A plazminogén metilglioxál módosítása csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát. Léránt István, Kolev Kraszimir, Gombás Judit és Machovich Raymund

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A plazminogén metilglioxál módosítása csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát. Léránt István, Kolev Kraszimir, Gombás Judit és Machovich Raymund"

Pál Bakos
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 A plazminogén metilglioxál módosítása csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát Léránt István, Kolev Kraszimir, Gombás Judit és Machovich Raymund Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémia Intézet, Budapest Fehérjék poszttranszlációs módosítása a Diabetes Mellitus (DM) késõi szövõdményei kialakulásában fontos szerepet játszhat. DM következtében a keringésében a metilglioxál (MGX) - egy reaktív α-keto-aldehid koncentrációja megemelkedhet 1. MGX hatására a fehérjék lizin, arginin, valamint cisztein oldalláncai módosulhatnak 2. Vizsgálataink szerint MGX hatására módosult plazminogénbõl képzõdõ plazmin csökkent fibrinolítikus aktivitást mutat 3. In vivo, a metilglioxál számtalan molekulával kerülhet kapcsolatba, a DM késõi szövõdményei kialakulásában játszott szerepét az in vivo rendszert megközelítõ rendszerben célszerû vizsgálni. Munkánk során humán plazmát inkubáltunk metilglioxállal. Vizsgáltunk, a plazma metilglioxál kezelése miként befolyásolja a protrombin idõ, aktivált parciális tromboplasztin idõ értékeket. Tanulmányoztuk, a MGX kezelés hogyan befolyásolja a plazminogén izolálására használt lizin-sepharose 4B affinitás kromatográfiát. Összehasonlítottuk a MGX módosított, valamint a normál plazmából izolált plazminogén aktivációs kinetikáját. Vizsgáltuk, hogy a csökkent fibrinolítikus aktivitás kialakulása, melyik molekuláris tényezõ plazminogén, fibrinogén, antitrombin MGX hatására bekövetkezõ módosulásával magyarázható. 1 P. J. Thornalley, N. I. Hooper, N. I. Jennings, C. M. Florkowski, A. F. Jones, J. Lunec, A. H. Barnett, The human red blood cell glyoxalase system in diabetes mellitus, Diab. Res. Clin. Pract. 7 (1989) A. S. Krolewski, J. H. Warram, L. I. Rand, C. R. Kahn, Epidemiologic approach to the etiology of type I diabetes mellitus and its complications, N. Engl. J. Med. 317 (1987) István Léránt, Krasimir Kolev, Judit Gombás and Raymund Machovich: Modulation of plasminogen activation and plasmin activity by methylglyoxal modification of the zymogen Biochim. Biophys. Acta 1480: , 2000

2 Extinkció MGX plazma Kontroll plazma Frakciószám 1. ábra. Metilglioxál kezelés hatása a plazminogénnek Lizin-Sepharose 4B affinitás kromatográfiával történõ elõállítására. Humán plazmát 20 o C-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mm) inkubáltunk. Az elõkezelt plazmát, illetve kontroll plazmát (20 ml) Lizin-Sepharose 4B gyantával (25 ml) kevertettük 1 órán át. Az aspecifikusan kötött fehérjék mosását követõen a plazminogént lineáris grádienssel [ε-aminokapronsav 0-10 mm] eluáltuk.

3 Extinkció Kontroll plazma MGX plazma Aktivációs idõ [perc] 2. ábra. Humán plazma metilglioxál kezelésének hatása a plazmából izolált plazminogén streptokináz aktivációs kinetikájára Humán plazmát 20 o C-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mm) inkubáltunk. A metilglioxál-kezelt, illetve a kontroll plazmából izolált plazminogént (1 µm) streptokinázzal (100 U/ml) inkubáltuk 37 o C-on. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl), majd SpPL szintetikus szubsztráttal (100 µm, 200 µl) mértünk a plazmin amidolitikus aktivitását.

4 Maradék plazmin aktivitás [% Inkubációs idõ [perc] Kontroll MGX kezelt plazma 3. ábra. Plazma metiglioxállal történõ kezelésének hatása a plazmin antitrombin inaktivációs reakciójára Humán plazmát 20 o C-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10 mm) inkubáltunk. A metilglioxál-kezelt, illetve a kontroll plazmából izolált plazminogént streptokinázzal aktiváltuk. A plazmint (1 µm) antitrombinnal (2 µm) inkubáltuk 37 o C-on, a jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl), majd SpPL szintetikus szubsztráttal (100 µm, 200 µl) mértünk a plazmin amidolitikus hatását.

5 Maradék plazmin aktivitás [%] Inkubációs idõ [perc] Plazmin [P] 100 um MGX P P + AT 100 um P + AT 10 um MGX P + AT 4. ábra. Plazminogén in vitro metilglioxál módosításának hatása a plazmin antitrombin inaktivációra. Plazminogént [P] (5 µm) 37 o C-on 1 órán át metilglioxál oldattal [MGX] (10, 100 µm) inkubáltunk. Dialízist követõen a plazminogént streptokinázzal aktiváltuk. A plazmint (1 µm) antitrombinnal [AT] (2 µm) inkubáltuk 37 o C-on. A jelzett idõpontokban mintát vettünk és SpPL (100 µm) szintetikus szubsztrát segítségével meghatároztuk a maradék plazmin aktivitást.

6 Maradék plazmin aktivitás [%] Inkubációs idõ [perc] Plazmin [P] P + kontroll AT P um MGX AT P + 10 um MGX AT 5. ábra. Antitrombin in vitro metilglioxál módosításának hatása a plazmin inaktivációra. Antitrombint [AT] (5 µm) 37 o C-on 1 órán át kezeltünk metilglioxállal [MGX] (10, 100 µm). A dialízist követõen a kezelt antitrombint [AT] (2 µm) 37 o C-on plazminnal [P] (1 µm) inkubáltuk. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl) és SpPL (100 µm) szintetikus szubsztrát segítségével meghatároztuk a maradék plazmin aktivitást.

7 Maradék trombin aktivitás [% Inkubációs idõ [perc] Trombin [T] T+ kontroll AT T+100 mm MGX AT T+ 10 um MGX AT 6A. ábra. Antitrombin metilglioxál módosításának hatása a trombin inaktivációjára. Trombin aktivitás SpTH szubsztráton: Antitrombint [AT] (2 µm) kezeltünk 1 órán át 20 o C-on metilglioxállal [MGX] (10, 100 µm). A dialízist követõen trombint (1 µm) inkubáltunk 37 o C-on a kontroll, illetve módosított antitrombin oldatokkal. A jelzett idõpontokban mintát vettünk (10 µl) és 100 µm SpTH-nal (200 µl) mértünk a minták maradék trombin aktivitását. Maradék trombin aktivitás [% Inkubációs idõ [perc] Trombin [T] T+ kontroll antitrombin T+ 100 um MGX AT T+ 10 um MGX AT 6B. ábra. Antitrombin metilglioxál módosításának hatása a trombin inaktivációjára. Mérési körülmények, mint 6A., csak SpTH szubsztrát helyett fibrinogént (2 mg/ml) használtunk.

8 Lízis idõk (50%) átlaga ± SD [Metilglioxál] x SD µm µm µm mm táblázat. Metilglioxállal módosított fibrinogénbõl képzett fibrin alvadék lízise Fibrinogént [2 g/l] módosítottunk 37 o C-on 1 órán át metilglioxál oldattal. A dialízist követõen 360 µg fibrinogénbõl 1 U/ml trombinnal a microplate küvettába alvadékot képeztünk. Az alvadék felszínére plazmin oldatott (2 µm) rétegeztünk, a fibrinolízis sebességét az alvadék ún. lízis idejével (50 %) jellemeztük.

9 Lízis idõk (50%) átlaga ± SD [Metilglioxál] x SD µm µm µm mm oo 2. táblázat. Metilglioxállal módosított plazmin hatása a fibrin alvadék lízis idejére (50 %) Plazminogént [2 µm] módosítottunk 37 o C-on 1 órán át metilglioxállal. A dialízist követõen a plazminogént streptokinázzal (1000 U/ml) aktiváltuk. A keletkezett plazmin aktivitását a fibrinolízis (360 µg fibrinogénbõl képzõdött alvadék) lízis idejével (50 %) jellemeztük.

10 Eredmények és megbeszélés Humán plazma 10 mm MGX-lal 1 órán történõ inkubációja nem befolyásolta a plazma protrombin idõ, aktivált parciális tromboplasztin idõ értékeit. Csökkentette az affinitás kromatográfiás eljárással a plazmából izolálható plazminogén mennyiségét. Az elúció során jelentkezõ minor plazminogén pool arra utal, hogy az izolált plazminogénben a lizin-kötõhely szerepét betöltõ domainek módosulhatnak (1. ábra). Az affinitás kromatográfiás eljárással preparált plazminogén streptokinázzal történõ aktivációjának sebessége, valamint az amidolitikus aktivitást mutató plazmin molekulák hányada csökken az MGX kezelt plazmából származó preparátum esetében (2. ábra). A plazmin - antitrombin inaktiváció sebessége fokozódik MGX kezelésre akkor, ha (i) MGX kezelt plazmából izolált plazminogénbõl aktivált plazmint (3. ábra), (ii) in vitro MGX lal módosított plazminogénbõl aktivált plazmint (4. ábra) vizsgáltunk. Nincs különbség a plazmin antitrombin inaktiváció sebességében akkor, ha MGX-módosított antitrombint alkalmaztunk a reakció során (5. ábra). Az antitrombin MGX módosítása nem befolyásolta a trombin antitrombin inaktiváció folyamatát sem (6. és 7. ábra). Fibrinogén MGX módosítása nem befolyásolta a trombin fibrinogén alvasztási reakciót. A MGXfibrinogén kölcsönhatás nem befolyásolja az MGX-módosított fibrinogénbõl készült fibrinháló plazmin hatására bekövetkezõ oldásának sebességét (1. táblázat). Ugyanakkor jelentõsen növekedett a fibrinháló oldási sebessége MGX-kezelt plazminogénbõl aktivált plazmin jelenlétében (2. táblázat). Eredményeink szerint rendkívül rövid inkubációs idõ 60 perc során MGX jelenlétében kialakulnak azok a módosulások, melyek következtében csökkenhet a plazminogén kötõdése a fibrin hálóhoz, aktivációjának sebessége, illetve a fibrinolízis hatékonysága. Vizsgálataink arra utalnak, hogy a fibrinogén, az antitrombin bár módosulhat MGX hatására, ezek nem befolyásolják az alvadási (trombin fibrinogén) reakciókat, illetve a trombin antitrombin inaktivációt. Plazminogén módosulása következtében esetleg fiziológiai szerepet kaphat a plazmin antitrombin reakció is. Kapott eredményeink a DM során kialakuló trombotikus történések okaként a metilglioxálnak a fibrinolítikus rendszer hatékonyságát csökkentõ hatását valószínûsítik.

Hasonló dokumentumok

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL Az egyes biomolekulák izolálása kulcsfontosságú a biológiai szerepük tisztázásához. Az affinitás kromatográfia egyszerűsége, reprodukálhatósága