A humán tripszinogén jellemzése és mutációinak szerepe a krónikus herediter pancreatitis pathogenezisében

A humán tripszinogén jellemzése és mutációinak szerepe a krónikus herediter pancreatitis pathogenezisében PhD doktori értekezés Kukor Zoltán Témavezető : Dr. Tóth Miklós Programvezető : Dr. Mandl József Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia Doktori Program 2005 Szigorlati bizottság elnöke : Tagok : Bíráló bizottság elnöke : Tagok : Hivatalos bírálók : Dr. Machovich Raymund Dr. Hrabák András Dr. Müllner Nándor Dr. Szilágyi László Dr. Zelles Tivadar Dr. Falus András Dr. Geiszt Miklós Dr. Hegyi Péter Dr. Varga Gábor Dr. Venekei István

Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke. 3. 2. Bevezetés 5. 3. Célkitűzések.. 33. 4. Módszerek. 35. 5. Eredmények.. 38. 6. Megbeszélés.. 75. 7. Következtetések 88. 8. Összefoglaló.. 93. 9. Summary.. 95. 10. Köszönetnyílvánítás... 97. 11. Irodalomjegyzék. 99. 2

1. Rövidítések jegyzéke BSA Bovine Serum Albumin CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator EDTA Etilén-Diamin-TetraAcetát GPR-pNA glicil-prolil-arginil-p-nitro-anilid IP izoelektromos pont TAP Tripszinogén Aktivációs Peptid TAT 1 Tumor Associated Trypsin 1 (tripszin 1) TAT 2 Tumor Associated Trypsin 2 (tripszin 2) TCA triklórecetsav Tg1 humán tripszinogén 1 (kationos tripszinogén) Tg1 * Arg122-Val123 helyen hasított (két szálú) humán tripszinogén 1 Tg2 humán tripszinogén 2 (anionos tripszinogén) Tg3 humán tripszinogén 3 (mezotripszinogén) Tr1 humán tripszin 1 (kationos tripszin) Tr2 humán tripszin 2 (anionos tripszin) 3

Tr3 humán tripszin 3 (mezotripszin) PAR Proteáz Aktivált Receptor PRSS1 kationos tripszinogén gén PRSS2 anionos tripszinogén gén PRSS3 mezotripszinogén gén PSTI Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor SAAP Surfactant-Associated Anionic Peptides SBTI SoyBean Trypsin Inhibitor SPINK1 Serine Protease INhibitor Kazal type 1 (PSTI) 4

2. Bevezetés 2.1. Nomenklatúra 2.1.1. A tripszin aminosavainak jelölése A kimotripszinszerű szerin proteázok, így a tripszin aminosav számozása hagyományosan a kimotripszinogén számozásán alapul. Mivel a pretripszinogén egyes aminosavai emiatt nem kapnak számozást, az esetleges mutációk egyértelmű jelölése is nehézségekbe ütközik, a kimotripszinogénen alapuló számozást egyre kevésbé használják. A kimotripszinen alapuló számozás előnye, mely szerint a kitüntetett aminosavak (pl. a katalitikus triád) egyforma számot kapnak és egyszerűen összehasonlíthatók így elvész, de egyéb jelölési módokkal (pl. a katalitikus triádot csillaggal jelölve) a hátrány kiküszöbölhető. Disszertációmban a tripszinogénen alapuló számozást használom a kétféle számozás közül. Mivel az értekezés alapjául szolgáló cikkekben mindkét számozás előfordul, az eltéréseket az alábbiakban írom le. A 2002 Feb 22;277(8):6111-7 JBC cikkben szereplő Arg117 Arg122-nek, Val118 Val 123-nak, Glu75 Glu80-nak, Glu85 Glu90-nek felel meg. Az értekezésben az aminosavak elfogadott egy- és három betűs rövidítéseit használom. 2.1.2. Tripszinogén mutációk jelölése Az aminosavak számozásának problémája magával hozta a mutációk jelölésének problematikáját is. A biokémikusok által a szerin proteázokra elfogadott kimotripszinogén szekvenciáján alapuló számozás több problémát is felvetett a tripszin mutációk jelölésében: A startkodon (Met) nem kodon 1. 11 aminosav az aktív tripszinben nem kapott számozást. A tripszinogén aktivációs peptidje szintén nem kapott számot ( 1 ). 5

Az első tripszinogén mutációt 1996-ban írták le, az eltelt időszakban számuk 20 körülire nőtt, és ez sürgőssé tette a mutációk egyértelmű jelölését is. Antonarakis 1998- ban az 1996-os heidelbergi (Locus-Specific Mutation Databases) és san franciscoi (Mutation Databases) International Nomenclature Working Group Nomenklatúra Bizottság vezetőjeként írta le javaslatukat a mutációk egységes jelölésére ( 2 ). Az egyértelmű, logikus jelölések ellenére az új számozás elterjedése még nem általános ( 3, 1 ) és bizonyára még fog félreértéseket okozni. 2.2. Pancreatitis (hasnyálmirigy gyulladás) A pancreatitis a pancreas gyulladásos betegsége. A pancreatitis incidenciája iparilag fejlett országokban 3,5-35 /100000, az arány -elsősorban az alkoholisták számának emelkedése miatt- folyamatosan növekvő tendenciát mutat ( 4, 5 ). A pancreatitis több szempont szerint is osztályozható. A legegyszerűbb felosztás szerint akut és krónikus pancreatitis létezik. Az akut és krónikus pancreatitis definíciója sem egységes, a klasszifikáció is problematikus ( 6, 7 ), egyes országok ajánlásai is eltérhetnek egymástól. Több alkalommal (Marseilles, 1963 ( 8 ), Cambridge, 1983 ( 9 ), Marseilles, 1984 ( 10 ) Marseilles- Róma 1988, Atlanta 1992 ( 11 ) ) próbáltak nemzetközi szinten egységes álláspontot kialakítani. A legelfogadottabbak a cambrigde-i és a marseilles-i kritériumok. A marseilles-i hátránya az, hogy hisztológiai bizonyítékra is szükség van, míg a cambrigde-i nem elég specifikus ( 10 ). 2.2.1. Akut pancreatitis (heveny hasnyálmirigy gyulladás) Az akut pancreatitis általában hirtelen kezdődik súlyos epigastriális fájdalommal, ami állandóvá és gyötrelmessé válik. A fájdalom a hátba, ritkán balra vagy jobbra sugárzik. A beteg a fájdalom helyét a hasán övszerűen széthúzva szokta 6

jelölni. A fájdalom járáskor vagy hanyattfekvéskor fokozódik, felüléskor és előrehajláskor csökken. Az ágyában ülő, előrehajló, a kezeit a térdén összekulcsoló beteg látványa a pancreas megbetegedésének a gyanúját kelti ( 12 ). Az akut pancreatitisre jellemző még a hányinger, hányás, a beteg gyengének érzi magát, izzadt, gyakori a magas, 38,4-39 o C-os láz. A has nyomásérzékeny, főként a felső részben. A legtöbb esetben az izomvédekezés, feszülés nem észlelhető. A has puffadt lehet, a bélhangok hiányozhatnak (néma has). Akut pancreatitisben az emésztőenzimek szekréciója csökken, míg szérumban koncentrációjuk nő. A fekális elasztáz-, lipáz-, tripszinszintek csökkennek, ami az elégtelen emésztési funkciókra utalnak. A laboratóriumi leletekre jellemző, hogy az esetek 90 %-ában 24 órán belül a szérum amiláz és lipáz szintek megemelkednek, rendszerint a normál érték háromszorosára ( 13 ). A változások korrelálnak a pancreatitis súlyosságával. O'keefe és mtsai közelmúltban megjelent cikke szerint akut pancreatitises betegek szérum átlagos lipázkoncentrációja kevesebb, mint 300 U/l ről mérsékelt pancreatitisben 4200-ra, míg nekrotizáló pancreatitisben 33000-re nőtt. Az amiláz szérumkoncentráció 150 U/l-ről több mint háromszorosára, illetve 15-szörösére emelkedett. A duodenális szekréciós ráta (U/óra) a tripszin esetében 500-ról 200-ra illetve 30-ra, az amiláz 9200-ról 9000-re, illetve 420-ra, míg a lipáz szekréció 570*10 3 - ról 235*10 3 -re illetve 6*10 3 -ra csökkent ( 14 ). Az akut pancreatitis oka leggyakrabban epekő megakadása és a pancreas szekrétum következményes pangása vagy nagy mennyiségű alkohol rendszeres fogyasztása. A recidiváló akut pancreatitis a kationos tripszinogén R122H ( 15 ), a kationos tripszinogén N29T ( 16 ), a PSTI N34S ( 17 ) mutációhoz, valamint CFTR mutációkhoz ( 18 ) is kapcsolható. Az alkoholos eredetű pancreatitis súlyosságának megítéléséhez a Ranson-féle kritériumokat használják. A 11 kritériumból 3 vagy több megléte esetén súlyos lefolyású esetre számíthatnak. 7-8 kritérium teljesülésénél a mortalitás 100 %-os. Az Acute Phisiology and Chronic Health II (APACHE II) kritériumrendszer, valamint a 7

módosított Glasgow kritériumok szintén használatosak a betegség súlyosságának megítélésében ( 19 ). Az akut pancreatitist az okozza, hogy az aktivált pancreas emésztőenzimek kiszabadulnak az acinus sejtekből a környező szövetekbe. Az aktiváció mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Az akut pancreatitis az esetek többségében enyhe betegség, amely kezelés nélkül, napok alatt magától gyógyul. A hasnyálmirigy nyugalomba helyezése érdekében az orális táplálkozást felfüggesztik, amíg a fájdalom nagyrészt nem szűnik meg sem folyadékot, sem szilárd táplálékot nem adnak szájon keresztül. Fontos a fájdalom csökkentése. Súlyos pancreatitis esetén a kezelés a laboratóriumi eredményektől is függ (folyadék-, kalcium-, plazma-, albumin-, stb. pótlás). Szükség lehet műtétes megoldásra is (pl. epeköves eredet esetén; részben vagy teljesen elhalt pancreas eltávolítása céljából) ( 20 ). 2.2.2. Krónikus pancreatitis (idült hasnyálmirigy gyulladás) A krónikus pancreatitist felnőttekben úgy definiálják, mint a pancreas kiújuló vagy folyamatos gyulladásos betegségét, irreverzibilis morfológiai változásokkal kísérve. Utóbbiak fájdalmat okozhatnak. Némelyik betegben az exokrin vagy endokrin funkciók vagy mindkettő zavart szenvedhet. A krónikus pancreatitisre jellemző a tartósan fennálló vagy visszatérő, rohamokban jelentkező epigastrialis és bal felső kvadráns fájdalom. Gyakori az étvágytalanság, a hányinger, a hányás, a székrekedés, a flatuentia és a fogyás. Roham alatt a has nyomásérzékeny, az izomvédekezés gyenge. A rohamok időtartama változó, néhány órától két hétig is eltarthatnak, a fájdalom állandósulhat vagy idővel csökkenhet. Steatorrhea alakulhat ki a betegség kései szakaszában. A felnőttek 80 %-ában a klinikai tünetek első megjelenése után 25 éven belül diabetes alakul ki ( 21 ). 8

Az akut rohamok során jellemző az emelkedett szérum amiláz és lipáz szint, de a normális vagy csökkent érték nem zárja ki a krónikus pancreatitist. A közös epevezeték kompressziója miatt a szérum alkalikus foszfatáz és bilirubin szint emelkedhet. Glukózuria is előfordulhat. A széklet vizsgálatával fokozott (7 gramm/napnál magasabb érték) zsírürítés mutatható ki. A pancreas elégtelen működését a széklet kimotripszin vagy elasztáz tartalmának csökkenésével mutathatják ki. Csökkenhet a beteg bikarbonát elválasztása, ami szintén a pancreas elégtelen működését jelzi. A krónikus pancreatitis leggyakoribb oka a hosszan tartó, nagy mennyiségű (férfiaknál legalább 80g/nap, nőknél 60 g/nap) alkoholabúzus. Az alkoholfogyasztás időtartamával és mennyiségével a krónikus pancreatitis kockázata megnő ( 22, 23 ), de a súlyos alkoholisták 5-10 %-ánál fordul csak elő. Az alkohol valószínűleg nem befolyásolja közvetlenül a tripszin aktiválódását. Publikálatlan eredményeink szerint az alkohol 2 %-os koncentrációban nem okozott fokozott autoaktivációt egyik izoenzimnél sem, nem növelte a tripszinek stabilitását, valamint a PSTI kötődését, illetve degradációját sem befolyásolta. Valószínű, hogy az etanol a zimogének ürítésére hat, kolecisztokininnel indukált patkány acinus sejtek tripszin és kimotripszin aktivitása nőtt 35 mm etanol jelenlétében ( 24 ). A második legyakoribb krónikus pancreatitis típus az elsősorban Ázsiában, trópusi területeken előforduló trópusi krónikus pancreatitis. Incidenciája Dél-Indiában magas, 126/100 000 ( 25 ). A trópusi krónikus pancreatitis fiatalkori, nem alkoholos eredetű, kalcifikáló pancreatitis. A trópusi pancreatitisre jellemző a fiatalkori, (2-3. dekád) manifesztáció, az esetek több mint 90 %-ában megjelenő nagy méretű intraduktális kő, a krónikus pancreatitises betegeknél is fokozottabb pancreatikus carcinóma. A tipikus klinikai kép az abdominális fájdalom, hasmenéshez vezető emésztési zavarok és súlyos, 90 % feletti gyakoriságú fibrocalculus pancreaticus diabetes. A trópusi krónikus pancreatitises betegeknél gyakori az alultápláltság, ami egyik oka lehet a betegségnek ( 26 ). 9

Pancreas szekretorikus tripszin inhibitor (PSTI) N34S mutációt találtak a trópusi krónikus pancreatitises betegek 44 %-ában ( 27 ), az egészséges kontrollokban az előfordulása ennek a mutációnak kb. 2 % volt. Egy másik munkacsoport is talált összefüggést a trópusi krónikus pancreatis és a PSTI N34S mutánsa között, különös tekintettel a fibrocalculus pancreaticus diabetes krónikus pancreatitisesekre ( 28 ). A krónikus pancreatitisisek körében a pancreas tumor valószínűsége kb. az ötvenszeresére emelkedik. Trópusi pancreatitis esetében a kockázat még nagyobb. A krónikus pancreatitis két csoportra osztható. Az első a késői típus, amelynek első klinikai manifesztációja az 5-7. dekádra jellemző. A második a korai típus, mely 35 év alatt fejlődik ki. Függetlenül az etiológiától a krónikus pancreatitis klinikai menete két szakaszra bontható. A korai fázisra jellemző a visszatérő akut pancreatitises epizódok, majd ezt követi a késői fázis a pancreas exokrin funkcióinak zavaraival, diabetes mellitussal és kalcifikációval. A krónikus pancreatitis pathogeneziséről az ismereteink még nagyon szegényesek. Nem világos, hogy milyen genetikai faktorok és környezeti tényezők vezetnek el egyértelműen a krónikus pancreatitis kialakulásához. A leggyakoribb PRSS1 gén (kationos tripszinogén) mutáció (R122H) penetranciája 80 %. A PSTI N34S mutáció növeli a krónikus pancreatitis kockázatát, de az emberek kb. 1%-a hordozza a mutációt klinikai manifesztáció nélkül, a tünetmentes hordozók aránya egy finn tanulmány szerint 2,6 % volt ( 29 ). Az iparilag fejlett országokban a krónikus pancreatitis esetek kb. 70 %-ában a betegség oka a hosszú távú (legalább öt éve tartó) alkohol abúzus. Az alkoholisták viszonylag kis hányada betegszik meg krónikus pancratitisben abban az esetben is, ha már ismert mutációkat hordoznak ( 30 ). Több elméletet is felállítottak a krónikus pancreatitis kialakulásának magyarázatára. Ezek alátámasztására felhozott kísérletes bizonyítékok általában állatkísérletekből származnak, ezért fenntartással kell őket fogadni. 10

Az az elgondolás, hogy a pancreatitis kialakulásának egyik első lépése a tripszin aktiválódása a pancreasban már több mint 100 éves múltra vezethető vissza. Klebs számolt be 1879-ben először arról, hogy a pancreasnak önemésztő potenciálja van. A képződő tripszin aktiválhatja a pancreatikus emésztőenzimeket, az elasztázt, karboxipeptidáz A-t, kimotripszint. A képet árnyalja, hogy a tripszin képes autolízisre, tehát a tripszin és tripszinogén lebontásával a pancreasban aktiválható potenciális tripszin mennyiségét csökkenti. A tripszinnek így védőszerepet is tulajdonítanak. Mint pancreatitis ellen védő izoenzim különösen a mezotripszin volt népszerű, mert gyengén kötődik a tripszin antagonista PSTI-hez, így aktivitása nem gátolt, szabadon bonthatná a tripszinogéneket ( 31 ). Ezt a védőfunkciót saját kísérleteink alapján kizártuk, mert a mezotripszin nem képes jelentős mértékben hidrolizálni egyik tripszin izoenzimet sem. Mivel a mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat bont, így a PSTI-t is, a tripszinaktiváció gátlásának megszüntetésével a mezotripszin pathológiás folyamatok egyik elindítója lehet ( 32 ). Chen és munkatársai 2003-ban írták le, hogy a PRSS1 gén (kationos tripszinogén) funkcióvesztő mutációját (loss of function mutation) egészséges kontrollokban és krónikus pancreatitisben nem szenvedő alkoholistákban is megtalálták, míg pancreatitis betegekben nem ( 33 ). Ezen eredemények alapján kijelenthető, hogy a tripszinnek nincs védőhatása a pancreatitis ellen, ellenkezőleg, egyre több adat arra mutat, hogy szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában. Kérdés, hogy mi lehet az oka a tripszinaktivitás megjelenésének a pancreasban? Az enteropeptidáz, mint a tripszin specifikus aktivátora valószínűleg nem iniciátor, mert expressziója a vékonybélre lokalizálódik. A tripszinaktiválás két lehetséges útja a pancreasban az autoaktiváció és a lizoszómális emésztőenzimek okozta aktiválás. Az autoaktiváció lehetséges helye a szekretórikus vakuolum vagy a lizoszóma. A citoszólra jellemző enyhén lúgos közegben a kationos tripszinogén autoaktiváció sebessége csak Ca 2+ jelenlétében jelentős ( 34, 35 ). A lehetséges tripszin mennyiség 20 %-ának megfelelő PSTI mellett, (0,1 M Tris/HCl, ph=8,0, 5 mm Ca 2+ 37 o C) 14 nap múlva sem tapasztalható tripszinaktivitás (Sahin-Tóth M, Kukor Z nem közölt megfigyelés). Az anionos tripszinogén autoaktivációját az eredmények részben ismertetem. A mezotripszinogén nem autoaktiválódik ( 32 ). 11

A tripszinnek lehet kitüntetett szerepe mégis a pancreatitis kialakulásában, mert pathológiás körülmények között nem csak lizoszómális enzim, katepszin B aktiválhatja, hanem képes PSTI hiányában autoaktivációra mind a citoszólra jellemző enyhén lúgos, mind a lizoszómákra jellemző enyhén savas kémhatású körülmények között is. A képződő tripszin pedig beindíthatja a pancreasban termelődő emésztőenzimek aktiválási kaszkádját. Tíz vizsgálat alapján a tripszin inhibitorokkal történt kezelés nem befolyásolja szignifikánsan az enyhe akut pancreatitisben szenvedők mortalitását, és közepesen vagy nagyon súlyos pancreatitisnél sem változtatja azt meg számottevően ( 36 ). A krónikus pancreatitis kezelésének fő szempontja a kiesett pancreasfunkciók pótlása és a szövődmények kialakulásának megelőzése, illetve késleltetése. Alkoholos pancreatitis esetében fontos a teljes alkoholelvonás. Általában csökkenthető a fájdalom, az emésztési funkciók javulnak, a pancreas károsodása csökkenthető, esetleg visszafordítható. Ha szükséges, a kiesett exokrin és endokrin funkciókat emésztőenzimek adásával és a diabetes kezelésével lehet helyettesíteni. A diétában általában csökkentik a zsír- és fehérjebevitelt. Fontos a néha szinte elviselhetetlen fájdalom csillapítása is. Műtéti megoldás is szóba jöhet a pancreas kivezető csövében lévő kövek eltávolításától kezdve a pancreasectómiáig. 2.2.3. Örökletes pancreatitis Az első családfát Comfort és Steinberg ( 37 ) írták le 1952-ben, mellyel igazolták, hogy a pancreatitis öröklődő is lehet. Ezután közel ötven év telt el, míg a betegséget okozó génhibák azonosítására is sor került. 1996-ban három munkacsoport egymástól függetlenül ( 38, 39, 40 ) bejelentette, hogy az öröklődő pancreatitis a VII. kromoszóma hosszú karjához köthető, ahol több pancreatikus emésztőenzim ( pl. karboxipeptidáz A 1, kationos tripszinogén, anionos tripszinogén) génje is megtalálható. Szintén a VII. kromoszóma hordja a CFTR gént is. 12

Az első olyan mutációt, ami krónikus pancreatitist okoz 1996-ban azonosították a kationos tripszinogén génjében (PRSS1 R122H). Krónikus pancreatitishez elsősorban a kationos tripszinogén, a PSTI és a CFTR gén mutációi vezethetnek. Az előbbieken kívül vizsgálták még az α1-antitripszin mutációinak szerepét, de egyértelmű eredmény nem született. Az örökletes pancreatitis kezelésének célja a fájdalom csökkentése, a beteg életminőségének javítása, a szövődmények kialakulásának késleltetése. A betegséget kiváltó okot nem lehet megszűntetni. A pathogenezis feltárásának ezért rendkívüli szerepe van a potenciális gyógymódok és a lehetséges preventív stratégia kidolgozásában. 2.2.3.1. Tripszinogén mutációk 1996-ban Whitcomb és munkatársai azonosították az első örökletes krónikus pancreatitissel kapcsolható pontmutációt ( 41 ), ami a tripszinogén1 R122H mutációja volt. Ez egy egyszerű nukleotid csere (tranzíció), CGC(Arg122)-ről CAC(His122)-re, ami a vizsgálatba bevont családok közül ötöt érintett. Mivel ez a mutáció egy új restrikciós helyet eredményez az Afl III endonukleáz számára, a könnyű detektálási megközelítés miatt világszerte ez a leggyakrabban használt módszer az érintettség kimutatására ( 42, 43 ). A leggyakrabban előforduló R122H mutáció mellett leírtak számos egyéb mutációt és polimorfizmust is (1. táblázat) ( 44 ). A promoter régióban egy deléciót azonosítottak, a tripszinogén aktivációs peptidjében találták az A16V, D19A, D22G, K23R mutációkat, a N29I, N29T, P36R, Y37X mutációk a tripszinogén 2. exonjában, az E79K, G83E, K92N, D100H, L104P, R116C, R122H, V123M és C139F mutációk pedig a 3. exonjában találhatóak. 13

PRSS1 gén mutáció Aminosav változás esetszám -28delTCC 1 47C>T A16V >10 56A>C D19A 1 65A>G D22G 1 68A>G K23R 1 86A>T N29I >50 86A>T N29I/N54S 1 161A>G PRSS1/PRSS2 génkonverzió 86A>C N29T 1 107C>G P36R 1 111C>A Y37X 1 235G>A E79K 4 248G>A G83E 1 276G>T K92N 1 298G>C D100H 1 311T>C L104P 1 346C>T R116C 3 364C>T R122C 2 365G>A R122H >100 365G>A, 366C>T R122H 2 367G>A V123M 1 416G>T C139F 1 1. táblázat A PRSS1 (kationos tripszinogén) gén örökletes pancreatitissel összefüggő ismert mutációi (polimorfizmusok nélkül) Vastag betűvel tüntettem fel az egynél nagyobb esetszámú mutációkat 14

A single-strand conformation polymorphism technikával felfedezett mutáció a kationos tripszinogén gén teljes szekvencia analízisével azonosítható. Ha az azonosított mutáció ritka (pl. kationos tripszinogén D19A), megfigyelésük mindössze egy esetre korlátozódik, ha családi öröklésmenet nem követhető nyomon (haláleset, mintaadás megtagadása) akkor könnyen lehet téves következtetés levonásához jutni. Kérdésessé válhat az is, hogy mutációról vagy variációról van-e szó. A mutáns fehérje biokémiai karakterizálása ebben az esetben segíthet (kationos tripszinogén D19A). Tapasztalataink alapján, ha egy feltételezett mutáns fehérje (pl. anionos tripszinogén V118I) tulajdonságai (autoaktiválás-, degradáció sebessége, mértéke, V max, K M, PSTI kötés, PSTI lebontás) megegyeznek a vad típuséval, érdemes további statisztikai analízisnek alávetni a mutációt. Esetünkben az anionos tripszinogén V118I-ről kiderült, hogy polimorfizmusról van szó, a változatot csak véletlenül mutatták ki először egy érintett családban (Whitcomb DC, Sahin-Tóth M, Kukor Z nem közölt megfigyelés). Az örökletes krónikus pancreatitis mutációk gyakoriságát nehéz megbecsülni megfelelő esetszám és metodikájú vizsgálat nélkül ( 45 ), az esetszám növelésével általában az R122H mutációt sikerül azonosítani ( 46 ). Gyakran csak a leggyakoribb mutációk vizsgálatára (PRSS1 R122H, N29I, A16V; PSTI N34S) kerül sor, ami a mutációk előfordulási arányának eltolódásához vezethet ( 47 ). Európában ( 48 ) Howes és munkatársainak az EUROPAC (European Registry of Hereditary Pancreatitis and Pancreatic Cancer) keretében végzett, több országot, 112 örökletes krónikus pancreatitisben érintett családot (418 beteget) magában foglaló felmérésében kationos tripszinogén mutációs profilt készítettek, a felmérés adatainak felhasználásával készült a 1. ábra. 15

Nincs Tg1 mutáció Ritka mutációk A16V N29I R122H 1. ábra Örökletes krónikus pancreatitis betegek kationos tripszinogén (PRSS1) génmutációinak megoszlása Európában (Howles ( 47 ) alapján) A leggyakoribb mutáció az R122H (52%), ezt követte az N29I (21%), A16V (4%), ritka mutációk (2%). A betegek 19 %-ában nem találtak PRSS1 mutációt. Örökletes pancreatitist okozó mutációt még nem találtak az anionos tripszinogén (PRSS2) génben ( 49 ). Még nem publikált eredményeink szerint viszont létezik olyan anionos tripszinogén mutáció (G191R), ami német populációban a pancreatitisben szenvedők kb. 1 %-ában, míg az egészséges kontroll csoportban kb. 3 %-os arányban fordul elő. Ez arra utal, hogy a G191R mutáció esetleg védő hatású lenne a pancreatitis ellen. Ez alátámasztja azt az elméletünket, mely szerint az anionos tripszinogénnek szerepe lehet a pancreatitis kialakulásának megakadályozásában (lsd. később). Jelenleg még pancreatitishez kapcsolható PRSS3 génmutációt (mezotripszinogén) nem azonosítottak. Ismert az E32del variánsa, amit biokémiai jellemzése során identifikusnak találtak a vad típussal ( 50 ). Tekintettel arra, hogy a mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat, így a pancreast a nemkívánatos tripszinaktivitástól védő PSTI-t bontja, stabilabb vagy aktívabb mezotripszint 16

eredményező esetleges mutációk a pancreatitis kialakulásának kedveznének ( 32 ). A PRSS3 emiatt vizsgálatok tárgya. 2.2.3.2. PSTI mutációk A pancreas acinus sejtjeiben termelődő PSTI elsődleges feladata a pancreas védelme az esetlegesen képződő tripszin ellen. A PSTI a potenciálisan képződő tripszin mennyiség kb. 20 %-át képes gátolni ( 51 ). Mennyiségének csökkenése vagy az inhibitor csökkent kötődése a tripszin esetleges felszaporodásához vezethet a pancreasban. A PSTI tripszin antagonista szerepéből adódóan logikus volt, hogy a tripszinmutációk felfedezése után az esetleges PSTI mutációk azonosítása a kutatók érdeklődését felkeltse. 2000-ben több munkacsoportnak is sikerült örökletes pancreatitissel kapcsolt PSTI mutációt azonosítani ( 52, 53 ). Érdekes, hogy több mutáció is intronokban található ( 8 ). A két nagyobb esetszámú, aminosavcserét jelentő N34S és P55S közül az N34S mutáció kiemelkedő számban fordul elő pancreatitisben, így jelentősége is nagyobbnak tűnik. Jelen ismereteink szerint ( 54 ) a PSTI N34S mutáció rizikófaktor az alkoholos pancreatitis kialakulásában. A krónikus alkoholos pancreatitises betegek közel 6%-a hordozza az N34S allélt. A pancreatitis nélküli alkoholisták és egészséges kontroll személyek kb. 1 %-a bizonyult heterozigóta hordozónak az N34S mutációra nézve. Egészségesek közt homozigóta N34S allélt nem találtak. Meglepetésre a heterozigóta és homozigóta betegek között nem lehetett klinikai különbségeket megfigyelni. Ezeknek az adatoknak az analízise három N34S asszociált pancreatitis hipotézishez vezetett, mely szerint pancreatitis abban az esetben fejlődhet ki, ha valamely személy - vagy N34S homozigóta hordozó - vagy N34S heterozigóta és alkoholos abúzus áll fenn - vagy N34S hordozó és legkevesebb egy másik genetikai rizikófaktor is fennáll. 17

PSTI mutáció aminosav változás esetszám -215G>A promoter 1-215G>T promoter 1-53C>T 5' UTR 1 2T>C M1T 1 c.27delc 2 41T>C L14P 1 c.87+1g>a 2 intron 1 101A>G N34S > 200 150T>G D50E 1 160T>C Y54H 1 163C>T P55S <10 194G>A R65Q 1 IVS3+2T>C 3 intron <10 IVS3+125C>A 3 intron 1 IVS3+184T>A 3 intron <10 199C>T R67C 1 2. táblázat A PSTI (SPINK1) gén örökletes pancreatitissel összefüggő ismert mutációi Vastag betűvel az egynél nagyobb esetszámú mutációkat (polimorfizmusok nélkül) jelöltem 2.2.3.3. Egyéb mutációk szerepe A vizsgálati adatok azt mutatják, hogy az örökletes pancreatitis poligénes betegség. A tripszinogén és PSTI géneken kívül más géneket is vizsgáltak. A CFTR gén mutációi okozta cisztikus fibrózis betegek 85 %-ának van pancreatitis érintettsége is ( 1 ). A leggyakoribb CFTR mutáns hordozó újszülöttek immunreaktív vér tripszinogén szintjét vizsgálva emelkedett tripszinogén szintet mutattak ki ( 55 ). Az α1-antitripszin egyike a szérumban található legfontosabb proteáz inhibitoroknak( 56 ). Az α1- antitripszin deficienciát összefüggésbe hozták májelégtelenséggel ( 57 ) és pulmonáris 18

emphysemával ( 58 ). Krónikus pancreatitisben is fontos szerepe lehet, mert védheti a pancreast az önemésztődés ellen a proteáz gátlásával. Az eddigi vizsgálatok eredménye nem egyértelmű. Az α1-antitripszin fenotípusának és szérumszintjének vizsgálata egyes esetekben korrelációt mutatott a krónikus pancreatitissel ( 59, 60, 61, 62, 63 ), míg mások nem találtak asszociációt ( 64, 65, 66, 67 ). 2.3. Tripszin A tripszin egyike a legrégebben tanulmányozott és legismertebb fehérjéknek. A tripszinek neutrális szerinproteázok, közös jellemzőjük a szubsztrátspecificitás. Bázikus aminosavak, tehát arginin és lizin mellett hidrolizálják a peptidkötést. A humán tripszinogénnek négy izoenzime ismert, jelen dolgozatban kationos tripszinogén, anionos tripszinogén, mezotripszinogén és agyi tripszinogén névvel különböztetem meg őket. 2.3.1. Tripszinogén szerkezete A tripszinogének aminosav szekvenciája ismert, meghatározták a kationos tripszin, mezotripszin és agyi tripszin háromdimenziós szerkezetét is. Az agyi tripszin kristályos szerkezetét magyar kutatócsoport írta le ( 68 ). A pancreasban expresszálódó három izoforma (kationos tripszin, anionos tripszin, mezotripszin) felépítésére jellemző, hogy a pretripszinogén egy 15 aminosavból álló szignál peptidből, 8 aminosavból álló aktivációs peptidből és 224 aminosavból álló tripszinből áll (2. ábra). 19

szignál peptid TAP Tg1 --MNPLL-ILTFVAA---------- ALAAPFDDDDKIVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQ 56 Tg2 --MNLLL-ILTFVAA---------- AVAAPFDDDDKIVGGYICEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLISEQ 56 Tg3 --MNPFL-ILAFVGA---------- AVAVPFDDDDKIVGGYTCEENSLPYQVSLNSGSHFCGGSLISEQ 56 H D Tg1 WVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVST 125 Tg2 WVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPKYNSRTLDNDILLIKLSSPAVINSRVSA 125 Tg3 WVVSAAHCYKTRIQVRLGEHNIKVLEGNEQFINAAKIIRHPKYNRDTLDNDIMLIKLSSPAVINARVST 125 / Tg1 ISLPTAPPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKD 194 Tg2 ISLPTAPPAAGTESLISGWGNTLSSGADYPDELQCLDAPVLSQAECEASYPGKITNNMFCVGFLEGGKD 194 Tg3 ISLPTAPPAAGTECLISGWGNTLSFGADYPDELKCLDAPVLTQAECKASYPGKITNSMFCVGFLEGGKD 194 S * * Tg1 SCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS 247 Tg2 SCQGDSGGPVVSNGELQGIVSWGYGCAQKNRPGVYTKVYNYVDWIKDTIAANS 247 Tg3 SCQRDSGGPVVCNGQLQGVVSWGHGCAWKNRPGVYTKVYNYVDWIKDTIAANS 247 2. ábra A pancreatikus tripszinogén izoenzimek aminosavsorrendje A tripszin működésében kitüntetett aminosavak a következők: vastag : szignálpeptid narancs : tripszinogén aktivációs peptid vastag piros : katalitikus triád (H, D, S-sel is jelölve) aláhúzott : kötőzsebben lévő glicinek (csillaggal is jelölve) vastag dőlt : mezotripszin és agyi tripszin inhibitor rezisztenciájáért felelős arginin 198 vastag dőlt aláhúzott : a szubsztrátspecificitásért felelős aszparaginsav (/-gal is jelölve) A tripszinek a peptidkötés hidrolízisét a szerin200-hisztidin63-aszparaginsav107 katalitikus triád segítségével végzik. A szerin proteázok által katalizált hidrolízis részletesen ismert folyamat, mechanizmusát biokémiai tankönyvek részletesen ismertetik ( 69, 29. és 222. o.), ezért leírásától eltekintek. A szubsztátspecificitás a kötőzsebben található konzervatív aszpartát194 és két glicin (Gly221, Gly231) segítségével biztosított. Az aszpartát negatív töltése révén erős ionos kötést képes létesíteni a szubsztrát argininjével vagy lizinjével. A két glicin szerepe az, hogy a kötőzsebbe bekötődhessenek a nagy oldallánccal rendelkező aminosavak is. A tripszin inaktív formában, tripszinogénként szintetizálódik. A tripszin aktivációja limitált proteolízissel történik, ennek során a nyolc aminosavból álló 20

tripszinogén aktivációs peptid lehasad a tripszinről. A vékonybélben ezt a hasítást specifikusan az enteropeptidáz végzi. A tripszinogén aktivációs peptid konzervatív felépítésű, összetétele a halaktól az emlősökig hasonló. A hasítóhely általában lizin, ami előtt savas karakterű aszparaginsavak (2-4) találhatóak. A lizin és az aszparginsavak egyaránt késleltetik az idő előtti aktivációt. A tripszin arginin mellett 2-10-szer nagyobb sebességgel hasít, mint lizin mellett ( 70 ). Az arginin guanidinocsoportja közvetlenül alakít ki ionos kötést a kötőzsebben található aszpartáttal, míg a lizin kisebb mérete révén nem képes elérni az aszpartátot, a két aminosav között egy vízmolekula közvetíti a kötést. Az aktivációs peptidben lizin jelenléte arginin helyett tehát csökkent autoaktivációs sebességet jelent. Az aktivációs peptid aszpartátjai negatív töltésük miatt gátolják a kötőzseb aszpartátjának bekötődését, ezért jelentenek csökkent autoaktivációs sebességet ( 71 ). Az Asp 4 szekvencia emlősökben erősen konzervált struktúra, a lizinnel együtt az enteropeptidáz specifikus hasítóhelyét adják. Az Asp-Asp-Asp-Asp-Lys szekvencia így a tripszinogén csökkent autoaktiválásán kívül lehetővé teszi, hogy az enteropeptidáz specifikusan aktiválja a tripszint. A tripszinogén aktivációs peptidben lévő negatív töltések árnyékolásával az autoaktiválás sebessége nő. A Ca 2+ hozzákötődik az aktivációs peptidhez, így csökkentve annak negatív töltését. Alacsony ph értéknél (ph<5) az aszparaginsav protonálódik, ami szintén a negatív töltések semlegesítését jelenti. Savas közegben emiatt nincs szükség autoaktivációhoz Ca 2+ -ra, a Ca 2+ nem növeli az autoaktiváció sebességét. Érdekes, hogy a tripszinhez hasonlóan az enteropeptidáz is nagyobb sebességgel hasít arginin mint lizin mellett. A természetben mégis lizin található argininnel szemben az aktivációs peptidben. Az ebből fakadó hátrány úgy tűnik kisebb, mint az előny, ami a csökkent autoaktivációból (idő előtti aktiválásból) származik. Az aktivációs peptidben található K23R mutációt egy német munkacsoport rövid, az aktivációs peptid szekvenciáját is tartalmazó peptiddel modellezte. A peptid emésztését vizsgálva azt tapasztalták, hogy az arginint tartalmazó változatot 12,5-szer nagyobb sebességgel hasította a tripszin a lizint tartalmazó változathoz képest ph=8,0-nál. Az arány csökkent a ph csökkentésével ( 72 ). Érdekes megfigyelés, hogy a tripszinogén aktivációs peptidhez hasonló szerkezetű, kis méretű (1 kda alatti), néhány aminosavból álló, legalább négy, egymást követő aszparaginsavat tartalmazó peptideknek antibakteriális hatása van. Ide tartoznak 21

a tüdőben található SAAP-ok (Surfactant-Associated Anionic Peptides), valamint egyes prohormonok, proenzimek aktivációs peptidjei, beleértve a tripszinogén aktivációs peptideket is. Marha tripszinogén aktivációs peptidet összehasonlítva SAAP pal azt tapasztalták, hogy közel azonos koncentrációban akadályozták meg a baktériumok szaporodását. Pasteurella haemolytica esetén tized mm, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginose, Staphyloccus aureus esetén közel 1 mm volt az a peptidkoncentráció, ami megakadályozta a baktériumok növekedését ( 73 ). A vékonybél lumenjének tripszin (tripszinogén aktivációs peptid) koncentrációja kb. 40 μm, ami a teljes gátláshoz nem elég. A vékonybél epiteliális sejtjeinek mikrokörnyezetében, a mucózus rétegben a defenzinekkel együtt feltehetően hatásos lehet. Kationos tripszinogén Arg122 szerepe A kationos tripszinogén 122-es pozícióban lévő arginin a fehérje felszínén található, a tripszin számára könnyen elérhető. Emiatt azt hitték, hogy az Arg122 melletti peptidkötés hasítása a tripszin(ogén) degradáció első lépése. Az R122H mutáció ezt az autolitikus helyet megszűntetve egy stabil, az autolízisnek ellenálló tripszint, szupertripszint hozna létre. Ez a mutáció tehát elősegítené pathológiás körülmények között a magas tripszinszint létrejöttét ( 41 ). A humán tripszinogénnek hat néma és három expreszálódó génje van. Ezek négy tripszinogén izoformát eredményeznek, mert a tripszinogén 3 génnek alternatív splicing miatt két formája létezik ( 74 ). A tripszin izoformáknak több elnevezésük is ismert (3. táblázat) ( 75 ). Jelen munkában a kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén elnevezést használom. Eredetileg a tripszin izoformáit elektroforetikus mozgékonyságuk alapján különböztették meg, innen ered a kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén elnevezés (3. ábra). 22

3. ábra Humán tripszinogén izoenzimek gélelektroforetikus képe 100 ul 2 μm Tg liofilizálás után 12 %-os natív gélen futtatva (0,1 M Tris/HCl ph=8,5), Coomassie blueval festve 23

Gén cdns Protein elnevezése Molekulatömeg IP Da T1 (pszeudogén) T2 (reliktum gén) T3 (pszeudogén) T4 (PRSS1) TRY I Kationos tripszinogén 23438 6,2 (jelen munkában) Tripszinogén 1 TAT 1 Tripszinogén 3 T5 (pszeudogén) T6 (nincs produktum) T7 (pszeudogén) T8 (PRSS2) T9 (PRSS3) TRY II Anionos tripszinogén (jelen munkában) Tripszinogén 2 TAT 2 Tripszinogén 1 TRY III Mezotripszinogén (jelen munkában) Tripszinogén 3 TRY IV Agyi tripszinogén Tripszinogén 4 25006 4,9 24348 5,7 24218 7,6 3. táblázat Tripszinogén gének és izoformák jellemzői A kilenc tripszinogén gén közül nyolc a VII kromoszómában, a 7q35 kromoszóma régióban lokalizálódik, míg egy, a PRSS3 gén (mezotripszinogén) a IX 24

kromoszómán, a 9p13 kromoszóma régióban található. Az expresszálódó tripszinogéneknek 5 exonja van. A humán tripszinogénekben jellemzően kevesebb diszulfid híd található, mint az analóg emlős tripszinogénekben. A kationos tripszinogénben és mezotripszinogénben öt, az anionos tripszinogénben négy diszulfid híd található ( 76, 77 ). 2.3.2. Pancreatikus tripszinogén A tripszinogének legnagyobb mennyiségben a pancreasban termelődnek pretripszinogén formában. A pancreatikus tripszinogéneket a pancreas acinus sejtjei termelik a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon. A szignálpeptid lehasítása után a tripszinogén a Golgi komplexbe transzportálódik, koncentrálódik, a szekretorikus vezikulumokban tárolódik, és a pancreatikus vezetéken keresztül ürül hormonális és neurális stimulusokra. A doudenumban az enteropeptidáz aktiválja a tripszinogént, majd az aktív tripszin itt aktiválja a többi emésztőenzimet (4. ábra). A tripszinogén a hasnyál fehérjemennyiségének kb. 20 %-a ( 78 ). Elsősorban két izoforma expresszálódik, a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén. Fiziológiás esetben a tripszinogén 60-65 %-a kationos tripszinogén, 30-35 % anionos tripszinogén a maradék 3-10 % pedig mezotripszinogén. Pathológiás esetekben (alkoholizmus, pancreatitis) a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén aránya megfordulhat (kationos tripszinogén:anionos tripszinogén=1:2). A tripszinogén összmennyisége nőhet (alkoholistáknál), vagy akár csökkenhet is (pancreatitises betegeknél) ( 79 ). 25

enteropeptidáz Tg PAR2 aktív PAR2 Tr prokarboxipeptidáz karboxipeptidáz kimotripszinogén proelasztáz prokolipáz profoszfolipáz kimotripszin elasztáz kolipáz foszfolipáz 4. ábra Az emésztési kaszkád aktiválása a vékonybélben 1978-ben Rinderknecht és munkatársai fedezték fel, és különítették el hasnyálból és pancreas szövetből a mezotripszinogént ( 80 ). Nevét elektroforetikus mobilitása alapján kapta, tudniillik a mezotripszin gélelektroforézis során a már két ismert izoforma közé vándorolt (3. ábra). Felfigyeltek arra a szokatlan tulajdonságára is, hogy a mezotripszin proteáz inhibitorokkal szemben rezisztenciát mutat. A humán mezotripszinhez hasonló inhibitor rezisztens proteáz szerepét az inhibitor emésztésben Broadway 1997-ben rovarokon mutatta ki. 1% szója tripszin inhibitor tartalmú táplálékot etetve rovar lárvákkal az inhibitor rezisztens proteáz mennyiségének és aktivitásának növekedését tapasztalta ( 81 ). Az inhibitor rezisztencia az állatvilágban már az evolúció korai szakaszában megjelent. A már említett rovarokon kívül kimutatták a tüskésbőrűekhez tartozó tengeri csillagban is ( 82 ), míg kutyában, szarvasmarhában, sertésben, patkányban, egérben, hörcsögben nem sikerült azonosítani ( 72 ). Amíg munkacsoportunk nem tisztázta, a mezotripszin szerepe titokzatos volt. Több szerepet is tulajdonítottak neki. Feltételezték, hogy védő funkciója van a pancreasban. Mivel a mezotripszin rezisztens a PSTI-vel szemben, ha a pancreasban megjelenik a tripszinogéneket lebontja és így csökkenti a lehetséges tripszin mennyiséget, redukálva a gyulladásos folyamatokat is ( 72 ). Ezt a szerepet a mezotripszin 26

nem tudja betölteni, mert képtelen a fehérjék gyors degradációjára ( 48 ). Mások az inhibitor rezisztencia miatt a mezotripszint mint a pancreatitis okát vélték megnevezni, mert rezisztenciája miatt inhibitor mellett is képes az aktivációs kaszkádot elindítani ( 83 ). Ez az elmélet is hibás, mert a mezotripszin a degradáció mellett az aktivációra is képtelen ( 48 ). Egyesek a mezotripszinre úgy tekintettek, mint funkcióját vesztett evolúciós melléktermékre ( 84 ). Munkacsoportunk mutatta be, hogy a mezotripszin képes gyorsan tripszin inibitorokat (PSTI, SBTI) bontani akkor is, ha az inhibitor nagy feleslegben van. A mezotripszin fziológiás szerepe tehát a tápcsatornában lévő tripszin inhibitorok lebontása lehet ( 48 ). Ehhez kis mennyiségű mezotripszin is elegendő, és ez magyarázatul szolgál arra is, hogy a mezotripszinogén a pancreatikus tripszinogén mindössze 3-10 %- a. Hasnyál ürítés szabályozása Emberben a hasnyálürítés idegi és hormonális szabályozás alatt áll. A pancreasnedv szekréció szempontjából a kolecisztokinin a legfontosabb hormon. A kolecisztokinin a pancreas acinussejtek enzimszekrécióját fokozza, valamint szekretin jelenlétében a pancreas kivezetősejtek elektrolitszekrécióját is növeli. Ezen kívül a kolecisztokinin hatásai közé tartozik, hogy az epehólyagot összehúzza, a gyomor ürülését lassítja, a bélperisztaltikát fokozza, ellazítja az Oddi sphinctert, gátolja a táplálékfelvételt. A patkánynak két PSTI analóg fehérjéje van. Az egyik, a monitor peptid kolecisztokinin releasing peptidként hat. A monitor peptid a pancreas nedv szekrécióját fokozta, míg a bélbe juttatott hasnyál csökkentette azt. A PSTI szekvenciák hasonlósága miatt felmerült az ötlet, hogy emberben a PSTI hasonló szereppel is bírhat, mint a patkány monitor peptidje. Betegeknél ha a képződő hasnyálat a testen kívülre vezették, a hasnyálszekréció nőtt. A bélbe juttatott tripszin vagy hasnyál a szekréciót viszont csökkentette. A vékonybélbe juttatott PSTI viszont nem befolyásolta a szekréciót ( 30 ). 27

2.3.3. Extrapancreatikus tripszin A tripszinogén legnagyobb mennyiségben a pancreasban termelődik, ahol három izoformája (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén) található meg. A pancreason kívül a kationos tripszinogént Paneth sejtekben, vékonybélben, gyomorfalban mutatták ki. Tripszinogén mrns-t azonosítottak bőrben, nyelőcsőben, gyomorban, vékonybélben, tüdőben, vesében, májban, epevezetékben, idegszövetben, makrofágokban, monocytákban, lymfocytákban is. A szérum tripszinkoncentrációja egészséges emberekben 15-26 μg/l. Az anionos tripszinogén jellemzően előfordul egyes carcinómákban is. Ezért tumor associated trypsinogen-nek (TAT) is nevezik. Ovárium-, gyomor-, colorectalis-, pancreas-, vastagbél- és tüdőcarcinomában mutatták ki ( 85, 86, 87 ) A hím genitáliákban (testis, ondóhólyag, ondóvezeték, húgycső) is kimutatták mind a kationos tripszinogént mind az anionos tripszinogént, a humán ondóban a koncentrációjuk meglehetősen magas, 0,4 (kationos tripszinogén) és 0,5 (anionos tripszinogén) mm volt ( 88 ), ami összemérhető a pancreasban található mm koncentrációval. Szerepük még tisztázásra vár. Az extrapancreatikus tripszinogének közül a legkarakterisztikusabb az agyban, idegszövetben termelődő tripszinogén, amit jellegzetes előfordulási helyéről agyi tripszinogénnek is neveznek. Az agyi izoforma az agyi idegszövetre jellemző. Az agyi tripszin kristályos szerkezetét magyar kutatócsoport közölte ( 67 ). Az agyi tripszinogén a mezotripszinogén alternatív splicingjának terméke. Proteáz aktivált receptorok A sejthártyában található, a szignált G fehérjék által közvetített receptorok csoportjába tartoznak a proteáz aktivált receptorok (PAR). A PAR családot négy típusra lehet osztani (PAR1, PAR2, PAR3 és PAR4). Ezek közül tripszinnel a PAR2 és PAR4 aktiválható. A PAR-ok főbb jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze. 28

Lokalizáció Potenciális endogén aktivátor Potenciális endogén inaktivátor szerepe PAR1 PAR2 PAR3 PAR4 Agy, tüdő, szív, Prosztata, vese, Szív, vese, Tüdő, pancreas, vastagbél, vese, testis Trombin, tripszin, granzim Katepszin G, elasztáz, plazmin, proteináz3 Sejtosztódás, vérlemezke aggregáció, Ca 2+ szint emelkedés Gyomor, bél kontrakció, relaxáció vékonybél, vastagbél, pancreas, máj, thymus, pajzsmirigy, vékonybél, pancreas, trachea vékonybél, placenta, testis, nyirokrendszer, vázizom, gyomor, trachea mellékvese, prosztata, méh, vastagbél Tripszin, triptáz, Trombin Trombin, faktor Xa, tripszin, prokonvertin, katepszin G MT-SP1 elasztáz, Katepszin G, plazmin, elasztáz proteináz3 Bél kontrakció, Lassú hatású Vérlemezke motilitás csökentése, Ca 2+ trombin receptor aggregáció szint emelkedés, pancreas nedv szekréció, Cl - szekréció, leukocita migráció 4. táblázat PAR-ok jellemzése ( 89, 90, 91, 92 ) A PAR2 kimutatható a pancreasban is. Marha pancreassal végzett kísérlet azt mutatta, hogy 3 μm tripszinnel végzett aktiváció 2,8 μmol/óra/cm 2 -ről 0,4 29

μmol/óra/cm 2 -re csökkentette a pancreas ductus bikarbonát szekrécióját. A pancreasban megjelenő szabad tripszin emiatt szerepet játszhat a pancreatitisben megfigyelhető csökkent bikarbonát ürítésben is ( 93 ). A PAR2 gátlása így potenciális lehetőséget nyújt a pancreatitises betegek bikarbonát szekréciójának normalizálására. A képet árnyalja az a tény, hogy PAR2 knock out egerekben súlyosabb cörulein indukált akut pancreatitist lehetett generálni, mint vad típusú egerekben. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a PAR2-nek védő szerepe lehet a pancreatitis ellen ( 94 ). A PAR2 aktiválása serkenti a pancreas tumorsejtek osztódását, valamint a ciklooxigenáz 2 expresszióját is. A PAR2 szignál transzdukció gátlásával új stratégiai út nyílt meg a pancreas tumorok növekedésének visszaszorítására és a gyulladás enyhítésére ( 95 ). 2.4. PSTI A PSTI (SPINK1, serine protease inhibitor Kazal type1) tripszininhibitor, legismertebb szerepe az, hogy a pancreast védje a nemkívánatos tripszinaktivitástól. A PSTI génje az V. kromoszómán található, 7,5 kbp nagyságú, 4 exont tartalmaz. A PSTI 79 aminosavból álló fehérje, ami 23 aminosavból álló szignálpeptidet tartalmaz. Az érett fehérje 56 aminosavból áll, mérete 6500 Da. A méretéhez képest sok, 3 diszulfidkötést hordoz. Ez rideg fehérjeszerkezetet eredményez. A PSTI reaktív helye, ami interakcióba lép a szerinproteázokkal a Lys18. A PSTI cdns-t már 1985-ben izolálták és meghatározták a nukleotidszekvenciáját ( 96 ). A PSTI a vékonybélben degradálódik, inhibitor hatását már nem fejti ki. Emiatt időleges tripszininhibitornak nevezte el a jelenséget leíró Laskowski ( 97 ). A PSTI lebontása két úton történik: a, kationos tripszin és anionos tripszin akkor képes bontani, ha feleslegben van a PSTIhez képest. Az aktív tripszin ekkor a komplexben található PSTI-t hasítja: Tr + PSTI = TrPSTI TrPSTI + Tr = 2 Tr + degradált PSTI 30

Ha a PSTI feleslegben van a tripszinhez képest, a degradáció nagyon lassú, hetekig nem történik változás. A pancreasban spontán keletkező tripszinaktivitást tehát a PSTI eliminálja. A vékonybélben a tripszinogént elsősorban az enteropeptidáz aktiválja, és az enteropeptidázra nem hat a PSTI. A keletkező tripszin, mivel a PSTI a tripszinogén kb. 20 %-a, feleslegben lesz az inhibitorhoz képest, a lebontása tehát akadálymentesen végbemehet. b, A mezotripszin nem kötődik a PSTI-hez, degradációját az inhibitor feleslegében is elvégzi. mezotripszin + PSTI = mezotripszin + degradált PSTI A vékonybélben is végbemehet a reakció, de mivel a mezotripszin az összes tripszinnek csak 3-10 %-a, a vékonybélben történő mezotripszin általi PSTI emésztés nem lehet jelentős. Pathológiás körülmények között, pl. pancreasban a katepszin B általi mezotripszin aktiváció azt eredményezi, hogy a tripszin izoenzimek közül csak a mezotripszin aktív, a másik kettőt a PSTI inaktív állapotban tartja. A mezotripszin ebben az esetben elbonthatja a PSTI-t és így elősegítheti a tripszin autoaktivációját. A PSTI koncentrációja szérumban 3-16 μg/liter. Ez a koncentráció nem változik pancreas eltávolítása után sem, tehát a PSTI nem kizárólagosan pancreas eredetű. Megtalálták a PSTI-t ováriumban, gyomorban, vastagbélben, epehólyagban, vesében, tüdőben, emlőben is. A második trimeszterben az amnionfolyadékban a koncentrációját 160 μg/liternek mérték. Ez az anyai szérumban található koncentráció 20-szorosa volt. A terhesség előrehaladtával az arány kb. 5-szörösre csökkent ( 98 ). Feltételezik, hogy emésztőtraktusban a PSTI a mucosat védi a tripszintől. 31

PSTI-t kimutatták tumorokban is, ezért TATI-nak (Tumor Associated Trypsin Inhibitor) is nevezik. Ovárium-, cervikális-, endometrium-, pancreas-, tüdő-, máj- és emlőtumorokban figyelték meg a jelenlétét. Ovárium tumoroknál ciszta folyadékban benignus esetekben átlagosan 2700 μg/liter, míg malignus esetekben 6600 μg/liter koncentrációt mértek. Mivel a PSTI az epidermális növekedési faktorhoz (EGF) hasonló (méret, aminosavszekvencia, 3 diszulfid híd), feltételezik, hogy esetleg az EGF receptorokhoz kötődve a sejtek osztódását segíti elő ( 29, 99 ). 32

3. Célkitűzések 1. Rekombináns tripszinogének jellemzése Munkánk egyik célja a natív humán tripszinogén izoformák (anionos-, kationos tripszinogén, mezotripszinogén), valamint a herediter krónikus pancreatitisszel kapcsolatban leírt tripszinogén mutánsok biokémiai jellemzése az acinus sejtekre, a duodenumra és a lizoszómákra jellemző ph értékek és Ca 2+ koncentrációk mellett. Vizsgálni kívántuk ezen körülmények között a tripszinogének autoaktivációjának, katepszin B-vel történő aktiválásának és autodegradációjának kinetikáját. Az eredményekből választ vártunk arra a kérdésre, hogy milyen biokémiai folyamatok lehetnek felelősek a krónikus pancreatitis kialakulásáért. 2. Az anionos tripszinogén szerepe a krónikus pancreatitisben Megfigyelték, hogy krónikus pancreatitisben megváltozik a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén mennyiségének aránya. Normálisan ez az arány 2/1, krónikus pancreatitisben ez megfordul és 1/2 arányt is elérhet. Feltételezve, hogy ennek a pathomechanizmusban vagy a betegséghez történő alkalmazkodásban lehet szerepe, vizsgálatainkban fiziológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén=2:1) és pathológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén=1:2) összetételű tripszinogén keverékek biokémiai viselkedéseit is jellemezni kívántuk. 3. Herediter pancreatitissel összefüggő tripszinogén aktivációs peptid mutációinak vizsgálata A kationos tripszinogén eddig ismert tripszinogén aktivációs peptid mutációi (A16V, D22G, K23R) mellett munkatársaink egy új mutációt, a kationos tripszinogén D19A mutációját azonosították. Mivel ezen mutációkat krónikus pancreatitisszel kapcsolatban írták le, vizsgálatainkat kiterjeszteni kívántuk ezek biokémiai jellemzésére is. E célra 3 mutációt választottunk ki (D19A, D22G, K23R). E három mutáció azért 33

volt számunkra különösen érdekes, mert a tripszin aminosav szekvenciáját nem érintik, ezért a tripszin eredeti tulajdonságait nem befolyásolják, várhatóan e mutációk a tripszinogén tripszin átalakulás és az autokatalizáció herediter pancreatitisszel kapcsolatos jelentőségének vizsgálatára különösen alkalmasak. 4. Az Arg122 helyen hasított kationos tripszinogén inhibitor tulajdonságának biokémiai jellemzése A kationos tripszinogén Arg122 helye feltételezett autolitikus hasítási pont, ennek R122H mutációjával a kationos tripszin autodegradációjának sebessége csökken. Eredeti célunk annak tanulmányozása volt, hogy az Arg122-Val123 kötés hidrolízisének milyen hatása van az autolízisre. Az Arg122-Val123 kötés hidrolízisével a peptidláncot diszulfidkötés tartja egyben, ennek alapján a hasított, kétszálú forma (Tg1 * ) elkülöníthető az intakt formától és vizsgálható. A Tg1* formáról vizsgálataink során kiderült, hogy a többi vizsgált tripszinogénnel szemben inhibitor tulajdonsággal rendelkezik. Ezért célul tűztük ki ezen forma tripszin inhibitor tulajdonságának biokémiai jellemzését. 34

4. Módszerek Mutagenezis A tripszinogén mutánsokat ptrap T7 expressziós plazmidban készítettük el. Egy szintetikus oligonukleotid linker kódolta a mutációt, amit NcoI és EcoRI helyeken ligáltunk. A K15Q/R117H mutációt EcoRI-SacI klónozásával készítettük ptrap-t7/r117h plazmidból ptrap-t7/k15q plazmidba. Munkám során a transzfektált Escherichia coli törzseket készen kaptam (Sahin- Tóth M), a munkafolyamatokat az expressziótól végeztem. Tripszinogén expressziója és tisztítása A tripszinogén expresszióját Rosetta (DE3) sejtek 800 ml-es tenyészetében végeztük Luria-Bertani médiumban 50 μg/ml carbenicillin és 34 μg/ml klóramfenikol mellett. A sejteket OD 600 0,5-ig növesztettük, ekkor az indukciót 1 mm izopropil-1-tioβ-d-galaktopiranoziddal végeztük, és további 5 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, majd 60 cm 3 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0), 5 mm EDTA oldatban reszuszpendáltuk és French press-szen nyomtuk át 25000 psi-n. Kis térfogatú (25 ml) sejttenyészetből származó lecentrifugált sejtekből ultrahangos feltárással (jégen 30 másodperc 2/3-os teljesítménnyel) is nyertünk zárványtesteket. A tripszinogént tartalmazó zárványtesteket centrifugálással gyűjtöttük és kétszer mostuk 25 cm 3 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) 5 mm EDTA oldattal. A zárványtestek oldatba vitelét és a tripszinogén refoldingját 0,9 M guanidin, 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0), 1 mm cisztein, 1 mm cisztin oldattal végeztük argon atmoszférában 15 percig szobahőn, majd 4 o C-on egy éjszakán keresztül. Az oldatot kétszeres térfogatra hígítottuk 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0)-dal, majd a tripszinogént ecotin affinitás kromatográfiával tisztítottuk meg 50 mm HCl eluáló oldattal. A zimogén koncentrációját 280 nm-es abszorbancia alapján határoztuk meg kationos tripszinogén 36160 M -1 cm -1 anionos tripszinogén 37320 M - 1 cm -1 moláris extinkciós koefficienssel számolva. 35

A kationos tripszinogén és Tg1 * izolálása A vad típusú kationos tripszinogént 1 mm EDTA jelenlétében 37 o C-on autoaktiváltuk 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0)-ben 2 órán keresztül. A K15Q kationos tripszinogén mutánst K15Q:wt=250:1 arányban vad típusú tripszinnel hasítottuk 37 o C- on 20 percig 1 mm EDTA, 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0)-ben. Inkubálás után azonnal Mono Q 5/5 oszlopra vittük a mintát, ekvilibráltuk 20 mm Tris/HCl (ph=8,8) dal. A kationos tripszinogént és Tg1 * -t 0-0,5 M NaCl líneáris grádiens oldattal eluáltuk és szeparáltuk. Adott körülmények között a tripszin nem kötődik az oszlophoz, így az átesőben jelent meg. A tripszinogén autoaktivációja A tripszinogének autoaktivációját, katepszin B-vel történő aktivációját, autolízisét a pancreasra jellemző modellkörnyezetekben végeztük el. Ezek a következők voltak: a, acinus sejtek ph=8,0 (Tris/HCl puffer) és alacsony Ca 2+ szint vagy Ca 2+ hiány b, duodenum ph=8,0 és milimólos Ca 2+ koncentráció c, lizoszómák ph=5,0 (Na-acetát puffer) A tripszinogént 2 μm koncentrációban, 37 o C-on inkubáltuk 0,1 M Tris/HCl-ban (ph=8,0) vagy 0,1 M Na-acetátban (ph=5,0) a jelzett CaCl 2 vagy EDTA koncentrációknál. Meghatározott időnként 2,5 μl mintát vettünk tripszin aktivitás méréshez. A tripszin aktivitást 200 μm mesterséges kromogén szubsztrát (glicil-prolilarginil-p-nitro-anilid, GPR-pNA) jelenlétében végeztük 22 o C-on 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0), 1 mm CaCl 2 -ban. A kromofór (p-nitroanilid) felszabadulás kinetikáját 405 nm-en követtük. 36

Gélelektroforézis és denzitometrikus analízis A mintákat Eppendorf csövekben 10 %-os végkoncentrációjú triklórecetsavval precipitáltuk, jégen tartottuk 10 percig, centrifugáltuk (14000 rpm, 10 perc), majd a csapadékot 20 μl Laemmli mintapufferben 1 μl 2 M NaOH-ban, 2 ul 1 M ditiotreitolban oldottuk, 90 o C-on 5 percig denaturáltuk. Az elektroforézist 12 %-os SDS PAGE gélen végeztük. A géleket Coomassie Brilliant Blue R-rel festettük 30 percig, majd éjszakán át 30 % metanol, 10 % ecetsavban mostuk. A géleket két réteg celofán között szárítottuk (Gel-Dry kittel). A száraz géleket 600 dpi felbontással szürkeskálában szkenneltük. A csíkok kvantifikációját ImageQuaNT 5.2 szoftverrel végeztük el. A natív gélelektroforézishez 100 μl 2 μm tripszinogént tartalmazó elegyet liofolizáltunk, SDS-t és ditiotreitolt nem tartalmazó 20 μl Laemmli mintapufferben oldottuk, forralás nélkül felvittük a gélre és elektroforetizáltuk. Számozás Jelen dolgozatban a tripszinogén számozását követem. 37

5. Eredmények 5.1. A kationos-, anionos- és mezotripszinogén vizsgálata 5.1.1. Az anionos tripszinogén jellemzése Az anionos tripszinogén expresziója Az anionos humán tripszinogént nekünk sikerült először rekombináns módszerrel előállítani. Az expressziót és tisztítást a Módszerekben leírtaknak megfelelően végeztük el. Az ecotin oszlopról egy egyszerű csúcsot eluáltunk, ami azt mutatta, hogy homogén tripszinogént kaptunk. A homogenitást ellenőriztük anioncserélő oszlopon (MonoQ), illetve molekulaszűrőn (Superose 6) is, amiken szintén egynemű csúcsot kaptunk. A tisztított anionos tripszinogént ellenőriztük SDS/PAGE gélen is, ahol az anionos tripszinogén molekulatömegének megfelelő homogén csíkot kaptunk. Az anionos tripszin (K M =11±1 μm, K cat =41±1 1sec -1 ) és kationos tripszin (K M =15±1 μm, K cat =50±1 1sec -1 ) katalitikus jellemzői hasonlóak a szintetikus kromogén GPR-pNA szubtráttal mérve. A rekombináns tripszinekkel összehasonlítható sebességgel hasítják a kis tömegű szubsztrátokat a natív tripszinek is ( 100, 101 ). Végezetül, a moláris extinkciós koefficiens alapján számolt anionos tripszinogén mennyiség 1:1 sztöchiometrikus arányban gátolható PSTI-vel. Az anionos tripszinogén autoaktivációja Az anionos tripszinogén autoaktivációját ph=8,0-on mind fiziológiás (0-1 mm) mind farmakológiás (20 mm-ig) Ca 2+ mellett mértük 2 μm tripszinogén koncentrációnál. 0-0,1 mm Ca 2+ koncentrációknál nincs mérhető anionos tripszin aktivitás (14. ábra). 0,1 mm Ca 2+ koncentráció felett a tripszinaktivitás már mérhető. Maximális tripszinaktivitást 20 mm Ca 2+ mellett mértünk. Az autoaktiválás sebessége 5 mm Ca 2+ koncentrációig nő, felette csökken, de magasabb tripszinszint érhető el. Az 38

autoaktiválást SDS/PAGE gélelektroforézissel is követtük (5. C ábra). 50 μm Ca 2+ koncentrációnál egy halvány tripszincsík látható, a tripszinogén pedig 30 perc alatt gyakorlatilag teljesen degradálódott, halványan kis molekulatömegű degradációs termékek jelennek meg. Tehát a tripszinaktivitás hiánya nem a lassú autoaktivációval, hanem a gyors degradációval magyarázható. 5 mm Ca 2+ mellett a tripszinogén jelentős része tripszinné alakul át 15 percen belül, a tripszin autolízise lassú. Degradációs termékek itt is megjelennek, de nem azonosak az 50 μm Ca 2+ koncentrációnál megfigyelhetőnél. Megjelenik egy 28 kda-os csík, és minden termék kifejezettebb, mint alacsony Ca 2+ koncentráció mellett. Ez arra utal, hogy a degradáció sebessége magasabb Ca 2+ koncentrációnál csökken, és alacsony Ca 2+ koncentráció mellett a gélen már nem látható kis molekulatömegű degradációs termékek keletkezése dominál. 39

5. ábra Az anionos tripszinogén autoaktivációja 2 μm anionos tripszinogén 100 μl végtérfogatban 37 o C-on inkubálva A és B panel aktivitásmérés 2,5 μl minta 140 μm GPR-pNA 100 %-os aktivitást enterokinázzal aktivált tripszinogén, 22 o C, ph=8,0, Ca 2+ =10 mm C panel 100 ml mintát 10 %-os TCA-val precipitáltunk, 12 %-os SDS/PAGE gélen futtatunk redukáló körülmények között, a gélt Coomassie Blue-val festettük Az anionos tripszinogén autoaktivációját kationos tripszinogén autoaktivációjával összehasonlítva több különbséget is észrevehetünk. Kationos tripszinogén vizsgálatánál már 10 μm Ca 2+ mellett is szignifikánsan megemelkedik a tripszin keletkezés sebessége (6. A ábra). Az autoaktiváció sebessége 1 mm Ca 2+ koncentrációig folyamatosan emelkedik, majd e felett a sebesség csökken. A Ca 2+ dependens autoaktiválás sebességének analízisét végezve (6. C ábra) megállapíthatjuk, 40

hogy az autoaktiválás Ca 2+ koncentrációtól való függése bifázisos. A görbe első része tipikus telítési görbe, melynek féltelítési értéke 15 μm Ca 2+ koncentrációnál található. A görbe második része líneáris emelkedést mutat. Eszerint a tripszin két Ca 2+ kötő hellyel rendelkezik, egy nagy és egy kis affinitásúval. A nagy affinitású kötőhely félmaximális aktivitást eredményező Ca 2+ koncentrációja (15 μm) gyakorlatilag megegyezik azzal a 20 μm Ca 2+ koncentrációval, ami félmaximálisan stabilizálja a kationos tripszint autolízis ellen. A Ca 2+ a kationos tripszint a Glu80 és Glu90 között található nagy affinitású kötőhelyre való bekötődéssel stabilizálja. A kis affinitású kötőhely Ca 2+ kötése 0,1-1 mm között a kationos tripszin autoaktiválás sebességének emelkedését okozza. A félmaximális sebességnövekedéshez tartozó Ca 2+ koncentrációt a CaCl 2 inhibitor sajátsága miatt nem lehetett megmérni. A gátló hatásért valószínűleg a magas ionerősség a felelős. 41

6. ábra Kationos tripszinogén autoaktivációja Az A és B panelben a kísérleti körülmények megegyeznek az 1. ábrában leírtakéval A C panel 1 egységnyi aktivitása a 0 mm Ca 2+ koncentrációnál mért autoaktiváció sebessége A kationos tripszinogén autoaktivációjának nyomonkövetése gélelektroforézissel már az értekezésen kívül eső munkában is megtörtént ( 102 ). A kationos tripszinogén autoaktivációja során a kationos tripszinogén 0,5-5 mm Ca 2+ koncentrációnál teljesen átalakul tripszinné. Itt emlékeztetni kell arra a tényre, hogy a kationos tripszin egy és két láncú formája egyensúlyban van egymással, így az aktív kationos tripszin megjelenik kis molekulatömegű, 15 kda-os csíkokban is. 42

A maximális tripszinszint elérése után nem csökken azonnal a tripszinaktivitás, ami arra utal, hogy a kationos tripszin az anionos tripszinnel összehasonlítva rezisztensebb az autolízisre (lsd. lejjebb). 100 mm NaCl gátolja a kationos tripszinogén autoaktivációját és autolízisét, és úgy tűnik, hogy a magas CaCl 2 koncentráció is a magas ionerőség miatt gátolja az enzimaktivitást. Humán tripszinogének degradációja ph=8,0-nál Már az autoaktivációs kísérleteknél is feltűnő, hogy az anionos tripszinogén autoaktivációjánál markáns degradációt lehet megfigyelni. A tripszinogének degradációjának pontos megfigyelése érdekében mindkét tripszinogénnek (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén) előállítottuk az aktív tripszinné át nem alakítható inaktív K23Q formáját, majd a degradációs kísérleteket az autoaktivációra rezisztens tripszinogénekkel végeztük. Az K23Q anionos tripszinogén 5 μm koncentrációban használtuk mint szubsztrátot, emellett 0,5 μm kationos tripszin volt mint enzim. Azért kationos tripszint használtunk enzimként, mert a kísérleti körülmények között és ideje alatt nem változott meg lényegesen az autolízis miatt a koncentrációja. A 7. A ábrán látható, hogy Ca 2+ mentes közegben (1 mm EDTA) a kationos tripszin gyorsan degradálja a K23Q anionos tripszinogént. A denzitometriás kiértékelés (7. C ábra) azt mutatta, hogy a féléletidő (t ½ ) 2,25 perc volt. 50 μm Ca 2+ négyszeres stabilizációt eredményezett, a féléletidő 10 percre tolódott ki (7. B és C ábra). Hasonló stratégiát alkalmazva a kationos tripszinogén lebontását vizsgálva (5 μm K23Q kationos tripszinogén, 0,5 μm kationos tripszin) a t ½ 45 perc volt ph=8,0-nál, Ca 2+ mentes közegben. Ez azt jelenti, hogy a kationos tripszinogén hússzor rezisztensebb az anionos tripszinogénhez képest a tripszinolitikus degradációval szemben. 43

7. ábra K23Q anionos tripszinogén degradációja kationos tripszinnel Kb. 5 μm anionos tripszinogént 0,5 μm kationos tripszinnel 100 μl térfogatban 37 o C-on emésztettünk 0,1 M Tris/HCl-ben (ph=8,0) 1 mm EDTA-ban (A) vagy 50 μm Ca 2+ (B) mellett. A reakciót a jelölt időpontokban 10 % TCA-val állítottuk le és redukáló SDS/PAGE gélen analizáltuk, Coomassie Blue festés mellett. C panel a kísérlet denzitometriás kiértékelése (n=3, SD<15 %) Humán tripszinogének autoaktivációja ph=5,0-nél Összehasonlítva a ph=8,0-nál bekövetkező gyors autoaktivációval, az anionos tripszinogén ph=5,0-nél jóval lassabban autoaktiválódik. Az autoaktiváció sebessége Ca 2+ dependens, 5 mm Ca 2+ koncentrációig nő. A maximálisan elérhető tripszinaktivitás az enteropeptidázzal elérhetőének kb. 30 %-a, ami erőteljes tripszinogén degradációra utal. 10 mm Ca 2+ a sebességet már nem növelte szignifikánsan. 20 mm Ca 2+ az 44

autoaktiválás sebességét csökkenti, de magasabb tripszinszintet eredményez. SDS/PAGE analízissel megvizsgáltuk, hogy miért nincs tripszin aktivitás Ca 2+ hiányában ph=5,0-nél. A jelenség hátterében nem a gyors anionos tripszinogén degradáció áll, mint az ph=8,0-nál megfigyelhető, hanem az, hogy savas közegben nincs zimogén aktiváció. 5 mm Ca 2+ jelenlétében idődependens módon jelenik meg az anionos tripszin csík a gélen, 120 percnél már masszív tripszincsík látszik, a tripszinné át nem alakult anionos tripszinogén pedig lebomlik (8. ábra). 8. ábra Az anionos tripszinogén autoaktivációja ph=5,0-nél Kb. 2 μm anionos tripszinogétn inkubáltunk 0,1 M Na-acetát pufferben (ph=5,0) (37 o C, 100 μl) a jelölt Ca 2+ koncentrációknál (A). Az enzimaktivitás mérése hasonló körülmények között történt, mint az 1. ábránál (A). B panel 100 μl (2 μm anionos tripszinogén) mintát 10 % TCA-val precipitáltuk, redukáló SDS/PAGE gélen elektroforezitáltuk és Coomassie Blue-val festettük. Ca 2+ mentes közegben a kationos tripszinogén ph=5,0-nél gyorsabban aktiválódik (9. A ábra) mint ph=8,0-nál. ph=5,0-nél 1 mm Ca 2+ koncentrációig enyhe 45

aktiváció sebességemelkedést figyelhetünk meg. 1 mm Ca 2+ felett 20 mm Ca 2+ -ig koncentrációdependens autoaktiválás sebességcsökkenést figyelhetünk meg. Az SDS/PAGE analízist megnézve látható, hogy Ca 2+ hiányában az anionos tripszinogén inaktív a vizsgálat 120 perce alatt, míg a kationos tripszinogén teljesen átalakul tripszinné ez idő alatt. Az átalakulás gyakorlatilag kvantitatív, zimogén degradáció nem figyelhető meg, 5 mm Ca 2+ csak enyhe autoaktiváció sebesség növelő hatással rendelkezik (9. C ábra). 46

9. ábra A kationos tripszinogén autoaktivációja ph=5,0-nél 2 μm anionos tripszinogént inkubáltunk 0,1 M Na-acetát pufferben (ph=5,0) (37 o C, 100 μl) a jelölt Ca 2+ koncentrációknál (A, B). Az enzimaktivitás mérése hasonló körülmények között történt, mint az 14. ábránál (A). C panel 100 μl (2 μm anionos tripszinogén) mintát 10 % TCA-val precipitáltuk, redukáló SDS/PAGE gélen elektroforezitáltuk és Coomassie Blue-val festettük. Az A és B csík magyarázatát lsd. az 5. ábránál. 47

Humán tripszinek degradációja ph=8,0-nál Korábbi kísérletek azt mutatták, hogy a natív humán tisztított anionos tripszin kevésbé stabil és autolízise gyorsabban történik, mint a kationos tripsziné ( 103, 104 ). A tripszin degradáció vizsgálatához enteropeptidázzal aktiváltunk tripszinogént tripszinné, majd tisztítottuk. Ca 2+ hiányában az anionos tripszin gyorsan degradálódott (t ½ =8 perc). A Ca 2+ már alacsony koncentrációban is stabilizálja a tripszint IC 50 = 5 μm (10. A és C ábra). 100 mm NaCl harmadára csökkenti az autolízis sebességét (t ½ =24 perc), és növeli a Ca 2+ IC 50 értékét a hatszorosára (IC 50 =30 μm) (10. C ábra). A kationos tripszin autolízise szignifikánsan lassúbb, Ca 2+ hiányában a t ½ =90 perc (11. A ábra). A két tripszin izoforma stabilitása között így több mint 11-szeres a különbség. A Ca 2+ IC 50 =20 μm értékkel stabilizálja a kationos tripszint az autolízis ellen (11. A és B ábra). 100 mm NaCl az autolízis sebességét 14-ed részére csökkentette, 50 %-os aktivitáscsökkenés Ca 2+ hiányában majdnem 21 óra alatt figyelhető meg. A sóérzékenységben tehát a két tripszin között nagyon jelentős a különbség. Az anionos tripszin aktivitását kevésbé csökkenti a NaCl, nagy sókoncentrációnál az anionos tripszin aktivitása magasabb a kationos tripszin aktivitásánál. 48

10. ábra Az anionos tripszinogén autolízise A tripszinogént enteropeptidázzal aktiváltuk és ecotin oszlopon tisztítottuk. Kb. 2 μm anionos tripszint 37 o C-on inkubáltunk 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) oldatban a jelölt Ca 2+ koncentrációknál. A panel anionos tripszin autolízise NaCl nélkül B panel anionos tripszin autolízise 100 mm NaCl jelenlétében C panel Ca 2+ hatása az autolízis relatív sebességére 100 mm NaCl jelenlétében ( ) és NaCl nélkül ( ) Egységnyi az autolízis sebessége Ca 2+ nélkül (1 mm EDTA) 49

11. ábra A kationos tripszinogén autolízise A tripszinogént enteropeptidázzal aktiváltuk és ecotin oszlopon tisztítottuk. Kb. 2 μm anionos tripszint 37 o C-on inkubáltunk 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) oldatban a jelölt Ca 2+ koncentrációknál. A panel anionos tripszin autolízise NaCl nélkül B panel anionos tripszin autolízise 100 mm NaCl jelenlétében C panel Ca 2+ hatása az autolízis relatív sebességére Egységnyi az autolízis sebessége Ca 2+ nélkül (1 mm EDTA) 5.1.2. A mezotripszinogén A mezotripszinogén a pancreatikus tripszinogének minor izoformája, a hasnyál tripszinogéntartalmának 3-10 %-a. Laboratóriumunkban sikerült először rekombináns mezotripszinogént előállítani és jellemezni. Dolgozatomban az öröklődő krónikus pancreatitissel szorosan kapcsolódó eredményeinket foglalom össze, ezért most a mezotripszinnel kapcsolatos fontosabb megállapításainkat csak röviden írom le az alábbiakban. A mezotripszinogén szekvenciaanalíziséből ( 105 ) és a benzamiddal kristályosított agyi tripszin struktúrájából arra következtettek, hogy az Arg198 okozza a tripszin inhibitor rezisztenciáját ( 66 ). Az R198G mezotripszinogén mutáns felhasználásával 50

megállapítottuk, hogy az R198G mezotripszin elveszíti inhibitor rezisztenciáját, gátolható PSTI-vel és BPSTI-vel egyaránt az inhibitor érzékeny tripszinekre jellemző 1:1=inhibitor:tripszin arányban és affinitással. Az R198G mezotripszin a mezotripszinnel ellentétben aktiválja a kationos - és anionos tripszinogént, a kimotripszinogént és elasztáz 2-t is. A fehérjékhez való affinitás csökkenése miatt a mezotripszin inhibitor rezisztenciáját tehát ténylegesen az Arg198 okozza. A mezotripszin fiziológiás funkciója ismeretlen volt, ezért munkánk során a mezotripszin lehetséges szerepének tisztázását is célul tűztük ki. Mivel a mezotripszin K M értéke PSTI-hez hasonló, mint a kationos tripszin K M értéke kimotripszinhez, felmerült, hogy a PSTI nem mint inhibitor, hanem mint szubsztrát viszonyul a mezotripszinhez. A mezotripszin a PSTI-t degradálta, a kationos és anionos tripszinnel ellentétben nagy PSTI felesleg esetén is. A mezotripszin hidrolizálja az SBTI aktív helyét is a doudenumra jellemző enyhén lúgos környezetben, 1 mm Ca 2+ mellett, tízszeres SBTI feleslegben is. Ez alapján jelentettük ki, hogy a mezotripszin fiziológiás funkciója valószínűleg a táplálékban található tripszin inhibitorok bontása lehet. Nagy inhibitor tartalmú élelmiszerek esetén (pl. szója, tök), a kationos - és anionos tripszint az inhibitor inaktív állapotban tarthatja, így a mezotripszinre gyakorolt degradatív hatásukkal az inhibitor bontásáig nem kell számolni. A mezotripszinogént aktiválja az enteropeptidáz, a kationos tripszin, az anionos tripszin és a katepszin B is. Enteropeptidázzal lehet elérni a legmagasabb mezotripszin szintet, degradáció ebben az esetben nincs. Meglepő, hogy a katepszin B a mezotripszinogént a másik két izoformánál nagyobb sebességgel aktiválja. Ez felveti a lehetőségét annak, hogy a mezotripszin pathogén tényező lehet a pancreatitis kialakulásában (lsd. Megbeszélés) ( 32 ). 5.1.3. Kölcsönhatások a kationos tripszinogén és anionos tripszinogén között: fiziológiás és pathológiás összetételű tripszinogének vizsgálata Az 5-11. ábrák a kationos tripszinogén és anionos tripszinogén autoaktiválását és degradációját mutatják be. A két izoenzim közötti különbségek azt sugallják, hogy a különböző tripszinogén összetételű hasnyálak stabilitása, aktivitása, aktivációja a tripszinogének arányától függően változhat. A változások in vitro modellezéséhez 51

különböző összetételű tripszinogének tulajdonságait vizsgáltuk. A kísérletekben két különböző keveréket használtunk. A fiziológiás keverék 2:1 arányban (67%:33%) tartalmazta a kationos tripszinogént és anionos tripszinogént. A pathológiás keverékben pedig a kationos tripszinogén:anionos tripszinogén arány 1:2 (33%:67%) volt. Az autoaktivációs kísérleteket ph=8,0-nál és ph=5,0-nél végeztük. ph=8,0-nál két Ca 2+ koncentrációt használtunk. 1 mm Ca 2+ koncentrációval a duodenum környezetét modelleztük, míg 50 μm Ca 2+ koncentrációval az intracelluláris környezetet imitáltuk. Az acinus sejtek Ca 2+ tartalma ennél kisebb, de 50 μm Ca 2+ mellett a reakciók sebessége elég nagy ahhoz, hogy az autoaktivációt teljes időtartama alatt nyomon követhessük. A kísérleteket megismételtük Ca 2+ hozzáadása nélkül is. ph=5,0 mellett az intracelluláris vezikulumok savas környezetét modelleztük, ahol pathológiás körülmények között megtörténhet a tripszinogének aktivációja ( 106, 107 ). Az intraacináris környezet és a pankreatikus szekrétum magas só és fehérje tartalmát a biokémiai kísérletek általában nem veszik figyelembe. Mivel ezek jelentősen befolyásolják a tripszinogének tulajdonságát, a kísérleteket elvégeztük 100 mm NaClban, illetve 100 mm NaCl, 2 mg/cm 3 BSA-ban is. Amint a 12. A ábra mutatja, ph=8,0-on (0,1 M Tris/HCl) 1 mm Ca 2+ koncentrációnál a tripszinogének hasonló autoaktivációs sebességgel aktiválódtak, de a végső tripszinszintben kétszeres különbség volt (12. A ábra fehér szimbólumok). Ez a különbség az anionos tripszinogén gyors degradációjának köszönhető. A fiziológiás és pathológiás tripszinogénkeverékek autoaktivációs rátájában szignifikáns különbség nincs, és érdekes, hogy a végső tripszintszintben is csak 20 %-os különbség tapasztalható (12. A ábra, fekete szimbólumok). Ha az aktiválást enteropeptidázzal végezzük el, gyakorlatilag azonos tripszinszintet kapunk eredményül (ábra nem mutatja). 100 mm NaCl a kationos tripszinogén autoaktiválási sebességét jelentősen csökkenti, míg az anionos tripszinogént ez a hatás kevésbé érinti (12. B ábra fehér szimbólumok). A tripszinogén keverékek aktiválási sebessége és a maximális tripszinszintjei 100 mm NaCl mellett azonosak (12. B fekete szimbólumok). 100 mm NaCl és 2 mg/cm 3 BSA az autoaktiválás sebességében és a végső tripszinszintben kb. 20 %-os különbséget eredményezett. 52

12. ábra Tripszinogének autoaktivációja ph 8,0-ál 1 mm Ca 2+ jelenlétében fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál Tripszinogén összkoncentrációja 2 μm; ( ) 2 μm kationos tripszinogén, ( ) 2 μm anionos tripszinogén, ( ) 1,33 μm kationos tripszinogén és 0,66 μm anionos tripszinogén, ( ) kationos tripszinogén 0,66 μm kationos tripszinogén és 1,33 μm anionos tripszinogén Kísérleti körülmények: A panel csak puffer, B panel 100 mm NaCl C panel 100 mm NaCl 2 mg/cm 3 BSA 53

Alacsony, 50 μm Ca 2+ koncentrációnál (ph=8,0, 0,1 M Tris/HCl) az előző kép gyökeresen megváltozik. Mindhárom vizsgálati körülmény között a tripszinszintek kizárólag a kationos tripszinogén koncentrációtól függnek, az anionos tripszinogén teljesen degradálódik. Ennek megfelelően a fiziológiás és pathológiás keverékekben legalább kétszeres különbség figyelhető meg mind az aktivációs ráták, mind a maximális tripszinszintek között (13. A, B, C ábra). 54

13. ábra Tripszinogének autoaktivációja ph 8,0-ál 50 μm Ca 2+ jelenlétében fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál Kísérleti körülmények a Ca 2+ koncentráció kivételével a 12. ábráéval azonosak Az intralizoszómális környezetet modellező ph=5,0-ös (0,1 M Na-acetát) pufferoldatban hasonló különbségeket lehet megfigyelni mint ph=8,0-nál Ca 2+ mentes közegben vagy μm nagyságrendű Ca 2+ koncentrációnál. Az autoaktiválás sebessége a kationos tripszinogén koncentrációtól függ. A maximálisan elérhető tripszinszinteket nem lehet pontosan meghatározni jelen körülmények között, de úgy látszik, hogy a fiziológiás keveréknek legkevesebb kétszer akkora az aktivitása mint a pathológiásnak (14. ábra A, B, C). 55

14. ábra Tripszinogének autoaktivációja ph 5,0-nél fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál Kísérleti körülmények a Ca 2+ koncentráció kivételével a 12. ábráéval azonosak Az izoformák különböző migrációs sebessége SDS/PAGE gélen lehetővé teszi a különböző formák vizuális elkülönítését (15. ábra). ph=8,0-nál (0,1 M Tris/HCl) 50 μm Ca 2+ mellett 60 perc alatt a tripszinogének közül csak a kationos tripszinogén alakul át tripszinné fiziológiás és pathológiás arányoknál egyaránt (15. ábra A). A kationos tripszinnek mind az egy-, mind a kétszálú formája megfigyelhető. Az aktivitásméréssel egybevetve a magasabb aktivitáshoz intenzívebb festődésű kationos tripszin csík társul. Az anionos tripszinogén gyors eltűnése detektálható tripszinképződés nélkül történik mindkét keverékben. Megállapítható tehát, hogy a pathológiás összetételű tripszinogén keverék ph=8,0-nál és 50 μm Ca 2+ mellett (intracelluláris kondíció) az anionos tripszinogén szelektív degradációjával alacsonyabb tripszinszintet, a fiziológiás kb. 56

50%-át eredményezi. Magasabb, 1 mm Ca 2+ koncentrációnál (doudenális kondíció) a tripszinaktivitás csökkenés nem jelentős. Enyhén savas körülmények között (ph=5,0-nél) a kationos tripszinogén teljesen tripszinné aktiválódik, míg az anionos tripszinogén inaktív, tripszinogén formában marad. 15. ábra Fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén: anionos tripszinogén keverékek autoaktivációja ph=8,0-nál és ph=5,0-nél A kísérleti körülmények megegyeznek a 12. ábra (A panel) és a 14. ábra (B, C panel) körülményeivel A mintákat (100 μl, 2 μm Tg) 10 % TCA-val precipitáltuk és 12 %-os SDS/PAGE gélen analizáltuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. A C panel a B panel 120 perces mintáinak kinagyított képe, a tripszinogén négy formájának elhelyezkedését demonstrálja (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén, kationos tripszin, anionos tripszin) Kationos tripszin Arg122-Val123 peptidkötés vizsgálata 57

5.2. A tripszinogén 1 aktivációs peptidjének mutációi A tripszin aktivációja során egy oktapeptid hasad le a tripszinogénről. A hasítást a vékonybélben a tripszin specifikus aktivátora, az enteropeptidáz végzi, illetve a már aktiválódott tripszin. A tripszin fiziológiás körülmények között inaktív állapotban található a pancreasban, de aktiválódhat ott is. Az idő előtti aktiválódást autoaktiváció vagy a lizoszómális katepszin B okozza. A kationos tripszinogén aktivációs peptidjében idáig négy mutációt azonosítottak. Ezek a A16V, D22G, K23R, a negyedik, D19A mutációt a jelen értékezés alapjául szolgáló egyik cikkben írtuk le először ( 108 ). A négy ismert tripszinogén aktivációs peptid mutáció közül három (D19A, D22G, K23R) biokémiai tulajdonságait vizsgáltuk rekombináns kationos tripszinogén segítségével. Az A16V mutáció a tripszinogén aktivációs peptid első aminosava, közvetlenül a szignál peptidet követi. A mutáció szerepe valószínűleg a pretripszinogén tripszinogénné való átalakulásában vagy a pretripszinogén lokalizációjában keresendő, ennek vizsgálatát a lehetőségeink nem tették lehetővé. A D19A, D23G és K23R mutációknak az autolízisét nem vizsgáltuk, mivel az aktív tripszint ezek a mutációk nem érintették. A kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsainak autoaktiválását, enteropeptidázzal és katepszin B-vel való aktiválását vizsgáltuk. Kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktiválása Mind a három kationos tripszinogén mutáns fokozott autoaktiválást mutatott ph=8,0-nál mind Ca 2+ hiányában, mind 1 mm Ca 2+ mellett, valamint ph=5,0-nél is (16. ábra). 58

16. ábra Tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktivációja kationos tripszinogén = 2 μm, BSA=2 mg/ml, T= 37 o C A panel Tris=0,1M (ph=8,0), Ca 2+ nélkül B panel Tris=0,1M (ph=8,0), Ca 2+ =1 mm C panel Na-acetát=0,1 M (ph=5,0) 100 % tripszinaktivitás ph=8,0 1 mm Ca 2+, 100 ng/ml enteropeptidázzal való aktiválás után vad típus, D19A, D22G, K23R Az autoaktiválás sebességét jellemző időt, ami a félmaximális aktivitás eléréséhez szükséges, az 5. táblázat mutatja. 59

ph=8,0 1 mm EDTA t ½ (perc) vad t ½ (perc) D19A t ½ (perc) D22G 60 12,5 2,5 3 ph=8,0 24 7 3,5 3 1 mm Ca 2+ ph=5,0 70 55 28 7 t ½ (perc) K23R 5. táblázat Kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktivációjának t ½ ideje A kapott eredmények jól magyarázhatók az (Asp) 4 és a Lys23 szerepével. A K23R kationos tripszinogén erősen fokozott autoaktivációt okoz. A tripszin arginin mellett legalább 8-szoros sebességgel hasított lizinnel (vad típusú kationos tripszinogén) összehasonlítva (5. táblázat). Ezt az arginin és a szubsztrátkötő helyben lévő Asp194 közötti erős ionkötés biztosítja. A P1 helyen lévő arginin guanidincsoportja tökéletesen illeszkedik az Asp194-hez. Az a megfigyelés (16. ábra A, B panel), hogy a Ca 2+ az (Asp) 4 töltéseinak árnyékolásával nem módosította lényegesen az autoaktivációt, azt mutatja, hogy az (Asp) 4 gátló hatását arginin mellett nem képes kifejteni. Ezt támasztja alá az is, hogy az (Asp) 4 -Lys motívum halaktól emlősökig konzervatív, (Asp) 4 -Arg nem fordul elő. Egyes esetekben, (rovarok, hideg adaptált halak tripszinogénje, illetve baktériumok és gombák tripszinogénszerű enzimjei) ahol a tripszinogén aktivációs peptid P1 pozíciójában arginin van, a P2 helyen aszpartát helyett más aminosav, általában glicin található. Az (Asp) 4 -ben lévő két mutáció (D19A, D22G) szintén az autoaktiválás sebességének növekedését okozta. A D22G kisebb t ½ -t eredményezett mint a D19A, tehát az autoaktiválást az Asp22 eredményesebben gátolja mint az ASp19. 60

Kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsok aktiválása enteropeptidázzal Az enteropeptidáz lizin vagy arginin mellett hasít, és fontos, hogy a P2 és P3 helyen két savas tulajdonságú aminosav legyen. A P4 helyen lévő savas karakterű aminosav is növeli az enteropeptidáz affinitását, de megléte nem esszenciális ( 109 ). Az enteropeptidáz Lys99 ionkötést alakít ki a tripszinogén P2 és P4 helyén lévő aszpartáttal, míg az enteropeptidáz Tyr174 hidrogénkötést létesít az Asp-P3-mal ( 110 ). Az (Asp) 4 formátumban így 3 aszpartát látszik fontosnak az enteropeptidáz általi aktiválásban. A 17. ábra a tripszinogén aktivációs peptid mutációk hatását mutatja az enteropeptidáz általi kationos tripszinogén aktivációjára. 17. ábra Tripszinogén aktivációs peptid mutánsok aktivációja enteropeptidázzal kationos tripszinogén =100 nm, 0,1 M Tris (ph=8,0), 1 mm Ca 2+, 2 mg/ml BSA T=25 o C Aktiválási reakciót p-nitroanilid felszabadulás folyamatos mérésével (405 nm) követtük vad típus, D19A, D22G, K23R A kationos tripszinogén koncentráció a kísérletekben rutinszerűen használt 2 μm helyett 100 nm volt, amiatt, hogy az autoaktiválásból származó tripszingenerációt a minimálisra csökkentsük. A D22G mutáció az enteropeptidáz általi tripszin aktivációt 61

gyakorlatilag meggátolta. A K23R mutáció fokozott aktivációt eredményezett, ami egyrészt annak köszönhető, hogy az enteropeptidáznak nagyobb az affinitása az argininhez mint a lizinhez, másrészt szerepe van a K23R megnövekedett autoaktivációs sebességének is. A D19A az enteropeptidáz aktiválás sebességét szignifikánsan nem befolyásolta. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal az adatokkal, amelyek az enteropeptidáz specificitását írták le. Eredményeink azt mutatják, hogy a tripszinogén aktivációs peptid (Asp) 4 -Lys szerkezet mutációi fokozott autoaktiváláshoz vezetnek. A katepszin B a vad típusú kationos tripszinogént aktiválja a leggyorsabban, ezért a katepszin B-nek nem lehet szerepe a tripszinogén aktivációs peptid mutációk pathológiás kifejeződéséhez. A K23R mutáció az (Asp) 4 gátló hatását gyakorlatilag megszűnteti, valamint a D19A és D22G mutációk is az autoaktiválás sebességét növelik. Eredményeink azt valószínűsítik, hogy a tripszinogén aktivációs peptid mutációk pathogenezisében a megnövekedett autoaktivizációnak lehet szerepe. 5.3. A humán kationos tripszinogén Arg122 vizsgálata Az Arg122-Val123 peptidkötés hasítása A tripszin autoaktivációja során az aktivációs oktapeptid lehasad a tripszinogénről. A keletkező tripszin mind a kationos tripszinogén, mind a kationos tripszin Arg122-Val123 peptidkötés hasítására képes. Így gélen négy csík figyelhető meg. A tripszinogén (Tg), tripszin (Tr), az A és a B csík (18. ábra). A kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötésének hasításánál két egyforma mobilitású peptid keletkezik, ezek egy csíkot adnak, az A csíkot. A kationos tripszin Arg122-Val123 kötésének hasításakor az aktivációs peptiddel rövidebb N-terminális gyorsabban vándorol, ez eredményezi a B csíkot, így a kationos tripszin hasításánál két csík figyelhető meg, az A és a B csík. A hidrolizált Arg122-Val123 kötést hordozó tripszinogén és tripszin Tg1 * és Tr1 * jelölést kapott. 62

A Tg1 * a tripszin által Tr1 * -né alakulhat át. A keletkező Tr1 * az N-terminális B csíkkal követhető nyomon. A gélen megfigyelhető két peptidláncot a valóságban egy diszulfidkötés tartja össze. A kd 0 5 10 20 40 80 160 320 perc 42 30 22 Tg1 Tr1 17 A B B A A Tg1 Tr1 Tg1 * B A Tr1 * 18. ábra Kationos tripszinogén aktiválása kationos tripszinnel [kationos tripszinogén]=3 μm, [kationos tripszin]=0,3 μm, T= 37 o C, Tris/HCl=0,1M (ph=8,0) 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blue-val festettük. A 0 perces minta nem tartalmazott tripszint. A és B proteolitikus fragmentek A B ábra a Lys23 és Arg122 hasítási helyeket és termékeket mutatja a tripszinogénben 63

A Tg1 * izolációja Megfigyeltük, hogy a tripszin általi Tg1 * aktiváció lassúbb folyamat, mint az intakt kationos tripszinogén aktivációja. Így a B csík mindig később jelent meg, és jóval halványabb volt, mint a Tr csík (19. ábra). Ez a megfigyelés vezetett ahhoz a hipotézishez, mely szerint a tripszinogén hasítása az Arg122 helyen gátolja a tripszinogén aktivációt. Feltételeztük, hogy ez a kationos tripszinogén szerkezet változásán keresztül következik be. A feltételezés igazolásához Tg1 * -t izoláltunk. Az izolációhoz anioncserélő oszlopot használtunk. A Tg1 * generáláshoz először kationos tripszinogént autoaktiváltunk Ca 2+ mentes környezetben. Ebben az esetben elsősorban az Arg122-Val123 kötés hidrolizálódik, mert az aktivációs peptid Lys23 Ca 2+ hiányában a tripszin számára nehezen hozzáférhető. Így elsősorban Tg1 * képződik és kis mennyiségű tripszin. MonoQ oszlopon a Tg1 * jól elkülöníthető az intakt tripszinogéntől (19. ábra). Amint a kis ábra a gélen mutatja, a tripszinogén kb. 95 %-a hasított, és csak kis része marad intakt. 64

E 280 0.4 0.3 kd 42 30 22 17 1 2 3 4 5 Gyűjtött frakció 1 2 3 4 5 [NaCl] (M) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0.0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Elúciós térfogat (cm 3 ) 19. ábra Az intakt és Arg122 helyen hasított kationos tripszinogén szeparációja Kb. 5 μm kationos tripszinogén autoaktivációjából (0,1 M Tris/HCl (ph=8,0), 1 mm EDTA, T=37 o C, t=2 óra) származó 5 ml mintát MonoQ 5/5 oszlopra vittük fel, 20 mm Tris/HCl-dal (ph=8,0) ekvilibráltuk, líneáris 0-0,5 M NaCl grádienssel eluáltuk. A jelölt helyeken 0,5 cm 3 frakciókat gyűjtöttünk, 20 μl-t közvetlenül redukáló gélre vittünk. Az Arg122-Val123 peptidkötés meglepő reszintézise Adat nem mutatja, de amikor tripszinaktivitást mértünk, nem tapasztaltunk semmilyen különbséget az intakt kationos tripszinogén és a hasított Tg1 * aktivációja között. A két tripszinogén forma enteropeptidázzal vagy tripszinnel történt aktivációjában sem észleltünk különbséget, valamint az autoaktiváció Ca 2+ függése is megkülönböztethetetlen volt. Továbbá a két forma teljesen azonosnak bizonyult az enzimkinetikai vizsgálatok alapján is. Ezek a megfigyelések nem támasztották alá az eredeti hipotézisünket. A korábbi megfigyelések, mely szerint marha tripszinogén degradálódik a humán kationos tripszinogén Arg122-Val123 peptidkötéssel identikus Arg-Val hidrolízise után ( 111 ) sem bizonyult igaznak humán kationos tripszinogén esetén. Amikor az időfüggését vizsgáltuk az autoaktivációnak SDS-PAGE gélen, 65

váratlan megfigyelést tettünk. Amint azt a 20. A ábra mutatja, ph=8,0-nál 5 mm Ca 2+ mellett a Tg1 * nagy része átalakult intakt tripszinné tripszin hatására. Jelen kísérleti körülmények között a reakciót nehéz kvantifikálni. Mivel a tripszinogén átalakul tripszinné, a reakcióban folyamatosan változik az enzim és a szubsztrát koncentrációja is. Az elegyben tehát a következő tripszin által katalizált reakciók mehetnek végbe: Tg1 * kationos tripszinogén kationos tripszinogén kationos tripszin Tg1 * Tr1 * Tr1 * kationos tripszin A reakciók reverzibilitását kísérletekkel igazoltuk. Annak érdekében, hogy a reakciót jobban lehessen követni, egy olyan tripszinogén mutánst hoztunk létre, melyben az aktivációs peptid Lys23-t glutaminra cseréltük (K23Q kationos tripszinogén). Ebben az esetben a tripszin képtelen az aktivációs peptidet lehasítani a tripszinogénről, tehát a tripszinogént nem lehet aktiválni. Így egy olyan mutánshoz jutottunk hozzá, mellyel a tripszinogén szubsztrát tulajdonságait lehet vizsgálni. A zimogén Arg122-Val123 peptidkötés elérhető a tripszin számára, de aktiválni nem lehet. A lehetséges reakciók száma így egyre csökken: K23Q Tg1 * K23Q kationos tripszinogén A fent említett módon K23Q Tg1 * -t hoztunk létre és izoláltuk az intakt formától. A K23Q Tg1 * -t vad tripszinnel inkubáltuk és az Arg122-Val123 időfüggő reszintézisét figyeltük meg (20. ábra B). Degradációs terméket a kísérlet ideje alatt nem figyeltünk meg. Reszintézist tripszin hiányában, illetve a katalitikusan inaktív S200A kationos tripszin jelenlétében nem figyeltünk meg (ábra nem mutatja). Amint a 20. C ábrán látható, a reszintézis során nem értük el az egyensúlyi állapotot, de egy látszólagos 66

egyensúlyi állapot kiszámítható. A tripszinogén kb. 40 %-a Tg1 *, 60 %-a kationos tripszinogén. Ebből a hidrolízisállandó értéke: K hid =[Tg1 * ] / [kationos tripszinogén]= 0,73. 20. ábra Az Arg122-Val123 peptidkötés reszintézise vad típusú és K23Q kationos tripszinogénben A reakciók [Tris/HCl]=0,1 M (ph=8,0), [CaCl 2 ]=5 mm, 37 o C-on történtek [kationos tripszin]=0,3 μm. 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. A panel, 2,8 μm kationos tripszinogén B panel 4 μm K23Q kationos tripszinogén C panel B denzitometriás kiértékelése. A Tg csík denzitását a Tg és Tg * összdenzitásának a %-ában adtuk meg Amikor az intakt K23Q kationos tripszinogént kis mennyiségű tripszinnel emésztettük (kationos tripszin:k23q kationos tripszinogén = 1:160), Ca 2+ hiányában ph=8,0-nál, nagyon gyors Arg122-Val123 hasítás volt megfigyelhető. Egyensúlyban a K23Q kationos tripszinogén* 85 %, míg a K23Q kationos tripszinogén 15 % volt (K hid =5,4). Ca 2+ jelenlétében a K23Q Tg * aránya szignifikánsan csökkent (21. ábra). 0,1 mm Ca 2+ koncentrációnál 0,96 ; 0,5 mm Ca 2+ -nál 0,7 a K hid értéke. 5 mm Ca 2+ mellett a vizsgált időben nem állt be az egyensúlyi állapot. A tripszin koncentrációt megemelve (22. ábra) az egyensúlyi állapot szintén K hid =0,7 értéknél állt be. Az adatok azt 67

mutatják, hogy a Ca 2+ koncentráció növelésével az Arg122-Val123 kötés lassabban hidrolizálódik, de az egyensúlyi állapot 0,1-5 mm Ca 2+ koncentráció intervallumban gyakorlatilag állandó. 21. ábra Ca 2+ hatása a K23Q kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötés kationos tripszin általi hasítására K23Q kationos tripszinogén=5 mm, kationos tripszin=30 nm, Tris/HCl=0,1 M (ph=8,0), T= 37 o C A-D jelzett időpontokban 10 % TCA-val precipitáltuk a mintákat, redukáló SDS/PAGE gélen futtattuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. E Az A-D ábrák denzitometriás kiértékelése. A Tg1 * %-os értékét a kationos tripszinogén és Tg1 * összdenzitásából számoltuk. 68

22. ábra 5 mm Ca 2+ hatása a K23Q kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötés kationos tripszin általi hasítására A kísérleti körülmények megegyeznek a 21. ábráéval, kivéve, hogy [kationos tripszin]=0,5 mm 5.3.1. Az Arg122 egy gyenge inhibitor loop reaktív helye A leírt megfigyelések azt mutatják, hogy az Arg122-Val123 kötés a kationos tripszinogénben több analógiát mutat a reverzibilis kanonikus inhibitorokkal ( 112 ). Ezek a következők: a, az Arg122 egy hiperszenzitív Arg a tripszinogén felszínén b, a kötés hasítása egyensúlyra vezet az intakt (szűz) és hasított (módosult) forma között c, hasonló egyensúly figyelhető meg a hasított formák tripszin katalizálta reszintézisénél. Ezek a tulajdonságok azt sugallják, hogy az Arg122 egy reaktív hely lehet a tripszinogén inhibitor doménjében. Egy lényeges különbség van a kanonikus proteáz inhibitorok és a tripszinogén között, mégpedig az, hogy a kationos tripszinogén hidrolízise nagyon gyors, ami arra utal, hogy a Tg1 * relatív gyenge inhibitor lehet ( 113 ). A hipotézist ellenőrizve megvizsgáltuk a hatását viszonylag magas koncentrációjú, 80 μm inaktív K23Q kationos tripszinogénnek és K23Q Tg1 * -nek vad típusú kationos tripszinogén auotoaktivációjára. A kontroll mintába K23Q tripszinogén helyett K23Q/R122H kationos tripszinogént tettünk. A K23Q kationos tripszinogén szignifikánsan csökkentette a kationos tripszinogén autoaktivációját (23. ábra). A K23Q 69

Tg1 * gátlás különösen ph=8,0-nál Ca 2+ nélkül és ph=5,0-nél volt feltűnő. A K23Q kationos tripszinogén és K23Q Tg1 * egyformán gátolt ph=8,0-nál Ca 2+ nélkül. Ez annak köszönhető, hogy a K23Q kationos tripszinogén hasítása nagyon gyors folyamat, a két reakció elegyben a K23Q Tg1 * koncentráció identikusnak tekinthető. A K23Q kationos tripszinogén kevésbé gátolt ph=5,0-nél és ph=8,0-nál 5 mm Ca 2+ jelenlétében. Ábra nem mutatja, de 100 μm bovine kimotripszinogén kationos tripszin általi aktivációját 80 μm K23Q Tg1 * kb. felére csökkenti. A kísérletet végrehajtottuk ph=5,0- nél is, ahol a kimotripszinogén aktiváció K M értéke nagyobb mint 0,5 mm (Sahin-Tóth M. nem közölt eredmény). Mivel a kimotripszinogén koncentráció jóval a K M érték alatt volt, a K i =EC 50 /(1+[S]/K M ) egyenletet használva ( 114 ) a hasított kationos tripszinogén K i értékét kb. 80 μm értéknek számoltuk. 70

23. ábra K23Q kationos tripszinogén és K23Q kationos tripszinogén* hatása a vad típusú kationos tripszinogén autoaktivációjára Kb. 2 μm vad típusú kationos tripszinogént inkubáltunk 80 μm K23Q Tg1( ) vagy K23Q Tg1* ( ) jelenlétében. A kontroll minták 80 μm K23Q/R122H kationos tripszinogént ( ) tartalmaztak. A panel 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) 5 mm CaCl 2 B panel 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) Ca 2+ nélkül C panel 0,1 M Na-acetát (ph=5,0) 5 mm CaCl 2 100 μl végtérfogatokból a jelzett időben 2,5 μl-t kivettünk és 140 μm kromofór szubsztráttal (GPR-pNA) mértük az enzimaktivitást. Az enzimaktivitást a potenciálisan elérhető tripszinaktivitás százalékában fejeztük ki, ami ph=8,0 és 10 mm CaCl 2 mellett enteropeptidáz aktiválással elérhető. 71

Zimogén degradáció Kísérleti eredményeink azt mutatják, hogy az Arg122-Val123 peptidkötés hidrolízise kis kationos tripszin:kationos tripszinogén (1:160) aránynál nem vezet a kationos tripszinogén gyors degradációjához. A kötés reszintézise dinamikus egyensúlyt eredményez a kationos tripszinogén és Tg1 * között. Ez akkor igaz, ha a kationos tripszin:kationos tripszinogén arány alacsony (21. ábra). Ha K23Q kationos tripszinogént emésztünk Ca 2+ mentes környezetben magasabb (kationos tripszin: kationos tripszinogén=1:10) tripszinkoncentráció mellett, nem csak az Arg122-Val123 peptidkötés hidrolízisét figyelhetjük meg (24. ábra). Idővel mind a K23Q kationos tripszinogén mind a K23Q Tg1 * csík intenzitása csökken. Ez azt jelenti, hogy a tripszinogén degradálódik. A degradációs termékek a gélen nem adtak detektálható degradációs terméket. A kísérletet megismételtük K23Q/R122H kettős mutáns tripszinogénnel is. Ebben az esetben már sikerült azonosítanunk a 24. B ábrán C-vel jelölt terméket. Szekvenciaanalízissel megállapítottuk, hogy a C fragment a peptid N terminális vége. A fragment látszólagos tömege alapján a hasítási hely Lys193-Asp194 nek bizonyult. Ugyanezt az autokatalitikus hasítási helyet már leírták patkány tripszinogén ( 115 ) és marha tripszin ( 116 ) vizsgálatánál, ahol a hasítás a tripszin(ogén) inaktiválódását eredményezte. A Lys193 hely természetesen hidrolizálódik a K23Q kationos tripszinogénben is, de az Arg122 szintén hidrolizálódik, és az így kapott fragmentumok már túl kicsik ahhoz, hogy a rutinszerűen használt 12 %-os gélen detektálhatóak legyenek. 5 mm Ca 2+ teljesen stabilizálta mind a K23Q kationos tripszinogént (22. ábra), mind a K23Q/R122H kationos tripszinogént (24. C ábra). A kationos tripszinogén és Tg1 * csík denzitása a jelzett időben nem változott. Kísérleteinkben az R122H mutáció hatását a tripszinogén degradációra K23Q kationos tripszinogén és K23Q/R122H kationos tripszinogén segítségével modelleztük. A kationos tripszinogén degradációt a kationos tripszinogén -Tg1 * csíkok intenzitásának csökkenése mutatta. A K23Q kationos tripszinogén K23Q Tg1 * átalakulás nem tekinthető degradációnak, mert a vad típusú Tg1 * teljesen aktív Tr1 * -né alakul át. Ezzel szemben a Lys193 (24. C ábra) kötés hidrolízise valódi degradációs lépésnek tekinthető. Ha a kationos tripszinogén Lys193 elhasad, aktív tripszint már nem nyerünk vissza. A K23Q kationos tripszinogén és Tg1 * összdenzitás csökkenéséből és a K23Q/R122H 72

kationos tripszinogén denzitásának csökkenéséből kiszámoltuk a degradáció sebességét. K23Q kationos tripszinogén esetében 39 nm/perc, K23Q/R122H kationos tripszinogén esetében 22 nm/perc adódott. Ez azt mutatja, hogy adott kísérleti körülmények között az R122H mutáció kb. kétszeres stabilitást eredményez a humán kationos tripszinogénben. A Tg1 * csík szekvenciaanalízise azt mutatta, hogy a Tg1 * csíkban az N és C terminális proteinek mennyisége azonos sebességgel csökkent, a vizsgálat időtartama alatt a C peptid:n peptid = 1:1 arány maradt. Ez azt jelenti, hogy a degradációjuk azonos sebességgel történt. Összehasonlítottuk az Arg122 hely hasítási sebességét egyéb tripszinolitikus helyek hasítási sebességével. Ca 2+ hiányában 1:160=kationos tripszin:kationos tripszinogén arányban a K23Q kationos tripszinogén K23Q Tg1 * átalakítás félideje kb. 0,5 percnek bizonyult (21. ábra). Ugyanilyen Ca 2+ mellett, de 16-szor nagyobb kationos tripszin koncentrációnál (0,5 μm) (kationos tripszin: kationos tripszinogén=1:10) a t ½ =60 perc volt K23Q/R122H esetén (24. B ábra). Tehát Ca 2+ mentes környezetben az Arg122 majdnem 2000-szer (16*60/0,5=1920) gyorsabban hasad mint az egyéb tripszinolitikus helyek a tripszinogénben. 73

24. ábra A K23Q kationos tripszinogén és a K23Q/R122H kationos tripszinogén tripszinolitikus degradációja 5 μm végső koncentrációjú K23Q kationos tripszinogént (A panel) vagy K23Q/R122H kationos tripszinogént (B és C panel) inkubáltunk 0,5 μm vad típusú kationos tripszinnel 37 o C-on 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) és 1 mm EDTA mellett (A és B panel) vagy 0,1 M Tris/HCl (ph=8,0) és 5 mm CaCl 2 mellett (C panel). ( Összehasonlításul lsd. a K23Q Tg1 5 mm CaCl 2 melletti emésztése a 22. ábrán.) 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blueval vizualizáltuk. A C fragment egy egyedi proteolitikus termék, ami csak a K23Q/R122H kationos tripszinogénnél figyelhető meg. 74

6. Megbeszélés 6.1. Krónikus pancreatitis pathogenezise A pancreatitis a pancreas gyulladásával járó betegség, gyakori a pancreas necrózisa, ami a pancreas exokrin és endokrin funkciók zavarával jár együtt. A tripszin szerepét a pancreatitis pathogenezisében már több mint egy évszázada felvetették. A tripszin 1876-os felfedezése után három évvel Klebs leírta, hogy a pancreas nedv pancreas vérzést okoz, majd 1896-ban Chiari állapította meg, hogy a pancreasnak önemésztő potenciálja van ( 117 ). A tripszin aktiválja a karboxipeptidáz A-t, elasztázt, foszfolipázt, kimotripszint. Az emésztőenzimek kaszkádszerű aktiválódását szöveti destrukció követheti. A tripszinnek tehát központi szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában mint kórokozó tényező. A pancreatitis oka tehát a nemkívánatos tripszinaktivitás megjelenése a pancreasban, ezen alapszik a gain of function teória, mely szerint a tripszinaktivitás növekedése a pancreatitis kialakulását vonhatja maga után. A pancreatitishez vezető mutációk tehát valamilyen módon a tripszinaktivitás növekedését idézik elő. A tripszin másrészt - a zimogének aktiválásán túl - a degradációban is szerepet játszhat. A tripszin eszerint védő funkciót láthat el, a veszélyessé váló enzimek mennyiségének csökkentésével a pancreatitis kialakulásának lehetőségét is csökkenti. A mutációk hatását teoretikusan magyarázók szerint az örökletes pancreatitis oka a mutációk hatására bekövetkező védőhatás elvesztése lehet. Ez a loss of function elmélet alapja. A kérdés mindkét esetben az, hogy milyen tényezők válthatják ki az aktív tripszin megjelenését a pancreasban? 75

6.1.1. A tripszin idő előtti aktivációjának megakadályozása A tripszinaktiváció a pancreasban erősen korlátozott, a folyamatot több mechanizmus is gátolja. A tripszin inaktív formában képződik a pancreasban, az aktív tripszin létrejöttéhez le kell hasadni a tripszinogén aktivációs peptidnek a tripszinogénről. A tripszinogén specifikus aktiválószere, az enteropeptidáz a duodenumban képződik, így nem aktiválhatja a pancreasban a tripszinogént. A tripszin aktiválódhat autoaktiváció révén is. Az autoaktivációnak akkor megfelelő a sebessége, ha a tripszinogén aktivációs peptidet Ca 2+ árnyékolja le. A pancreas acinus sejtekben a Ca 2+ koncentráció alacsony, nem kötődik az (Asp) 4 -hez, az autoaktiváció sebessége lassú, és a lehetséges maximális tripszinaktivitás is alacsonyabb, mint Ca 2+ jelenlétében. Ca 2+ hiányában a tripszin stabilitása kisebb, mint Ca 2+ jelenlétében, autolízisre hajlamosabb, degradációja gyorsabb. Alacsony Ca 2+ koncentráció mellett jelentős lehet a Tg1* gátló hatása is. Csekély mennyiségű tripszin is képes a kationos tripszinogén 80 %-át átalakítani Tg1*-né, ami gátolhatja a további tripszinképződést. A legjelentősebb tényező a tripszin aktiválás megakadályozásában a PSTI. A tripszinogén tripszin átalakulás nagyon lassan, de spontán is megtörténik. A keletkező tripszin már képes a tripszinogént átalakítani tripszinné (autoaktiválás). A keletkező tripszint a PSTI inaktiválja, így gátolva meg az autoaktivációt (25. ábra). A PSTI a kationos tripszin és anionos tripszin izoformákat gátolja (K d = 10-9 M). A PSTI a potenciális kationos tripszin és anionos tripszin mennyiség 20 %-át képes gátolni, és ez elég ahhoz, hogy megakadályozza a tripszin megjelenését a pancreasban. A PSTI a mezotripszinnel gyengén asszociál (K d = 8*10-5 M). A szabad mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat bont, így a PSTI-t is degradálja. Fiziológiás körülmények között viszont a mezotripszin képtelen autoaktivációra, és ez megakadályozza a mezotripszin megjelenését a pancreasban. 76

A N-Ala-Pro-Phe-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- Ile- -- B Tg enteropeptidáz degradáció Tg1* Tr PST Ca 2+ 25. ábra A tripszin idő előtti aktivációjának megelőzése pancreas acinus sejtekben A panel a tripszinogén aktivációs peptid (Asp) 4 -Lys motívuma az autoaktivációt csökkenti B panel Az enteropeptidáz extrapancreatikus aktivátor, kizárólag a vékonybélben termelődik. Az alacsony Ca 2+ szint az autoaktiváció sebességét csökkenti, a tripszinogén degradációját növeli. A PSTI a tripszint inaktív komplexben tartja. Eredményeink szerint szerepe lehet a pancreas károsodás megakadályozásában a tripszinogén arány megváltozásának is. Az anionos tripszinogén mennyiségének növekedése a pancreasban megjelenő maximális tripszinaktivitást csökkenti. Alacsony Ca 2+ koncentrációnál és ph=8,0 mellett a tripszin aktív anionos tripszin megjelenése nélkül degradálja az anionos tripszinogént. A kationos tripszinogén: anionos tripszinogén =2:1 arány megfordulásával a tripszinaktivitás a fiziológiás érték felére csökken. A lizoszómákban sem jelenik meg jelentős anionos tripszin aktivitás, az itt jellemző ph=5,0 értéken az anionos tripszinogén inaktív formában marad akkor is, ha a kationos tripszin aktív. Eszerint a lizoszómában is a fiziológiás aktivitás 50 %-a érhető el a tripszinogén arány megfordulásával (26. ábra). 77

fiziológiás Tg1:Tg2=2:1 pathológiás Tg1:Tg2=1:2 Tg1 Tr1 Tg1 Tr1 Tg2 degradáció szekretórikus vezikulum Tg2 degradáció szekretórikus vezikulum lizoszóma lizoszóma 26. ábra Pancreas acinus sejtekben elérhető tripszinaktivitás fiziológiás és pathológiás tripszinogén keverékek esetén A kationos tripszinogén: anionos tripszinogén arány megváltozásával a pancreas acinus sejtekben az elérhető maximális tripszinaktivitás kb. a felére csökken. Az esetleges tripszinaktivációkor a szekretorikus vezikulumokban az anionos tripszinogén degradálódik, a lizoszómákban pedig inaktív marad. 6.1.2. A PRSS1 (kationos tripszinogén) gén mutációk szerepe a pancreatitis kialakulásában A tripszin felszaporodása a pancreasban elméletileg vagy a megnövekedett autoaktivációnak vagy a csökkent degradációnak a következménye. A pancreas által termelt tripszinogén mennyiség állandónak tekinthető, így kórosan megnőtt tripszinogénszinttel akkor kell számolni, ha a hasnyál működése akadályozott (epekövek, Oddi sphincter görcse, anatómiai anomáliák stb.). A pancreatitis kialakulása emberben nem követhető nyomon, a betegek az első tünetek megjelenésével fordulnak orvoshoz, amikor már csak a végállapot vizsgálható. In vitro elsősorban az autoaktivációt, autolízist, PSTI lebontást, tripszinaktivációt lehet nyomon követni. Humán acinus sejttenyészet híján az esetleges transzport defektusok (A16V kationos tripszinogén mutáció), expressziós zavarok (intron mutációk) nehezen vizsgálhatók. 78

R122H mutáció, a szupertripszin Az elsőként felfedezett és egyben leggyakoribb kationos tripszinogén mutáció az R122H. Marha és patkány tripszin degradációjának vizsgálata során feltételezhető volt, a tripszin degradáció első lépése az Arg122-Val123 helyen lévő peptidkötés hidrolízise. Logikusnak tűnt, ha a mutációval megszűnik a tripszinhasítási hely, egy autolízis rezisztens, stabil szupetripszin jön létre. E modell szerint az esetlegesen képződő tripszin nem degradálódik, mennyisége folyamatosan nő, hasnyálmirigy károsodást okozva ( 40, 50 ). Rekombináns kationos tripszinogén R122H vizsgálatával Sahin-Tóth M. megnövekedett autoaktivációt és csökkent autolízis sebességet mutatott ki ( 118, 119 ). N29I mutáció Az N29I mutáció a második a gyakoriságot tekintve, eddig több mint 50 esetben azonosították. Az N29I kationos tripszinogénnel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a kationos tripszinogén N29I autoaktivációs sebessége megnövekszik, a növekedés a vad típushoz képest 2-3-szoros volt ( 85, 120 ). R122C A kationos tripszinogén R122C mutációt 2002-ben írták le először. A kationos tripszinogén R122C mutáns fehérje megemelkedett autoaktivációs sebességet mutatott ph=8,0 és ph=5,0 mellett is. Ca 2+ mentes közegben a maximális tripszinaktivitás is magasabb volt a vad típushoz képest. A magasabb tripszinaktivitást a kationos tripszin R122C csökkent autolízise okozhatja ( 121 ). Azok a mutációk, amelyek új cisztein megjelenéséhez vezetnek (R116C, R122C) a tripszinogén foldingjában is zavart okozhatnak. Még nem publikált eredményeink szerint azonos kitermelés mellett, a módszerekben ismertetett módon a natív állapotban feltekeredett tripszinogén mennyisége kb. harmada a kationos tripszinogén R116C mutáns esetén a vad típushoz képest. A hibás folding a fehérje lizoszómális transzportjához és lebontásához vezet. A lizoszómákban a megnövekedett zimogén mennyiség megnövekedett katepszin B általi tripszin aktiválódást okozhat. Ez a tényező is elősegítheti a pancreatitis kialakulását. E79K A kationos tripszinogén E79K mutációt európai és amerikai együttműködés keretében mi azonosítottuk először három európai családban, és mi végeztük el a biokémiai karakterizálását. A mutáció érdekessége, hogy nem okoz szignifikáns 79

változást sem az autoaktivációban, sem a degradációban, nem változtatja meg a PSTI kötődést. Az aktív kationos tripszin E79K viszont az anionos tripszinogént kétszeres sebességgel aktiválja a vad típusú kationos tripszinhez képest. Más eltérést nem találtunk vizsgálataink során. Mivel idáig az irodalomban nem ismert olyan anionos tripszinogén mutáció, ami pancreatitist eredményez, úgy gondolták, hogy az anionos tripszinogénnek a szerepe perifériás lehet a pancreatitis kóroktanában. Eredményünk viszont azt támasztja alá, hogy az anionos tripszinogénnek is fontos szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában, és a pathológiai folyamatok vizsgálata további erőfeszítéseket kíván ( 122 ). Génkonverzió (kationos tripszinogén N29I/N54S) Az ismertetett esetben a génkonverzió során a PRSS2 gén (anionos tripszinogén) 2 exonjából és 2 intronjából legalább 289 bázishosszúságú szakasz került át a PRSS1 génbe (kationos tripszinogénbe), mégpedig csere nélkül, a PRSS2 nukleotidsorrendje tehát nem változott. A konverzió során 16 intron- és 6 exon nukleotid szubsztitúció történt, utóbbiak közül kettő okozott aminosav sorrendváltozást, kationos tripszinogén N29I/N54S kettős mutáns keletkezett. A mutáció fokozott autoaktivációt eredményezett ph=8,0-nál és ph=5,0-nél is, enteropeptidázzal és katepszin B-vel való aktiválás nem okozott változást ( 123 ). Nonszensz és splicing védő mutációk Chen és mtsai 2003-ban olyan nonszensz és splicing PRSS1 mutációkat írtak le (nonszensz mutáció: c.111c>a; Y37X splicing mutáció: IVS2+1G>A), amelyek csökkent kationos tripszinogén szintézishez vezetnek, és krónikus pancreatitises betegekben nem, csak egészséges emberekben volt kimutatható. Ez azt jelenti, hogy a kationos tripszinogén szint csökkenése véd a pancreatitis ellen ( 32 ). In vitro kísérletek tehát azt bizonyítják, hogy a megnövekedett tripszinszintért az autoaktiváció sebességének emelkedése lehet a felelős. A munkák során világossá vált, hogy az ismert mutációk a tripszinszint növekedését teszik lehetővé. Ez a gain of function elmélet mellett szól. Pancreatitist előidéző mutációt, ami a tripszin károsodását, és így a tripszin védő hatásának csökkenését okozza, nem találtak. A loss of function elméletet tehát nem sikerült kísérletes bizonyítékkal alátámasztani, sőt, 80

Chen és mtsai adatai szerint (lsd. nonszensz és splicing mutációk) a kationos tripszinogén funkcióvesztése védelmet biztosít a pancreatitis ellen. 6.1.3. Katepszin B szerepe a krónikus pancreatitis pathológiájában A krónikus pancreatitis pathogenezisében nem világos, hogy a tripszinaktiválás milyen mechanizmussal történik. Az autoaktiválás PSTI jelenlétében nagyon lassú. Az autoaktiválás kezdő lépése a tripszinogén által katalizált Tg Tr átalakulás. A keletkező tripszin öt nagyságrenddel aktívabb a tripszinogénnél. A tripszin inaktív komplexbe kerül a PSTI-vel, így az autoaktiválás akkor lehet jelentős, ha a PSTI mennyisége jelentősen lecsökken, vagy a tripszinogén tripszinszerű aktivitása nagyságendekkel emelkedik, pl. mutáció következtében. Ez utóbbira nem ismerünk példát. A PSTI mennyiségének csökkentésében szerepe lehet a katepszin B-nek. A katepszin B lizoszómális cisztein peptidáz, a tripszinhez hasonlóan lizin és arginin mellett hasít. A ph optimuma 4 körül van ( 124, 125 ). Német munkacsoporttal kollaborációban kimutattuk, hogy a katepszin B és a tripszinogén kolokalizálódhat, valamint a lizoszómákban uralkodó savas környezetben a katepszin B képes a tripszinogén aktivációs peptidet hasítani, így a tripszin aktívvá válik. Szilágyi és mtsai. kimutatták, hogy a katepszin B PSTI jelenlétében is aktiválja a tripszint ( 126 ). Munkacsoportunk érdeme az az érdekes megfigyelés, hogy a katepszin B legnagyobb sebességgel a mezotripszint aktiválja, bár a degradáció is gyors. A pancreatitisre is jellemző oxidatív stressz a lizoszómák membránjának sérüléséhez vezet. A sérült lizoszómákból a fehérjetartalom a citoszólba ürül ( 127 ), az aktiválódott mezotripszin a PSTI lebontásával lehetővé teszi a kationos tripszin és anionos tripszin autoaktivációját, amik elindíthatják az emésztési kaszkádot és az önemésztődést. A lizoszómák szétesése hidrogénperoxid produkcióhoz vezethet, így egy apoptózist okozó öngerjesztő folyamat indulhat be. Kolecisztokininnel kiváltott intracelluláris Ca 2+ szintemelkedés a tripszin megjelenését okozta a pancreasban ( 128 ). Ca 2+ kelátorral egerekben és patkányokban kísérletes pancreatitis kialakulását késleltetni lehetett a tripszin idő előtti aktivációjának megakadályozásával ( 129 ). A Ca 2+ szint emelkedésének tehát szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában. 81

6.1.4. Enteropeptidáz szerepe Az enteropeptidázt a vékonybél enterocytái termelik. A tripszinogént specifikusan aktiválja, peptidáz inhibitorok a működését nem gátolják, ellenálló a peptidázokkal szemben ( 130 ). 1968-ban McCutcheon felvetette, hogy a pancreatitis oka lehet az, hogy az enteropeptidáz megjelenik a pancreasban ( 131 ). Normál körülmények között a sphincter megakadályozza, hogy a vékonybélből enteropeptidáz, epe és aktív proteázok kerüljenek a pancreasba. A hepatocyták az esetlegesen vérbe kerülő enteropeptidáz 98-99 %-át lizoszómális hidrolázokkal lebontják. Az aktív enzim 0,2-2 %-a 1 órán belül az epébe kerül kiválasztásra. A hepatocyta funkciók sérülése esetén, pl. etanol indukált tengerimalac zsírmájban az epe enteropeptidáz koncentrációja 2-3- szorosra növekedett. Pancreas ductusba juttatott 50-200 ng enteropeptidáz fatális hemorrhágiás pancreatitist eredményezett ( 132 ). Grant és munkatársai humán enteropeptidáz aktivitást mérve epében azt tapasztalták, hogy duodenális reflux nem kimutatható, de epében 0,1-4,8 ng/ml aktív enteropeptidáz koncentráció mérhető. A legnagyobb enzimaktivitást postoperatív nekrotizáló pancreatitisben mérték ( 133 ). In vitro körülmények között 3 ng/ml enteropeptidáz a hasnyál zimogénjeit aktiválni képes, az epében található enteropeptidáz tehát (ha nem hígul az epe) elvileg képes a tripszinogén aktiválására. 6.2. A pancreatitis lehetséges pathogenezise Saluja és mtsai 1989-ben mutatták ki, hogy nyulakban a pancreas ductus műtéti elzárásával a lizoszómális katepszin B és az amiláz kolokalizálódik ( 134 ). A katepszin B aktiválja a tripszinogént ( 135, 136, 137 ), ami az emésztőenzimek aktiválásával a környező szövetek autofágiáját okozhatja. Munkacsoportunknak jelentős szerepe volt a katepszin B humán pancreatitisben betöltött esetleges kóroktani szerepének felderítésében. Kimutattuk, hogy humán pancreasban a tripszinogén és a katepszin B kolokalizálódik (27. ábra), valamint a humán katepszin B képes mindhárom pancreatikus tripszinogén izoenzim aktivációjára. Az aktiváció éles ph depenciát mutat, a ph optimum 4,0-4,3 között van, ph 5,0-nél az 82

aktiváció a töredékére, a maximum kb. 10 %-ára csökken. Érdekes és fontos megfigyelés, hogy a proteáz rezisztens mezotripszint aktiválja a katepszin B a leggyorsabban. Ha a lizoszómában aktiválódott mezotripszin kiszabadul a citoszólba, a PSTI degradáció révén a tripszin aktiváció drámaian felgyorsulhat. 27. ábra A katepszin B és tripszinogén kolokalizációja egészséges humán pancreasban Az A, B és C panel egy, míg a D és E panel egy másik egyénből származik, akiknél nem volt az anamnézisben korábbi pancreas betegség. A szöveteket fixálták, műgyantába ágyazták, immuno-arannyal jelölt antitesttel kezelték (katepszin B esetében 5 nm arany, anionos tripszin esetén 15 nm arany jelöléssel). A vonal 1 μm vastagságot jelöl. A panel kontroll 2 órás előinkubálás a megfelelő feleslegben vett antitesttel, jelölés gyakorlatilag nem tapasztalható B panel acinus sejtek endoplazmatikus retikulumában és lizoszómájában (beillesztett ábra) megfigyelhető a katepszin B A kolokalizáció következetesen a szekretorikus granulumokban figyelhető meg (C és D panel) A B és D panelekben a fehér nyilak a katepszin B; míg a fekete nyilak a tripszin arany jelölését mutatják. E panel acinus sejtek lumenje 83