2007/11/05 Molekuláris biológia előadások - Putnoky 1-1

Átírás

1 1-1

2 Fehérje transzportmechanizmusok az eukariota sejtben: 1) transzmembrán transzport kitekert formában, egyedi fehérjék transzportja célzottan - citoszol ER, citoszol MT 2) póruson keresztüli transzport (gated transport) nukleusz, nukleáris pórus, aktív térszerkezet megmarad, komplexek ellenőrzött transzportja 3) vezikuláris transzport egyik kompartmentből a másikba, membránba zárva, lefűződés és fúzió a másik kompartmenttel: ER Golgi transzfert irányító szignálok a fehérjéken 1-2

3 A SEJTMAG (nucleus) Az eukarióta sejt dupla membránnal körülvett része. A külső membrán egybefügg az endoplazmatikus retikulummal (ER). nukleáris membrán a genetikai anyag mechanikai védelme elkülönítés (transzkripció, transzláció) speciális funkciók nukleáris lamina - erősítés nukleáris pórus magi transzport nukleoplazma kromatin nukleáris genom nukleolusz riboszóma összeszerelés 1-3

4 Nukleusz nukleoplazma kromatin, fehérje és DNS elkülönülnek benne: nukleolusz membrán nélküli elektrondenz rész, intenzív RNS szintézis (rrns) heterokromatin elektrondenz, sötétebb, erősen kondenzált, csomagolt DNS eukromatin lazább szerkezet az interfázisos sejtmagban, a működő gének főleg itt 1-4

5 NUKLEÁRIS LAMINA lamin fehérjék intermedier filamentumok, membránok erősítése, laminok, nukleáris membrán, nukleáris mátrix lamin A, C és B fehérjék lamin A és C egy gén által kódolt, alternatív splicing lamin A 133 AS-val hosszabb a C-terminális részén lamin B fehérje poszttranszlációs módosítás hidrofób izoprenil (zsírsav) csoport, belső nukleáris membránba rögzítés dimerek, α-helix pálca, globuláris fej, fej-fej ill. farok-farok polimerizáció az interfázisos sejtmagban lamin dimer lamin tetramer farok-farok polimerizáció sejtosztódás előtt depolimerizáció Ser-P foszforiláció laminb-(p) nukleáris membránhoz kötött marad, a többi az oldatban 1-5

6 A nukleáris pórus complex (NPC) nyolcszögletü kosár kd nagyságú fehérje komlplex 30x nagyobb mint egy riboszóma citoplazmikus filamentumok nukleoplazmikus kosár gyűrűk (citoplazmikus, központi és nukleoplazmikus) 60 kd nagyságú globuláris fehérjéig átjárható (vizes csatorna, ionok, kisebb molekulák - diffúzióval) nukleoporin fehérjék alkotják: 50 féle fehérje élesztőnél, 100 körül gerinceseknél A nukleáris póris képe a citoplazmikus (a) és a nukleoplazmikus (b) felszínen 1-6

7 Nukleáris transzport makromolekulák, ribonukleoprotein (RNP) komplexek irányított transzport (export és import) Minden fehérje a citoplazmában szintetizálódik és a nukleáris póruson keresztül jut be ill. utána ki - sok esetben körforgalom (hisztonok, transzkripciós alap és regulátor fehérjék, mrns érés, replikáció, rekombináció, repair (javító) fehérjék, riboszómális fehérjék! 10 6 hiszton fehérje / 3 min. - S fázisban transzportin fehéjék végzik a szállítást (importinok, exportinok) nukleáris likalizációs szignál (NLS) van a magi fehérjéken Első bizonyítékok: SV40 vírus nagy T-antigén fehérje génben mutánsok, a hibás fehérje nem transzportálódik a sejtmagba -x-x- Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val -x-xbázikus motívumot kódoló régión belül találhatók a mutációk Pro-Pro-Pro-Lys-Thr-Lys- Arg-Lys-Val - nem működik Kísérletek hibrid fehérjékkel: NLS szignál: bárhol lehet, 4-8 AS, két blokkban (2-4 AS) Ha egy citoszolikus hibrid fehérje tartalmazza a motívumot, bekerül a sejtmagba. Nyomkövetés ellenanyaggal. (a): normál fehérje lokalizáció, (b): NLS motívumot tartalmazó hibrid fehérje helyzete 1-7

8 Nukleáris import négy komponens Ran monomer G-protein GTP, GDP kötés NTF2 - nukleáris transzport faktor 2 (Ran-GDP import) nukleáris import receptor: importin α NLS felismerő domén importin β - FG-nukleoporin felismerés FG-nukleoporin megtalálható a citoplazmikus filamentumokban, a csatorna belsejében és a kosárban, fenilalanin (F) és glicin (G) gazdag hidrofób régió, ezeket felismerve és ezekkel kölcsönhatva jut be az importin komplex (cargo complex) közvetlen energia felhasználás (ATP) nincs. Vannak más típusú NLS szignálok, amelyeket különböző importin β homológ fehérjék ismernek fel, nem szükséges az α alegység A cargo komplex kialakulása: a) szabad importin az NLS-hez kötődik import b) Ran-GDP-NTF2 komplex import A cargo komplex szétesése transzport után: a nukleoplazmában a Ran-GDP Ran-GTP átalakulást a GEF protein (guanine nucleotideexchange factor) segíti. A Ran-GTP kötődik az importinhoz és ez a komplex exportálódik, majd a GAP (GTPase accelerating protein, citoplazmikus filamentumon) hatására Ran-GDP keletkezik a komplex szétesik 1-8

9 Nukleáris export proteinek, trns, riboszóma alegységek exportja hasonló mechanizmus exportinok nukleáris export receptor, exportin 1 NES (nuclear export signal) Leu gazdag, ill más, még nem ismert szignálok NES (Leu) található pl. a HIV Rev fehérjén Ran-GTP/exportin1/NES-protein komplex ki Általános ciklus: Ran-GTP keletkezik a nukleuszban (GEF) ez jut ki komplexben vagy 1) az üres importinnal, vagy 2) az exportin-cargo komplexszel együtt Ran-GDP keletkezik kívül, a citoplazmikus filamentumokon lévő GAP fehérje által Ran-GDP- NTF2 import, visza a sejtmagba 1-9

10 A transzport szabályozása Számos fehérje folyamatosan ingázik a citoplazma és a sejtmag között mrns export fehérjék, mind NLS mind NES szakaszokat tartalmaz a fehérje Számos génreguláló fehérje csak bizonyos szignálok meglétekor transzportálódik -foszforiláció megléte vagy hiánya módosítja az NLS felismerhetőségét - maszkírozás: citoplazmikus fehérje kapcsolódása elfedheti az NLS szekvenciát, így a fehérje a citoplazmában marad a maszkírozó fehérje leválása (jel) után történhet meg a transzport 1-10

11 Egy példa: a glükokortikoid receptor 1) A receptor a hsp90 hősokk fehérjével komplexet alkot, ha nincs hormon az NLS rész rejtve 2) Ha hormon kötődik a receptorhoz konformáció változás, hsp90 leválik, NLS szabad 3) A nukleáris transzport után a DNS-kötő domén segítségével transzkripció aktiválás a hormon által szabályozott gének bekapcsolva, génexpresszió. 1-11

12 A kromatin egy átlagos humán kromoszóma 280 Mb a haploid humán genom 3 Gb (3x10 9 bp), aminek a hossza 1 m (a sejtmag µm) (prokarióták: E. coli kromoszóma 1 mm, a sejt 1µm hossszú) x es tömörítés szükséges, hogy a kromatin elféjen a sejtmagban Egy kromoszóma DNS állományának egy része. Fehérjementesített preparátum EM képe. Egyetlen kígyózó DNS-fonál alkotja. A kép alsó részén a fehérjékből álló vázszerkezet maradványa a scaffold látható. 1-12

13 A kromoszóma metafázisban citogenetikailag jellegzetes szerkezet, protein-dns komplexek fele-fele arányban a két alkotó A kromatin fehérjék hiszton és nonhiszton fehérjékre oszthatók. Legnagyobb mennyiségben minden eukarióta sejtmagban a hiszton fehérjék vannak. A hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt fő típusuk van: H1, H2a, H2b, H3, H4 mindegyik gazdag pozitív töltésű, bázikus aminosavakban (Arg=R, Lys=K, His=H), melyek szoros kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött DNS-sel (foszfát csoport). Erősen konzerválódott aminosavsorrend: tengerisün H3 1 AS eltérés szarvasmarha H3 4 AS eltérés borsó H3 1-13

14 A nukleoszóma Alacsony sókoncentrációnál és Mg ++ hiányában a kromatin 10 nm vastag fonalként izolálható, amelyen gyöngyszerű képletek, nukleoszómák vannak. Ezekre tekeredik fel a DNS (2 fordulat, 146 bp). Két nukleoszóma között szabadon lévő kapcsló v. linker DNS található (20-60 bp). A 10 és a 30 nm vastag szál EM képe. Egy nukleoszóma 2-2 molekula H2a, H2b, H3 és H4 hisztont tartalmaz, amelyek egyenként kb. 100 AS hosszúak. N-terminális szabad farok, Lys aminosavak amino csoportjai kölcsönhatásban a két nukleoszóma közötti linker DNS-sel. Acetiláció (+) töltés megszűnik, csomagolás lazul Metiláció (+) töltés stabilizálódik, mert gátolja az acetilációt, kompakt szerkezet marad. Az Arg aminosavak szintén metilálódhatnak A Ser, Thr pedig foszforilálódhat (P), ezzel negatív töltések keletkeznek a hisztonokon, így a kromatin struktúra fellazul. A hisztonok és a DNS között létrejövő, nem szekvencia-specifikus H-híd kötések tovább stabilizálják a kapcsolatot. 1-14

15 A nukleoszómákra feltekeredett kromatin szerkezetet nemcsak a H2-H4 hisztonok N-terminális része, hanem a H1 hiszton is segít egymáshoz rögzíteni. Ez kb. 200 AS hosszú, és egy molekula kapcsolódik minden nukleoszómához. A 30 nm vastag szál egy fehérje vázhoz (szkaffold) kapcsolódik, további hurkokba rendeződve. A szkaffold természete még kevéssé ismert. A hurkokba rendezett szál 300 nm vastag és tovább tömörödik egy kb 700 nm vastagságú tekercsben. A metafázisos kromoszómát két, erősen feltekercselt DNS kettős spirál alkotja, amelyek osztódáskor a két utódsejtbe kerülnek. A hisztonfehérjék N-terminális farok részének módoításai szabják meg a kromatin állapotát. Specifikus fehérjék kötődhetnek ezekhez a részekhez, amelyek a bromo domén vagy kromo domén segítségével ismerik fel az egyes szakaszokat. Bromo domén: acetilált hiszton farok felismerése, kapcsolat hiszton acetil-transzferázokkal és deacetiláz enzimekkel Kromo domén: metilált hiszton farok felismerése hiszton metil-transzferázok és demetilázok A bromo ill kromo domén megjelenik transzkripciót szabályozó ill. kromatin szerkezetet befolyásoló más fehérjéken is. 1-15