Izomdystrophiak genetikai háttere és terápiás lehetőségük

Átírás

1 Izmdystrphiak genetikai háttere és terápiás lehetőségük Dr. Karcagi Vernika, dr. Pikó Henriett, dr. Nagvmihály Marianna, dr. Garami Márta, dr. Herczegfalvi Ágnes, dr. Tímár László Országs Környezetegészségügyi Intézet Mlekuláris Genetikai és Diagnsztikai Osztály, Budapest, MRE Bethesda Gyermekkórház Neurlógiai Osztály, Budapest, OGYEI, Genetikai Tanácsadó, Budapest Duchenne/Becker izmdystrphia (DMD/BMD) Altaláns jellemzők A Duchenne/Becker típusú izmdystrphia X krmszómáhz kötött recesszív öröklődésmenetü betegség, előfrdulási gyakrisága: DMD esetében 1/3500; BMD esetében 1/ A DMD betegségre súlys, krai halállal járó fentípus jellemző, míg a BMD betegség tünetei enyhébbek, nincs krai halál. A dystrphin gén (Xp21) 2,5 Mb méretű, 79 exnt tartalmaz, 8 prmóter régióval, a mrns 14 kb hsszúságú. A géntermék a dystrphin fehérje (427 kda), a sarclemmális elhelyezkedésű dystrphin asszciált fehérje kmplex legfntsabb tagja. A fehérje kmplex feladata az izmmembrán stabilitásának biztsítása a kntrakció ill. relaxáció srán. A betegség kialakulásában szerepet játszó géndefektusk Deléciók (60%), ht-spt régiókban a gén prximális (ex02-exl0) és a középső(ex44-ex52)részén. Duplikációk (5-8%). Pntmutációk(30-35%). Minden harmadik esetben új mutáció alakul ki; aznban germiná1 is/szmatikus mzaiksság lehetséges. A két eltérő fentípus hátterében az ún. frame-shift elmélet áll: in frame" mutáció (a mrns lelvasási kerete nem tlódik el) BMD fentípust eredményez ut f frame" mutáció (a lelvasási keret eltlódik, így értelmetlen fehérje keletkezik), DMD fentípust kz 73

2 о pntmutációk esetén a stpkdn DMD fentípust eredményez Célkitűzéseink a) A DMD/BMD betegséggel érintett fiú/férfi betegek mutációs analízise, exn deléciók lkalizációja, mérete és gyakriságának elemzése a vizsgált magyar ppulációban b) Hrdzóság szűrés a betegséggel érintett családk női hzzátartzóiban c) Prenatális vizsgálatk felajánlása az érintett családkban Alkalmaztt vizsgálati módszerek a) Multiplex PCR reakció: 2 X 9 exn egyidejű vizsgálata b) Suthern blt analízis: cdns próbákkal (XJ10, 7b8, 30.2, 30.1, 47.4, 60.1) сj MLPA (multiplex ligáció függő próba amplifíkálás) о deléciók, duplikációk és biznys pntmutációk kimutatására alkalmas, valamint kvantitatív hrdzósági analízisre о kis mennyiségű DNS elegendő ( ng); о gyrs analízis (3-4 nap) о a DMD/BMD betegségnél a teljes dystrphin gén (79 exn) vizsgálható 1. ábra. Multiplex PCR reakció: A 42. és 38. minta pzitív, míg a 41. és 39. beteg mintájában nem találtuk meg a gyakri deléciókat 74

3 2. ábra. Suthern blt analízis hrdzóság szűrésre; 7b8 cdns próbával történő hibrídizálás: 107/3 beteg édesanyja (107/2) hrdzza a dystrphin gén e48- e51 delécióját PCRpi u^navaina Y Minta DNS3'~ UnivMiiBi prirn^ Minta 0NS3' Hibridizációs szekvencia ijwjjjjj(iijllul hllhujlr~ * 3. ábra. Az MLPA analízis flyamata PCR primer stefev«nci»x Töltelék szekvencia Hibridizációs ttekvwicia Minta DNS danaturaiáaa, majd MLPA i raba hibrídizálás ^ Unni i X ""S ^ " B"«in Ligálás, majd PCR reakció, p r m«ib.pri»,r sfra^k - Umverzálu^* < I PCR tennék mer«t"»zerln?l szétválasztása kapillár elaktrfrézissal B "nn PCR *> tarméln 75

4 A G M s T X T. t x t 1.4 T 4 1 a s ec CLI 0.6 <1.4 * \ í II 02 i S Pt i! * 4. ábra. Dystrphin gén ex45-ex46 deléció detektálása fiú betegben 35bet_195_3AGMsTXT.txt, MM Mapviaw Lcatin 5. ábra. Dystrphin gén ex51-ex55 duplikáció detektálása fiú betegben

5 Eredmények a) Fiú/férfi betegek dystrphin gén analízise Az MLPA vizsgálat bevezetésével kaptt eredményeink a következők: V \ f \ Duplikációk: A 66.7'J/:-ban igazlt betegek 7,5%-ában a mutáció nem igazlt detektálhatóak. Ritka deléciók: 1_ 67,8 %*«r> deléciók 6,7%-ban.nagy ex22-ex41; ex30, a majr ht-spt deleciók" ex32, exől, ex61(ex44-ex52) régióban (mindkét ht-spt réglöt érintő) ex64 kimutatása Feherle analízis: csak MLPA-val 8 minta vizsgálata 5 esetben hiányztt a vált lehetővé. 17,8%-ban deléciók dystrphin feherje a minr ht-ipt Pntmutáció: (ex02-ex10) régióban Ebből 4 esetben MLPA Egy ikerpár esetéanalízissel igazlódtt a mutáció ben, 4147C>T; 5,5%-ban déléclók a Glnl383Stp mutáht-spt ció, egy másik beréglókn kívül tegben egy exn deléció detektálása MLPA-val, ezt követő DNS szekvenálás igazlta, hgy valójában pntmutációvan jelen. Teljes dystrphin gén deléció: két beteg esetében. Flyamats géndeléciós szindrómát mutattunk ki, a szmszéds gének deléciója is igazlódtt (AR_X;IL1 RAP11, NR0B1, GK, RPGR gének). / N 149 DMDíBMD flu/ferfl beteg vizsgálata l b) Hrdzóság szűrés női hzzátartzókban 93 női hzzátartzó vizsgálata 28 esetben hrdzósági analízis érintett fiú/férfi / hzzátartzó D N S rpintój«igazlt hrdzósági státusz: nélkül, MLPA módszerrel 42 (45 %) esetben édesanya 31 f (74 * ), leánytesvér 11 f ő (26 %) 55 %-ban a hrdzósági státusz nem igazlódtt Z duplikációs, 3 manifcszt hrdzóság (egy esetben de nv manifcszt hrdzóság) c) Prenatális analízisek eredményei 16 eset, 10 fiú magzatból 3 beteg magzatt detektáltunk. 77

6 Spinalis izmatrphia (SMA) A betegség klinikai háttere A spinalis izmatrphia a másdik leggyakribb autszmális recesszíven öröklődő betegség, előfrdulási gyakrisága 1/6000. A hyptniával, denervációval, izmbénulással járó tüneteket a gerincvelői amtneurnk fkzats pusztulása kzza. A hrdzósági gyakriság a nrmál ppulációban magas, 1/35. A betegségnek 5 különböző súlysságú fentípus csprtját különböztetjük meg: cngenitalis frma, SMA 0 halál<4 hó Werdnig-Hfímann kór, SMA I kezdet<6 hó, halál<18 hó, nem ül Fried-Emery, SMA II kezdet<18 hó, halál>2 év, nem jár Kugeiberg Welander, SMA III kezdet>18 hó, halál felnőttkrban, jár felnőttkri frma, SMA IV kezdet>30 év, nrmális élettartam Az SMA betegség genetikai háttere SMA determináns gén az SMN (survival mtr neurn) gén, az 5ql3 lókuszban helyezkedik el, egy inverz duplikációban lévő 500 kb-s elemben. Ez az SMN, NAIP és a p44 gének hmlóg kópiáit tartalmazza. A betegség mutációs spektruma visznylag szük, az SMN1 exn7 (és exn8) deléció a betegek >95%-ában megtalálható, míg 5%-uk összetett heterzigótának biznyult (deléció, valamint pntmutáció). S M A regin C*ntrm«ríe cpy ynajp T»lm*ric cpy \ BCD Mb 6. ábra. Az SMA regin sematikus felépítése 78 / SMN NAIP pj4

7 Az SMN gének és a prtein funkciója SMN1 gén 294 as-ból álló, 38 kd fehérjét kódl, 9 exn. SMN2 gén 5 nukletid különbség, alternatív splicing? exn 5 és 7 skipping? csak 20% teljes hsszúságú fehérje. SMN2 gén a betegekben mindig jelen van, kntrll egyének 5%-ában hiányzik. Génknverzió? SMN2 gén kópiaszáma megnő. A hárm súlyssági frma kialakításáért felelős? minél magasabb az SMN2 gén kópiaszáma, annál enyhébb a fentípus. Prtein funkció az mrns metablizmusban, splicingban. Ubiquiter fehérje, de a mtneurnkban kitüntetett szerepe van (axn növekedési kúpban kncentrálódik). Anti-appttikus funkció? neurn-specifikus gének regulációja? Genetikai szűrővizsgálatk a) Direkt mutáció analízis: PCR és RFLP technika; az SMN1 gén 7. és 8. exn deléció kimutatására alkalmas. Hmzigóta deléció esetén a betegség mlekuláris diagnózisa igazlt. Heterzigóta állapt kimutatására (hrdzóság szűrésre) nem alkalmazható. b) Hapltípus analízis: 5 q l 3 régióban az SMN génhez közeli plimrf mikrszatellita markerek vizsgálatán alapul. Elsősrban prenatális diagnsztika esetében alkalmazzuk. cj Kvantitatív real-time PCR az SMN1 és SMN2 kópiaszám meghatárzására. A kvantitatív real-time PCR az alábbi vizsgálatkra alkalmazható: Hrdzóság szűrés: SMNl kópiaszám alapján. Fentípus előrejelzése: SMN2 kópiaszám alapján Cmpund heterzigóták aznsítása (delé-ció/egyéb mutáció). A módszer krlátai (93,5%-s szenzitivitás): az egyének 4%-ában egyik krmszómán több SMNl kópia van jelen; ebben az esetben a hrdzót nem aznsítja. az intragenikus mutációt hrdzót nem aznsítja. 7. ábra. SMNl és SMN2 exn 7. és exn 8. mutáció analízise. 133/3 minta hmzigóta deléeiót mutat 79

8 í. ábra. SMN1 gén exn 7. real-time PCR amplifíkációs görbéje, valamint az lvadási hőmérséklet csúcsk SMNI exn 7. és a referencia albumin gén esetében Hazai spinalis izmatrphia családk 265 családban genetikailag igazltuk a betegséget. Ezek fentipuss megszlása a következő: SMA I. típus 136, SMA II: típus 62, SMA III. típus 67, biznytalan 75. Kiemelve 17 összetett heterzigóta. Prenatális vizsgálatk 1993 óta 182 esetben végeztünk (SMA I: 141, SMA II: 34, SMA 111:7); ennek eredménye 132 egészséges, 50 beteg magzat. Neurmusculáris betegségek (NMD) és terápiás lehetőségük Jelenleg gyógyíthatatlan betegségcsprt, de terápiás módszerek kidlgzás alatt állnak. Egyénenként ritka betegségcsprt (<5/10,000) szükséges egy európai betegadatbázis létrehzása, a klinikai kipróbálás összehanglásáhz. A TREAT-NMD knzrcium struktúrája EU FP6 által támgattt prjekt, periódusban. Partnerei: 11 európai rszág, 21 partner (klinikusk, kutatók, betegszervezetek, gyógyszer-, bitechnlógiai cégek). A knzrcium célja: öröklődő neurmusculáris betegségek, elsősrban (SMA, DMD) terápiájának kidlgzása és a klinikai kipróbálás európai összehanglása. 16 munkacsprtból áll (állatés sejtszintü mdellek, mlekuláris diagnsztika fejlesztése, áplás standardizálása, betegek felkutatása, terápia - txiklógia, szisztémás bejuttatás, multicentrums klinikai kipróbálás, etika). Az OKI feladata: kelet-európai SMA és DMD beteg-adat bázis létrehzása a pnts genetikai diagnózis birtkában. Az adatbázis létrehzásáhz a betegeknek beleegyező nyilatkzatt, valamint a következő DMD/BMD ill. SMA klinikai kérdőívet küldjük ki: Kötelező adatk beteg személyes adatai (név, lakcím, TAJ szám, stb.) mi az rvsa által felállíttt diagnózis? mi a beteg genetikai tesztjének eredménye? 80

9 jelenlegi legjbb mtrs teljesítmény ha a beteg 3 éves vagy annál idősebb, használ-e tlószéket? jelenleg szed a beteg szteridkat izmdystrphiára? vlt-e a betegnek műtéte sclisis (gerincferdülés) miatt? fkzttan ajánltt adatk: vlt a beteg családjában valakinek hasnló betegsége? diagnsztizáltak-e a betegnél cardimypathiát? kap-e a beteg jelenleg gyógyszeres kezelést a szívére? használ-e rendszeresen nem-invazív lélegeztető készüléket? használ-e a beteg invazív lélegeztetést? regisztrálva van-e a beteg más DMD beteg-adatbázisban? vlt-e a betegnek izmbipsziája? 9. ábra. Harmnizált, tartós és releváns bibankk és beteg-adatházisk létrehzása Terápiás lehetőségek Támgató: rtpédiai, légzés. Megelőző: genetikai tanácsadás, prenatális vizsgálat, preimplantációs genetika, egyéb. Gyógyító: farmaklógiai (sérült fehérje külső bejuttatása, funkcinálisan rkn fehérje fkzása vagy közvetve izm degeneráció gátlása), sejt-terápia (embrinális ill. szöveti őssejtek), génterápia (transzgén bejuttatása különböző módn). Terápiás eljárásk DMD betegség esetében Gén transzfer Az egészséges dystrphin gén bevitele a sejtbe vektr segítségével, amely lehet: virus-mediált: Hátránya, hgy erős immunválaszt indukálhat, valamint, hgy krlátztt kiónzó kapacitással rendelkezik. Jelenleg 81

10 a legjbb vectr az aden-assciated virus (AAV): csökkent immunválasz, mini-dystrphin gén bevitele lehetséges, amely BMD fentípussá módsíthatja a DMD fentipust nem virus-mediált: Plazmid DNS. Nincs immunválasz a plazmid és az új dystrphin fehérje ellen. Jelnleg elért legjbb hatásfk: az izmrstk 10%-ába épült be a transzgén celluláris transzfer: Myblast transzfer: A dnr izm prekurzr sejtek (myblastk) bejuttatása a beteg izmba. Hátránya, hgy immunválasz alakul ki a dnr myblastk ellen őssejtek (szatellita sejtek, mesangiblastk, embrinális őssejtek). Pótlhatják az elpusztult izmt. Gén repair Antiszenz lignukletidk (AON): exn-skipping (biznys exnk átugrása) történik mesterséges ribnukletidkkal, amely lelvasási keret eltlást eredményez, így BMD fentípus alakítható ki a DMD helyett. Kmpenzáló fehérjék túltermeltetése Utrphin: 80% hasnlóság a dystrphin fehérjével, így képes átvenni a dystrphin szerepét. Bevitel az izmba vírus vektrral történhet. Gyógyszeres kezelés Stp kdn átugrás. Aminsav beépítése a stp kód helyére. Szóbajöhető szerek: Gentamicin (txikus), Negamicin, valamint a PTC 124 nevű vegyület, amely kipróbálás alatt van. Lehetséges még az 1GF-1 (inzulinszerü növekedési faktr) fkzása is. Sejtdifferenciáció szabályzás. Mystatin gátlás. Gátlja az izm szatellita sejtjeinek sztódását. Gátlásával (fllisztatin) mdx egérben növekedett az izmtömeg és az izmerő. Glükkrtikidk/szteridk Prednisln: Lassítja a betegség prgresszióját, aznban sk mellékhatása van. Deflazacrt: Kevésbe súlys mellékhatásk. Megnövekedett tüdőfúnkció, növeli az utrphin termelést is. növekedést faktrk: izmtömeg növelésre kalcium hmesztázis fenntartása prteáz gátlók: szójabab kivnat Étrend kiegészítők: aminsavak, karnitin, kreatin, antixidánsk (kenzim Q10, zöldtea kivnat - Prtandim).

11 Terápia SMA betegségben Gén módsítás: SMN2 génből teljes hsszúságú-smn fehérje lelvasására, mrns kivágását módsító vegyületek. Prmter aktiváló és SMN2 transzkripciót fkzó hisztn deacetiláz gátlók. Nem az SMN gén módsítása SMN fehérje kmplex egyéb tagjainak fkzása trfikus faktrk a mtneurnk működésében neurprtektív, neurtrfikus vegyületek a sejtpusztulás megakadályzására: riluzle, Carditrphin-1 (IL-6 cytkine család tagja) trphs: mitchndriális permeabilitás átmeneti membrán pórus (mptp) funkciójának javítása Lentivirus gén-transzfer (SMA egérben ill. SMA fíbrblasztkban működik). Olignukletidk: 7. exnhz kapcslódnak, ún. splicing faktrkat vnzanak. Kis fragmens hmlóg kicserélés (SHFR) - T>C báziscsere az SMN2. Exnban teljes hsszúságú fehérje előállítására. Őssejtterápia - prblémák őssejtek differenciációja a megfelelő sejttípussá gerincvelőből kilépés és izmkntaktus kialakítása embrinális őssejtek tumrképződést indukálhatnak Összefglalás Neurmuscularis betegségek ritka betegségek - fnts, hgy a klinikai kipróbálás kritériumainak eleget tevő betegek Európa-szerte elérhetőek legyenek Krszerű terápiás eljárásk kidlgzása, majd kipróbálása a betegségek gyógyítása érdekében Elsődleges feladat: nemzeti adatbázisk létrehzása, európai ill. glbális adatbázisba összegzés Klinikusk és betegszervezetek bevnása elsődleges fntsságú Hatékny kezelés lehetősége, európailag összehanglt, standardizált prtkll szerint történik majd meg Betegek részvétele önkéntes (adatbázis, klinikai kipróbálás) EU FP6 által támgattt TREAT-NMD knzrcium segítségével valósulnak meg a célk Elérhetőség: 83