai markerek A genetikai markerek az vizsgált szervezetek közötti genetikai különbségeket teszik láthatóvá. Morfológiai marker Biokémiai markerek Molekuláris markerek Számuk korlátozott megnyilvánulásuk környezeti hatástól és fejlődési állapottól függő Nukleotid azaz DNS szintű variabilitás vizsgálatára alkalmasak. Számuk korlátlan, megnyilvánulásuk nem függ a környezeti hatásoktól. Az ideális DNS markerre jellemző a nagyfokú polimorfizmus koddomináns öröklődés Gyakori előfordulás Könnyű hozzáférhetőség Reprodukálhatóság Kódoló Genom Nem kódoló Morfológiai marker Biokémiai marker Molekuláris marker

18 Biokémiai markerek Izoenzimek: Az emzimek allél tíusait különbözteti meg Elektroforézis vagy speciális festés segítségével tehetők láthatóvá

19 Marker kapcsoltsági térképek Genetikai markerek A genetikai markerek az vizsgált szervezetek közötti genetikai különbségeket teszik láthatóvá. Morfológiai marker Biokémiai markerek Molekuláris markerek Számuk korlátozott megnyilvánulásuk környezeti hatástól és fejlődési állapottól függő Nukleotid azaz DNS szintű variabilitás vizsgálatára alkalmasak. Számuk korlátlan, megnyilvánulásuk nem függ a környezeti hatásoktól. Az ideális DNS markerre jellemző a nagyfokú polimorfizmus koddomináns öröklődés Gyakori előfordulás Könnyű hozzáférhetőség Reprodukálhatóság Kódoló Genom Nem kódoló Morfológiai marker Biokémiai marker Molekuláris marker

20 Monomorf és polimorf markerek

21 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák Hibridizáción alapuló RFLP PCR alapú markerek ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű: RAPD, AFLP ismert kromoszómális elhelyezkedésű: SSR, STS funkcionális markerek: EST, SNP, Tillling HTP marker technikák (DArT) Szekvencia alapú Új generációs szekvenálás (Illumina platform)

22 Marker kapcsoltsági térképek RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) A DNS molekula restrikciós endonukleázzal történő emésztésén és Southern-hibridizáción alapuló módszer. A hasító helyeken történt pont mutáció (SNP) vagy inszerció és deléció (INDEL) okozta különbségek mutathatók ki. Restrikciós endonukleázok: bakteriális eredetű enzimek 4-10 nukleotid hosszúságú palindróma szekcvenciát ismernek fel nagyon specifikusak az adott DNS-szekvenciára; (ha akár csak egy bázisnyi különbség van a hasítási helyen, már nem történik meg a hasítás) a hasítással ragadós (EcoRI) vagy tompa (SmaI; HaeIII) vég jön létre

23 RFLP Lépések: a vad típusú és az ismeretlen DNS hasítása restrikciós endonukleázokkal (ha a mutáció a restrikciós hasítóhelyen volt, akkor ott az enzim nem képes hasítani) a mintát gélre vinni, elektromos erőtérben megfuttatni denaturálás lúggal blottolás membránra hibridizáció általában radioaktív próbával Autoradiográfia Előnye: Nem szükséges a templát DNS szekvenciájának ismerete A heterozigóták megkülönböztetését biztosító kodomináns módszer Megbízható, jól ismételhető Hátránya: Egyes fajokban a restrikciós hasítóhelyek megfelelő szintű polimorfizmusának hiánya Nagy mennyiségű DNS-t igényel Southern hibridizációhoz jelölt próba szükséges Hosszadalmas és költséges

24 RFLP Lépések: a vad típusú és az ismeretlen DNS hasítása restrikciós endonukleázokkal (ha a mutáció a restrikciós hasítóhelyen volt, akkor ott az enzim nem képes hasítani) a mintát gélre vinni, elektromos erőtérben megfuttatni denaturálás lúggal blottolás membránra hibridizáció általában radioaktív próbával Autoradiográfia Előnye: Nem szükséges a templát DNS szekvenciájának ismerete A heterozigóták megkülönböztetését biztosító kodomináns módszer Megbízható, jól ismételhető Hátránya: Egyes fajokban a restrikciós hasítóhelyek megfelelő szintű polimorfizmusának hiánya Nagy mennyiségű DNS-t igényel Southern hibridizációhoz jelölt próba szükséges Hosszadalmas és költséges

25 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák RFLP PCR alapú markerek ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű: RAPD, AFLP ismert kromoszómális elhelyezkedésű: SSR, STS funkcionális markerek: EST, SNP, Tillling HTP marker technikák (DArT) Új generációs szekvenálás (Illumina platform)

26 PCR (polymerase chain reaction) Akár 1 sejtből származó, egyetlen nukleinsav molekula megsokszorozására enzimatikus úton, élő szervezet (baktérium, élesztő) igénybevétele nélkül..95c. DNS szálak kitekerednek..denaturáció.. Hűtés primerek olvadáspontja alá 1-2 fokkal Primerek bekötődése hibridizáció 72 C DNS polimeráz a primerektől építi a DNS láncot polimerizáció DNS Nukleotidok Primerek DNS polimeráz puffer

27 PCR (polymerase chain reaction) PCR készülék Horizontális gél elektroforézis Agaróz gélelektroforézis EtBr festés

28 Molekuláris marker technikák PCR alapú markerek Marker kapcsoltsági térképek Előnye: Gyors, kis mennyiségú DNS-t igényel, nem kell jelölt próbát alkalmazni Hátránya: Megbizhatósága függ az alkalmazott markertípustól ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű: RAPD (Randomly Amplyfied Polymorphic DNA), Nagyfokú polimorfizmus Reprodukálhatósága függ a kisérleti körülményektől A termék szekvenálása után specifikus primer tervezhető (SCAR) Kodominánsá tehető CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Secuence) A random amplifikáció során kapott monomorf mintázat (azonos méret, de különböző szekvencia) restrikciós hasitással polimorffá tehető. Kodomináns AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorphism) A genomi DNS restrikciós emésztésén és a fragmantumok szelektív PCR amplifikációján alapul. Sok fragmentumot eredményez, domináns markereket eredményez, lokusz-specifikus markerek fejlesztése nemhéz.

29 Molekuláris marker technikák PCR alapú markerek Marker kapcsoltsági térképek Előnye: Gyors, kis mennyiségú DNS-t igényel, nem kell jelölt próbát alkalmazni Hátránya: Megbizhatósága függ az alkalmazott markertípustól ismeretlen kromoszómális elhelyezkedésű: RAPD (Randomly Amplyfied Polymorphic DNA), Nagyfokú polimorfizmus Reprodukálhatósága függ a kisérleti körülményektől A termék szekvenálása után specifikus primer tervezhető (SCAR) Kodominánsá tehető CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Secuence) A random amplifikáció során kapott monomorf mintázat (azonos méret, de különböző szekvencia) restrikciós hasitással polimorffá tehető. Kodomináns AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorphism) A genomi DNS restrikciós emésztésén és a fragmantumok szelektív PCR amplifikációján alapul. Sok fragmentumot eredményez, domináns markereket eredményez, lokusz-specifikus markerek fejlesztése nemhéz.

30 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák ismert kromoszómális elhelyezkedésű: SSR (Simple Sequence Repeat) Fajtól függően a genom 10-90% monoton ismétlődő nukleotid motívumokat tartalmaz (AC, AG, CG, TA, AG/TC, AC/TG) A határszekvenciákra tervezett primerekkel hossz polimorfizmus mutatható ki. Jól használható genotipizálásra, ujjlenyomat meghatározásra. STS (Sequence-Tagged-Site) Egyedi szekvenciájú rövid DNS szakasz Kromoszómális elhelyezkedése ismert Igen gyors és megbízható eszközzé vált a genetikai vizsgálatokban, mely térképezésre és markerszerlekcióra egyaránt használható

31 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák ismert kromoszómális elhelyezkedésű: SSR (Simple Sequence Repeat) Fajtól függően a genom 10-90% monoton ismétlődő nukleotid motívumokat tartalmaz (AC, AG, CG, TA, AG/TC, AC/TG) A határszekvenciákra tervezett primerekkel hossz polimorfizmus mutatható ki. Jól használható genotipizálásra, ujjlenyomat meghatározásra. STS (Sequence-Tagged-Site) Egyedi szekvenciájú rövid DNS szakasz Kromoszómális elhelyezkedése ismert Igen gyors és megbízható eszközzé vált a genetikai vizsgálatokban, mely térképezésre és markerszerlekcióra egyaránt használható

32 Markerek (M1 ) DNS markerek, mint ujjlenyomatok M1 N1 N2 N5 N10 N15 M2 M3 A szülő B szülő A x B keresztezés utódpopulációjának növényegyedei (N1 )

33 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák funkcionális markerek: EST (Expressed sequence Tagg) cdns-ek részei RNS izolálás > cdns klónozás > szekvenálás > EST adatbázis > primer tervezés Összehasonlító térképezés SNP (Single nucleotide polymorphysms) DNS szekvencia variáció, mely akkor jön létre, ha egy nukleotid a genomban megváltozik (pl.: AAGCCTA AAGCTTA ) tulajdonképpen pontmutáció csak akkor tekinthetjük a variációt SNP-nek, ha a populáció legalább 1%-ában megjelenik Allélvariációk kimutatása Szekvencia ismeret szükséges Tillling (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) Mutáns populáció előállítás HTTP mutáns azonosítás

34 esnp detektálás Árpában több, mint 420,000 EST áll rendelkezésre 8 különböző genotípusból EST jelentős többségében kimutatható SNP a fajták között 10,985 esnp azonosítottak 3,334 génben Elsődleges szempont, az eredmények egységesíthetősége az ÁRPA1 Gén-Chip (kapcsolat a gén expressziós mintázatokkal), valamint a BACkönyvtár alapú fizikai térkép információkkal

35 Marker kapcsoltsági térképek Molekuláris marker technikák HTP marker technikák Speciális műszerezettséget igényel Multiplex modszerek Rövid idő alatt több száz vagy ezer marker Szolgáltatás jellegűek DArT (Diversity Arrays Technology) hybridizáción alapuló marker technológia Nem igényel szekvencia információkat Nagy mennyiségű adat létrehozása Új generációs szekvenálás Illumina platform,

36 Az Illumina Bead Array az SNP genotipizálás nagyhatékonyságú rendszere Bead Array leolvasó (SNP-re) Oligo pool assays (OPA) 1,536 SNP tesztelhető párhuzamosan Typical Data in GenCall Display

37 Marker kapcsoltsági térképek A növénynemesítésben és a genetikában az egyik alapvető cél, hogy a tulajdonságokat meghatározó gének kromoszómális lokalizációját, és egymáshoz viszonyított sorrendjüket meg tudjuk határozni. A géntérképezés során a gének egymástól való távolságát, a genomban való viszonylagos elhelyezkedésüket határozzuk meg anélkül, hogy valóban megszekvenálnánk a DNS-t. Amint készen áll a térkép, képesek vagyunk egy ismert gén vagy marker (ismert DNS szekvencia) alapján megmondani egy másik gén helyét a genomban. Ezt oly módon érik el, hogy az együtt öröklődő tulajdonságok (koszegregáció) gyakoriságát figyelik, tehát a Mendeli független öröklődéstől való eltérést, és ebből következtetnek a megfelelő gének egymástól való távolságára a kromoszómán.

38 Rekombináció molekuláris rekombináció: DNS törése és újraegyesülése (nem feltétlenül homológ szakaszoké) genetikai rekombináció: új (nem-szülői) allélkombinációk létrejötte, mely a meiózis profázisában történő nem testvér kromatidák közötti molekuláris rekombináció eredménye (crossing over)

39 Két tulajdonság együttes öröklődésmenete P1 AABB x aabb F1 AaBb (AB ab haplotípus: kapcsolt allélek sora) nem rekombináns nem rekombináns rekombináns F1 gamétái: AB Ab ab ab ha A és B független ha A és B kapcsolt ha szorosan kapcsoltak ha teljesen kapcsoltak

40 Testcross rekombináció gyakorisága A testcross megmutatja az F1 szülőben keletkező 4- féle gaméta arányait, mert a tester szülő mindig ab-t ad. F1 x tester:aabbx aabb utódok:aabb Aabb aabb aabb(4 kül fenotípus)

41 Rekombináció gyakorisága közeli és távoli gének esetén

42 Rekombináció gyakorisága r: recombination fraction, = rekombináns gaméták száma/ összes gaméta Morgan és Sturtevant definíciójában a rekombináns utódok gyakorisága egyszerűen megadja a távolságot. d: genetikai távolság M-ben (Morgan, használatosabb a cm egység rek. gyak. x 100 = távolság cm-ben)

43 Rövid távolságokra d = r r = rekombináns utódok gyakorisága d = távolság A gének közötti, rekombinációs gyakoriság felhasználásával számolt, távolságot térképtávolságnak hívjuk, és centimorganban (cm) fejezzük ki. Egy cm az a távolság, ahol a gaméták 1%-a rekombináns.

44

45 Morgan d = r (r 0,5) Használatos függvények Haldane-függvény C=1 (tfh. nincs interferencia) d = -½ ln(1-2r) r = ½ (1-e-2d) Kosambi-függvény C=2r (ha r=0,5 => nincs interferencia, ha r=0 => teljes interferencia) d = ¼ ln[(1+2r)/(1-2r)] r= ½ e4d-1/e4d+1

46 Marker kapcsoltsági térképek Számítógépes térképező programok marker térkép készítés (MAPMAKER, GMENDEL, JOINMAP) A LOD - dal kapott r (rekombinációs) gyakoriságokat (megfelelő lötyögéssel) a térképező programok a legvalószínűbb géntérképekké rakják össze. ( Azaz az r értékekből levezetett d értékeket (Haldane függvény) a kétfaktoros térképezési logika (additivitások) alapján rendezik. QTL elemző programok (MAPMAKER, WINQTL, JOINMAP) Egyszerű intervallum térképezés (SIM) Összetett intervallum térképezés (CIM) QTL x környezet kölcsönhatás elemzés Fenotípusos vizsgálatok ismételhetőség, pontosság Fenomika

47 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Marker kapcsoltsági térkép elkészítése 8> make chromosome chrom2h chrom4h chrom5h chromosomes defined: chrom2h chrom4h chrom5h 9> seq hvm36 bmag125 sequence #1= hvm36 bmag125 10> anchor chrom2h HvM36 - anchor locus on chrom2h Bmag125 - anchor locus on chrom2h chromosome chrom2h anchor(s): HvM36 Bmag125

48 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Marker kapcsoltsági térkép elkészítése 8> make chromosome chrom2h chrom4h chrom5h chromosomes 16> assign defined: chrom2h chrom4h chrom5h HvM36 - anchor locus on chrom2h...cannot re-assign Bmag125 - anchor locus on chrom2h...cannot re-assign 9> seq hvm36 bmag125 Bmac30 - anchor locus on chrom4h...cannot re-assign sequence HvM67 #1= hvm36 - bmag125 anchor locus on chrom4h...cannot re-assign Bmag337 - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign 10> anchor ABG702 chrom2h - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign HvM36 ABG8 - anchor locus - assigned on chrom2h to chrom2h at LOD 20.1 Bmag125 ABC311 - anchor locus - assigned on chrom2h to chrom2h at LOD 24.4 chromosome OPH121 chrom2h - assigned anchor(s): to HvM36 chrom2h Bmag125 at LOD 28.6 OPB162 - assigned to chrom2h at LOD 23.8 ABG318 - assigned to chrom2h at LOD 22.9 ABG358 - assigned to chrom2h at LOD 13.8 ABG459 - assigned to chrom2h at LOD 24.4

49 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Marker kapcsoltsági térkép elkészítése 8> make chromosome chrom2h chrom4h chrom5h chromosomes 16> assign defined: chrom2h chrom4h chrom5h HvM36 18> - three anchor point locus on chrom2h...cannot re-assign Bmag125 - anchor locus on chrom2h...cannot re-assign 9> seq hvm36 bmag125 Bmac30 - anchor locus on chrom4h...cannot re-assign sequence HvM67 #1= hvm36 bmag125 'triple - anchor error locus detection' chrom4h...cannot is on. re-assign Bmag337 - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign 10> anchor ABG702 chrom2h - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign HvM36 ABG8 - anchor count locus - assigned on markers chrom2h to chrom2h at LOD 20.1 Bmag125 ABC311 - anchor locus - assigned on chrom2h to chrom2h at LOD 24.4 chromosome OPH121 chrom2h - assigned anchor(s): to HvM36 chrom2h Bmag125 at LOD 28.6 OPB162 - assigned to chrom2h at LOD 23.8 ABG318 - assigned to chrom2h at LOD 22.9 ABG358 - assigned to chrom2h at LOD 13.8 ABG459 - assigned to chrom2h at LOD 24.4 Linkage Groups at min LOD 3.00, max Distance 37.2 Triplet criteria: LOD 3.00, Max-Dist 37.2, #Linkages 2 counting linked triplets in 2 linkage groups log-likelihood differences a-b-c b-a-c a-c-b 1: ABG8 ABC311 OPH : ABG8 ABC311 HvM : ABG8 ABC311 OPB : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 Bmc222a : ABG8 ABC311 OPP102b : ABG8 ABC311 OPA : ABG8 ABC311 OPQ

50 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Marker kapcsoltsági térkép elkészítése 8> make chromosome chrom2h chrom4h chrom5h chromosomes 16> assign defined: chrom2h chrom4h chrom5h HvM36 18> - three anchor point locus on chrom2h...cannot re-assign Bmag125 - anchor locus on chrom2h...cannot re-assign 9> seq hvm36 bmag125 Bmac30 - Placing anchor at locus log-likelihood on chrom4h...cannot threshold re-assign sequence HvM67 #1= hvm36 bmag125 'triple - Start: anchor error 9 locus detection' chrom4h...cannot is on. re-assign Npt-2: (10) Bmag337 - No anchor unique placements locus on chrom5h...cannot for 6 remaining markers re-assign 10> anchor ABG702 chrom2h - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign HvM36 ABG8 - anchor count locus Map: - assigned on markers chrom2h to chrom2h at LOD 20.1 Markers Distance Bmag125 ABC311 - anchor locus - assigned 9 on Bmc222a chrom2h to chrom2h 21.5 cm at LOD 24.4 chromosome OPH121 chrom2h - assigned 5 OPB162 anchor(s): to HvM36 chrom2h 8.2 cm Bmag125 at LOD ABG cm OPB162 - assigned to chrom2h at LOD OPP102b 6.3 cm ABG318 - assigned 11 OPA192 to chrom2h 10.6 cm at LOD 22.9 ABG358 - assigned 12 OPQ10 to chrom2h at LOD 13.8 ABG459 - assigned to chrom2h at LOD 24.4 Linkage Groups at min LOD 3.00, max Distance 37.2 Triplet criteria: LOD 3.00, Max-Dist 37.2, #Linkages 2 counting linked triplets in 2 linkage groups log-likelihood differences a-b-c b-a-c a-c-b 1: ABG8 ABC311 OPH : ABG8 ABC311 HvM : ABG8 ABC311 OPB : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC Bmc222a cm 6 markers 0.00 log-likelihood= : ABG8 ABC311 OPP102b Markers placed relative to above map: 9: ABG8 ABC OPA : ABG8 :-21-:--8-:-11-:--6-:-11-: ABC311 OPQ *.:.**.:...:...:...:...: *.:.**.:...:...:...:...: :.**.:..*.:...:...:...: :..*.:.**.:...:...:...: :...:.**.:..*.:...:...: :...:.**.:..*.:...:...: Placing at log-likelihood threshold Start: Npt-4: 9 5 (2) Npt-4: 9 5 (4)

51 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Marker kapcsoltsági térkép elkészítése 8> make chromosome chrom2h chrom4h chrom5h chromosomes 16> assign defined: chrom2h chrom2h framework: chrom4h chrom5h HvM36 18> - three anchor point locus on chrom2h...cannot re-assign Bmag125 - anchor locus on chrom2h...cannot re-assign 9> seq hvm36 bmag125 Bmac30 - Placing anchor at locus log-likelihood on chrom4h...cannot threshold re-assign sequence #1= hvm36 Markers HvM67 bmag125 'triple - Start: anchor error 9 locus detection' Distance 12 chrom4h...cannot is on. re-assign Npt-2: (10) Bmag No anchor ABG358 unique placements locus on 20.6 chrom5h...cannot for cm 6 remaining markers re-assign 10> anchor ABG702 chrom2h - anchor locus on chrom5h...cannot re-assign HvM36 ABG8 - anchor count locus - 5 Map: assigned OPB162 on markers chrom2h to chrom2h 2.4 cm at LOD 20.1 Markers Distance Bmag125 ABC311 - anchor locus 4 - assigned HvM36 9 on Bmc222a chrom2h to chrom2h cm cm at LOD 24.4 chromosome OPH121 chrom2h - assigned 5 OPB162 anchor(s): to HvM36 chrom2h 8.2 cm Bmag125 at LOD 28.6 OPB162-3 assigned OPH121 1 ABG8 to chrom2h cm cm at LOD OPP102b 6.3 cm ABG assigned ABC311 OPA192 to chrom2h cm cm at LOD 22.9 ABG358 - assigned 12 OPQ10 to chrom2h at LOD 13.8 ABG459 - assigned to chrom2h at LOD 24.4 Linkage Groups at min LOD 3.00, max Distance 37.2 Triplet criteria: LOD 3.00, Max-Dist 37.2, #Linkages 2 counting linked triplets in 2 linkage groups log-likelihood differences a-b-c b-a-c a-c-b 1: ABG8 ABC311 OPH : ABG8 ABC311 HvM : ABG8 ABC311 OPB : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABG8 ABC311 ABG : ABC Bmc222a cm 6 markers 0.00 log-likelihood= ABG cm 8: ABG8 ABC311 OPP102b Markers placed relative to above map: 9: 10 ABG8 OPP102b ABC OPA192 cm : ABG8 :-21-:--8-:-11-:--6-:-11-: ABC311 OPQ OPA *.:.**.:...:...:...:...: cm 7 2.*.:.**.:...:...:...:...: OPQ :.**.:..*.:...:...:...: :..*.:.**.:...:...:...: :...:.**.:..*.:...:...: cm 9 markers :...:.**.:..*.:...:...: Placing at log-likelihood threshold Start: log-likelihood= Npt-4: 9 5 (2) Npt-4: 9 5 (4)

52 DK1DK2DK3DK4DK7DK8DK9 DK10 DK11 DK12 DK13 DK14 DK15 DK16 DK17 DK18 DK19 DK20 DK21 DK22 DK24 DK25 DK26 DK27 DK28 DK29 DK30 DK31 DK32 DK35 DK36 DK37 DK38 DK39 *mst102 A B A A A B B B A A B B A B B B A B B B A B B A B B A A B A A B A B *Bmac144d A B A A A B B B A B B A B B B B B B B B A B B A B B A A B A A B A B TCGA96 A B A A A B B B A B B A B B B A B B B B A B B A B B A A B A A B A B *MWG938 A B A A B B B B A B B A B B B A B B B B A B B A B B A A B A A B A B AGAT166/162 A B A A B B B B A B B A B B B A B B B B A B B A B B A A B A A B A B GCTC58 A B A A B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B A A B A B B B B OPK16 A B A A B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B A A B A B B B B *abc156.1 A B A A B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B A A B A B B B B *BMAC213 A B A A B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B A A B A B B B B GAAT76 A B A A B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B A A B A B A B B *OPE171 A B A A B B B B A B B - B B B A B A B B A B B A B B B A B A B A B B GAAT414 A B A B B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B B A B A B A B A *OPO18 A B A B B B B B A B B A B B B A B A B B A B B A B B B A B A B A B A *OPB16-1 A B A B B B B B A A B A B B B A B A A A A B B A B B B A B A B A B A *Bmag211 A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B B A B A B A B A *OPS16 A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B A A B A B A B A GCGA428 A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B A A B A B A B A *Ebmac560a A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B A A B A B A B A *OPB41 A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B A A B A B A B A GAAT550 A B A B B B B B B A B A B B B A B A A A A B B A B B A A B A B A B A AGGT290 A B A B B B B B B A B A B B B B B A A A A B B A B B A A B A B A B A TCGA119 A B A B B B B B B A B A B B B B B A A A A B B A B B A A B A B A B A *OPT152 A B A B B B B B B A B A B B B B B A A A A B B A B B A A B A B A B A GAAT510 A B A B B B B B B A B A B B B B B A A B A B A A A A A B A A B B A A AGAT51 A B A B A A A B B A B A B B B B B B A B B B A A A A A B A A A B A B *Bmac144a A B A B A A A A B A B A B B B B B B A B B B A A A A A B A A A B A B GCGA269/270 A B A B A A A A B A B A B B B B B B A B B B A A A A A B A A A B A B *ABC152b A B A B A A A A B A B A B B B B B B A B B B A A A A A B A A A B A B *HvHVA1 A B B B A A A A B A B A B B B B B B A B B B B A A A A B A A A B B B *BCD265c A B B B A A A A B A B A B B B B B B A B B B B A A A A B A A A B B B GCGT132 A B B B A A A A B A B A B B B B B B B B B B B A A A A október B A 13. A A B B B *OPP142 A B B B A A A A B A B A B B B B B B B B B B B A AMészáros A A BKlára A A A B B A

53 mst102 0 Bmac144d 4 TCGA96 6 MWG938 8 AGAT GCTC58 15 OPK16 17 abc Bmac GAAT76 24 OPE GAAT OPO18 31 OPB Bmag OPS16 50 GCGA Ebmac560a 54 OPB GAAT AGGT TCGA OPT GAAT AGAT51 99 Bmac144a 100 GCGA ABC152b 109 HvHVA1 125 BCD265c 126 GCGT OPP OPX H Bmac222a 0 ABG459 1 ABG HvM36 25 ABC GAGT ABG8 31 GCGA52 37 GAGA72 39 TCTC GAAT OPA AGAT AGAT GAGA GAGT62 58 GCGT abg459a 101 Bmac Bmac144b 108 bcd175b 109 Bmag GAGT TCGT TCAT TCTC Bmag003c 127 GCAT OPG H OPD07 0 OPS141 6 OPO GATC GCGA TCAT GAGA TCTC AGTC GAAT GCAT OPI AGAT OPS Bmag384b 75 TCTC GCGT OPK HvM60 99 AGAT AGAT GAAT AGGT GCGT OPH ABG4 152 TCAT Bmag GCAT TCTC OPS Hvm GAGA OPH Hvm GCGT TCAT GCAT GCGA TCGA ABC AGTC GAAT H HvPhyA 0 GCAT76 8 TCAT300 TCAT77 9 AGAT HvPhyB 21 CAB 22 Bmac30 24 AGAT Bmag Bmag173a 33 Bmac OPJ15 40 TCAT OPU AGAT46 59 ABG abg54 64 AGAT GCGT GCAT AGAT HvM67 85 OPS VRN-H2 HvSnf2 92 AGGT Hdamyb 100 4H OPT151 0 GCAT50 7 Bmag136b 8 GAGA556 9 Bmag GATC AGTC AGGA GAGA AGAT42 32 GAGA58 33 Bmag abc AGAT TCTC Bmag223 mr 41 GATC abg459b 51 OPH GCGT GCGA TCAT abc306d 90 OPK TCTC ABG AGTC Bmag381b 112 gms HvPhyC VRN-H1 117 abc TCGT GCAT ABC H BMAC316 0 AGGT256 2 TCTC386 9 AGAT ABC152c 23 Bmag Bmag21a 51 GAGA GCGT Bmag OPH Bmag HvCry1a HvCry2 GCGA48 71 AGGA62 72 OPI OPA abc306b 80 abc306c 81 abc AGGT Bmag003b 89 ebmac TCTC OPT14 95 GCTC GAGA AGGT TCAT GCAT AGAT wg464a GAGA GAGA TCTC TCAT GCGT H Hvm4 0 Bmac222b 9 GCAT TCAT TCTC abg TCTC abc152a 16 GCGT69 25 AGTC TCAT Bmag21c 32 GCAT Ebmac TCGT TCGA VRN-H3 50 KSuA1a 52 abc306a 59 TCGT TCGT64 62 AGGT64 65 OPE Bmac TCGT Bmag OPR OPS mst101b 88 Bmag AGAT AGAT GCGT OPQ TCTC OPB AGGT GCTC GAAT H B1 B3 B7 B9 B10 B12 B13 B5 B3 B3 B7 B7 B8 B15 B14 B16 B18 B19 B4 B5 B6 B10 B12 B14 B4 B5 B7 B11 B13 B18 B1 B3 B4 B8 B10 B12 B3 B6 B5 B9 B12 B10 Dicktoo Kompolti korai marker térkép (246 lókusz)

54 Oregon Wolfe Barley Map Centromere Morphological marker ABG Bmag ABG HVCMA 44.3 Bmac X Bmac047B 65.9 DAK MWG nud 81.6 lks Bmag WG380B Ris ABC ABG461A WG380A X HVM ThA (7H) ABG DAK ABG X Pox 42.4 MWG949B 55.8 Hot EBmac ABG X Bmag0113E 77.9 Bmac0144F 84.1 vrs Bmag MWG MWG844E X KFP MWG882A ABG EBmac cnx zeo X MWG X wst X MWG949A (2H) BCD ABC171A 26.4 X ABG alm 62.2 Bmac ABC BCD Bmac Bmag HVM X ABG X Pub MWG HVM ABC ABC (3H) MWG MWG HVM CDO CDO hvknox Dhn ABC HVM X Bmag X Bmac ABG X KFP MWG652B EBmac X Hsh HVM X ABG (4H) Rh 0.0 Act8A 8.8 kazmil 15.6 MWG837B 21.2 MWG837A 24.5 Bmac X BCD X Bmag ABG X ABC Bmac0144A 85.0 Bmag0113A 88.3 MWG706A 98.2 Blp MWG ABC X WMC1E MWG ABG387A (1H) Bmac MWG MWG652A 28.8 MWG602B 33.0 X ABG X HVM rob 70.5 Bmag X Bmac0218C 88.1 ABG MWG X MWG Tef X Bmac X (6H) MWG ABC ABG ABG Bmac0273B 38.2 Bmac KFP ABC srh 88.3 Bmag0113D ABG003B MWG X ABG ABG ABC Bmag0113C MWG602A (5H)

55 Marker kapcsoltsági térképek alkalmazási területei Összehasonlító térképezés rokon fajok között, fajon belül különböző populációk között Genom szerveződés makro és mikro kolinearitás kromoszóma átrendeződések intergénikus és génklaszter szakaszok azonosítása

56 Egyedi térképek fajra jellemző konszenzus térkép Stein et al. TAG(2007)114:823

57 A búza kromoszómák BIN térképe Qi et al. Genetics 2004

58 P92201D5-2/P91193D1-10 Ajana/WAWHT2074 Cadoux/Reeves EGA Blanco/Millewa B wpt-5195* wpt-0643 wpt-6575 wpt-5587 wpt-3459 wpt-5934 wpt-6627* wpt-4916* wpt-0100* wpt-8235* gwm614b* wpt-8404* wpt-1041* wmc25* gwm319* wpt-3569* wpt-1650* wpt-1068* wpt-7937* wpt-0775* wpt-8294* wpt-0395* wpt-1494* wpt-2249* wpt-2907* wpt-0434* wpt-9131* barc183* wpt-0615* wpt-1127* wpt-5440* wpt-6144* wpt-0079* gwm630* wpt-9350* cfd56* AF112966* wpt-7625* gwm47* wmc477* gwm120* wpt-3109* wpt-9336* wpt-7350* wpt-4701 wpt-2266* gwm526c* barc1147* barc92 Marker kapcsoltsági térkép kromoszóma fizikai térképe B gwm614 wpt-1663 wpt-5567 wpt-4527 cfd238 wmc25a barc318 wpt-9423 wpt-9402 wpt-1489 wpt-8072 wpt-4301 wpt-0462 wpt-3561 wpt-6932 wpt-3983 wpt-5707 wpt-2314 wpt-6199 wpt-8583 wpt-6477 wpt-4125 wpt-9644 wpt-7757 wpt-0408 wpt-0615 wpt-5672 wpt-8492 barc183b* gwm46 barc7 barc55 wmc474 cfa2278 wpt-0335 wpt-0709 wpt-7750 gwm374 gwm319 gwm630b gwm271 gdm14a gwm120a gwm191a* wpt-1140* wpt-7200 wpt-3132 wpt-0950 wpt-7404 wpt-5128* gwm120b wpt-4199 gdm61* B wpt-4527 cfd238 wpt-8004 wpt-8326 wpt-9423 wpt-9402 wpt-1489 wpt-8072 wpt-5707 wpt-3983 wpt-4997 gwm429 barc13 wpt-6477 wpt-0615 wpt-7750 wpt-2430* wpt-8569* B wpt-6575* wpt-5587* wpt-3459* wpt-5934* wpt-6970* wpt-6627* wpt-5195* wpt-0643* wpt-6805* wpt-0100* wpt-8760* wpt-2410* wpt-3565* gwm614* wpt-6223* barc35* barc297a* wpt-2106* wpt-8004* wpt-8326* wmc154 wpt-5374 wpt-3561 wpt-5707 wpt-7757 wpt-5672 wpt-5556 wpt-4125 barc55 wpt-6278 barc1114 cfa2043b gwm120 wpt-4199* wpt-2430 wpt-8569 wpt-0094 wpt-7200 wpt-3132 wpt-8460 wpt-5680 wpt-5242 wpt-0694 stm509acag wpt-4701 wpt-7004 wpt-4210 wpt-0047 barc1147 wpt-2135 wpt-3378 barc159 wpt-4559 wpt-6970 wpt-7123 wpt-9288 wpt-6311 wpt-8737 wpt-4916 wpt-9423 wpt-5587 wpt-5934 wpt-6575 wpt-9859 wpt-7995 wpt-9220 wpt-3459 wpt-3188 wpt-1549 wpt-1549 wpt-2249 wpt-2397 wpt-3807 wpt-5287 wpt-1650 wpt-8074 wpt-0408 wpt-0615 wpt-1489 wpt-1494 wpt-3188 wpt-3983 wpt-4701 wpt-4737 wpt-4997 wpt-5249 wpt-5556 wpt-5597 wpt-7348 wpt-7610 wpt-8072 wpt-8294 wpt-8460 wpt-8720 wpt-9402 wpt-6144 wpt-6053 wpt-6627 wpt-7408 wpt-7757 wpt-8070 wpt BS-3 2BS-1 2BL-6 Chromosome 2B

59 Térképegység (cm) és megabázis (Mb) 1 cm 1Mb 1 Mb = 106bázis A rekombinációs gyakoriság változó genomon belül is, ezt jellemzi a rekombinációs ráta, amely 1 körül változik. Vannak rekombinációs hot-spotok, míg máshol, pl. a centroméra környékén szinte nincs rekombináció.

60 Marker kapcsoltsági térképek alkalmazási területei Gének azonosítása, fenotípusos hatásuk vizsgálata finom térképezés, pozicionális klónozás modell növény ismert génszekvenciája alapján Mennyiségi tulajdonságok lókuszainak (QTL) elemzése lókuszok számának és helyének azonosítása Adott lókusz szerepének elemzése; QTL dinamika, tulajdonság komponensek vizsgálata Allél gyakoriságok vizsgálata szélesebb genetikai bázison Marker szelekció

61 A QTL meghatározás fő módszerei Sigle-marker analízis: nincs szükség kapcsoltsági térképre Statisztikai módszerek: t-teszt Anova Lineáris regressió A determinációs koefficiens (R2) megadja, hogy az adott marker a fenotípusos variancia hány százalékét magyarázza Hátránya: a marker és a QTL közti rekombináció esetén alulbecsli a kapcsoltságot Nagy populáció méret csökkenti ezt a hatást

62 A QTL meghatározás fő módszerei Marker Chromosome or P value R2 Sigle-marker analízis: nincs szükség kapcsoltsági térképre Statisztikai módszerek: t-teszt Anova linkage group E 2 < F Lineáris regressió G A determinációs koefficiens (R2) megadja, hogy az adott marker a fenotípusos variancia hány százalékét magyarázza H Hátránya: a marker és a QTL közti rekombináció esetén alulbecsli a kapcsoltságot Nagy populáció méret csökkenti ezt a hatást

63 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával QTL azonosítás a teljes marker kapcsoltsági térképre kiterjedve markerek közötti intervallumok vizsgálata Valószínűségi becslések LOD= lg(qtl csúcs jelenlétének valószínűsége/annak a valószínűsége, hogy nincs QTL hatás) LOD küszöbérték: - genom méret - marker típus és sűrűség - populáció típusa és méret

64 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Single intervall mapping (SIM): Két szomszédos marker közötti intervallumot vizsgál az egész kromoszóma mentén. Kiküszöböli a rekombinációból származó torzítást. Composit interval mappiung (CIM): egyesíti az intervallum térképezést a lineáris regresszió analízissel és a szomszédos markerpárokat további markerekkel egészíti ki.

65 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával Hasadó populáció Genotípusos jellemzés Fenotípusos jellemzés szülők AAABBAB ABBABABB BBBAA A B Adat mátrix *mst1011 ABAAABBBABBBABBBBBABBABBA *mst1012 ABBAABAABBAABBBBBBABBBBBB *mst102 AAABBBAABBABBBABBBBABBABB *wg4642 ABBAABAABBAABBBBBBABBBABB *bcd1752 ABBAAABBBA---ABBABBBABABAA *wg541 AA-BBBA---ABBABBABBABABAABA *v8h *uv16h *v16h *uv24h

66 Adott tulajdonsággal kapcsolt marker

67 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával ============================================================= QTL-Map for peak 3: Confidence Interval: Left Boundary= OPS31-Snf Right Boundary= Snf2-Hdamyb (off end) INTERVAL LENGTH QTL-POS GENETICS WEIGHT Snf2-Hdamyb free chi^2= (1 D.F.) log-likelihood= mean= sigma^2= variance-explained= 93.8% =============================================================

68 QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával cm Weight R 2 LOD OPJ15-ABG cm % % % % * % ** ============================================================= % ** % *** QTL-Map 14.0 for peak 3: 37.8% *** Confidence Interval: 38.2% Left Boundary= **** OPS31-Snf % **** Right Boundary= Snf2-Hdamyb (off end) % **** % **** % **** INTERVAL % LENGTH QTL-POS *** GENETICS WEIGHT Snf2-Hdamyb % *** free ABG366-abg cm % *** % *** chi^2= (1 D.F.) log-likelihood= % ** mean= sigma^2= variance-explained= abg54-opr % cm % ============================================================= % % 1.992

69 LOD values QTL elemzés marker kapcsoltsági térkép alkalmazásával cm Weight R 2 LOD OPJ15-ABG cm % % H25.0% H 5H % * % ** ============================================================= % ** % *** QTL-Map 14.0 for peak 3: 37.8% *** Confidence Interval: 38.2% Left Boundary= **** OPS31-Snf % **** Right Boundary= Snf2-Hdamyb (off end) % **** % **** % **** 30 INTERVAL % LENGTH QTL-POS *** GENETICS WEIGHT Snf2-Hdamyb % *** free ABG366-abg cm % *** % *** chi^2= (1 D.F.) log-likelihood= % ** mean= sigma^2= variance-explained= abg54-opr % cm % recombination distance (cm) ============================================================= % % HD16h uv HD16h vern HD24h uv HD24h vern

70 DH vonalak száma Kalászolási idő, mint vizsgált tulajdonság Populáció egyedei közti változékonyság Kompolti X átl =77 nap Dic ktoo 16h + hő ciklus Kalás zolás i idő

71 Dicktoo x Kompolti korai DH vonalak HvSnf2 ZCCTH 4H árpa kromoszóma 0 HvPhyA 8 GCAT76 9 TCAT300 TCAT77 16 AGAT HvPhyB 22 CAB 24 Bmac30 29 AGAT Bmag Bmag173a 39 Bmac OPJ15 41 TCAT OPU AGAT46 62 ABG abg54 65 AGAT GCGT GCAT AGAT HvM67 86 OPS VRN-H2 HvSnf2 AGGT650 Hdamyb QTL elemzés vernalizálatlan vernalizált kezelés

72 Pozicionális klónozás Alapja: a QTL hatás 1 cm-nál kisebb marker intervallumhoz köthető Finomtérképezés, nagy populáció méret bevonásával A génhez közeli rekombinációt hordozó egyedek azonosítása, fenotípusos jellemzése A kromoszóma régióhoz köthető átfedő BAC klónok azonosítása, térképezése A keresett gént tartalmazó BAC klón szekvenálása A BAC klónon talált gén(ek) funkciójának tisztázása Gén expresszió transzformáció

73 Pozicionális klónozás A kalászos gabonafélék vernalizációs igényéért felelős VRN-2 gén azonosításának menete Yan et al., Science 303(2004):

74 Pozicionális klónozás A kalászos gabonafélék vernalizációs igényéért felelős VRN-2 gén azonosításának menete Yan et al., Science 303(2004):

75 Gén azonosítás főbb módszerei marker kapcsoltsági térképek és pozicionális klónozás Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör jelölt gén megközelítés Genom pozíció függő stratégiák Összehasonlító genomikai stratégiák mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) génfunkció és fenotípus közti kapcsolat Gén expressziós mintázatok elemzése

76 Széles genetikai bázisú fajtakör asszociációs genetika Hagyományos két-szülős térképező populációk hátrányai: Előállításuk idő és munka igényes Lókuszonként csak két allél hatásának vizsgálatára van mód A két szülő közti hasonlóság korlátozza az egyes gének azonosítási lehetőségeit Adott populációban azonosított QTL csúcshoz szorosan kapcsolt marker nem polimorf a nemesítési anyagban Gén (allél) kölcsönhatások vizsgálata limitált

77 Gén azonosítás főbb módszerei marker kapcsoltsági térképek és pozicionális klónozás Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör jelölt gén megközelítés Genom pozíció függő stratégiák Összehasonlító genomikai stratégiák mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) génfunkció és fenotípus közti kapcsolat Gén expressziós mintázatok elemzése

78 Összehasonlító genomikai stratégiák Ortológ lokusz: Különböző fajokban ugyanabból az ősi lokuszból származó hasonló szekvenciájú és funkciójú géneket hordozó lokusz. Paralóg lokusz: Ősi lokusz duplikációjából származó lokusz. Szinténia: Két különböző fajban a gének és markerek hasonló sorrendje. Mikroszinténia: Szekvencia szintű szinténia. A homológ szekvenciájú gének hasonló sorrendje, szekvenciája és orientációja a genomban.

79 Gu et al Plant Phys

80 Stein et al. TAG(2007)114:823

81 Cockram et al. JEXB(2007)58:1231

82 Gén azonosítás főbb módszerei marker kapcsoltsági térképek és pozicionális klónozás Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör jelölt gén megközelítés Genom pozíció függő stratégiák Összehasonlító genomikai stratégiák mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) génfunkció és fenotípus közti kapcsolat Gén expressziós mintázatok elemzése

83 Mutáció A mutáció az örökítő anyag spontán, maradandó megváltozása, amelynek során új genetikai tulajdonság keletkezik. A Hugo De Vries által a múlt század elején bevezetett fogalmat ma szűkebb értelemben a génen belüli bázissorrend-változásra vonatkoztatjuk, tágabb értelemben azonban mutációnak tekinthető a kromoszóma-szerkezetben, ill. a kromoszómák számában bekövetkezett minden változás, ideértve a poliploidiát is.

84 A génmutációk (pontmutációk) egy gén bázissorendjének változását jelentik. Ennek hatása ritkán jelenik meg azonnal a fenotípusban, csak ha domináns a mutáció. Bázis csere (tranzicio, transzverzió) Keret eltolódás (Frameshift) Hatásuk: same sence azonos aminósav missense aminósav csere nonsense stop kodon kialakulása Kromoszómamutáció: A kromoszóma egyes részei változnak meg. Ez lehet szerkezeti változás, például a kromoszómák törlődése (deléció), megfordulása (inverzió) kicserélődése (transzlokáció), megduplázódása (duplikáció). Másrészt lehet számbeli, melyen belül megkülönböztetünk poliploidiát (kromoszómagarnitúra a normális egész számú többszöröse) és aneuploidiát (csak egy kromoszómánál van eltérés).

85 Mutagenezis kémiai (EMS, ENU, DEB, HNO 2, ) besugárzás (R, a-g, gyors neutron, UV) inszerció [T-DNS és/v. (retro)transzpozon] kimérikus (RNS-DNS) oligonukleotidok véletlen, azonosítás?? letalitás géncsendesítés (antiszensz, RNSi)

86 TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) (EMS) mutagenezis + genomika = HTP azonosítás Szelekció a genotípus alapján ( reverz genetika) Lépései mutáns populáció előállítása HTP mutáns azonosítás értékelés

87 TILLING mutáns populáció előállítása

88 TILLING mutáns populáció előállítása

89 TILLING a módszer Heteroduplex formációk

90 TILLING a módszer A mutációk kimutatása IR 700 IR 800 IR 700 IR 800

91 TILLING a módszer LI-COR 4300 DNA Analyzer

92 TILLING

93 TILLING IR 700 IR 800

94 TILLING

95 ECOTILLING TILLING a természetben létező ökotípusokkal vagy populációkkal és TILLING mesterségesen fenntartott genetikai forrásokkal, pl. fajta- és mutánsgyűjtemények, izogén vonalak (NIL), hasadó és térképezési populációk (BSA), fajtajelöltek,...

96 ecotilling

97 TILLING alkalmazások allél(sorozatok) azonosítása (funkc. genomika, SNP) többszörös mutánsok azonosítása HTP szelekció (MAS, GAS, SAS ) pedigrévizsgálat rokonsági körök igazolása (kukorica) (fejlődés)rendszertan genetikai térképezés (génizolálás)

98 Ajánlott irodalom Dudits D., Heszky L.: Növényi biotechnológia és géntechnológia Heszky L., Fésüs L., Hornok L.: Mezőgazdasági biotechnológia B.C.Y. Collard1,4,, M.Z.Z. Jahufer2, J.B. Brouwer3 & E.C.K. Pang (2005) An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica 142: DOI: /s

99 Köszönöm a figyelmet!