MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA. Saccharomyces cerevisiae, pékélesztő, yeast. Az 1950-es évektől kedvelt modellorganizmus a genetikában.

Átírás

1 MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA Saccharomyces cerevisiae, pékélesztő, yeast Az 1950-es évektől kedvelt modellorganizmus a genetikában. Egysejtű eukarióta, egyszerű életciklussal, könnyen tenyészthető, haploid és diploid fázis, rövid generációs idő, mind a négy meiótikus termék együtt azonosítható, tetrád analízis. Az eukarióta genom felépítésének és génszabályozásnak, a sejtciklus szabályozásának, a sejtek kommunikációjának, a mitokondriális genetikának ideális kísérleti objektuma. 1) fejlődési (differenciálódási) mutánsok azonosítása, gének és fehérjék megismerése 2) fő szabályozó gének (master genes) működése és hatásuk a fenotípusra 3) szignál transzdukciós út és a fenotípus megváltozása Olyan alapfolyamatok tanulmányozhatók rajta (génszabályozás, differenciáció, replikáció, rekombináció, repair...), amelyek nagyon hasonlóan működnek a soksejtes, magasabban szervezett élőlényekben. De sokkal egyszerűbb a rendszer. Genetikai szempontból nagy előnye, hogy a haploid és diploid sejtek is tanulmányozhatók. Recesszív mutációk azonosítása a haploid sejtekben mutációk kombinálása (komplementációs kísérletek) a diploid háttérben. Recesszív letális mutációk fentartása diploid sejtekben. 108 sejt /ml! sok utód átvizsgálása, ritka események meglátása 6/1

2 Nukleáris genom haploid: 16 lineáris kromoszóma minden kromoszóma tartalmaz: egy centromeron, két telomeron, telomerikus szekvencia, szubtelomerikus hosszabb repeat és telomerikus repeat régió replikációs origók kb távolságra kariotipizálás pulse-field gélelektroforézissel szétválaszthatók (b) fotó. a kromoszómák Az I. kromoszóma a legkiseb: 235 kb, a XII. kromoszóma a legnagyobb és a mérete variál kb közötti rdna, riboszómális rrns gének kópia, törzstől függő teljes genom kb ( kb rdna) 1996-ban készült el a teljes szekvencia A III. kromoszóma genetikai és fiziki térképének összehasonlítása. Nem mindenütt hasonlóak az arányok. Genetikai térkép A klassszikus genetikai térkép tetrád analízissel készült. Extrém aktív rekombinációs rendszer a közelebbi gének között is nagyobb a mért genetikai távolság szokatlanul hosszú genetikai térkép Több mint markert tartalmaz és cm 3 kb/cm, kivétel a centromerikus régiók és az rdna, ahol nincs meiótikus rekombináció A Neurospora crassa genomja nagyjából hasonló nagyságú, de a genetikai térkép hossza csak 15%-a az élesztőének. (T4 fág 1 kb/cm human 3690 cm kb kb/cm) 6/2

3 Genetikai térképezés, tetrád analízis Ha a PD jóval több, mint az NPD, a két marker nem kombinálódik szabadon, tehát kapcsolt. A legegyszerűbb rekombinációs esemény TETRATÍPUSÚ aszkospórát eredményez!

4 Ebben a példában 127 PD és csak 3 NPD tetrád van, tehát a két marker kapcsolt. Ha csak egy rekombináció van a kapcsolt markerek között, akkor TETRATYPE aszkusz keletkezik (Lásd az előzőleg bemutatott ábrát!) Jelen példánál 70 T aszkusz van. A térképtávolságot T és az NPD tetrádok figyelembe vételével számíthatjuk ki. Ha a rekombináció csak két kromoszómát érint (legegyszerűbb, leggyakoribb eset), akkor tetratípusú elrendezés keletkezik. Tetratípusnál csak az utódok fele rekombináns! NPD esetében mindegyik kromoszómán rekombináció volt a markerek között! Ugyanazt az eredményt kapjuk, ha nem a tetrádok, hanem az utódok számával számolunk (3 x4 NPD aszkospóra és 70 x2 T aszkospóra)

5 A gének száma A Human Genome Project 2001-ben fejeződött be. Példáján látható, milyen nehéz a gének számát megbecsülni. A szekvenálás előtt körülire becsülték a humán gének számát. A szekvenálás befejezése után 40 és 60 ezer közöttire, de sokan inkább 30 ezerről beszélnek. Élesztőnél is nagy a bizonytalanság. A fehérjekódoló gének számának becslésekor a 100 aminosavnál hosszabb lehetséges fehérjéket kódoló ORF-ek számából indulhatunk ki AS szekvenciát összesen ORF kódol AS ORF 100 AS vagy több ORF DE 210 ORF kisebb mint 100 AS kódoló kapacitású és bizonyítottan működő gént jelent. Viszont jelentős számú 100 AS kapacitású ORF nem kódol fehérjét az eddigi eredmények szerint. orphan genes árva gének Jelenleg a becsült gének száma , melyek közül ismeretlen funkciójú. Azaz biokémiai, genetikai módszerekkel nem lehet funkciót rendelni hozzá, és a kódolt fehérje nem mutat más, ismert funkciójú fehérjékkel hasonlóságot. 6/5

6 Szisztematikus mutagenezis: Hány funkcionálisan fontos gén van? A genomprojekt után minden feltételezett génben mutációt helyzetek el. Csak 20 % bizonyult haploid formában letálisnak. Laboratóriumi körülmények között ennyi létfontosságú. DE a természetes környezetben sokkal több gén jelenthet előnyt a mikróbák, populációk közötti versengésben. A fehérjekódoló gének 4-5 %-a tartalmaz csak intront! (1 intron 276 génben, 2 intron 7 génben) kevés a pszeudogén is 274 trns gén, 71 snrns riboszómális RNS éréshez, 5 snrns splicing, 3 RNS gén RNase P, endoribonuclease MRP, és a telomerase enzimekhez. Genom szerveződés 75 %-a a genomnak átíródik egyedi gének, saját promóterrel, ált. nincsenek csoportok egyik kivétel a GAL operon (galaktóz transzport és lebontás), ahol a gének csoportosulnak, DE saját promóterről íródnak át (monocisztronos mrns) a soksejtes eukariótákhoz képest sokkal kevesebb az ismétlődő szekvencia rdna géneken kívül: trns gének 5-7-es csoportokban (izoakceptor), subtelomerikus ismétlődések Ty retrotranszpozonok A GAL4 regulátorfehérjén alapszik az élesztő két hibrid rendszer. DNS-kötő és aktivátor domének. Ha a két domént két különböző fúziós fehérjében helyezzük el, amelyek között fehérje-fehérje kölcsönhatás alakulhat ki, akkor is működik az aktivátor funkció. UASGal :: lacz fúzión keresztül mérhető. 6/6

7 Deléció rekombinációval 5 TSD X 5 TSD Ty retrotranszpozon szekvenciák (5-6 kb) 50 körüli teljes szekvencia és 385 long terminal repeat (LTR), ahol a Ty deléciót szenvedett az LTR-ek rekombinációja révén. A Ty majdnem egy teljes retrovírus genom, kivéve a lízist kódoló funkciókat. RNS intermedier szükséges a transzpozícióhoz. 5 TSD Homológ kópiák közötti rekombináció genom evolúció kromoszóma átrendeződések, deléció, inverzió. Csere rekombinációval A B C gének X X X Y Z gének 6/7

8 A B C gének X X Beépülés rekombinációval X Y Z gének 53 nagy duplikáció a teljes genomban (ábra). A nem homológ kromoszómákon hosszú, hasonló szekvenciájú szakaszok. (Az ábrán színes sávok kötik össze a homológ régiókat hordozó kromoszómákat. Az élesztő genom 100 millió évvel ezelőtt egy degenerált tetraploid genomból alakulhatott ki, a rokon Kluveromyces és Saccharomyces szétválása után. Számos redukció (deléció) és átrendeződés történt. A fehérjék 15%-a duplikált, nem kapcsolt génekről íródik át. A duplikált gének között vannak transzkripciós és transzlációs faktorok, protein kinázok, kontraktilis fehérjék (miozin, tubulin), ciklinek, hisztonok és a mating feromonok génjei. A nagyobb duplikációk helye az egyes kromoszómákon 6/8

9 Az élesztő genetika eszközei Transzformáció és homológ rekombináció A sejteket könnyű tisztított DNS-sel transzformálni. Az alkalmazott plazmidok szelektálható markerként funkcióképes bioszintézis géneket tartalmaznak: LEU, HIS, URA (pl. LEU2 gén a Leu- sejtek transzformációjakor) Plazmidok: (1) YIp yeast integration plasmids: élesztőben nem képes replikálódni, stabil transzformánsok homológ rekombinációval pl. LEU2 génbe (2) replikálódik: YEp, YCp - yeast episomal és yeast centromeric plazmodok a sejtmagban replikálódnak YEp a 2 μm-es természetes élesztő plazmid származékai, 20 kópia sejtenként, túltermeltetésre jó a sok példány YCp élesztó centromeron (CEN) és replikációs ori (ARS), kromoszómákhoz hasonlóan szegregálódnak, egy kópia sejtenként, komplementációs kísérletekhez shuttle vectors : E. coli sejtekben történik a konstrukció összerakása, a vektorok egyben bakteriális klónozó plazmidok is, a megfelelő elemekkel (antibiotikum rezisztencia, oric, klónozó helyek (MCS) 6/9

10 Törzskonstrukció, allélcsere Mutánsok előállítására (lásd knock out élőlények) In vitro mutáció konstrukció (pl. URA3 gén inszerció a marker!, nem pedig antibiotikum rezisztencia) Lineáris DNS transzformációja és URA+ szelekció Diploid sejtek transzformációja, a homológ rekombinánsok általában heterozigóták szegregáció, meiózis indukció, a haploid spórák fele életképtelen, ha a mutáció esszenciális gént érintett, A heterozigóta diploid törzsben fentartható a mutáció. 6/10

11 Az élesztő képes váltogatni a haploid (1n) és a diploid (2n) életciklusait. Az új leánysejtek mitotikusan képződnek ezekben a ciklusokban és válnak le az anyasejtről (bimbózás). α a A haploid sejteknek kétféle párosodási típusa lehet: a és α Mindegyik képes mitotikusan szaporodni, mint haploid sejtvonal, vagy a különböző párosodási típusú sejtek kommunikálnak egymással, feromonokat bocsájtanak ki és fúzionálnak. Sejt és nukleáris fúzió. A diploid sejtek képesek sarjadzással szaporodni (diploid ciklus). Tápanyaghiány esetén indukálódik a meiózis és a haploid spóraképzés (tetrád). A sejtek típusát a MAT lókusz határozza meg, mely a III. kromoszómán van. A MATa/MATα heterozigóta diploidok 2a és 2α haploid spórát szegregálnak. A MATa/MATα diploid steril, de lehetséges MATa/MATa vagy MATα/MATα sejteket is létrehozni. Ezek képesek fúzionálni (párosodni) az ellentétes párosodási típusú sejtekkel, függetlenül a ploiditástól. Sejt differenciáció és sejttípus meghatározás Az a, α és a/α sejtek ugyanúgy differenciálódott sejtek, mint az izom, ideg vagy májsejtek. Különböző géneket (is) expresszálnak és eltérő a környezeti szignálokra adott válaszuk. Három különböző genetikai program alapozza meg a differenciálódási útvonalat. 1n 1n 2n A sejtidentitás megalapozása a soksejtes élőlényeknél alapvető a differenciációs folyamatokban, ezért az élesztő egy fontos, egyszerüsített modellje ezeknek a folyamatoknak. α-feromon és a-feromon termelés és érzékelés 6/11

12 Párosodás és sejt-sejt kommunikáció Az α-sejtek α-feromont szekretálnak és a-feromon receptort hordoznak, az a-sejtek a-feromont termelnek és α-feromon receptort expresszálnak. A feromon kötés hatására a receptorok egy szignál transzdukciós utat indítanak be. Mutánsok izolálásával a feromon termelést és az arra adott választ genetikailag fel lehetett bontani steril mutánsok izolálása (a mutánsok nem képesek a szignál termelésre, vagy nem képesek az érzékelésére) szignál teszt (alsó ábra) Mindkét feromon gátolja a sejtosztódást az érzékelő sejtben. Ha egy sejttípus nem termel, akkor nem képes a másik típus osztódását gátolni, ha hibás az érzékelés, akkor nem gátolja a másik típus feromonja az osztódásban. Szignál transzdukcióban hibás mutánsok: sterilek, de feromon termelők (gátolják a másik típus növekedését, de őket nem lehet gátolni). 6/12

13 A MAT lókusz szabályozza a sejttípust meghatározó gének expresszióját. Steril mutáns α sejtek segítségével kiderült, hogy a MATα lókusz két komplementációs egységet (gént) tartalmaz. A α1 hibája miatt nem termelődik az α-feromon, az α2 mutációjakor termelődik ugyan, de szekréció előtt gyorsan degradálódik. Ez a lebontási folyamat normál esetben az a-sejtek jellemzője. A MATα lókusz Komplex lókusz. Az α1 gén terméke egy aktivátor fehérje, amely α-specifikus gének expresszióját akativálja (pl. α-feromon termelés). Az α2 gén terméke pedig egy represszor fehérje, amely gátolja az atípusú gének működését. Az α2 mutációja miatt mindkét sejttípusra jellemző funkciók működnek, ami sterilitást okoz. A szabályozott gének csoportjai: asg: a-specifikus gének, αsg: α-specifikus gének, hsg: haploid specifikus gének, RME: meiózis represszor A dupla mutáns (α1-, α2-) az a-sejtre jellemző géneket expresszál! Ez egy egyszerű szabályozási hálózat két mestergén meghatározzák számos gén expresszióját, így a sejtidentitás kialakulását eredményezik. A MATa lókusz Nem lehet strerilitást okozó mutációt izolálni, bár van egy a1 gén benne (represszor alegység). Az α1 és α2 gének hiánya határozza meg az a-sejtek sorsát. 6/13

14 MATα/MATa diploid a1/α2 represszor: Az a1 és az α2 gének terméke együtt represszora az α1, a hsg és az RME géneknek! Ezért: 1) nincs α1 aktivátor nem működnek az alfa spec. gének 2) REPRESSZÁLT a hsg haploid spec. gének csoportja 3) gátolt az RME represszor NINCS meiózis represszió 4) nincs mating type meghatározás (nincs feromon termelés) A MAT lókuszok 2500 bp hosszúak. A régió közepén eltérő szekvenciákat hordoznak, a két szélük azonban azonos. Yα 747 bp - promóter és CDS eleje mindkét génre Ya 642 bp a1 gén Teljesen más genetikai információ, nem szokásos allélek! 6/14

15 GÉNEK és SZIGNÁL TRANSZDUKCIÓ STE2 Az α-faktor 13 aminosavbó álló peptid: Trp1-His2-Trp3-Leu4-Gln5-Leu6-Lys7-Pro8-Gly9-Gln10Pro11-Met12-Tyr13 Az a-sejtek α-feromonra specifikus receptorral rendelkeznek. Ezt az a-specifikusan expresszáló STE2 gén kódolja. A másik, az a-feromon receptorgén az STE3. A receptorok 7 hidrofób transzmembrán domént (TMD) tartalmaznak, heterotrimerikus G-protein kapcsolt receptorok. A G-protein alegységek: α (SCG1 gén), β (STE4 gén), γ (STE18 gén). α-feromon/receptor GαGDP GαGTP GβGγ disszociál MAP kináz kaszkád aktív MAPK-P (FUS3) sejtmagba STE12 foszforiláció STE12-P aktív transzkripciós faktor Hatására: - sejtciklus G1 fázisban stop (pl. FAR1), - sejtfúzió elidító (pl. FUS1), - nukleáris fúzió elindító gének (pl. KAR5) transzkripciója MAP-kináz: mitogén aktivált protein kináz A receptorok sejttípus specifikusak, de a szignáltranszdukciós út többi részét a haploid specifikus gének (hsg) kódolják, amelyek mindkét haploid sejtben expresszálódnak. 6/15

16 Bal oldal: Génexpresszió változás az α-faktor hatására cdns szekvencia 6000 különböző génről, a piros szín a faktor hatására megemelkedett expressziót mutató géneket jelzi kontroll: Ste12 mutáns (transzkripciós faktor) Alul: A Ste12p fehérje kötő DNS szakaszok azonosítása az élesztő intergenikus régióiban 28 gén promóterében van Ste12p kötőhely. 6/16

17 Extranukleáris öröklődés és a mitokondrium (web-jegyzet) Mary Mitchell, 1952, Neurospora poky, ("ócska") mutánsok. Nincs cit-a, cit-b és sok a cit-c bennük, elektrontranszport lánc (mitokondrium) hibája. A mutációk anyai öröklésmenetet mutattak. Radioaktív jelölést alkalmazva kimutatták, hogy a mitokondriumok de novo (újonnan) nem keletkeznek, csak a meglévő mitokondriumok osztódnak! Edward Tatum (1965) abnormal mutánsból mitokondriumokat ültetett át normál sejtekbe az utódok között megjelent az abnormál fenotípus gének a mitokondriumban (mtdns) A mitokondriális DNS genetikai feltérképezését az élesztő rendszeren végzett munkák segítették leginkább elő. Boris Ephrussi, 1940-es években a Neurospora poky mutánsokhoz hasonló mutánsokat izolált élesztőből. petite (pötit) mutánsok, szintén a respirációban hibásak. Más típusú mutációk (ant és a mit) szintén anyai öröklődésmenetet mutattak mtdns géneket érintenek. 1. szegregációs petite mutánsok (mendeli 1:1, nukleáris) 2. neutral petite mutánsok (keresztezésnél csak normál utód) 3. szupresszív petite mutánsok (nem 1:1) 4. ant mutánsok: kloramfenikol (capr), eritromicin (eryr), spiramicin (spir) mind prokarióta riboszóma különböző pontjain hatnak úgy, hogy a transzlációt gátolják 5. mit - mutációk (mt pontmutánsok, revertálnak) Krebs-ciklus, terminális elektron transzport, oxidatív foszforiláció és ATP szintézis a mitokondriumban. mtdns, nukleoid a mátrixban, a méret és a gének száma változó, élesztőnél 75 kb, humán 17 kb kromoszóma gén transzfer a nukleuszba, de cp mt transzfer is 6/17

18 Uniparentális öröklődés Az ery alélélek és a párosodási típust meghatározó allélek szegregációja élesztőben. Meiózis után az a és alfa mendeli hasadást mutat, míg az ery allélek "uniparentálisan" öröklődnek. Itt nem alkalmazható a "maternális" kifejezés, mert az ery allélek megjelenése nincs összefüggésben az egyik vagy másik párosodási típussal (sem az "a" sem az "alfa" szülő ery allélja nem öröklődik kizárólagosan). Rekombinációs térképezés markerek: ery - eritromicin, spi - spiramicin szülők: alfa (eryr, spir) X a (erys, spis) rekombinánsok: eryr,spis erys,spir 6/18

19 A humán és élesztő mt genom összehasonlítása yeast, külső kör: 78 kb human, belső kör 17 kb Saját genom Saját transzkripció Saját transzláció trns és rrns gének 6/19

20 a humán (gerinces) mt kódszótár az univerzális kódszótár 6/20

21 A mitokondriális DNS és a filogenetikai vizsgálatok Populációk közötti és fajok közötti rokonsági meghatározására egyaránt használják. Gyorsan mutálódó szakaszok. Nagy kópiaszám. fok The complete mitochondrial genome sequence was reconstructed from DNA obtained from a 38,000 year old Neanderthal bone fragment excavated in 1980 from the Vindija Cave, Croatia. Analysis of the assembled sequence unequivocally establishes that the Neanderthal mitochondrial DNA falls outside the variation of extant human mtdnas, showing that Neanderthals did not contribute mtdna to present-day humans. Furthermore, using the chimpanzee and human mitochondrial DNA sequences as reference points, the number of nucleotide differences found in the Neanderthal mitochondrial DNA establishes the divergence date between human and Neanderthal mtdnas at 660,000±140,000 years. (A teljes neandervölgyi genomszekvencia alapján már feltételezik a genetikai keveredést, ami 80 ezer évvel ezelőtt történhetett.) 6/21

22 Az extranukleáris genom a kloroplaszt genetikája A cpdns kb nagyságú, kör alakú, sok példány kloroplasztonként. Genetika web jegyzet: