A hisztamin és hisztamin H4 receptor hiányának hatása a dendritikus sejtek működésére

A hisztamin és hisztamin H4 receptor hiányának hatása a dendritikus sejtek működésére Doktori értekezés Jelinek Ivett Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. László Valéria egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Berki Tímea egyetemi docens, Ph.D. Dr. Dérfalvi Beáta egyetemi tanársegéd, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Oláh Imre egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Lányi Árpád egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Kiss András egyetemi adjunktus, Ph.D. Budapest 2007

Tartalomjegyzék A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke... 3 I. BEVEZETÉS... 7 I.1 A dendritikus sejtek, és szerepük az immunológiai folyamatokban... 7 I.2 A hisztamin felfedezése, bioszintézise, lebontása és alapvető funkciói... 14 I.2.1 A hisztamin jelátviteli mechanizmusai és főbb biológiai hatásai... 15 I.2.1.1 Jelátvitel H1, H2 és H3 receptorokon keresztül... 17 I.2.1.2 Jelátvitel H4 receptoron keresztül... 19 I.3 A hisztamin és a dendritikus sejtek kapcsolata... 21 I.4 A hisztamin hatása a dendritikus sejtek működésére - kérdésfeltevés... 23 II. CÉLKITŰZÉSEK... 25 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 26 III.1 Anyagok... 26 III.1.1 Állatok... 26 III.1.2 Primer sejtek, sejtkultúrák... 26 III.1.3 Kísérletek során alkalmazott médiumok... 27 III.1.3 Pufferek és egyéb oldatok... 28 III.1.4 Antitestek, mágneses gyöngyhöz konjugált antitestek, peptidek, ELISA... 29 III.1.5 RNS izoláláshoz, tisztításhoz, átírásához és real time PCR-hez szükséges eszközök... 30 III.1.6 Egyéb reagensek és eszközök... 31 III.2 Módszerek... 33 III.2.1 Dendritikus sejt izolálás... 33 III.2.2 In vitro antigénprezentációs assay... 33 III.2.3 Hisztamin és H4R antagonista hatása aktivált dendritikus sejtek in vitro citokin termelésére... 35 III.2.4 In vivo dendritikus sejt stimulációs modell... 35 III.2.5 RNS izolálás, reverz transzkripció és real time PCR... 36 III.2.6 Áramlási citometriás vizsgálatok... 37 III.2.7 ELISA... 38 III.2.8 In vitro migrációs assay... 38 III.2.9 Epidermisz preparálás és Langerhans sejtek vizsgálata... 39 III.2.10 In vivo migrációs assay (FITC painting assay)... 40 III.2.11 Statisztikai elemzések... 40 IV. EREDMÉNYEK... 41 IV.1 HDC -/- és vad típusú DC-k antigénprezentáló képességének összehasonlítása. 41 IV.2 HDC -/- és vad típusú DC-k áramlási citometriás vizsgálata... 42 IV.3 HDC -/- és vad típusú DC-k in vitro citokin termelésének vizsgálata... 45 IV.4 HDC -/- és vad típusú DC-k in vivo citokin termelésének vizsgálata... 48 IV.5 Hisztamin receptorok expressziójának vizsgálata dendritikus sejteken... 50 1

IV.6 H4R -/- és vad típusú DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása51 IV.7 DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása különböző hisztamin receptor blokkolók jelenlétében... 52 IV.8 A H4R szerepe a hisztamin-mediált Th polarizációban... 54 IV.9 A H4R szerepe a DC-k in vitro migrációjában... 55 IV.10 Langerhans sejtek számának összehasonlítása H4R -/- és vad típusú egerek fül epidermiszében... 58 IV.11 A H4R szerepe a DC migrációban in vivo (FITC painting assay)... 59 V. MEGBESZÉLÉS... 61 VI. KÖVETKEZTETÉS... 70 ÖSSZEFOGLALÓ... 74 SUMMARY... 75 IRODALOMJEGYZÉK... 76 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE... 88 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 89 2

A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke 5/4E8 egér T-sejt hibridóma sejtvonal, Balb/c egértörzsből ANOVA APC varianciaanalízis, Analysis of Variance antigénprezentáló sejt, antigen presenting cell BSA Balb/c marha szérum albumin, bovine serum albumin beltenyésztett egértörzs C57BL/6 camp CCL_ CCR_ CD cdc cdns CFA CIITA C T CTLL CXCR_ beltenyésztett egértörzs ciklikus adenozin-monofoszfát chemokine (CC motif) ligand _ chemokine (CC motif) receptor _ katalogizált sejtfelszíni marker sorszám-azonosítóját bevezető előtag, Cluster of Differentiation kovencionális dendritikus sejt komplementer DNS komplett Freund adjuváns, Complete Freund s Adjuvant MHC class II transactivator Cycle treshold limfoblaszt sejtvonal, citotoxikus T-sejt klón chemokine (CXC motif) receptor _ DAO DC DC-SIGN DEC205 Dectin-1 DMEM DMSO diamin-oxidáz dendritikus sejt, dendritic cell C-típusú lektin receptor, DC-specific ICAM grabbing non-intergrin,cd209 nem rövidítés, C-típusú lektin receptor, CD205 nem rövidítés, C-típusú lektin receptor, béta-glükán-receptor Dulbecco's Modified Eagle's Medium dimetil-szulfoxid 3

dntp dezoxiribonukleotid-trifoszfát EDTA ELC (CCL19) ELISA etiléndiamin-tetraacetát EBV-induced molecule-1 Ligand Chemokine Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FACS FCS FITC Fluorescence Activated Cell Sorting embrionális borjúsavó, Fetal Calf Serum fluoreszcein-izotiocianát GAPDH glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GATA-3 transzkripciós faktor: GATA binding protein 3 GILT IFN-gamma-inducible lysosomal thiol reductase GM-CSF Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor H1R H2R H3R H4R H4R -/- HDC HDC -/- HGPRT HNMT hisztamin H1 receptor hisztamin H2 receptor hisztamin H3 receptor hisztamin H4 receptor hisztamin H4 receptor génkiütött L-hisztidin-dekarboxiláz L-hisztidin-dekarboxiláz génkiütött hipoxanthin-guanin foszforibozil transzferáz hisztamin-n-metil transzferáz IFNγ IL -_ ip. interferon gamma interleukin_ intraperitoneális KO génkiütött, knockout LC Langerhans sejt 4

LPS lipopoliszacharid MACS MAPK MFI MHC MMR mrns MTT mágneses sejt szeparációs rendszer, magnetic cell separation mitogén-aktivált protein kináz átlagos fluoreszcencia-intenzitás, mean fluorescence intensity major histocompatibility complex macrophage mannose receptor, CD206 hírvivő, messenger RNS metiltiazolil-difenil-tetrazólium bromid OD optikai denzitás PAMP PBS PCR pdc PE PerCP PLC PRR patogénekre jellemző molekuláris mintázat, Pathogen-Associated Molecular Pattern foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat, phosphate-buffered saline polimeráz láncreakció, polymerase chain reaction plazmacitoid dendritikus sejt phycoerythrine peridinin-chlorophyll-protein complex foszfolipáz C mintázat felismerő receptor, Pattern Recognition Receptor RNS RPMI ribonukleinsav Roswell Park Memorial Institute által kifejlesztett tápfolyadék SDF-1 SEM SPF SV129 stromal cell derived factor-1 standard hiba, Standard Error of Mean egyes kritikus kórokozóktól mentes, specific pathogen free nem beltenyésztett egértörzs T-bet transzkripciós faktor, T-box expressed in T-cells; T-box protein 21 Th segítő, helper T- sejt 5

TLR TNF Treg Toll-like Receptor tumor nekrózis faktor regulatórikus T-sejt WT vad típus, wild type 6

..I... Bevezetés Jelen doktori értekezés tárgyát egy kismolekulájú biogén amin, a hisztamin, dendritikus sejtek működését, érését és migrációját befolyásoló hatásainak elemzése képezi. I.1 A dendritikus sejtek, és szerepük az immunológiai folyamatokban A dendritikus sejtek (DC-k) az immunrendszer meghatározó antigénbemutató sejtjei (1. ábra). Heterogén populációik csontvelői eredetűek, megtalálhatók szinte mindenhol a szervezetben, mind limfoid, mind nem limfoid szövetekben. Mégis legjellemzőbbek azokon a területeken, ahol a szervezet kapcsolatba kerül a környezettel, így az epidermiszben, mukózális membránokban, de a szervek közötti intersticiális területeken is. Bár ezek a sejtek csupán 1-2%-át teszik ki a bőr, illetve a mukózális felszínek teljes sejtszámának, mégis jellemző nyúlványaikkal szinte behálózzák a teljes szöveti felszínt és ellenőrzés alatt tartják azt. A DC-k jellegzetes nyúlványaikról könnyen felismerhetők, ebből ered a dendritikus sejt elnevezés is. 1. ábra A DC k jellegzetes nyúlványos morfológiájú sejtek 7

Kezdetben azt gondolták, hogy a dendritikus sejtek mieloid eredetűek, mivel számos morfológiai és funkcionális hasonlóságot mutattak a makrofágokkal. Később, mikor a dendritikus sejtek differenciálódási útvonalainak pontos feltérképezése lehetségessé vált, kiderült, hogy ezen sejtek kialakulása igen komplex és bonyolult folyamat 1;2. Jelenlegi ismereteink szerint, a dendritikus sejtek mind limfoid, mind mieloid progenitor sejtekből differenciálódhatnak, létrehozva a három legnagyobb dendritikus sejt alpopulációt: az epidermális Langerhans sejteket (LC-k), a szöveti, dermális és interstíciális dendritikus sejteket, vagy más néven a konvencionális dendritikus sejtek csoportját (cdc-k) és a plazmacitoid dendritikus sejteket (pdc-k) 1-6. Ezek az alpopulációk fenotípusukban, funkcióikban, aktiváltsági állapotukban és anatómiai lokalizációjukban is különböznek egymástól 2;6;7. Jelen dolgozat vizsgálati tárgyát az egérben található DC-k képezik, amelyek funkcionális felosztása alapvetően eltér az emberi DC-kétől, különösképpen a limfoid szövetekben található DC-k tekintetében. Az itt található konvencionális dendritikus sejteket ugyanis további alcsoportokba sorolják jellemző sejtfelszíni antigén-mintázatuk alapján. Így ha a fő dendritikus sejtfelszíni markeren, a CD11c-n kívül a dendritikus sejt CD8α expressziót is mutat, akkor limfoid dendritikus sejtről, ha viszont CD8α helyett CD11b-t hordoz, akkor mieloid dendritikus sejtről beszélhetünk. Fontos látni ugyanakkor, hogy ez a nomenklatúra némiképpen félrevezető lehet, ugyanis a limfoid és mieloid jelzők nem utalnak egyértelműen a sejt eredetére 3;6;7. A képet tovább bonyolítja, hogy valójában mára már ennél jóval több dendritikus sejt alpopuláció létezését is igazolták, sőt azt is, hogy az egyes alpopulációk képesek átalakulni egymásba 2;3;8. A dendritikus sejtek differenciálódását igen komplex transzkripciós faktor hálózat tartja kézben. Ez a rendszer szabja meg, hogy adott esetben mely dendritikus sejt alosztály jön létre 2. Ezek az alpopulációk különböző, de ugyanakkor részben át is fedő differenciálódási útvonaluknak köszönhetően, a felszínükön expresszált markerek alapján különíthetőek el egymástól 9;10. A fentiektől függetlenül azonban le kell szögeznünk, hogy a dendritikus sejtek egerekben és emberekben ugyanazt az alapvető szerepet töltik be, habár bizonyos eltérések is megfigyelhetők olykor ezen sejtek viselkedésében 6. A dendritikus sejtek, mint professzionális antigénprezentáló sejtek meghatározó szerepet töltenek be az immunválasz megindításában és szabályozásában. Fő feladatuk 8

az antigének felvétele, feldolgozása és bemutatása T-limfocitáknak (2. ábra) 11-15. A T- sejtek a DC-k által feldolgozott peptideket MHC molekulákkal együtt, míg a glikolipideket a CD1 molekulák segítségével ismerik fel 11;16. 2. ábra Az antigénprezentáció sémája DC= dendritikus sejt, Th1 és Th2= 1 es és 2 es típusú segítő T sejt, Treg= regulatórikus T sejt, PRR= mintázat felismerő receptor A dendritikus sejtek az immunrendszer őrszemei, melyek állandóan vándorolva a vér, perifériás szövetek, nyirokutak és limfoid szövetek között, folyamatosan ellenőrzés alatt tartják a szervezetet, felkészülten várják az esetlegesen szervezetbe kerülő patogéneket, majd a patogének természetétől függően, aktív immunválaszt vagy toleranciát indukálnak. Ugyanakkor a DC-k az immunrendszer szenzorainak is tekinthetők, amelyek aktivációtól függően, legyen az mikrobiális vagy egyéb stimulus, intenzív érési folyamaton (maturáció) mennek keresztül, amely elengedhetetlen az effektív adaptív immunválaszhoz nemcsak egy esetleges fertőzéssel szemben, hanem transzplantáció, tumorok, autoantigének, és allergének esetében is 11;13. Megfigyelések szerint, a szervezetben található DC-k többsége úgynevezett éretlen formában található. Ezek az éretlen DC-k igen csekély T-sejt aktivációs képességgel rendelkeznek, ugyanakkor hihetetlen aktív antigén felismerő képességgel bírnak, ami csak ebben az állapotukban jellemző rájuk 13. Az éretlen DC-k felszínén számos 9

antigénfelismerő receptor található, amelyek az endocitózisban, azaz az antigének felvételében vesznek részt. Néhány molekula ezek közül a C-típusú lektinek csoportjába tartozó receptor, például az MMR, DEC-205, DC-SIGN és a Dectin-1, amelyek az antigéneket cukormintázatuk alapján ismerik fel 17-19. Az éretlen DC-k szelektíven aktiválódnak különböző TLR (Toll-like Receptor) ligandokra megfelelő receptoraik révén, amelyek különböző mikrobiális termékek mintázatának felismerésére képesek. Ezen ligandok nagy részét mára már sikerült azonosítani 20-24. Fontos itt megjegyezni, hogy a különböző DC alosztályok meghatározott TLR mintázattal rendelkeznek, így különböző mikrobák ellen különböző DC populációk indukálnak effektív választ. Például a plazmacitoid DC-k jellemzően TLR7 és TLR9 receptorral rendelkeznek, mely receptorok elsősorban mikrobák DNS-ét ismerik fel. A CD8α pozitív DC-k jellemzően TLR3, TLR4 és TLR9 receptorral rendelkeznek, míg a CD8α negatív DC-k TLR4, TLR7 és TLR9 receptorokat expresszálnak 4;25. A TLR-ok és egyéb mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek, Pattern Recognition Receptors) által a DC-kben olyan jelátviteli útvonalak indulnak be, amelyek a DC-ket olyan, hatékony effektor dendritikus sejtekké alakítják át, amelyek képessé válnak az adott kórokozó elleni leghatékonyabb immunválasz kiváltására. A DC-k érését azonban egy sor egyéb molekula is befolyásolhatja, így a citokinek, kemokinek és számos egyéb szolubilis faktor is 26;27. Ilyen faktor a hisztamin is, amelynek hatásaival foglalkozik a dolgozat 28;29. A DC-k érése elengedhetetlen az effektív immunválasz kialakulásához. Számos megfigyelés igazolja, hogy a DC-kben az antigén felvételét követően beindul az az érési folyamat, mely során kialakul a DC-kre jellemző dendritikus morfológia, azonban nemcsak morfológiai, hanem egy sor funkcionális változás is bekövetkezik a sejtekben, például az MHCII molekulák kihelyeződnek a sejtek felszínére. Így a DC-k már képesek a felvett és feldolgozott antigének hatékony bemutatására, amely az első feltételt jelenti az antigénprezentáció folyamatában. Ekkorra már a DC-k egyrészt elvesztik képességüket az antigének felvételére, másrészt számos kostimulációs molekula is megjelenik a felszínükön, amelyek közül a legjellemzőbbek a B7 családba tartozó CD80 és CD86 molekulák 30-32. E molekulák az antigénprezentációval egyidejű kostimulációban veszenek részt. A kostimuláció az aktív immunválasz beindításának második, elengedhetetlen feltétele, ennek hiánya a T-sejtben anergiát, illetve toleranciát eredményez. 10

Azonban a kostimuláció megléte sem elégséges az effektív immunválaszhoz, mivel mind a bemutató DC-k (IL-12 és interferonok), mind a felismerőt-sejtek (Th1 és Th2 citokinek) által termelt citokinek is szükségesek az immunválasz irányának és erősségének meghatározásához 33-35. A DC-k által termelt citokinek tehát alapvető szerepet töltenek be a természetes és adaptív immunválasz összekapcsolásában. Az interferonok és az IL-12 számos olyan jelátviteli útvonalat indukálnak, amelyek meghatározóak többek között a Th1 irányú T- sejt differenciálódásban, a Th2 válaszban, így szerepet játszanak az antitestek termelődésében, a makrofágok aktivációjában, a citotoxikus immunválasz kialakításában és ez által az adaptív ellenálló képesség kialakításában 36-38. A DC-k jellemzően mobilis sejtek. Számos olyan kivételes tulajdonsággal rendelkeznek, amely lehetővé teszi számukra a hatékony immunválasz megindítását olyan antigénekkel/patogénekkel szemben is, amelyek sok esetben a szervezet limfoid szöveteitől távol, a periféria bármely területén jelennek meg. A DC-k azok, amelyek eljuttatják az antigéneket a felvétel helyszínétől az immunrendszer nyirokszerveibe, és ott megjelentetik azokat, mint immunogén MHCII/peptid komplexeket. A DC-k ezen képessége alapvető az elsődleges immunválasz megindítása szempontjából 39;40. Tehát az antigénfelvétel és -bemutatás a szervezet különböző helyszínein történik. Ennek érdekében az immunrendszer fejlődése során a dendritikus sejteket irányító jól szervezett és kontrollált migrációs rendszer alakult ki, amelyben a kemokinek és kemokin receptorok meghatározó szerepet töltenek be 41-44. A kemokinek olyan szolubilis molekulák, amelyek növekvő koncentrációjukkal kemotaxist váltanak ki a kemokint kibocsájtó szerv, vagy sejtcsoport felé, emellett jellemzik a sejteket körülvevő szöveti környezetet is. A jeleket csak az a sejt tudja fogni, amely rendelkezik a kemokin felismerésére szolgáló megfelelő kemokin receptorral. A kemokinekre és receptoraikra korlátozott specificitás jellemző, mivel egy adott receptor több különböző kemokin felismerésére is képes, illetve ugyanaz a kemokin több eltérő receptorhoz is képes kötődni 45. A kemokineken kívül egyéb molekulák, nem kemokin-jellegű kemotaktikus agonisták, citokinek, lipid mediátorok, membrán proteinek, gyulladási mediátorok- így a hisztamin- is modulálhatják a DC-k migrációját 41;46. Az immunrendszer sejtjei eltérő kemokin és kemokin receptor mintázattal rendelkeznek, sőt ezen mintázat időben, aktiváltsági állapottól függően is eltérést mutat 45. 11

Így a DC-k is számtalan kemokin receptort hordoznak a felszínükön. Ezek többségében két nagy kemokin-családba tartozó kemokinek receptorai, a CC- és CXC-kemokineké (CXCR4, CCR1, stb.), amelyek a DC-k érettségi állapotától függően eltérő mintázatokban jelennek meg a sejtek felszínén. Már az éretlen DC-k is számos kemokin receptorral rendelkeznek, ezek közül néhány a CCR1, CCR2, CCR5 és CXCR1, CCR6. Ezen receptorok ligandjai a CCL5, CXCL8, CCL3, CCL7; többségében gyulladás hatására termelődnek, szerepük a DC-k odavonzása a gyulladás helyszínére 47;48. A DC-k érésük során a fenti kemokin receptoraik expresszióját csökkentik, ezáltal elvesztik érzékenységüket az előbb említett kemokinek iránt, ami lehetővé teszi, hogy elhagyják a gyulladás helyszínét 7. Ugyanakkor fokozzák egy másik kemokin receptor, a CCR7 expresszióját, amely a konstitutívan expresszálódó kemokineknek, a CCL19, illetve a CCL21 receptora 40;41;47;48. Ezt a két kemokint a nyirokcsomók T-sejtes zónájában található stróma-sejtek termelik, és egy növekvő grádienst képezve a DC-ket a nyirokcsomókba irányítják. Így az érett DC-k kapcsolatba kerülnek a naív T-sejtekkel és bemutathatják a felvett és feldolgozott antigéneket. A másik két kemokin receptor, amely ugyancsak az érett DC-kre jellemző a CCR4 és CXCR4, ezek ligandjai a CCL17 és az SDF-1 47;49. Ugyanakkor csak abban az esetben indulhat meg egy sikeres immunválasz, ha a DC-k kapcsolatba kerülnek megfelelő naiv T-limfocitákkal, ezért a DC-k is számos kemokint (CCL19, CCL17) termelnek azért, hogy a T-sejteket magukhoz vonzzák, és ezzel még inkább növeljék az antigénprezentáció és a T-sejt aktiváció hatékonyságát 47. Mindezek azt mutatják, hogy a kemokinek, kemokin receptorok és egyéb migrációban szerepet játszó faktorok egy olyan rendkívül komplikált, de ugyanakkor jól szervezett hálózatot alkotnak, amelyek lehetővé teszik, irányítják és fenntartják a szervezet sejtjeinek és ezen belül a DC-knek is a mozgását. A dendritikus sejtek miután megérkeznek a gyulladás helyszínére, felveszik az antigéneket, aktiválódnak a környezetből származó egyéb aktivátor, illetve gyulladásos molekulák hatására és érési folyamaton mennek keresztül. Ilyen környezeti faktorok a PAMP-ok (patogénekre jellemző molekuláris mintázatok), endogén gyulladási molekulák (pl. hisztamin), gyulladásos citokinek (pl. IL-1, TNFα) és különböző bakteriális termékek (pl. LPS). 12

Összefoglalva: mindezen folyamatok végső célja természetesen az, hogy amikor egy fertőző ágens megtámadja a szervezetet, hatékony immunválasz alakuljon ki ellene. Azonban az is fontos, hogy a patogén ellen megindított válaszreakció során a DC-k a lehetséges immunológiai válaszlépések közül a leghatékonyabb mechanizmusok optimális kombinációját indítsák be. Másrészről legalább ilyen fontos, hogy a DC-k működése következményeként, a saját antigénekkel szemben ne szűnjön meg a tolerancia, ne alakuljon ki immunreakció, azaz autoimmunitás. Mindezen döntések meghozatalában a DC-k alapvető szerepet játszanak, mivel elsősorban ezek a sejtek a felelősek a naív és az effektor T-sejtek aktivációjáért és a centrális és perifériás tolerancia kialakításáért is. A DC-k mintázat-felismerő receptoraik segítségével (TLRok, C-típusú lektinek, stb.) információhoz jutnak az antigén természetéről és ezt az információt citokinek és kostimulációs molekulák termelése révén megosztják a reagáló T-sejttel is. A DC-k által termelt IL-12 és IFNγ például Th1 irányba polarizálja az aktiválódott T-sejteket, ugyanakkor az IL-10 immunszupressziót vált ki 36;50;51.Ezek a jelek aztán olyan jelátviteli folyamatokat indítanak meg a T-limfocitákban, amelyek a fertőző organizmussal szembeni leghatékonyabb választ eredményezik. 13

I.2 A hisztamin felfedezése, bioszintézise, lebontása és alapvető funkciói A hisztamin egy alkalikus biogén amin, amely előállításáért egyetlen enzim, az L- hisztidin karboxilcsoportját eltávolító L-hisztidin dekarboxiláz (HDC) a felelős. 52-55 A hisztamin szinte minden emberi szövetből izolálható, de különösen nagy mértékű hisztamin termelést a hízósejtek és bazofil granulociták folytatnak. Ezek a sejtek granulumaikban tárolják a termelt hisztamint, amelyek tartalma különféle fizikai és kémiai stimulusra degranulálódik a hisztamint termelő sejtekből 56. A hisztamin izolálása, legfontosabb élettani hatásainak leírása már mintegy 100 esztendővel ezelőtt megtörtént. Az elsők között fedezték fel, mint szolubilis gyulladási mediátort, így kutatástörténeti szempontból ez a molekula egyedülállóan hosszú tudományos pedigrével rendelkezik. Simaizom-stimuláló és vazodepresszor hatásait elsőként Dale és Laidlaw írták le még 1910-ben 57. Később kiderült, hogy a hatásokért felelős molekula mindössze 17 atomból álló igen egyszerű hatóanyag, amelyet számtalan szövetből is izolálni tudták, így a histos, a szövet görög neve után, hisztaminnak nevezték el (3. ábra) 58. A hisztamin inaktiválásában két enzim, a diamin-oxidáz (DAO), és a hisztamin-nmetil-transzferáz (HNMT) játszik szerepet. A DAO a hisztamint imidazol-acetaldehiddé alakítva, a terminális aminocsoport eltávolításával inaktiválja azt 59. A HNMT a hisztamint N τ -metil-hisztaminná metilálja 60. Jelentős eltérés van a két enzim szervi, illetve szöveti expressziójában, míg a DAO csak néhány szövettípusban expresszálódik, így elsősorban a vékonybélben, a vesékben, illetve a terhesség alatt a placentában és a vérben 61;62, addig a HNMT a szervezet számos szövetében kimutatható 60;63. 3. ábra A hisztamin (2 (4 imidazolil) etilamin) szerkezeti képlete 14

A hisztamin alapvető szerepet tölt be a szervezet fiziológiás és patológiás folyamataiban 64. Számos kórkép kialakításában vesz részt, sok esetben, mint effektor funkciók mediátora, más esetekben, mint szabályozó molekula, a betegségben szerepet játszó sejtek működését regulálja. Különösen fontos szerepet játszik immunológiai folyamatokban 56. Legismertebb ezek közül is az allergiás folyamatokban betöltött szerepe, de részt vesz a gyulladásos folyamatok regulálásában is 65-67. A hisztamin számtalan más immunfolyamat szabályozásában vesz részt 56, így kimutatták hatásait atheroszklerózisban 52;68, daganatokban 69 és autoimmun betegségekben 70 is. I.2.1 A hisztamin jelátviteli mechanizmusai és főbb biológiai hatásai A hisztamin hatásait négy különböző hisztamin receptor közvetítheti a célsejt felé. Ezek a receptorok a felfedezésük sorrendjében, a hisztamin H1, H2, H3 és H4 néven leírt receptorok (a tömörség kedvéért a továbbiakban a konvencionálisnak tekinthető H1R, H2R, H3R, H4R rövidítéseket fogjuk használni). Mind a négy receptor integráns, 7 transzmembrán doménnel rendelkező, tipikus G-proteinhez kapcsolt plazmamembránreceptor, melyek ligandkötő affinitása, szervezeten belüli szöveti megoszlása, jelátviteli útjai és funkcionális sajátságai egyaránt jelentős mértékben különböznek egymástól 71. Mindegyik receptor rendelkezik számos, többé-kevésbé specifikus antagonistával, de vannak olyan blokkoló molekulák is, amelyek az összes receptort gátolni képesek. A hisztamin antagonisták szerkezeti hasonlóságot mutatnak a hisztaminnal, így kötődni képesek a hisztamin egy vagy több receptorához. Az antagonisták, ellentétben a hisztaminnal, bár kötődnek ugyan a receptorhoz, de a kötődés nem eredményez receptor aktivációt, így jel-továbbítás sem történik. Ahogy léteznek a hisztaminnak antagonistái, úgy vannak olyan molekulák, amelyek a hisztamin receptorhoz kötődve annak aktiválódását eredményezik. Ezek a hisztamin receptor agonisták. A természetes ligand, a hisztamin így maga is agonistának tekinthető. Az egyéb hisztamin agonisták hasonlóképp működnek, mint a hisztamin, csak a kötési affinitásuk és hatékonyságuk eltérő 72-74. Ugyanakkor azt is kimutatták, hogy függetlenül a ligandok jelenlététől, ezek a G- proteinhez kapcsolt receptorok aktív és inaktív állapotban is lehetnek. Valójában egy állandó equilibrium figyelhető meg az aktív és inaktív állapot között, amelyet az 15

agonista bekötődése az aktív konformáció felé billent el, amennyiben az aktív állapotot stabilizálja, míg az antagonista a receptor inaktív formáját stabilizálja. Ez alapján tehát elmondhatjuk, hogy az agonisták a receptor aktív konformációjához képesek kötődni és ez által tartós aktivációs szignálokat közvetítenek. Ezzel szemben a hisztamin receptor antagonisták jelentős része egyedi abban a tekintetben, hogy az inaktív receptor állapotot preferálják, stabilizálják a receptort ebben a működésképtelen állapotában, ezzel gátolva a szignál transzdukciót. Ezért sok hisztamin receptor antagonistát valójában inverz-agonistának tekintünk 72-74. Az alábbi táblázatban összefoglaltuk a legfontosabb tudnivalókat a négy hisztamin receptorról (1. táblázat) 1. táblázat A hisztamin receptorok jellemző tulajdonságai H1R H2R H3R H4R Antagonisták Agonisták Előfordulás Mepiramin, Chlorpheniramin, Cetirizin, Astemizol, Clemastin, Terfenadin, Loratidin, Tripolidin Zolantidin, Cimetidin, Ranitidin, Tiotidin, Famotidin Thioperamid, Clobenpropit, Carboperamid, Iodoproxyfan, Thioperamid, JNJ7777120, JNJ10191584 Hisztamin, Histaprodifen Hisztamin, Dimaprit, Amthamin, Ipromidin, Amthamin Imetit, (R)-a Methylhisztamin, Immepip Clobenpropit, Imetit, Clozapin, 4-methyl-hisztamin Szinte minden sejten (ideg-sejtek, légút- és ér simaizom, kondrociták, endotél sejtek, hepatociták, T- és B- limfociták, DC-k, monociták, eozinofil és neutrofil granulociták) Szinte minden sejten (ideg-sejtek, légút- és ér simaizom, kondrociták, endotél sejtek, hepatociták, T- és B- limfociták, DC-k, monociták, eozinofil és neutrofil granulociták) Központi idegrendszer, hisztaminerg neuronok, alacsony expresszió a perifériás szövetekben Hízósejtek, bazofil és eozinofil granulociták, DC-k, T-limfociták, hematopoetikus prekurzorok G protein Gq Gs Gi/o Gi/o 16

I.2.1.1 Jelátvitel H1, H2 és H3 receptorokon keresztül Hisztamin H1 receptor (H1R) A négy hisztamin receptor közül a H1R-t fedezték fel elsőként. A hisztamin receptorai közül ez rendelkezik a legkisebb kötési affinitással (K i = 12.500 nm), jelátvitele elsősorban G q/11 proteineken keresztül, tehát a foszfolipáz-c aktivált útvonalakon, többek között a protein-kináz C közreműködésével zajlik 46;75;76. A H1R számos sejttípus felszínén expresszálódik, így az érfal-endotél sejteken, simaizomsejteken, a mellékvesevelő kromaffin sejtjein, de a központi idegrendszer számos neuronján, és a szívizomsejtek felszínén is megjelenik 77. Az immunrendszer sejtjei közül a granulociták, monociták, dendritikus sejtek, T- és B-limfociták is megjelenítenek H1R-t a felszínükön. A szervi, szöveti megoszlását tekintve elmondhatjuk, hogy ez a receptor igen nagy elterjedtséget mutat, hiszen a gasztrointesztinális rendszerben, az agyban, az urogenitális rendszerben és a szívben is igen nagy mértékben expresszálódik 71;74. A H1R a fő hisztamin receptor az allergiás válasz során, mivel mind a hörgők és tápcsatorna simaizomzatának összehúzódásában, az érfal-endotél aktivációjában, az érfal-permeábilitás növekedésében, mind pedig az allergiás válasz során tipikus, erőteljes vazodilatációban is központi szerepe van 77;78. A H1R aktiválódása számos jellegzetes hisztamin-hatás kialakulásához vezet, így például a viszketés, vagy a mucus szekréció a H1R aktiváció tipikus következményei. Mivel mindezen azonnali típusú hiperszenzitivitás tünetei H1R antagonistákkal ( antihisztaminokkal ) jól kezelhetők, ezért a H1R-nak nagy jelentősége van a klinikumban is 78. A H1R a központi idegrendszerben is fontos szereppel bír, többek között szabályozza a cirkadián ritmust, és étvágy szabályozó hatása is van 79-81. A H1R immunológiai folyamatokat szabályozó hatása igen összetett, de általában véve úgy tűnik, hogy a H1R a Th1-jellegű, azaz a celluláris immunválaszt támogató immunrendszeri kommunikációt erősíti 82. Hisztamin H2 receptor (H2R) Mivel a H2R alapvető funkciót tölt be a gyomornyálkahártya sósav-szekréciójának szabályozásában, ez a receptor ugyancsak kiváló klinikai célpont gyomorfekélyes betegek kezelése során 83. A hisztamin H2R-hoz kötődése a K + -H + pumpákat stimulálja a gyomorban, amely megnövekedett gyomorsav-szekrécióhoz vezet. Ez a folyamat alapvető védekezési reakció az esetlegesen a tápcsatornába jutó parazitákkal szemben, 17

ugyanakkor a savas ph megfelelő környezet biztosít a gyomorban történő emésztési folyamatokhoz is 84. H2R számos egyéb szerepét is leírták, az erek simaizom-sejtjeinek kontrakcióját okozza, a szívben a H1R-ral ellenkező hatást vált ki 85;86, és kimutatták jelenlétüket a központi idegrendszerben és a zsírsejteken is 74. A H2R sok esetben ugyanazokon a sejteken is megtalálható, amelyeken a H1R, és ilyen esetekben a hisztamin rajta keresztül gyakran a H1R-ral ellentétes hatásokat vált ki. Így a hisztamin ugyanazon a sejten mind aktiváló, mind gátló hatásokat is kiválthat különböző receptorain keresztül, ilyen esetekben a hisztamin által okozott végső hatás a receptorok megjelenési arányától és kötési affinitásuktól függ 71. A H2R affinitása egyértelműen felülmúlja a H1R-ét (K i = 2.000 nm), és esetében a hisztamin hatását főként Gs fehérjék közvetítik, tehát elsősorban ciklikus adenozin monofoszfát (camp) keletkezését katalizáló útvonalak aktiválódnak 56;87. Az immunrendszerben a H2R főként Th2-jellegű, szuppresszív, illetve részben a humorális válaszokat is támogató immunmodulatórikus jeleket közvetít 82;88. Hisztamin H3 receptor (H3R) A H3R az előző két receptorral szemben igen korlátozott szöveti megjelenésű, elsősorban a központi idegrendszeri neuronok felszínén jellemző, de egyes perifériás idegsejteken és nem-idegrendszeri sejteken is expresszálódik 89;90. A H3R mint preszinaptikus receptor a hisztamin és egyéb neurotranszmitterek kibocsájtását szabályozza, illetve autokrin módon negatív visszacsatolás útján regulálja az idegszövetek hisztamin termelését 91. A négy hisztamin receptor közül a H3R rendelkezik a legnagyobb hisztaminkötő-affinitással (K i = 5,4 nm). A hisztamin hatást főként Gi/o fehérjék közvetítik, amelyek gátolják a camp keletkezését, serkentik a Ca ++ felhalmozódást és aktiválják a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) útvonalat 92. A H3 receptornak több izoformáját is megfigyelték, amelyek alternatív splicing következtében jönnek létre. Ezek az általuk aktivált jelátviteli mintázatok minőségében finom különbségeket mutattak egymáshoz képest 93. A H3R-nak az étvágy, a figyelem, a memória, továbbá a szervezet spontán lokomotórikus aktivitásának, cirkadián ritmusának, és alvás közbeni testhőmérsékletének a szabályozásában is jelentősége van 94;95. 18

Mivel a negyedik hisztamin receptor szerepének és működésének vizsgálata szerves tárgyát képezi a doktori dolgozatnak, ezzel a receptorral egy külön alfejezetben foglalkozunk. I.2.1.2 Jelátvitel H4 receptoron keresztül Hosszú ideig csak a három, az előzőekben említett hisztamin receptor volt ismert, de az egyre növekedő számú nyitott kérdés és megmagyarázhatatlan eredmény sejtette a létezését egy negyedik receptornak is, amelyet csak nemrégiben (2001-ben) fedeztek fel 96. A hisztamin immunkompetens sejtekre gyakorolt hatásai, ezen belül is például az eozinofil és hízósejtek migrációban betöltött szerepe már évtizedek óta igazolt volt, de csak az elmúl években - miután a H4 receptort felfedezték derült ki, hogy melyik receptor mediálja ezeket a hatásokat. Ezt a legfiatalabb hisztamin-receptort valójában nem is a hagyományos kutatási stratégiákkal, hanem egy in silico kutatási programban, a H3R-ral való homológiája révén sikerült azonosítani 96. Bár sem a receptor által aktivált intracelluláris jelátviteli utakat, sem a biológiai funkcióit nem írták még le teljes részletességgel, úgy tűnik, hogy a H4R jelátvitele elsősorban Gi/o proteinek aktiválásán keresztül zajlik. Aktiválása olyan jelátviteli útvonalakat indít be, amelyek Ca ++ beáramláshoz, camp-szint csökkenéshez és a MAPK útvonal aktiválódásához vezetnek 56. A H4R a H3R mögött éppen csak lemaradva a második legnagyobb affinitású hisztamin-receptor (K i = 8,1 nm) 97. A H4R-ról elmondható, hogy a legtöbb szövetben igen alacsony szinten expresszálódik, de ez alól kivételt képeznek a primer és szekunder nyirokszervek, így a csontvelő, a thymus, a lép, és a nyirokcsomók. A H4 receptor szinte kizárólag immunkompetens sejteken jelenik meg, így elsősorban bazofil és eozinofil granulocitákon, hízósejteken, egyes T-limfocitákon, és így a dendritikus sejteken is 56;97-99. Mivel az emberi H4R 31%-os szekvencia azonosságot mutat a H3R-al, számos széles körben alkalmazott H3R agonistáról és antagonistáról kiderült, hogy H4R-on keresztül is közvetítenek hatásokat 56;97. Például a thioperamid, amely korábban H3 antagonistaként vált ismertté, ugyanolyan hatékonyan kötődik a H4R-hoz is, és ez felveti számos korábbi eredmény újraértékelését a H3R-ral kapcsolatban 97. Az utóbbi években H4R-nak mind specifikus gátló szereit, antagonistáit, mind agonistáját megszintetizálták, sőt, egy genetikailag H4R-hiányos egérmodell is rendelkezésre áll 19

szerepének és hatásainak feltérképezéséhez. A két, már kereskedelmi forgalomban (de a klinikumban még nem) megjelent antagonista a JNJ7777120100 és JNJ10191584 100-102 egymástól csak egyetlen nitrogén atomban eltérő molekulák, amelyek igen nagy affinitással kötődnek a H4R-hoz (K i =4 nm és K i =27 nm). Specifikus H4R agonistaként a 4-methyl-hisztamint alkalmazzák 103, amely egy már régen ismert molekula, ugyanakkor a H4R felfedezéséig, mint H2R agonista volt ismert. Csak a H4R felfedezése után derült ki róla, hogy a H4R-hoz körülbelül 100-szor nagyobb affinitással kötődik, mint a többi hisztamin receptor típushoz, így ennek a molekulának is átértékelődött a jelentősége. Az a tény, hogy a H4R az immunrendszer sejtjein expresszálódik, előrevetíti esetleges szerepét gyulladásos és egyéb immunfolyamatokban 46;98;104. Ez a feltételezés a vele kapcsolatban eddig leírt kísérleti adatok alapján igazolódni is látszik. Specifikus antagonistákkal és agonistákkal folytatott kísérletekből, illetve H4R knockout egerek vizsgálatainak eredményeiből kiderült, hogy a hisztamin a H4R-on keresztül serkenti a kemotaxist eozinofil granulocitákban illetve hízósejtekben, mivel aktin polimerizációt indukál és Ca ++ -ot szabadít fel (4. ábra) 46;99;104;105. H4R H H H H Gα i/o Gβγ Ca ++ Ca ++ Ca ++ Ca++ Ca++ Ca ++ Ca ++ PLC Kemotaxis 4. ábra H4R mediált jelátvitel egyik lehetséges következménye a kemotaxis serkentése H= hisztamin, PLC= foszfolipáz C 20

A H4R-nak a migrációban betöltött szerepére később még visszatérünk, hiszen a DC migráció és a hisztaminnak a DC-k migrációjára gyakorolt hatása egyik a három alapvető DC funkciók közül, amit a dolgozatban megvizsgáltunk. A H4R szerepet játszhat viszketéses tünetek kialakulásában is, amely tünetek H4R antagonistával szintén kezelhetők 106;107. Ezen kívül H4R antagonistával kezelt illetve H4R génkiütött egerekben csökkentek az allergiás, gyulladásos tünetek, amelyek együtt jártak a tüdőt infiltráló eozinofilek és limfociták számának csökkenésével. Ezeken túlmenően a T-sejtek citokin termelése is megváltozott, gyengültek a Th2 irányú, illetve gyulladásos válaszok, így az IL-4, IL-5, IL-13, IL-6 és IL-17 citokinek termelődése is 99;108. A H4R antagonisták megakadályozták a peritonitisz kialakulását egy zymosan indukált modellben 109. Mindezen adatok felvetik annak a lehetőségét, hogy a H4R antagonisták a H1R antagonisták mellett hatékonyan felhasználhatók lesznek az allergiás megbetegedések, például az allergiás asztma terápiájában, de ezen kívül nagy reményeket fűznek a H4R blokkolók terápiás alkalmazáshoz egyéb gyulladásos (pl. colitis) és autoimmun betegségekben is 110;111. I.3 A hisztamin és a dendritikus sejtek kapcsolata A DC-k működésében a környezeti faktorok, mint például a citokinek, kemokinek, és különböző gyulladási mediátorok, így például a hisztamin is meghatározóak 28;29. Az is köztudott, hogy a DC-k számos hisztamin receptor-típust expresszálnak a felszínükön 28;88. Eltérő DC alosztályok eltérő funkciót töltenek be az immunfolyamatok során és irodalmi adatok alapján az is körvonalazódni látszik, hogy ezek az alpopulációk nemcsak funkciójukban, hanem sejtfelszíni molekula-mintázatukban is eltérnek, sőt eltérő hisztamin receptorokat jelenítenek meg a felszínükön 112. A hisztamin és a DC-k kapcsolatának irodalmát áttekintve kitűnik, hogy kevés és sokszor ellentmondó adat szól a hisztamin szerepéről a DC-k fejlődésében és működésük szabályozásában. Az előző fejezetben említett módon a DC-k stimulustól függően Th1, vagy Th2, sőt akár Treg irányba polarizálhatják a T-sejteket. Van olyan irodalom, ami arról számol be, hogy monocitákból történő DC differenciáltatás során a hisztaminnal való kezelés H1R-on keresztül Th1 irányú polarizációt és hatékonyabb antigénprezentációt eredményez 28. Ezzel szemben a H2 receptoron közvetített szignálok inkább szuppresszív hatásúak és az antigénprezentáció csökkenéséhez vezettek, továbbá 21

a hisztamin H2R-on keresztül növelte az IL-10 termelést és csökkentette az IL-12 szekréciót is 29. Adatok szólnak arról is, hogy a hízósejtek jelenléte és degranulációja fontos szereppel bír DC-k környezetében, jelenlétük Th2 irányú T-sejt polarizációt eredményez 113;114. Ugyanakkor olyan közlemény is olvasható, amelyben azt találták, hogy in vitro hisztamin jelenlétében differenciálódott humán DC-k nem jutnak el differenciáltságban olyan szintre, mint azok a DC-k, amelyek nem voltak hisztaminnal kezelve. A hisztaminnal kezelt kultúrák sokkal kisebb arányban tartalmaztak CD1a+ érett DC-ket, mint a kezeletlen csoport. Az is kiderült, hogy ezek a hisztaminnal kezelt DC-k gyenge T-sejt stimulátorok voltak a kontroll csoporttal összevetve 115. Egészséges saját szövetekből származó antigéneket a DC-k kereszt-prezentáció segítségével mutatnak be T-sejteknek, és toleranciát indukálnak velük szemben. Ezt a stratégiát választja számos tumor is, annak érdekében, hogy elkerülje az aktív immunválaszt, sőt kimutatták, hogy tumorok olyan citokineket termelnek (TNFα és IL- 10), amelyek a DC-kre és T-limfocitákra hatva anergiát, azaz válaszképtelenséget váltanak ki 116. Immár számos megfigyelés tanúsága szerint a hisztamin-termelés jelentősen felerősödik egy sor különböző daganattípusban 117-119. A daganatok által termelt hisztamin szintén hathat negatívan a DC-k antigénprezentációjára, illetve a Th2 polarizációnak kedvezve, támogathatja a tumorsejtek túlélését. Végül a hisztamin aktin polimerizációra gyakorolt hatását, intracelluláris Ca ++ mobilizációját és kemotaktikus hatását ugyancsak igazolták éretlen DC-ken. Ezen hatások közvetítésében munkacsoportoktól függően a H1, H3 és H4 receptoroknak is tulajdonítottak szerepet 29;120;121. Mivel a H4 receptort csak nemrégiben fedezték fel, irodalmi szempontból nem tekint nagy múltra, így e receptor szerepéről igen csekély információval rendelkezünk. Számos sejttípus esetében leírták a H4 receptor immunregulációban és migrációban betöltött szerepét, ideértve az eozinofil granulocitákat, hízósejteket, T-limfocitákat is. Ugyanakkor funkciójáról DC-ken csak csekély számú adat áll rendelkezésre. Eredmények szólnak arról, hogy a hisztamin H4R-on keresztül serkenti a DC-k migrációját, és fontos szerepet tölt be a DC-k T-sejt polarizációjának regulálásában 108;120. Dendritikus sejtek H4R-án keresztül a hisztamin Th2 polarizációt indukált, hiányában csökkent a T-sejtek IL-4 expressziója és számos egyéb gyulladási 22

citokiné is (IL-6, IL-17). Ugyanakkor a T-sejtek proliferációs képessége nem változott H4R hiányában 108. I.4 A hisztamin hatása a dendritikus sejtek működésére - kérdésfeltevés Jelen dolgozat középpontjában a dendritikus sejtek, és azok funkcióinak vizsgálata áll. Elsősorban azt a kérdést kívántuk vizsgálni, hogy a hisztamin, mint közismert gyulladásos, illetve allergiás mediátor hatással van-e a dendritikus sejtek működésére, és ha igen, milyen szerepet tölt be abban. Másodszor azt a kérdést tettük fel, hogy a hisztamin hatásainak közvetítésében mely receptorok játszanak szerepet, illetve célunk volt a legújabban felfedezett hisztamin H4-es receptor szerepét feltérképezni a DC-k működése során. A kérdések megválaszolásához és a hisztamin-hatások elemzéséhez olyan egérmodelleket használtunk fel, amelyek vagy nem rendelkeznek a hisztamint előállítani képes hisztidin-dekarboxiláz enzim génjével (HDC -/- ), vagy amelyekben a hisztamin négyes típusú receptorát (H4R -/- ) ütötték ki homológ rekombinációval. Az egerekből mágneses szeparációs technikával tisztított DC-k hisztamin-mentes környezetben differenciálódtak, értek, illetve a második rendszerben, bár a hisztamin jelen lehetett a környezetükben, nem rendelkeztek a hisztamin hatások közvetítéséhez szükséges egyik receptorral, a H4R-al. Alapos okunk van feltételezni, hogy mind fiziológiás, mind patológiás körülmények között a hisztamin megtalálható a DC-k környezetében, hiszen számos esetben kimutattak hízósejteket és egyéb hisztamin szekrécióra képes sejteket a DC-k közelében 113, sőt, irodalmi adatok tanulsága szerint a DC-k sejtek maguk is képesek hisztamin termelésre 108;122. A DC-kről másokkal egyetemben kimutattuk, hogy legalább három hisztamin receptort, H1R-t, H2R-t és H4R-t is expresszálják a felszínükön 88;108. Ettől függetlenül, és számos in vitro megfigyelés ellenére, mind a mai napig nem teljesen tisztázott, hogy a különböző hisztamin receptorokon keresztül mediált jelátviteli útvonalaknak van-e tényleges szerepe a DC-k működésében. Figyelemre méltó, hogy a hisztamin az immunrendszer működését valószínűleg mind a periférián, mind a környéki nyirokszervekben, az antigénprezentáció szintjén is hatékonyan befolyásolni képes 28. Ráadásul úgy tűnik, hogy az adott környezetből a 23

környéki nyirokcsomókba vándorló DC-k felé elsősorban Th2-típusú hatásokat közvetít, vagyis a celluláris immunválaszt gátolja 123. Mindezek ismeretében, vizsgálataink első lépcsőjében antigénprezentációs kísérletekben vetettük össze a hisztamin jelenlétében és hiányában differenciálódott DC-ket, majd megvizsgáltuk azokat a faktorokat is, amelyek az antigénprezentációt befolyásolják és esetlegesen hisztamin szabályozás alatt állnak. Ilyenek voltak a kostimulációs molekulák expressziójára és dendritikus sejt szubpopulációs megoszlásra irányuló kísérleteink, illetve a DC-k citokin termelő képességének vizsgálata. A második lépcsőben megvizsgáltuk, mekkora a jelentősége H4R-nak a fenti hisztamin hatások közvetítésében. Végezetül megvizsgáltuk a hisztamin és H4R szerepét a DC-k migrációjában is. 24

..II... Célkitűzések Az itt bemutatott doktori dolgozat célkitűzései röviden a következők voltak: 1. Transzgénikusan módosított, hisztamin-hiányos egerekből izolált dendritikus sejtek antigénprezentációjának vizsgálata 2. Hisztamin-hiányos és vad típusú dendritikus sejtek alpopulációinak és kostimulációs mintázatának összehasonlítása 3. Hisztamin-hiányos dendritikus sejtek citokin termelésének vizsgálata in vitro stimulálás után 4. Hisztamin-hiányos dendritikus sejtek citokin termelésének vizsgálata in vivo aktiválás után 5. Egér eredetű dendritikus sejtek különböző hisztamin receptor expressziójának vizsgálata 6. A H4R szerepének tanulmányozása az antigénprezentációjának folyamatában 7. A H4R szerepének elemzése dendritikus sejtek citokin termelésében 8. A H4R hatásának vizsgálata dendritikus sejtek migrációjára 25

..III... Anyagok és módszerek III.1 Anyagok III.1.1 Állatok Kísérleteinkhez kétféle génkiütött (knockout, KO) egérmodellt használtunk, amelyek intézetünk állatházában, SPF körülmények között voltak tartva. Minden kísérlethez 8-10 hetes nőstény egereket használtunk fel. Mindkét egérmodell beltenyésztett, Balb/c egértörzsből származik. Az egyik egértörzs genetikailag hisztamin hiányos (HDC -/- ), mert hiányzik belőle a hisztamin előállításáért felelős enzim, a hisztidin-dekarboxiláz (HDC) génje. Mivel ez az egyetlen enzim, amely hisztidinből hisztamint képes előállítani, ennek a génnek a kiütésével az állat többé nem képes hisztamin termelésre. A HDC -/- egértörzset Ohtsu és társai homológ rekombinációval hozták létre intézetünkkel együttműködve 54. Annak érdekében, hogy az állatok a táplálék útján se juthassanak hisztaminhoz, már a kísérleteket megelőző két hétben speciális, hisztamin-mentes tápon tartottuk őket. Így, mindezek eredményeként teljes hisztamin hiányt értünk el az egerekben. Kísérleteink második részében olyan egereket használtunk, amelyekből a hisztamin újonnan felfedezett, negyedik receptorát, a H4R-t ütötték ki homológ rekombinációval (H4R -/- ) 99. Ezt az egértörzset a Lexon Genetics hozta létre, intézetünkhöz a Johnson&Johnson jóvoltából került. Ezt az egértörzset a nem beltenyésztett SV129 törzsből intézetünk keresztezte vissza Balb/c, beltenyésztett törzsbe. Mindkét esetben a kísérletekhez génkiütött egerek mellett Balb/c hátterű vad (wild type, WT) genotípusú egyedeket alkalmaztunk kontrollként. III.1.2 Primer sejtek, sejtkultúrák Izolált dendritikus sejtek: HDC -/-, H4R -/- és vad típusú egerek lépeiből, mágneses gyöngyök segítségével (MACS rendszerrel, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) dendritikus sejteket 26

szeparáltunk, ezeket a sejteket használtuk fel későbbi kísérleteinkhez (lsd. még Módszerek című alfejezet). CTLL-2: Limfoblaszt sejtvonal, citotoxikus T-sejt klón. Ez a vonal IL-2 dependens 124, ezért kiválóan alkalmas az IL-2 citokin mennyiségi változásának pontos és érzékeny nyomon követésére. 5/4E8: Egér T-sejt hibridóma sejtvonal, amely a humán aggrekán peptid epitópjának (ATEGRVRVNSAYQDK) specifikus felismerésére képes T-sejt receptorral rendelkezik 125. III.1.3 Kísérletek során alkalmazott médiumok RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Kiegészítve: 10% hő-inaktivált FCS (Invitrogen, Gibco, Paisley, USA) 160μg/ml gentamicin (Biochemie Ausztria, Kundl, Ausztria) 2mM glutamin (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 50μM β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) DMEM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Kiegészítve: 10% hő inaktivált FCS (Invitrogen, Gibco, Paisley, USA) 160μg/ml gentamicin (Biochemie Ausztria, Kundl, Ausztria) 2mM glutamin (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 50μM β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 1% nem esszenciális aminosavak (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 1% nátrium-piruvát (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 27

III.1.3 Pufferek és egyéb oldatok 1xPBS MACS puffer: 1xPBS 0,5% BSA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) 2mM EDTA Kollagenáz D oldat: RPMI médium 2mg/ml Kollagenáz D (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) MTT oldat: MTT (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) 5 mg/ml 1xPBS-ben 3%-os BSA oldat 1xPBS-ben 0,02M EDTA 1xPBS-ben FITC oldat 5mg FITC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) oldva 2ml dibutil-ftalát aceton 1:1 arányú elegyében (FITC painting assay-hez) 28

III.1.4 Antitestek, mágneses gyöngyhöz konjugált antitestek, peptidek, ELISA Antitestek: Az összes antitest a BD Biosciences Pharmingen-től származik (San Diego, CA, USA) kivéve a DEC 205 antitestet, amelyet a Serotec Ltd-től vásároltunk, (Oxford, Anglia). Fluoreszcensen jelölt antitestek: PE anti-mouse CD11c PerCP anti-mouse CD8α FITC anti-mouse I-A/I-E (MHCII) FITC anti-mouse CD4 FITC anti-mouse CD11b FITC anti-mouse CD40 FITC anti-mouse CD80 FITC anti-mouse CD86 FITC anti-mouse DEC205 Fc-Receptor-Blokkoló: CD32/CD16 Mouse Fc Block Izotípus kontrollok: FITC Rat IgG2a FITC Rat IgG2b PE Rat IgG2a PE Rat IgG2b PE Hamster IgG1a PerCP Rat IgG2a 29

Aggrekán peptid: Humán aggrekán peptid Aminosav sorrend: ATEGRVRVNSAYQDK (Dr. Hudecz Ferenc jóvoltából, Peptidkémiai Kutatócsoport, ELTE, Budapest) CCL19: Rekombináns egér CCL19 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) GM-CSF: Rekombináns egér GM-CSF (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) Mágneses gyöngyök: CD11c (N418) MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) IFNg ELISA kit: Quantikine Mouse IFNg Immunoassay Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) IL-12p70 ELISA kit: Quantikine Mouse IL-12p70 Immunoassay Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) III.1.5 RNS izoláláshoz, tisztításhoz, átírásához és real time PCR-hez szükséges eszközök RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) DNS emésztés: DNase I (Promega, Madison, WI, USA) DNase buffer (Promega, Madison, WI, USA) STOP solution (Promega, Madison, WI, USA) Reverz transzkripció: 10x buffer 30

MgCl 2 dntp RNase inhibitor Random hexamer primers Reverse transcriptase (mind: Promega, Madison, WI, USA) Taqman Universal PCR Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Taqman real time próbák: mgapdh, mhgprt, mccr7, mccr6, mcxcr4, mil- 12p35, mil-10, mifnγ, mil-4, mt-bet, mgata-3, mh1r, mh2r, mh3r, mh4r, (mind: Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) III.1.6 Egyéb reagensek és eszközök Hisztamin és antagonistái: Hisztamin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Fexofenadin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Famotidin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Thioperamid (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) JNJ7777120 (R.L. Thurmond jóvoltából, Johnson&Johnson Labs, San Diego, USA) Mikropartikulumok: Polisztirénből készült mikropartikulumok, átlag átmérő 15 μm, normalizáláshoz használtuk fel FACS mérések során, sejtszámolás céljára (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Svédország). CFA, komplett Freund adjuváns (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) 31

LPS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) DMSO (Renal Finomvegyszergyár Rt., Budapest) Lefedőanyag: ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) MS mágneses sejtszeparáló oszlopok (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) Multiwell ELISA leolvasó (Labsystems, Helsinki, Finnország) Nanodrop ND-1000 spektrofotométer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) Gene Ataq Controller standard PCR automata (Pharmacia LKB, Uppsala, Svédország) AbiPrism 7000 real time PCR automata (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) FACSCalibur áramlási citométer (BD Biosciences, Pharmingen, San Jose, CA, USA) Transwells migrációs rendszer 5 µm pórus méret; 6,5 mm átmérő (Costar, Cambridge, MA, USA) Olympus IX81 Fluoreszcens mikroszkóp (Olympus, Tokyo, Japán) 32