A SEJTKÖZÖTTI ÁLLOMÁNY SZEREPE A SZARUHÁRTYA SEBGYÓGYULÁSÁBAN

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Klinikai Orvostudományok, Szemészet program Iskolavezető: Tulassay Zsolt egyetemi tanár Programvezető és témavezető: Süveges Ildikó egyetemi tanár A SEJTKÖZÖTTI ÁLLOMÁNY SZEREPE A SZARUHÁRTYA SEBGYÓGYULÁSÁBAN DOKTORI ÉRTEKEZÉS Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Szemészeti Klinika Tömő utca Budapest 2006.

TARTALOM 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...4 2. BEVEZETÉS...5 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...6 3.1. A szaruhártya sejtközötti állománya...6 3.1.1. Alkotóelemek...6 3.1.2. A sejtközötti állomány a szaruhártya degeneratív elváltozásaiban...7 3.1.3. Transzparencia és oedema...8 3.2. Szemműtétek hatása a szaruhártyára...9 3.2.1. Szürkehályog műtétek hatása a szaruhártyára...9 3.2.2. Refraktív műtétek hatása a szaruhártyára... 10 3.3. A szaruhártya ECM vizsgálati lehetőségei.... 11 3.3.1. A szaruhártya felszínének vizsgálata (Cornea topográfia)... 11 3.3.2. A szaruhártya vastagságának mérése (Pachymetria)... 12 3.3.3. A szaruhártya belső szerkezetének vizsgálata... 12 4. CÉLKITŰZÉSEK... 15 4.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után... 15 4.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon).... 15 4.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet).... 16 5. MÓDSZEREK... 17 5.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után... 17 5.1.1. Esetbemutatás... 17 5.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány... 19 5.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon).... 20 5.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet).... 25 6. EREDMÉNYEK... 31 6.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után... 31 6.1.1. Esetbemutatás... 31 6.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány... 32 6.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon).... 37 6.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet).... 41 6.3.1. A sejtközötti állomány változásai... 41 6.3.2. Celluláris változások... 45-2 -

7. MEGBESZÉLÉS... 52 7.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után... 52 7.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon).... 57 7.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet).... 59 8. ÚJ EREDMÉNYEK ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGÜK... 65 9. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS... 66 10. IRODALOM... 67 11. ÖSSZEFOGLALÓ... 79 12. SUMMARY... 80 13. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE... 81 13.1. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények... 81 13.4. Egyéb idézhető absztrakt... 83 13.5. Az értekezés témájában elhangzott előadások, poszterek... 84 13.6. Egyéb előadások, poszterek... 85 13.7. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai... 86-3 -

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ANOVA variancia analízis (analysis of variances) CCT központi cornea vastagság (central corneal thickness) CST központi stroma vastagság (central stromal thickness) DAPI diamino phenylindrol dihydro chlorid Dcyl keratometriás / corneális astigmia (cilindrikus dioptria) ECM extracelluláris matrix = sejtközötti állomány GAG glükózaminoglikán HE Hematoxylin-eozin LASIK Laser in situ keratomileusis KS keratán szulfát OCT optikai koherencia tomográfia (optical coherence tomography) PAS perjódsav-schiff (periodic acid Schiff) PCL hátsó csarnok műlencse (posterior chamber lens) PCNA proliferáló sejtmag antitest (proliferating cell nuclear antibody) PG proteoglikán PMN polymorphonukleáris granulocyta PRK fotorefraktív keratectomia (photorefractive keratectomy) PVA potenciális látóélesség (potential visual acuity) SAI felszíni aszimmetria index (surface asymmetry index) SIA sebészileg indukált astigmia (surgically induced astigmatism) Sim K szimulált keratometriás értékek (simulated keratometric values) SRI felszíni szabályosság index (surface regularity index) TUNEL terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dutp-digoxigenin nickend labelling UBM ultrahang biomikroszkóp - 4 -

2. BEVEZETÉS A szaruhártya átlátszóságának és a törőerő fenntartásának feltétele a sejtek és a sejtközötti állomány szabályos elrendeződése. A szaruhártya sebgyógyulása avasculáris, bradytrop, sejtszegény helyzetéből adódóan különbözik a szervezet többi szövetétől. A sebgyógyulás célja az átlátszóság helyreállítása. A transzparencia fenntartásában elengedhetetlen a szaruhártya relatív dehidrált állapota, amelyet az epithelium épsége, a sejtközötti állomány vízkötő képessége és az endothelium aktív pumpafunkciója biztosítanak. Amennyiben a szaruhártya átlátszó, víztartalma a sejtközötti állományhoz, vagy más néven extracelluláris mátrixhoz (ECM) kötött. A szaruhártya keratocytái biztosítják, hogy az ECM összetétele viszonylag állandó legyen, így a szaruhártya átlátszó maradjon. Az ECM fő alkotóelemei a szabályos elrendeződésű kollagén rostok és a köztük egyenlő távolságot biztosító proteoglikánok. A proteoglikánokat polipeptid lánchoz kapcsolódó glükózaminoglikánok (GAG) alkotják, amelyek diszacharid alegységekből épülnek fel. A szaruhártya GAG egyik legfontosabb diszacharid alkotóeleme a keratán szulfát (KS). Az ECM kollagén és proteoglikánok mellett többek között lipideket is tartalmaz. Az ECM összetétele megváltozhat degeneratív folyamatok során és a corneán végzet sebészeti beavatkozások hatására. A szaruhártya degeneratív folyamataiban a sejtközötti állomány összetétele megváltozik, amely a transzparencia csökkenésével jár. A 60 év feletti életkorban leggyakoribb cornea degeneráció az arcus lipoides (más néven arcus senilis vagy gerontoxon), mely esetén a lipid tartalom megemelkedik, a szaruhártya stromában az extracelluláris térben koleszterinből, foszfolipidből és trigliceridből felépülő depositumok jelennek meg. Az extracelluláris mátrix változása és benne idegen anyagok lerakódása a sebgyógyulást befolyásolja, amely szürkehályog műtét során készített cornea sebek esetében is nyomon követhető. Az ép szaruhártya sérülés, vagy refraktív beavatkozás (fotorefraktív keratektomia - PRK, Laser in situ keratomileusis - LASIK) hatására integritását átmenetileg elveszti, amely a sejtközötti állomány - esetenként klinikailag is észlelhető - biokémiai változását - 5 -

eredményezi. A sejtközötti állomány biokémiai változásai a dehidráció csökkenésével járnak, a szaruhártya víztartalma megnövekszik, amely a szaruhártya vastagságának növekedését és egyben borússágát vonja maga után. 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. A szaruhártya sejtközötti állománya 3.1.1. Alkotóelemek A szaruhártya többszörös funkciót lát el egyszerre a látásban. Átlátszósága és a megfelelő fénytörés elengedhetetlen az éles látás biztosításában. Ugyanakkor kellően ellenállónak kell lennie a külső fizikai, kémiai és biológiai behatásokkal szemben. A szaruhártya határoló rétegei, az epithelium és az endothelium kivételével kevés sejtet tartalmaz. A stroma térfogatának mindössze 10%-át képezik a sejtes elemek, míg 90%-át a sejtközötti állomány alkotja. A sejtközötti állomány alkotóelemeinek szabályos elrendeződése teszi lehetővé, hogy a fenti szerepeknek eleget tehessen. (7). A humán szaruhártya 78%-át víz alkotja (10) és 22%-a szárazanyag (113). A kollagén (elsősorban I. típus) mellett a szárazanyag 4-5 %-át a proteoglikánok képezik. A proteoglikánokat polypeptid lánchoz kovalens kötéssel kapcsolódó hosszú, glükózaminoglikánok (GAG) alkotják. A GAG-ot korábban mukopolyszacharidnak nevezték, később nevüket a szénhidrát oldalláncuk alapján kapták (105). Szabályos elrendeződésük révén a 30 nm (26) átmérőjű kollagén rostok közötti egyenlő távolságot (42-44 nm) tartják fent és biztosítják a transzparenciát (12,13,63,64,68,78,79). A GAG a szervezet egyes szöveteiben más-más összetevőkből áll, a szaruhártyában a keratán szulfát (KS) van jelen a legnagyobb arányban. A KS heteropoliszacharid, amely N-acetyl glükózamin, galaktózamin és szulfát csoportokból épül fel (1. ábra). Élettani körülmények között a KS a kollagén rostok között a nyúl és a humán szaruhártyában egyaránt előfordul lamelláris elrendeződésben (15). Eloszlására - 6 -

jellemző, hogy főleg a stroma hátsó részében fordul elő és mennyisége fokozatosan csökken az elülső stroma és a limbus felé (10,22). Az ép stroma anyagcseréje lassú (un. bradytrop), amelyet a más kötőszövetekhez képest kis sűrűségű keratocyták végeznek. A keratocyták az ép corneában nyugvó állapotban vannak, így az ECM összetétele is viszonylag állandó. A könnyfilm és az epithelium a külvilágtól, az endothelium a csarnokvíztől határolja el. A keratocyták biokémiai sajátosságát és fenotipusát ugyanakkor az ECM szabályozza, így a keratocyták és az ECM közöttt szoros kölcsönhatás áll fenn. 1. ábra. A glülózaminoglikán (GAG) kémiai szerkezete sematikus ábra. A. Az extracelluláris mátrixban a kollagén molekulákkal (nyíl) proteoglikán komplexeket képeznek a proteoglikánok (zöld keretben). B. Az A. ábrán zöld keretben ábrázolt proteoglikán core proteinhez kapcsolódó GAG-okból épül fel (keratán- és kondroitin szulfát). C. A B. ábrán piros színnel jelzett oldalláncok kémiai szerkezete (a GAG fő típusai) a keratán szulfát és rokon molekulái. A kék oldalláncok felelősek a GAG negatív töltéséért (www.webanatomy.net alapján) 3.1.2. A sejtközötti állomány a szaruhártya degeneratív elváltozásaiban A szaruhártya degeneratív folyamataiban a sejtközötti állomány összetétele megváltozik, amely a transzparencia csökkenésével jár (114). A kóros összetétel vagy a fiziológiás körülmények között jelenlévő anyagok felszaporodásából, vagy új anyagok lerakódásából adódhat. A depositumok lehetnek a keratocyták kóros anyagcseréjének - 7 -

termékei, vagy származhatnak a limbus érrendszeréből. Jelen munkában a lipidek lerakódásának következményeit vizsgáltuk. A lipid molekulák számos betegségben szaporodnak fel a szaruhártyában (4,109). A lerakódás lehet primér folyamat (110,117) vagy másodlagos elváltozás. Arcus lipoides. Az arcus lipoides elnevezés a szaruhártya azon degeneratív elváltozásait foglalja össze, amelyek során a limbushoz közel, de a limbust szabadon hagyva a cornea stroma és a Descemet-membrán határáról kiindulva az extracelluláris térben koleszterinből, foszfolipidből és trigliceridből felépülő depositumok (18) szaporodnak fel a stromában, amely szabad szemmel is látható gyűrű alakú sárgás-fehér homályok formájában jelentkezik. Az elváltozás a főleg időskorban jelentkezik, így arcus senilis és gerontoxon nevekkel is illetik, jóllehet pathológiai szempontból legpontosabb az arcus lipoides elnevezés (24), így e dolgozatban utóbbit használtuk. A 60 év feletti életkorban a leggyakoribb cornea degeneráció (17,75) és a két szemet általában együttesen érinti, bár a két oldal között az előrehaladottság stádiumában lehet különbség (94). Canton (11) 1863-ban már megemlíti, hogy ritkán csak az egyik szemen jelentkezik a szaruhártyában homály, elsősorban interstitialis keratitist követő fokozott ereződésből fakadó aszimmetriával magyarázta a féloldali arcus lipoides kialakulását. 3.1.3. Transzparencia és oedema A stromában található GAG többszörös anionos részei révén vizet köt meg (1. ábra), amely a szaruhártya ozmotikus elven működő ún. imbibációs nyomását tartja fenn. A szaruhártya hidratációját (3,5 g H2O / g szárazanyag ) a szem belnyomása és az stroma imbibációs nyomása (kb. 55 Hgmm) szabályozza (26). A stroma víztartalmát azonban nagyban csökkenti az epithelium fizikai barrierként és az endothelium aktív pumpafunkciója révén (3). Kísérletes modellben a teljes epithelium eltávolítása után a szaruhártya a stroma vastagsága kétszeresére, míg az endothelium eltávolítása után ötszörösére növekszik (47,62). A szaruhártya víztartalmának növekedése a térfogat növekedéssel arányos. A szaruhártya térfogatnövekedése a vastagság növekedésben nyílvánul meg. A vastagság növekedése az interfibrilláris távolság egyenetlen növekedésével jár együtt, amely a szaruhártya transzparenciáját csökkenti (20,62,66). A vastagságváltozás mérésével - 8 -

következtethetünk a szaruhártya víztartalmára. A szaruhártya kötött víztartalma az ECM változásakor (főleg a szulfatáció növekedésekor) módosul, amely szaruhártya homályok kialakulásához vezet. Az ECM szabályosságának megbomlása és összetevőinek mennyiségi és biokémiai átalakulása lehet dystrophia és degeneráció következménye és létrejöhet a sérülésre adott válaszreakcióként a sebgyógyulás részjelenségeként is (20). A refraktív kezelések után jelentkező subepitheliális homályok kialakulásában a kóros ECM összetétel és elrendeződés játszik szerepet (22). 3.2. Szemműtétek hatása a szaruhártyára A szaruhártyán végzett sebészi beavatkozások egy része a szaruhártya kórfolyamat kezelése céljából indikált (pl. perforáló vagy lamelláris keratoplasztika, fototerápiás keratectomia), más része a szaruhártya fénytörésének megváltoztatását célozza (refraktív műtétek), harmadrészt a szem más betegségeinek (pl. szürkehályog) műtéte során a szaruhártya mint a behatolás helyszíne vesz részt (57,93). 3.2.1. Szürkehályog műtétek hatása a szaruhártyára A szürkehályog műtét történhet sclerocorneális vagy corneális behatolásból, a seb lehet önzáró, vagy zárhatjuk varrat(ok) segítségével. Minden szürkehályog műtét előidéz valamilyen fokú corneális eredetű astigmiát, ún. sebészileg indukált astigmia Surgically induced astigmatism (SIA) alakul ki. A SIA mértéke, tengelye és a posztoperatív változása számos tényező függvénye: a seb készítés módja (93), a seb hossza (57) és alakja (93), elhelyezése és távolsága a cornea centrumától, a helye (corneális vagy corneosclerális) és helyzete (superior, temporális, nasalis, superonasalis, stb.). A varratok legtöbb esetben a SIA növekedésével járnak (128). A legkisebb SIA-t a kis méretű superior elhelyezésű corneális seb készítés idéz elő (67). A SIA nagymértékben függ a sebgyógyulástól, amelyet az ECM mellett a sebkészítés határoz meg. A cornea degeneratív elváltozásaiban az ECM összetétele megváltozik, amely így a sebgyógyulásra is hatással van és ezáltal a sebészileg indukált astigmiát is befolyásolja (107). A SIA pathomechanizsmusának pontos ismeretével megvalósítható az un. refraktív - 9 -

phakoemulzifikáció, amely során a sebkészítés helyének megválasztásával és a limbusban elhelyezett relaxációs bemetszésekkel a SIA minimalizálható (126) 3.2.2. Refraktív műtétek hatása a szaruhártyára A szaruhártya fénytörését kívánt módon változtatva a szem egészének törőereje emmetropiássá alakítható. A szaruhártya fénytörését változtató műtéteket refraktív bevatkozásoknak nevezzük, amelyre számos technikát fejlesztettek ki, és finomítása a jelenben is kiterjedt kutatás tárgya (16,21,65,85). Pontossága révén a szaruhártya alakjának megváltoztatására alkalmas módszerek közül az excimer lézerrel végzett fotorefraktív kezelések terjedtek el leginkább, hazánkban is már több mint tíz éve alkalmazzuk (90). A különböző fotorefraktív technikákban közös, hogy a szaruhártya stromából távolítunk el adott alakú és vastagságú szövetréteget (fotoabláció), így módosítva a szaruhártya egészének dioptria értékét. A szaruhártya stromához több módon férhetünk hozzá. Fotorefraktív keratectomia (PRK) során a fotoablációt az epithelium mechanikus eltávolítása előzi meg. LASIK esetében az epitheliumot egy elülső stroma lebennyel együtt felhajtjuk, majd a fotoabláció elvégzése után visszahajtjuk a helyére (97). A műtéti technika a sebgyógyulásban is eltérésekkel jár, a LASIK kisebb szöveti reakiót vált ki (23,69,86). A refraktív műtétek utáni sebgyógyulás első fázisa az epithelium regenerációja (6,101). Az epithelium proliferációja és migrációja során kezdetben egy rétegben fedi a szaruhártya felszínét. Az epithelium hiánya és a reepithelizáció számos olyan cytokin képződését váltja ki, amely a szaruhártya mélyebb rétegeiben, elsősorban a stroma elülső részében kaszkádszerű reakciót indít el. A reakció sejtszintű és ECM változásokat foglal magába. Az epithelium proliferációja jól követhető folyamat, míg a stroma sejtállománya in vivo nehezen monitorozható. Szövettani vizsgálatok bizonyították, hogy a fotoabláció területe alatt a stromaágyban a fotoabláció után megkevesbednek a keratocyták, ugyanakkor felszaporodnak a gyulladásos sejtek (95), elsősorban a polymorphonukleáris granulocyták (PMN). A keratocyták megkevesbedésének hátterében az apoptosis szerepe ismert (74,82-84), azonban annak pontos szabályozási mechanizmusai nem teljesen tisztázottak (133,134). A keratocyták később újra megjelennek az elülső stroma rétegben (29). - 10 -

A sejtszintű változásokat az ECM változásai kisérik és egyben hatással vannak a további celluláris változásokra. Az ECM változásai a refraktív beavatkozások kései szövődményeként jelentkező homályképződéshez és a refrakció eredmény romlásához vezetnek (76). 3.3. A szaruhártya ECM vizsgálati lehetőségei. A sejtközötti állomány vizsgálatára közvetlen és közvetett módszerek állnak rendelkezésre. Közvetlen vizsgálat akkor lehetséges, amennyiben a szaruhártya szövete feldolgozható, morfológiai és biokémiai sajátosságai így megismerhetők. Az ECM közvetett vizsgálatát jelentik azon in vivo klinikai vizsgálómódszerek, amelyek segítségével tanulmányozható a szaruhártya görbülete, felszíne, vastagsága. 3.3.1. A szaruhártya felszínének vizsgálata (Cornea topográfia). A szemfelszín szabályosságának kisfokú változása rontja a látóélességet. A szaruhártya elülső felszínét a könnyfilm és az epithelium mellett a cornea stroma sejtközötti mátrixa határozza meg. A szaruhártya felszínének vizsgálatára a cornea topográfia pontos és reprodukálható vizsgálómódszer (40), melynek segítségével mérhető a szaruhártya görbületi sugara és a szaruhártya törőereje, kiszámítható a keratometriás astigmia, így segítségével megítélhető a SIA is. A szaruhártya felszínére jellemző további mutatók a felszín szabályosságára (surface regularity index SRI) és szimmetriájára (surface asymmetry index SAI) vonatkoznak. A potenciális látóélesség (potential visual acuity PVA) a szemfelszín részletesebb leírásának lehetőségét nyújtja (27,91,132). Az SRI és SAI mutatók értéke nő, amennyiben a szaruhártya felszíne eltér az ideális síma felszíntől és a gömbfelszíntől. Az SRI a szaruhártya centrális részének optikai minőségét jellemzi; minél szabályosabb a felszín, annál alacsonyabb az SRI érték. Hasonlóképp, a SAI értéke annál alacsonyabb, minél szimmetrikusabb a teljes szaruhártya felszíne. A PVA a topográfiás értékekből kerül kiszámításra, és a decimális rendszerben mért visusérték formájában fejezzük ki (egészséges szem esetén 1,0); minél jobbak a topográfiás értékek, annál magasabb a PVA értéke. - 11 -

Cornea topográfiás vizsgálatokkal refraktív beavatkozások és szaruhártya átültetés után jól követhető a sebgyógyulás folyamata (56,119,120) 3.3.2. A szaruhártya vastagságának mérése (Pachymetria). A szaruhártya vastagságának mérése közvetett adatot szolgáltat a cornea víztartalmáról és az ECM szerkezetéről. Alapvetően optikai és ultrahangos módszerekkel mérhető a szaruhártya vastagsága. A méréseket legtöbbször a szaruhártya középpontján végezzük (centrális cornea vastagság central corneal thickness [CCT]). Optikai pachymetria tiszta törőközegek esetén végezhető, pontossága az ultrahangos pachymetriáéhoz hasonlatos (70). Az ultrahangos pachymetria elvégezhető kizárólag erre a célra kifejlesztett A-scan üzemű UH pachymeterrel (81), amely 10 vagy 20 MHz transzducerrel rendelkezik. A szaruhártya vastagsága ultrahang biomikroszkópiával (UBM) is mérhető 50-80 MHz transzducer alkalmazásával (52,123). Mindkét ultrahangos pachymetria kontakt módszer, továbbá az UBM vízelőtétet igényel, így intraoperatív felhasználása nem kivitelezhető. Az eltérő elven működő pachymeterek követéses vizsgálatra alkalmasnak bizonyultak, de szabadon nem helyettesíthetik egymást (116). Optikai elven (alacsony koherenciájú lézer interferometria) működik az optikai koherencia tomográf (OCT) is (30), amely non-kontakt módszerként intraoperatív vizsgálatok végzésére is alkalmas. Wirbelauer és munkatársai LASIK közben végeztek intraoperatív OCT vizsgálatokat (140-141), LASIK utáni posztopeatív vizsgálatokat Maldonado munkacsoportja végzett (60). Az OCT alkalmas a szaruhártya hidratációjának in vivo megitélésére (46), továbbá a cornea transzparenciájának mérésére is (131). Optikai elvű vizsgálóeszköz a konfokális cornea mikroszkópia, amely az OCT és UBM-hez hasonlóan a vastagságmérésen túl a szaruhártya belső szerkezetéről is in vivo szolgáltat adatokat (48-50,76). 3.3.3. A szaruhártya belső szerkezetének vizsgálata A cornea strukturájának in vivo vizsgálatára alkalmasak a pachymetriával kapcsolatosan említett klinikai vizsgálómódszerek közül az UBM, az OCT és a - 12 -

konfokális cornea mikroszkóp. Az UBM és az OCT keresztmetszeti képek készítésére alkalmas, míg a konfokális corneamikroszkóppal rétegfelvételek nyerhetők. A cornea szövete fixációtól függően számos vizsgálatnak vethető alá. A formalinos fixáció és paraffinos beágyazás mellett a transzmissziós elektron mikroszkópiához szükséges epoxy beágyazás és a fagyasztásos fixáció nyújtanak lehetőséget a celluláris és az ECM változások megfigyelésére. Immunhisztokémia segítségével nagy specificitással azonosíthatók az ECM alkotóelemei. Caterson (14) monoklonális egér ellenanyagot dolgozott ki, amelynek segítségével a keratán-szulfát (poliszacharid részéhez kapcsolódva) szelektíven kimutatható. A szaruhártya sejtjei és a sejtközötti állomány összefüggésének vizsgálatára a sejtek életfolyamatainak nyomonkövetésére is alkalmas az immunhisztokémia. Így az epithelium és a keratocyták proliferációjának, a programozott sejthalál (apoptosis) (133-136) és a gyulladásos sejtek (95) azonosítása is lehetséges. Az immunhisztokémia előnye a pontos lokalizáció lehetősége, hátránya, hogy csak szemikvantitatív értékelést tesz lehetővé. A szaruhártya sebgyógyulásának és homeostasiának pontos szabályozási lépésének számos területe még ismeretlen. Az apoptosis (programozott sejthalál) szerepét felvetették (43,53,74). Az apoptosis szerepe más cornea betegségekben, így Fuchs dystrophiában is igazolódott (121). A szaruhártya ultrastrukturális változásainak tanulmányozásában a transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) is számos információt nyújt mind a celluláris, mind az ECM változásairól (9,34). Pontos mennyiségi meghatározásra biokémiai módszerek szolgálnak (105,106). Ebben komoly nehezítő körülmény a szaruhártya kis tömege (kb 40 mg), amely sok módszernél azt vonja maga után, hogy az adott anyag kimutathatóságához legalább tíz teljes cornea együttes feldolgozására van szükség (55). További hátránya, hogy nem lokalizálható, hogy az adott anyag a szaruhártya mely rétegében halmozódott fel. Zhang (142) az ún. electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) technikával fagyasztott metszeteken mennyiségi meghatározásokaz végzett. A celluláris és ECM összefügések vizsgálatára sejttenyészet vizsgálatok használatosak (12,42). Léteznek három dimenziós kontraktilis sejt-mátrix modellek is, amelyek a cellulárisextracelluláris kölcsönhatások pontosabb leírására szolgálnak (35). - 13 -

A PRK a pontos adagolhatósága révén elterjedt modellt kínál a szaruhártya felszínes sérüléseinek nyomonkövetésére. Leggyakrabban nyúl (19,38) és majom (39) szaruhártyája használatos modell. Vizsgálatainkban nyulak kezelését végeztük, ezért szükséges szót ejtenünk az ember és a nyúl szaruhártyája közötti különbségekről (98). A nyúl szem mérete kisebb az emberénél (kb. 19 mm hosszú), de a cornea dimenziói hasonlatosak vastagság és átmérő tekintetében. A limbus és a trabeculáris rendszer felépítése eltérő. A szaruhártya felépítésében az egyetlen jelentős különbség a Bowmanmembrán hiánya, amelynek a szaruhártya stabilitásában játszott szerepét újabb ultrastrukturális vizsgálatok alapján az emberi szaruhártyában is megkérdőjelezik (137). További különbség, hogy a teljes epithelium eltávolítás után mintegy 24 órán belül teljes hámregenerációt írnak le nyúl szemekben, míg emberben ez hosszabb időt igényel. A gyors epithelizációban az epitheliális ősejtek a cornea centrumában való jelenlétét feltételezik, amelyek emberi corneában csak a limbusban helyezkednek el (103). Az ECM összetételét illetően kifejezett eltérések az emberi és a nyúl cornea között nem igazolódtak, amely az állatmodell eredményeinek emberi szövetre való értelmezését elősegíti. - 14 -

4. CÉLKITŰZÉSEK Célunk a sejtközötti állomány vizsgálata egészséges és degeneratív elváltozással rendelkező corneában iatrogén seb gyógyulása során egyrészt humán anyagon klinikai diagnosztikus módszerekkel, másrészt állatkísérletes anyagon hisztopathológiai módszerekkel. 4.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után A szaruhártya degeneráció (arcus lipoides) során a sejtközötti állományban lipid halmozódik fel. Célunk megvizsgálni a lipid lerakódásnak a cornea sebgyógyulására gyakorolt klinikailag kimutatható hatását. Az arcus lipoides ritka, féloldali ptosissal együtt járó formájában nyomon kívántuk követni, hogyan változnak a szaruhártya keratometriás értékei 9 mm hosszú corneosclerális seben keresztül végzett extracapsuláris szürkehályog műtét után. A kazuisztika tapasztalataira alapozva prospektív klinikai vizsgálatban annak elemzését tűztük ki célul, hogy miként befolyásolja az arcus lipoides kapcsán megváltozott ECM a cornea topográfiás paramétereit corneális sebkészítéssel végzett phakoemulzifikáció esetén. 4.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) A LASIK-ot követő korai posztoperatív látóélesség hátterében feltételezett átmeneti cornea oedema a szaruhártya vastagságának növekedésével jár. A cornea oedema kialakulásának dinamikáját kívántuk részleteiben feltárni. A szaruhártya vastagságának LASIK beavatkozás különböző fázisaiban végzett méréséből következtetni terveztünk az oedema mértékére. - 15 -

Megvizsgáltuk, változik-e a cornea vastagsága LASIK műtét kapcsán és azt követően a sebgyógyulás során, továbbá hogy mikor lép fel és meddig marad fenn az oedema a LASIK-lebenyben illetve a stromában. 4.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) A cornea felszíni lézerkezelése a stroma ECM átrendeződését eredményezi a transzparencia és a látóélesség rovására. Célunk a stroma ECM fő alkotóelemének, a GAG-nak, különös tekintettel a KS-nak az eloszlását tanulmányozni PRK után az alábbi szempontok alapján: Hogyan változik meg a szaruhártyában a GAG és a keratán szulfát eloszlása nyúl kísérletes modellben PRK után? A cornea stromát milyen mélységben érintik a változások? A GAG és keratán szulfát változások összefüggésben állnak-e az epithelium regenerációjával, a gyulladásos sejtek jelenlétével, a keratocyták sűrűségével, proliferációjával és apoptosisával? - 16 -

5. MÓDSZEREK 5.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után 5.1.1. Esetbemutatás A jelentős extracelluláris lipoid lerakódás sebgyógyulásra gyakorolt hatásának elemzését elsőként az arcus lipoides féloldali ptosissal együttjáró, ritka formájában mutatjuk be. TMS-2 (Tomey, Erlangen, Németország) cornea topográfia segítségével a corneális astigmia szimulált keratometriás (SimK) értékek vizsgálatát végeztük az extracapsuláris cataracta műtét után és varratszedés után. Az arcus lipoides és a ptosis lehetséges pathomechanikai kapcsolatát elemeztük. Panaszok. A jelentkezésekor 70 éves nőbeteg a területi szakrendelés beutalását követően 2000. márciusában kereste fel klinikánkat bal szemének ptosis ellenes műtéte céljából. A bal szemrése gyermekkora óta szűkebb volt (2A. ábra), a két szeme közötti különbséget körülbelül húsz évvel korábban vette észre, mely látáspanaszt nem okozott. Anamnesis. Anamnézisében más szembetegség nem szerepelt, azonban krónikus pancreatitis, cholecystitis, hypertonia és pneumonia miatt belgyógyászati kezelésben részesült. Laboratóriumi leleteiben emelkedett vérzsírszintet találtunk: koleszterin 7,3 mmol/l, HDL koleszterin 1,56 mmol/l, LDL koleszterin 5,11 mmol/l, triglicerid 0,96 mmol/l és emelkedett szérum lipáz (79 mmol/l) valamint gamma-gt (38 U/l) értékeket észleltünk. Felvételi status. Jelentkezésekor a bal szemrés 4 mm-rel keskenyebb volt a jobb oldalinál, amely normális volt (11 mm) (2B. ábra). A jobb szemen sem cornea erezettség, sem limbus menti homály nem volt észlelhető (2C. ábra). A bal szemen a szaruhártyában teljes vastagságban, körben, de felül kifejezettebb vajsárga körkörös lerakódás volt megfigyelhető, a limbusban 0,5-0,8 mm széles gyűrűt szabadon hagyva. A limbusban körben kisfokú ereződés látszott (2D. ábra). A corneális astigmia a jobb szemen 0,75 D, a bal szemen 1,75 D volt. - 17 -

A B O.D. O.S. C D 2. ábra. Féloldali ptosis és arcus lipoides A. 20 éves korban készült fotó. Bal oldali ptosis látható. A szaruhártya homály megjelenésének ideje nem ismert, a fotón mindkét cornea tisztának látszik. B. A beteg első megjelenésekor készült fotó. A ptosis a fiatalkori képhez képest keveset változott, az arcus lipoides a makroszkópos fotón is kivehető. C. Fotó a jobb szemről: a cornea tiszta, arcus lipoides nem látható. D. A bal szemről a varratszedést követően készült fotó: körben erezett limbus, a corneában vajsárga gyűrű alakú homály, a limbus áttetsző. - 18 -

5.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány A fenti eset kapcsán észlelt jelentős corneális astigmia alapján prospektív klinikai vizsgálatot terveztünk az extracelluláris corneális lipidlerakódás sebgyógyulásra gyakorolt hatását tanulmányozandó. Vizsgálatban résztvevők: A Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikán egymást követő 40 beteg, 40 szeme került a vizsgálatba (1. táblázat). A szemeket az arcus lipoides körkörös kiterjedése alapján réslámpás vizsgálatot követően osztályoztuk a Blue Mountain Eye Study (17) szemikvantitatív módszerét követve (3. ábra): 0. csoport (n=6) arcus lipoides nem látható, 1. csoport (n=18) az arcus lipoides kiterjedése 180, 2. csoport (n=16) az arcus lipoides kiterjedése >180. 0: nincs arcus lipoides; 1: arcus lipoides 180º; 2: arcus lipoides >180º 3. ábra: Az arcus lipoides stádiumai a lipid circumferenciális lerakódása alapján Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) Szemek 0 1 2 száma Életkor (év) 56,3+/-4,8* 70,1+/-12,0 71,9+/-7,4 Nem értékelhető 0 1 3 4 Preoperatív 6 17 13 36 1 nap 4 14 11 29 10 nap 4 11 5 20 1 hónap 4 14 9 27 3 hónap 3 11 6 20 1. táblázat. A topográfiás tanulmányban résztvevők demográfiai adatai és az esetszámok a követési idő során. - 19 -

Műtét: Minden beteg egyik szemén 4 ml 2% Lidocain (Egis, Budapest) és 1 ml Naropin (Ropivacain hydrochloratum 7,5mg/ml, Astra Zeneca AB, Södertalje, Svédország) retrobulbáris érzéstelenítésben ugyanazon operatőr XII óra poziciónál 3,2 mm-s tisztán corneális alagútseben keresztül szövődménymentes phakoemulzifikációt végzett 4,0 mm-re megnagyobbított seben keresztül történő hydrofób akril hátsó csarnok műlencse (PCL) tokzsákba történő beültetéssel. A corneasebet varrattal nem zártuk. Cornea topográfia: Cornea topográfiát (TMS-2, Tomey, Erlangen, Németország) végeztünk a műtét előtti napon, a műtét utáni 1. és 10. napon, valamint 1 és 3 hónappal műtét után. Minden vizsgálatnál törekedtünk arra, hogy a felvétel pislogás után standard idővel (5 másodperc) történjen a könnyfilm dinamika hatásának minimalizálása érdekében. (27,91,132). Cornea topográfia előtt egy órával szemcseppet hasonló okból nem adtunk. Vizsgált paraméterek: keratometriás cylinder (Dcyl), felszíni szabályosság index (SRI), felszíni aszimmetria index (SAI), potenciális látóélesség (PVA). Statisztika. Az adatok statisztikai feldolgozása a Wilcoxon és a Mann-Whitney féle nem paraméteres tesztekkel történt az SPSS (version 10.0 for Windows; SPSS Inc., Chicago, USA) szoftver felhasználásával. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük, ha p<0,05 (konfidencia intervallum 95%). 5.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) A szaruhártya oedema arányos a szaruhártya vastagságával. A szaruhártya vastagságának ultrahangos mérését a LASIK műtét során kialakuló hidratáció változások vizsgálatának céljából végeztük. Vizsgálatban résztvevők: Harminc, korábbi szembetegséget nem említő személy 30 szemén végeztünk vizsgálatokat írásos beleegyezésük után. Közülük 21 myopiás (28,9+/-8,6 év; -8,40+/-2,40 D) és 9 hypermetropiás (32,7+/-10,7 év; +5,06+/-0,87 D) - 20 -

fénytörésű volt. A vizsgálatban résztvevők demográfiai és klinikai adatait a 2. táblázat foglalja össze. A kontaktlencse viselők a vizsgálatot megelőző egy hétben nem hordták a kontaktlencséjüket. A humán vizsgálatok megfeleltek a Helsinki Deklarációban foglalt alapelveknek. MYOPIA (n=21) HYPERMETROPIA (n=9) Átlag +/- SD Min, Max Átlag +/- SD Min, Max Életkor (év) 28,9+/-8,6 21; 51 32,7+/-10,7 25; 51 Szférikus D -8,12+/-2,7-12,5; -2,5 +5,1+/-0,9 +4,0; +6,25 Cylinder D -1,08+/-1,35-5,0; -2,5 +0,7+/-1,1 0; +3,0 Szférikus ekvivalens -8,6+/-2,5-12,5; -4,75 +5,4+/-0,9 4,0; +6,25 2. táblázat Az ultrahangos pachymetriás vizsgálatban résztvevők demográfiai és klinikai adatai Kezelés. Helyi érzéstelenítésben (2x 0,4% oxybucaine - Humacain 0,4%, Human Pharmaceuticals, Gödöllő) LASIK műtétet végeztünk a Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikán. Intraoperatív komplikáció nem lépet fel. A cornealebenyt 130 µm beállítással Moria CB Microkeratome (Moria SA, Antony, France) segítségével készítettük. A cornea lebeny nyelét XII óránál pozícionáltuk. Az argon fluorid (ArF) excimer lézer fotoablációt Zeiss Meditec MEL 70 G-Scan excimer lézer készülékkel végeztük. A készülék aktív szemkövető rendszerrel (eye-tracker) volt ellátva, beállításai a következők voltak: repülőpont átmérője 1,8 mm, energiasűrűség 250 mj/cm 2, frekvencia 35 Hz. A fotoabláció során eltávolított stroma szövet területének átmérője és mélysége egyénenként változó volt: a dioptria függvényében a szoftver kiszámítja a fotoabláció legnagyobb mélységét (un. tervezett fotoablációs mélység). A műtét végén helyi széles spektrumú antibiotikumot (Tobramycin, Tobrex, Alcon) és szteroidot (0,5% Fluorometholone, Flucon, Alcon) cseppentettünk, majd lyukas kagylókötéssel ellátva otthonukba bocsátottuk a pácienseket. Mérések. A Humphrey (Model 850 San Leandro, CA, USA) 10 Mhz transzducerét fertőtlenítés (5% Povidon iodine Betadine és steril 0,9% NaCl oldat) - 21 -

után a cornea centrumára illesztve ultrahangos pachymetriát végeztünk a LASIK műtét előtt, annak egyes fázisait követően és a posztoperatív időszakban. Pachymetriával mértük a cornea vastagságát a centrumban az alábbi időpontokban: műtét előtt, lebenykészítés után, fotoabláció után, lebeny visszahajtása után 5 perccel, majd a posztoperatív 1. és 5. napon, és a kezelés után 1 és 6 hónappal (4. ábra). A lebeny felhajtott helyzetében a stromaágy központi vastagsága (CST) volt mérhető. Minden alkalommal a három egymást követő mérés során nyert adatokat dolgoztuk fel. - 22 -

A B C D 4. ábra. Sematikus ábra az ultrahangos pachymetria segítségével mért központi szaruhártya vastagságról (CCT). A szaruhártya centrumában készített keresztmetszetet ábrázoltuk a LASIK egyes fázisaiban. A piros nyilak az ultrahangos pachmyetriával közvetlenül mérhető centrális vastagságokat jelzik. A lebeny felhajtott helyzetében a stromaágy központi vastagsága (CST) mérhető. A. Preoperativ CCT B. Lebenykészítés utáni CST C. Excimer lézerkezelés utáni CST. A kék nyilak az ArF eximer lézer sugarait szimbolizálják. D. CCT a lebeny visszahelyezést követően. A szaggatott vonal a lebeny határát jelzi. - 23 -

Közvetlenül nyerhető adatok (4. ábra): preoperatív központi cornea vastagság (CCT) stromaágy központi vastagsága (CST) a lebenykészítés után CST a fotoabláció után CCT a lebeny visszahajtását követően Posztoperatív CCT (1. nap, 5. nap, 1. hónap, 6. hónap) Számítható adatok: A közvetlenül mért adatokból számítás útján (ún. szubtrakciós pachymetria (99)) segítségével további számított adatokhoz jutottunk: Számított lebenyvastagság = preoperatív CCT a lebenykészítés utáni CST Számított fotoablációs mélység = a lebenykészítés utáni CST a fotoabláció utáni CST Tervezett CCT = preoperatív CCT tervezett fotoablációs mélység] Oedema = tervezett és mért CCT különbsége az egyes mérési időpontokban. Statisztika. Az adatok statisztikai elemzését az SPSS (version 10.0 for Windows; SPSS Inc., Chicago, USA) szoftver felhasználásával végeztük. A variancia analízis (ANOVA) a lebenyvastagság gyártó által megadott értéktől való eltérés kimutatására szolgált. Egymintás t-próba segítségével végeztük a tervezett és mért/számított értékek összehasonlítását. A tervezett és mért/számított értékek közötti összefüggést Pearsonféle korreláció analízissel vizsgáltuk. A különbséget 95%-os konfidencia intervallum mellett fogadtuk el szignifikánsnak (p<0,05). - 24 -

5.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) A szaruhártya ECM fő alkotóelemének, a KS eloszlásának vizsgálata céljából szövettani vizsgálatokat végeztünk nyúl modellben. Kezelés. Az állattartás és a kísérletek nemzetközi szabályainak (NIH, No. 85-23, 1985) és az Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Határozat az állatok alkalmazásáról a kutatásban (Resolution on the Use of Animals in Research) állásfoglalásának megfelelően, a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenőrző Állomás jóváhagyásával 37, átlagosan 2,5-3,5 kg tömegű pigmentált nyúl (Oryctolagus cunniculus) jobb szemét kezeltük excimer lézerrel. Intramuscularis (50 mg/tkg ketamine) és helyi érzéstelenítés (2x 0,4% oxybucaine - Humacain 0,4%, Human Pharmaceuticals, Gödöllő) után az epitheliumot mechanikusan távolítottuk el hokikés segítségével. A fotorefraktív keratectomiát Aesclepion Meditec MEL 70 G-scan (Asclepion-Meditec GmbH, Jena, Németország) repülőpont-technikás 193 nm hullámhosszú argon fluorid (ArF) excimer lézerrel végeztük. A készülék aktív szemkövető rendszerrel (eye-tracker) volt ellátva, beállításai a következők voltak: repülőpont átmérője 1,8 mm, energiasűrűség 250 mj/cm 2, frekvencia 35 Hz. A -6,0 D-nak megfelelő fotoabláció során eltávolított stroma szövet területének átmérője 6,0 mm, tervezett centrális mélysége 82 µm volt. A műtét végén egy alkalommal antibiotikum (Neomycin) és indomethacin tartalmú szemcseppet adtunk, további posztoperatív kezelést nem alkalmaztunk. Szövet preparálás. Kilenc csoportban, csoportonként 4-5 nyúl túlaltatását végeztük el (70 mg/tkg ketamine, 40 mg/tkg suxamethonium i.m.). A túlaltatásra a műtét után 4 órával, valamint a posztoperatív 1., 4., 7., 14. és 28. napokon, továbbá 56 nap (2 hónap), 112 nap (3 hónap) és 208 nap (7 hónap) időpontokban került sor. Ezt követően mindkét szemet enukleáltunk (3. táblázat). A bulbusokat 4% formaldehidben fixáltuk és a szaruhártya kipreparálása után paraffinba ágyaztuk. A szaruhártya középső részéből 6 µm vastagságú metszeteket készítettünk Superfrost Plus tárgylemezre (Erie Scientific Company, Portsmouth, NH, USA). A bal, kezeletlen szemek képezték a kontroll csoportot. - 25 -

Kezelési csoport (PRK után eltelt idő) Szemek száma Kizárt szemek száma* Kezeletlen (kontroll) 37 3 4 óra 4 0 1 nap 4 0 4 nap 4 2 7 nap 5 1 14 nap 4 0 28 nap 4 0 56 nap (2 hónap) 4 0 112 nap (3 hónap) 4 0 208 nap (7 hónap) 4 0 3. táblázat. A PRK kezelt nyúl szemek adatai az egyes kezelési csoportokban és a kontroll csoportban. A csoportok felállítása a PRK és az enukleáció közötti idő alapján történt. *kizárás oka: mucopurulens keratoconjunctivitis Hisztológia. A metszeteken alcián-kék, hematoxylin-eozin (HE), Massontrikróm, perjódsav-schiff (PAS), ezüst-impregnáció festéseket alkalmaztunk. A különböző festési eljárásokkal más-más paraméterek vizsgálatát végeztük el: A GAG kimutatására standard alcián-kék festést alkalmaztunk, amely azt kék színnel jelölte. Az epithelium sejtek, keratocyták, és gyulladásos sejtek azonosítása HE, Masson-trikróm és PAS festésekkel történt. Festés Gyártó Kimutatás célja Módja anti-ks Seikagaku keratán szulfát fluoreszcens immunhisztokémia PCNA DAKO proliferáló sejt (epithelium) immunhisztokémia és fluoreszcens immunhisztokémia Ki67 DAKO proliferáló sejt (keratocyta) immunhisztokémia Apoptag Q-Biogene apoptosis immunhisztokémia DAPI Vector Laboratories sejtmag fluoreszcens immunhisztokémia alcián-kék SE Szemészeti Klinika GAG hisztológia trikróm SE Szemészeti Klinika gyulladásos sejt hisztológia HE SE Szemészeti Klinika keratocyta hisztológia 4. táblázat. Hisztológiai és immunhisztokémiai módszerek összefoglalása Immunhisztokémia. Specifikus antitestek alkalmazásával az alábbi anyagokat és sejteket jelöltük (4. táblázat): - 26 -

Keratán szulfát. A keratán szulfát kimutatása monoklonális, egérben termelt tisztított KS-ellenes antitest (Seikagaku Co., Tokio, Japan) 0,01 mg/ml koncentrációjú oldatával történt. A sejtmagvakat DAPI (diamino phenylindrol dihydro chlorid) festéssel jelöltük. Vectashield H-1000 (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA USA) fedés után közvetlenül fluoreszcens mikroszkópiát (Nidek Ecclipse E600, Tokio, Japan) végeztünk. 200x-400x eredeti nagyítást használva digitális fotódokumentációt végeztünk. Sejt proliferáció. A sebgyógyulás során az epithelium és a keratocyták egyaránt proliferálnak. Az epithelium sejtek proliferációját a Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) antitesttel (DAKO, Glostrup, Denmark) jelöltük. Fluoreszcens immunhisztokémia során a kearatánszulfáthoz hasonló protokollt követtünk, nem fluoreszcens immunhisztokémia esetén másodlagos festést nem alkalmaztunk. A Ki67 ellenanyagot (DAKO, Glostrup, Denmark) elsősorban a keratocyták proliferációjának kimutatására használtuk (1:100 hígítás, chromogén: diaminobenzidint, háttérfestés: methyl zöld festés). Apoptosis. Proteináz K előkezelés után methanollal és hidrogén-peroxiddal blokkoltuk az endogén peroxidázt. 1:100 hígításban TUNEL-próbát (terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dutp-digoxigenin nick-end labelling, Apoptag, Q-Biogene, Strasbourg, France) végeztünk. Az apoptotikus sejteket morfológiájuk és a TUNEL reakció pozitivitása alapján azonosítottuk. Mérések. A távolság adatokat a mikroszkóp által használt skála (okulár mikrométer) segítségével határoztuk meg a különféle festések után. Epithelium vastagság. HE metszeteken a cornea centrális részén öt, egymást nem átfedő sejtoszlopnak megfelelően mértük az epithelium vastagságát. Centrális stroma vastagság (CST). A stroma vastagságát metszetenként (alcián kék és keratán szulfát fluoreszcens immunhisztokémia) 3 helyen mértük meg: a centrumban és 500 µm távolságra mindkét irányban a periféria felé (5. ábra). A hisztológiai előkészítés bizonyos mértékig megváltoztatja a szaruhártya - 27 -

vastagságát (79), amelyet a szövettani metszeteken mérhető vastagságnál figyelembe vettünk. Minden szövet esetében azonos koncentrációjú fixáló oldat azonos ideig történő alkalmazásával törekedtünk az egyes metszeteken az azonos vastagságváltozás elérésére. Keratán szulfát réteg vastagság. Az elülső és hátsó stroma azon részének vastagságát, ahol KS volt kimutatható, a CST-nél leírtak szerinti helyeken mértük meg. Az infiltráció mélysége. Az elülső stroma gyulladásos sejteket tartalmazó részének vastagságának CST %-os arányában. - 28 -

A KS CST 500 µm 500 µm B 0,1 mm 0,1 mm 45 % 5. ábra. A szaruhártya stroma és KS-pozitivitású rétegek vastagságának mérési módszere. A. Sematikus ábra a szaruhártya keresztmetszetéről. Szürke színnel a stroma, zölddel a KS réteg, kékkel a keratocyták ábrázolódnak. A piros négyzet egy High Power Field (HPF = 100x100 µm) területét jelzi. B. Hisztológia 4 nappal a PRK után a regenerálódó epithelium és a stroma elülső 45%-át infiltráló gyulladásos sejtek láthatók. A piros négyzet a HPF jelölésére szolgál. (Masson trikróm, eredeti nagyítás 200x). - 29 -

Számítások Keratocyta sűrűség. A keratocyták számolása CST mérésénél használt két, perifériás mérési sík közé eső területre (kb. 500x1000 µm 2 ) vonatkozott (5. ábra). Apoptotikus sejtek sűrűsége. A TUNEL immunhisztokémiával azonosított apoptotikus sejtek sűrűségét öt, egymást nem átfedő 100x100 µm területű négyzetben (un. High Power Field = HPF) számláltuk. Proliferáló keratocyták sűrűsége. A fentiekhez hasonlóan a Ki67 immunhisztokémia segítségével jellemzett proliferáló sejtek sűrűségét a stromában HPF-re vonatkoztatva adtuk meg. Gyulladásos sejtek sűrűsége. A fentiekhez hasonlóan a gyulladásos sejtek sűrűségét HE metszeteken határoztuk meg HPF- re vonatkoztatva. Statisztika. A statisztikai elemzést Statistica 6.0 program (Statsoft Inc, Tulsa, Okla) felhasználásával kétmintás t-próba segítségével végeztük. A kétmintás t-próba során a kontroll csoport értékeitől való eltérést vizsgáltuk. Ezalól kivételt képzett a CST. A csoportokban kapott CST eredmények statisztikai összehasonlítása a számított stroma vastagsággal történt, azaz a CST-ből kivontuk a fotoablációs mélységet (= CST-82 µm). A különbséget 95%-os konfidencia intervallum mellett fogadtuk el szignifikánsnak (p<0,05). - 30 -

6. EREDMÉNYEK 6.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után 6.1.1. Esetbemutatás Kórlefolyás. A beteg első megjelenésekor (2000. március) látóélessége a jobb szemen 0,6 volt, melyen üveg nem javított, a bal szemen -3,0 szférikus dioptriával 0,4-re volt korrigálható. 2000. márciusában frontális szuszpenziót végeztünk szilikon szalaggal a ptosis miatt. Fél évvel később a bal szemen a romló látóélesség hátterében álló szürkehályog miatt extrakapszuláris hályogkivonásra került sor. A szürkehályog műtétet követően a látóélesség elmaradt a műtét előtti állapothoz képest, a szaruhártya nagyon lassan tisztult fel és nagyfokú asztigmia alakult ki. A posztoperatív első hónapban végzett cornea topográfia szimulált keratometriás értékei (Sim K = 52,0D x 80 / 37,0D x 170) igazolták a nagyfokú asztigmiát (6. ábra). Az asztigmia csökkentésének érdekében 2001. januárjában a tovafutó corneosclerális varratot eltávolítottuk, így valamivel kedvezőbb keratometriás értékeket kaptunk, de még így sem sikerült az asztigmiát 10 D alá szorítani (Sim K = 45,7D x 82 / 35,3D x 172) és a látóélességet 0,2 felé korrigálni. 2001. márciusára kisfokú, majd 2001. szeptemberére további javulást észleltünk a visusban és az asztigmia is csökkenést mutatott (Sim K: 46,73D x 44 / 41,86D x 134). 2001. novemberére a bal szemen 2,0 Dcyl 140º korrekcióval 0,5 látóélességet sikerült elérni. Ugyanekkorra a jobb szem visusa 0,5-re csökkent. 2003. áprilisára a corneális asztigmia 5 D alá csökkent (Sim K: 45,8D x 44 / 41,4D x 134. Kiegészítő vizsgálatok. Az arcus lipoides aszimmetriájára való tekintettel Doppler vizsgálat végzését kértük, amely szerint az arteria carotis egyik szakaszán sem igazolódott keringési akadály. Az arteria subclavia és vertebralis keringése is megtartott volt. Észlelésének közel két éve alatt rendszeresen Goldmann-féle applanációs tonometriával mértük a szemnyomást, mindkét szemen 16-19 Hgmm közötti értéket kaptunk, a két oldal közötti 2 Hgmm-nél nagyobb különbséget egy alkalommal sem találtunk. - 31 -

6. ábra. Cornea topográfia féloldali arcus lipoidesben. A jobb szem szabályos topográfiai jellegzetességgel bír, míg a körkörös lipidlerakódásos bal cornea felszíne egyenetlen. 6.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány A preoperatív vizsgálatok során a 0-1 és 0-2 csoportok között nem tértek el egymástól a Dcyl, SRI és PVA paraméterek (Mann-Whitney U-test). Az egyes paramétereket külön-külön táblázatban (5-8. táblázatok) és a 7. ábrán foglaltuk össze. A 2. csoportban a corneális astigmia 1 nappal (3,1+/-1,9D) és 10 nappal (2,7+/-2,1D) a műtét után szignifikánsan eltért a műtét előtti (1,8+/-1,9D; p<0,05, Wilcoxon-teszt) és a kontroll csoport értékeitől (preop.: 1,3+/-0,7D; 1 nap: 1,2+/-0,4D; 10 nap:1,1+/-021d; p<0,05, Mann-Whitney-teszt) (5. táblázat). A posztoperatív 1-3 hónapban az arcus lipoides az SRI (6. táblázat), SAI (7. táblázat) és PVA (8. táblázat) paramétereket jelentősen nem befolyásolta. - 32 -

Cylinder (D) Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) Mérés 0 1 2 Preoperatív 1,29+/-0,67 1,19+/-0,25 1,82+/-1,96 1 nap 1,22+/-0,39 1,70+/-0,31*# 3,10+/-1,90*# 10 nap 1,12+/-0,21 1,12+/-0,23 2,7+/-2,15*# 1 hónap 0,91+/-0,19 1,20+/-0,20 2,64+/-1,74*# 3 hónap 1,12+/-0,10 0,91+/-0,18 1,33+/-0,28 5. táblázat. A keratometriás astigmia az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test). SRI Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) Mérés 0 1 2 Preoperatív 0,83+/-0,27 0,70+/-0,33 0,62+/-0,31 1 nap 0,84+/-0,15 1,21+/-0,28*# 1,36+/-0,29*# 10 nap 0,71+/-0,24 0,68+/-0,22 1,01+/-0,13*# 1 hónap 1,11+/-0,17 0,81+/-0,23 0,76+/-0,17 3 hónap 0,39+/-0,14 0,56+/-0,29 0,45+/-0,14 6. táblázat. A felszíni szabályosság index (SRI) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test). - 33 -

SAI Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) Mérés 0 1 2 Preoperatív 1,02+/-0,32 0,52+/-0,18# 0,69+/-1,04# 1 nap 0,54+/-0,24 1,10+/-0,30*# 1,17+/-0,83*# 10 nap 0,63+/-0,03 0,43+/-0,08 1,01+/-0,66 1 hónap 0,63+/-0,12 0,53+/-0,11* 0,49+/-0,59 3 hónap 0,45+/-0,15 0,44+/-0,09 0,68+/-0,54 7. táblázat. A felszíni aszimmetria index (SAI) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). #szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test). PVA Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) Mérés 0 1 2 Preoperatív 0,71+/-0,07 0,87+/-0,67 0,83+/-0,31 1 nap 0,89+/-0,09 0,63+/-0,07# 0,61+/-0,25# 10 nap 0,70+/-0,06 0,73+/-0,06 0,59+/-0,28 1 hónap 0,64+/-0,07 0,77+/-0,05 0,73+/-0,29 3 hónap 1,06+/-0,08 0,90+/-0,04 0,80+/-0,25 8. táblázat. A potenciális látóélesség (PVA) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test). - 34 -