Telomeráz expresszió mérése és galectin-3 vizsgálata patológiai mintákon Doktori (PhD) értekezés Dr. Kovács Rita Beáta Témavezeto: Dr. Kopper László egyetemi tanár Konzulens: Dr. Sápi Zoltán egyetemi docens Programvezeto: Dr. Jeney András egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Tudományok Doktori Iskolája Onkológia (8/1) Budapest 2004 1
Tartalomjegyzék Összefoglaló/Summary 3-4. oldal 1. Bevezetés és irodalmi háttér 5. oldal 2. Célkituzések 26. oldal 3. Anyag és módszer 28. oldal Szövetminta preparáció 29. oldal RNS izolálás 29. oldal RNS izolálás citológiai mintákból 30. oldal RT-PCR és a telomeráz (htert) assay 30. oldal Galectin-3 immunhisztokémia 33. oldal 4. Eredmények 34. oldal 5. Megbeszélés 48. oldal Vesedaganatok 52. oldal Lágyrészdaganatok 52. oldal Húgyhólyagdaganatok és vizelet 55. oldal Pajzsmirigyléziók 59. oldal Egyéb elváltozások 60. oldal Terápiás konzekvenciák 62. oldal Galectin-3 68. oldal 6. Következtetések 71. oldal 7. Köszönetnyilvánítás 74. oldal 8. Irodalomjegyzék 75. oldal Hivatkozások 75. oldal Az értekezés tárgykörében megjelent saját közlemények 88. oldal Egyéb közlemények 88. oldal Eloadások, poszterek, elnyert tudományos díjak 89. oldal 2
Összefoglaló A telomeráz (tel) egy speciális reverz transzkriptáz, mely saját belso templát használatával képes pótolni a kromoszómák végeit (telomer). Ez ellensúlyozhatja a sejtosztódások során fiziológiásan bekövetkezo telomervesztést, mely egy kritikus rövidség elérésekor a sejt proliferációs képességének elvesztéséhez és végül apoptózishoz vezet. A tel expresszója lehetové teszi a sejt halhatatlanságát, mely kulcsfontosságú lépés az onkogenezisben, ugyanis a sejt a sorozatos osztódások során többszörös mutációkat felhalmozva malignus transzformációt szenvedhet. Egyes normál proliferáló sejteken kívül, a humán malignus daganatok 85%-ában, a carcinomák 90%-ában mutattak ki tel aktivitást (TA), és azt is megfigyelték, hogy a TA szintje többségükben korrelál a carcinogenezis stádiumával. (Kivételt képez pl. a világos sejtes veserák.) Következésképpen a tel az eddig ismert egyik legjobb molekuláris tumormarker, így egyben vonzó célpont a daganatok diagnosztikájában, prognosztikájában és terápiájában. Ezidáig nem ismerünk az irodalomban olyan tanulmányt, mely rutin anyagon vizsgálta volna a TA-t. Munkánk elso részében célul tuztük ki a tel reaktiváció vizsgálatát rutin hisztológiai és citoló giai anyagon. Megvizsgáltuk azt is, hogy a kapott értékek milyen kapcsolatban állnak a morfológiai faktorokkal. A 118 (77 hisztológiai és 41 citológiai) mintát öt fo csoprtra osztottuk: vesedaganatok, lágyrészdaganatok, húgyhólyagtdaganatok (vizelet), pajzsmirigyléziók és egyéb (különbözo lokalizációjú és eredetu) elváltozások. A TA-val szorosan korreláló katalitikus alegység, a (human telomerase reverse transcriptase) htert mrns relatív expresszióját mértük, real-time RT-PCR módszerrel. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a htert expresszió mérése a preoperativ differenciál-diagnosztikában értékes segitséget nyújt, különösen a pajzsmirigy- és emloléziók dignitását illetoen. Vizeletmintákban vizsgálva, a htert expresszió meghatározása kiválóan alkalmas a korai daganat észlelésére és a hólyagrákos betegek monitorozására. Úgy tunik, a lágyrészdaganatok kialakulásában a tel reaktivációnak nincs lényeges szerepe, mégis, az egyéni terápia szempontjából vizsgálata fontos lehet. A pajzsmirigydaganatok változatos hisztopatológiai megjelenést és klinikai viselkedést mutatnak. A molekuláris markerek, így a munka elso részében vizsgált telomeráz is, ígéretesek ugyan, de egyelore egyesek még kevéssé hozzáférhetok a rutin diagnosztika számára. A pajzsmirigydaganatok differenciál-diagnosztikájában és gradingjében azonban a diagnosztikus immunhisztokémiai antitestek is egyre fontosabbá válnak. Ezek közül -az irodalmi adatok alapján- a galectin-3 (gal3) igen specifikusnak és érzékenynek tunik. Munkánk második részében 91 pajzsmirigyelváltozásban vizsgáltuk meg retrospektive a gal3 immunhisztokémiai reakciót, és elemeztük diagnosztikus értékét a különbözo elváltozások dignitásának meghatározásában, különös tekintettel a follicularis eredetu léziókra. Míg a gal3 erosen és diffúzan expresszálódott a papillaris carcinomákban, más malignus léziókban gyengébb, fokális vagy változó pozitivitast mutatott. Valamennyi gyulladásban fokális pozitivitás volt megfigyelheto. A nodózus struma és a normál pajzsmirigyszövet negativ volt. Eredményeink alapján a gal3 immunhisztokémiai reakció megbízhatónak látszik a papillaris carcinomák hisztológiai diagnosztikájában. Azonban éppen a pajzsmirigydiagnosztika legnehezebb területén, a szoliter nodulusok és a follicularis léziók esetén, tapasztalataink nem támasztják alá a legtöbb eddigi tanulmányban leírtakat. A follicularis elváltozások esetén ugyanis -bár hasznos kiegészíto vizsgálat- a dignitás eldöntésére a módszer önmagában nem abszolút értéku, tehát alapvetoen továbbra is a klasszikus morfológiai kritériumokra kell támaszkodnunk. Legújabb megfigyeléseink arra utalnak, hogy Hashimoto thyreoiditisekben a papillaris képletek területén megjeleno gal3 pozitivitás már korai stádiumban, még a papillaris carcinoma jellegzetes morfológiai kritériumainak megjelenése elott jelezheti a malignus transzformációt. 3
Summary Telomerase (tel) is a special reverse transcriptase that is able to replace the ends of the chromosomes (telomer) by using an own inner template. This might compensate for the physiologically occurring telomeric loss, which reaching a critical shortness leads to the loss of the cell proliferation capacity and eventually to apoptosis. The tel expression makes the cellular immortality possible, which is a crucial step in oncogenesis, since the cell during serial divisions, accumulating multiple mutations can suffer a malignant transformation. Besides certain normal proliferating cells, in 85% of human malignant tumors, in 90% of carcinomas tel activity (TA) was detected, and it was also observed that in their majority the TA level correlated with the stage of the carcinogenesis. (An exception is represented e.g. by the clear cell renal cancer.) Consequently, tel is the best molecular tumor marker known so far, thus being an attractive target in the diagnosis, prognosis and therapy of tumors. Up to now no study examining TA in a routine material has been published in the literature. In the first part of our work we set the objective to study the tel reactivation in routine histological and cytological material. We also studied the correlation of the values received with the morhphological factors. We divided the 118 (77 histologic and 41 cytologic) samples into five major groups: kidney tumors, soft tissue tumors, bladder tumors (urine), thyroid lesions and other lesions (of various localisations and origin). We measured the mrna relative expression of htert (human telomerase reverse transcriptase), a catalytic subunit closely correlating with TA. It was determined with real-time RT-PCR method. Based on the results it can be established that measuring expression of htert yields valuable assistance in the preoperative diagnosis, particularly regarding the dignity of thyroid and breast lesions. The study of urine samples suggests that determination the expression of htert is well suitable for the early detection and monitoring of bladder cancer. The tel reactivation does not seem to play a key role in the development of soft tissue tumors although its study might be important for individualised treatment. Thyroid tumors show varying histopathological feature and clinical behaviour. Molecular markers, among them the telomerase studied in the first part of this work, are promising, however, they have currently limited availability for routine diagnostics. Nevertheless, the diagnostic immunohistochemical antibodies are getting more and more important in the differential diagnostics and grading of thyroid tumors. Out of them based on literature data the galectin-3 (gal3) seems to be highly specific and sensitive. In the second part of our work, in 91 thyroid lesions we retrospectively studied the gal3 immunohistochemical reaction and analysed its diagnostic value in the determination of the dignity of various lesions, with special regard to those of follicular origin. While gal3 was markedly and diffusely expressed in papillary carcinomas, it showed weaker, focal or varying positivity in other malignant lesions. In all the inflammations focal positivity was observed. The nodal goiter and normal thyroid tissue was negative. On the basis of our results the gal3 immunohistochemical reaction seems to be reliable in the histological diagnosis of papillary carcinomas. In the most difficult field of thyroid diagnostics, however, in the case of follicular lesions, our experience does support the observations described in most studies so far. In case of follicular lesions the method although a useful supplementary examination has no absolute value in itself, therefore fundamentally we must further rely on the classic morphologic criteria. Our most recent observations suggest that in the Hashimoto s thyreoiditis the gal3 positivity occurring in papillary structures might indicate a malignant transformation already prior to the onset of the characteristic morphological criteria of papillary carcinomas. 4
1. Bevezetés és irodalmi háttér 1.I. A genom tagozódása lineáris kromoszómákra, a cirkuláris DNS-sel szemben nagyobb, független génkészlelet biztosit, ezzel evolúciós elonyt jelent. Azonban a végek megjelenése a sejtet végvédelemre, illetve -fenntartásra kényszeríti, mely esszenciális fontosságú a genom integritásának és stabilitásának megorzése tekintetében - a számos, primer RNS-t igénylo, DNS-polimeráz végrehajtotta replikációs ciklusban. Ezt a feladatot a telomerek látják el. Blackburn azt találta, hogy a Tetrahymenában a telomerek egy extrém rövid, egyszeru nucleotid-szekvencia ismétlodéseit tartalmazzák (TTGGGG) (1,2,3,4). A "telomer" szót a görög "vég" (telos) és "rész" (meros) kifejezésekbol alkotta Muller 1978-ban. A telomerek 6-25 kilobázispárnyi (kbp) specifikus struktúrák, ismétlodo hexamer DNS-szekvenciák (5 -(TTAGGG)n-3 ) az eukariota kromoszóma végeken (5), melyek speciális proteinekkel együttesen sapkaszeru végstrukturát alkotnak. McClintock megfigyelte, hogy ezek nélkül a végsapkák nélkül a kromoszómák egymáshoz ragadnak, strukturális változásokon mennek keresztül vagy más abnormális viselkedést mutatnak (6). A telomer-sapka : 1. Lehetové teszi a sejteknek, hogy a normális kromoszómavégeket a törött DNS-tol megkülönböztessék. (Ha a DNS-vég törött, két lehetoség áll fenn, miután a sejtciklus leállt: reparáció vagy sejthalál.) A kettos szál törését kétféle mechanizmus állíthatja helyre: a) homológ rekombináció (HR) a reparáció hibamentes, de homológ szomszéd kromoszómát igényel; b) non-homológ vég-illeszkedés (NHEJ=non homolog end joining) a reparáció során hibalehetoség van, de védi a kromoszómát a degradációtól. 2. Véd a NHEJ során esetlegesen bekövetkezo, egyéb kromoszómákkal való end-to-end fúziótól. (A fúzió-híd-törés ciklusok genomikus instabilitáshoz vezetnek, mely sejthalált vagy neoplasztikus transzformációt eredményezhet.) 3. Véd az exonukleázok, ligázok okozta degradációtól, valamint az átrendezodésektol. 5
4. Segít a homológ kromoszómák párképzodésében és a crossing over-ben a meiosis I. profázisában, mellyel a számtartó sejtosztódás mechanizmusát biztosítja. Hozzájárul a kromoszómák térbeli és funkcionális rendezodéséhez a sejtmagon belül, részt vesz a transzkriptom regulációban (7). Összefoglalva: a telomerek a kromoszóma stabilitást biztosítják (6). A differenciált muködést végzo szomatikus sejtekben a telomerek a DNS-replikáció mechanizmusának elégtelensége miatt fokozatosan rövidülnek. A DNS replikáció bidirekcionális, a vezeto és követo szálon különbözo módon zajlik. Ugyanakkor a DNS polimeráznak csak 5-3 irányú polimeráz aktivitása van, és de novo lánckezdésre sem képes, tehát a replikáció indításához primert igényel. A követo szálon különálló fragmentumok (ún. Okazaki-fragmentumok) keletkeznek, melyek mindegyikének iniciációjához új RNS primerek szükségesek, ezután képes a DNS polimeráz extendálni. Végül csak egyetlen, az 5 végi terminális RNS primer marad a leány DNS-en, melyet az 5-3 exonukleáz lebont (8). A keletkezett rést azonban a DNS polimeráz nem tudja betölteni, mert nem áll rendelkezésre 3 -OH vég, amelyhez a következo RNS primer kötodne (ún. end-replikációs probléma) (9-12). Mivel a DNS-polimeráz nem tudja befejezni a követo szálak 5 végi szintézisét, a kromoszómák minden osztódás S- fázisában progressziven, 8-12 bázispárral rövidebbek lesznek (ez kb. 50-200 nukleotidnyi nem replikálódott szekvencia), egyre rövidebb utód-dns-ek jönnek létre az egyes replikációs ciklusok során (ezt nevezik biológiai vagy mitotikus órá -nak). 1. ábra 6
A DNS replikáció 1. ábra A keletkezett hiányt a telomeráz enzim (a továbbiakban tel) képes pótolni. A normál sejtekben a proliferáció leállításáért két mechanizmus felelos. Az M1 fázis (mortality stage 1, replicativ senescence, senescence=elöregedés) akkor jelenik meg, amikor a kromoszómák többsége már legalább többezer bázispár telomer-szekvenciával, kb. 5 kb-nyira rövidült, mely kb. 60-80 sejtosztódás után következik be (11,13,14). Ez a mechanizmus az ARF/p53/p21 CIP1/WAF1 vagy a prb/p16 INK4a antiproliferatív út génjei által mediált növekedés-leálláshoz vezet (funkcionális inaktiváció, ún. growth arrest és/vagy sejthalál apoptózissal - G1-ben). Az M1 fázist valószínuleg közvetlenül a subtelomerikus régióban elhelyezkedo gének aktivációja indukálja. A replikatív senescencia effektorainak részleges vagy teljes inaktivációja fontos addícionális követelménye a tel reaktiváció által eloidézett immortalizációnak egyes sejttípusokban 7
(pl. a keratinocytákban és egyéb emlos epithelsejtekben). Inaktivációt mutáción kívül virális onkoproteinek, pl. az SV40LT (amely a p53-at és a prb-t egyaránt inaktiválja) vagy a human papillomavirus-16 E7 (amely a prb-t inaktiválja) kötodése idézhet elo, melyek eredményeképp a sejt túléli a senescenciát (15,16). Így a sejtek tovább osztódnak, a telomerek tovább rövidülnek egészen addig, amíg a második független mechanizmus, az M2 (mortality stage 2, krízis pont) indukálódik. Az M2 azt a - fiziológiásan- kritikussá vált telomerhosszat reprezentálja, amelynél a sejt már nem képes többé megvédeni a kromoszóma végeket, ezért end-degradáció, end-to-end fúzió következik be, mely a genom instabilitásához és sejthalálhoz vezet (cellular senescence). A legtöbb esetben a sejtek már elöregednek, mielott elegendo mutációt halmoznának fel ahhoz, hogy malignus fenotípusuk kialakuljon. Ezért a növekedés rövid telomerek miatti leállását potenciális rákellenes mechanizmusként is felfoghatjuk. Az M1 és M2 fázisok a replikativ kapacitás korlátozottságával - a különbözo onkogén behatásokkal szembeni védelmen (tumor suppresszión) kívül - kiküszöbölik az életkor elorehaladtával felhalmozódó elöregedo sejteket is. Utóbbi azért fontos, mert ezek a sejtek - távoli hatással is rendelkezo molekulák expressziója révén (proteázok, antiangiogén faktorok, növekedési faktorok, gyulladásos cytokinek) - megbonthatják a normál szöveti integritást és funkciót. A telomerhossz vesztést felgyorsíthatja a hypoxia - a telomer törés indukálásával (17). A sejtek csak ritka esetben élik túl a krízis pontot és válnak halhatatlanná (immortalizáció). Ez leggyakrabban a tel reaktivációjával vagy up-regulációjával kapcsolatos, ilyenkor a tel - a sejtosztódás normális telomervesztése helyett - a telomervégeket pótolja (18,19). 2. ábra 8
Telomerhossz M1=mortality stage1, replicative senescence M2=mortality stage2, crisis point p53,prb inaktiváció tel. upreguláció vagy reaktiváció M1 M2 proliferáció leállása további mitózisok mitózisok száma immortalizáció, tumor 2. ábra A tel enzimet 1984-ben fedezte fel Carol Greider és Elizabeth Blackburn, biokémiailag eloször 1985-ben azonosították (2,4). Az enzim az ismétlodo telomerikus szekvencia G-gazdag szálát ismeri fel, és komplementer DNS szál hiányában új, ismétlodo szakaszokat szintetizál (azaz polimerizálja a telomerikus DNS szekvenciát) különleges módon, saját belso RNS templát használatával (20,21,22). A tel jelen van a normál embrionális sejtekben. A fejlodés során a legtöbb szövetben represszálódik vagy down-regulálódik (mivel a normál humán sejtek domináns tel inhibitort expresszálnak), ezért a sejt-reprodukció során a telomerek rövidülnek. (A tel represszor géneket a p53, prb ellenorzi.) A kritikus hossz elérése a további sejtosztódásokat leállító szignálként szolgál, így a sejt - Hayflick szavával - senescens -sé válik, azaz elöregszik (23). A 10-12 kb átlagos hosszúságú telomerrel rendelkezo sejtek életük során 50-60x osztódhatnak. (A telomerhossz spermium, 9
petesejt esetén 20 kb, magzati és újszülött sejtekben 15 kb., felnott sejtekben 10 kb, míg az elöregedo sejtek esetén 5 kb. Sejtkultúrában humán újszülött szomatikus sejtek 80-90x osztódnak, míg egy 70 éves ember szomatikus sejtjei legfeljebb csak 20-30x, de ezt természetesen az adott sejt differenciáltsága is befolyásolja.) A tel a korai embrionális sejteken kívül - csökkent szinten ugyan -, de normálisan expresszálódik a csírasejtekben, bizonyos ossejtekben (melyekben igen szigorúan regulált) és a felnott progenitor sejtekben (24). Utóbbiak közé tartoznak a normál regeneratív sejtek, aktivált lymphocyták, specifikus hematopoetikus sejtek, az epidermisz bazális sejtjei, a premenopauzális proliferativ endometrium, a bél cryptáinak sejtjei, a dohányosok bronchiális epithelsejtjei. Tehát a tel expresszió önmagában nem jelent malignitást (25,26)! A legtöbb humán szomatikus sejtben azonban a tel-t regulátor protein blokkolja (27). Az endometriumban a tel expresszió specifikus a glanduláris epithelsejtekre (a stromális sejtekben nincs). A késoi proliferativ fázisban - a carcinomával egyenértéku - maximális enzimaktivitás van jelen, míg a késoi szekrécióban az aktivitás minimális. A postmenopauzális és az anti-ösztrogénekkel kezelt endometrium csökkent telomeráz aktivitást (a továbbiakban TA) mutat (28). Csírasejtek esetén a TA szint az érési stádiumtól függ: A preovulációs follikulusokban magas, míg az ovulált oocitákban szignifikánsan alacsonyabb (29). A TA igen magas az I. típusú spermatogoniumokban, csökkent a spermatocitákban és a spermatidákban, míg teljesen hiányzik az epididymális spermatozoákban (29). A különbözo fajok embrióiban - így humánban is - a blasztociszta stádiumban észlelheto viszonylag magas TA. Elobbiek rögtön felvetnek egy érdekes kérdést is: ha a TA alacsony az ovulált oocitákban, illetve hiányzik spermatozoákban, akkor hogyan szerzodik meg a korai embrióban? Az immortalizált sejtekben a telomerhossz stabilizálódik, bár a telomerek rövidebbek, mint a normális (wild type) sejtekben (30). Az immortalizáció fenntartásához a tel állandó expressziója szükséges, ami a krízis értékeknél valamivel nagyobb telomerhosszúsággal társul. SCID (súlyos kombinált immundeficienciában szenvedo) egerekben az immortalizált sejtek nem képeznek daganatot, nem borul fel a sejtciklus szabályozás, nincs kariotípus 10
instabilitás sem (31). Tehát ahogyan a tel expresszió sem, önmagában az immortalizáció sem egyenlo a malignus átalakulással! Azonban a tel aktiváció által létrejött immortalizáció addicionális lépésként szolgál az onkogenezisben. A tel nemcsak a humán ossejtekben és reproduktiv sejtekben stabilizálja a telomerhosszat, hanem a daganatsejtek 80-90 %-ában is expresszálódik (32). A maradék 10-20 %-ban az end replikációs probléma más módon, valószínuleg rekombinációval oldódik meg - ezt a késobbiekben részletezni fogom. Bár a tel reaktiváció számos humán malignitásban megtalálható, ugyanakkor hiányzik a tumorral szomszédos normál sejtekben (32). Ez azt sugallja, hogy a tel aktivációnak, illetve a telomerstabilitás fenntartásának (akár alternatív módon is) kulcs-szerepe lehet a maligus daganat folyamatos proliferációjában (32). Fentiekbol következoen a tel nemcsak a daganatok diagnosztikájában játszhat kiemelkedo szerepet, hanem az új onkoterápiás szerek kifejlesztésében is célponttá vált. Az az elképzelés, miszerint a tel-nak fontos szerepe lehet a humán daganatok folyamatos növekedésében, fenntartásában, 1990 körül kezdett napvilágot látni, de 1994-ig nem volt rá bizonyíték. Ebben az évben megfigyelték, hogy a tel nemcsak a laboratoriumi körülmények között fenntartott, hanem az emberi testben lévo daganatsejtekben is mutatott aktivitást (33). Mintegy egy évvel késobb Harley, Shay és munkatársai 101 humán daganatmintából (melyek 12 féle daganattípust reprezentáltak) 90-ben detektált tel-t, míg az 50 normál szövetmintából (melyek 4 féle szövettípust reprezentáltak) egyben sem (34). Már ezek elott is folytak kutatások a tel szerepérol a carcinogenezisben, sot az egyik tanulmány már azt is valószínusítette, hogy a tel feltehetoleg azután válik aktivvá, amikor a sejt már elvesztette proliferáció feletti kontrollját (24). A tel egy RNS templátot hordozó speciális reverz transzkriptáz (RNS-függo DNS polymeráz), hexa-ribonukleoprotein komplex, mely az egyláncú DNS hosszabbítására képes. Miután hat dezoxiribonukleotid trifoszfátot (dntp) ad hozzá a telomer túlnyúló szabad 3 OH végéhez, 6 nukleotidnyit transzlokálódik, és ismét 6 nukleotidnyit hosszabbít a telomer végén. Ez többször ismétlodik, majd a folyamat végén a tel 11
disszociálódik. A komplementer szálon a túlnyúló G-gazdag lánc a szabad 3 OH csoportjával hajtut képez, és így primerként szolgál, tehát a követolánchoz hasonlóan szintetizálódik (35). A telomeráz fo komponensei CAATCCCAAT htr telomerikus DNS 3.ábra A humán tel, mely egy relative nagy molekulasúlyú holoenzim-komplex, három fo alegységbol áll: 1. az RNS templát (AATCCC), vagyis a strukturális RNS komponens (htr=humán telomeráz RNS komponens, melynek génje a humán a 3q26 kromoszómán van) (17) 2. a tel asszociált protein (TEP1) (36,37) 12
3. és a katalitikus alegység (htert=human telomeráz reverz transzkriptáz, melynek génje az 5p15 kromoszómán van) (38,39). Ezen kívül a tel-nak még számos protein alegysége van, és számos protein kapcsolódik a htr-hez, valamint a htert-hez, melyek elosegítik ezek egyes alkotórészeinek összeillesztését és struktúrába rendezését. 3. ábra (40. nyomán). Így pl. a p23 és hsp90 molekuláris chaperonok a htert-hez kötodve az aktiv tel-l kapcsoltak a sejtekben. Ennek a kapcsolódásnak a blokkolása a tel funkcionális gátlását eredményezi, ezért - többek között - az egyik lehetséges támadáspont az antitel terápiában (41). A telomerikus DNS-hez is több különféle protein kötodik (ún. telomer asszociált proteinek), melyek szintén közremuködnek a tel felépítésében (I/1. Táblázat - Shay és mtsai után,12). I/1. Táblázat. A fo humán telomer asszociált proteinek és telomeráz komponensek HUMÁN TELOMER ASSZOCIÁLT PROTEINEK a TRF1 (telomeric repeat binding factor 1: a duplex TTAGGG-hoz kapcsolódik) Tankiráz (TRF1 interacting protein: poli (ADP-ribóz) - polimeráz) TIN2 (TRF1 interacting protein 2) TRF2 (telomeric repeat binding factor 2: a duplex TTAGGG-hoz kapcsolódik, és a végvédelemben van szerepe) hrap1 (TRF2 interacting protein: vég-védelemben szerepel) Mre11/Rad50/Nbs1 (DNS reparáció; a t-loop modulálása) 13
HUMÁN TELOMERÁZ KOMPONENSEK htert (human telomerase reverse transcriptase: a katalitikus alegység) p23/hsp90 (chaperonok) htr (human telomerase RNA: a belso templát) SnoRNA binding proteins (dyskerin, hgar1) TEP1 (asszociált protein) hnrnps C1/2 (heterogén nukleáris ribonukleoproteinek) La (autoantigén) L22, hstau (riboszomális protein és a dupla szálú RNS-t köto protein) a A telomer biokémiájában valószínuleg még szerepet játszó egyéb proteinek: Ku, ATM, hnrnpa1, PARP, BLM, WRN, Rad51 és RPA. A tel expresszió és funkció bonyolult szabályozás alatt áll, melynek fo eleme a htert gén transzkripcionális repressziója. A tel szuppresszor géneket a p53 és prb ellenorzi. (4. ábra 42) 14
A htert gén expressziójának regulációja 4. ábra Számos transzkripciós faktor befolyásolja a htert gén expresszióját, pl.: - Mad1/c Myc, Sp1 (mely a TGF-béta út transzkripcionális targetje) mindketto represszor - ösztrogének (43) - Est1 és Cdc13 - mindketto a tel funkció pozitiv regulátora (44) - E2F-1 (45), WT-1 (46), NF- B (47), MZF-2 (48), stb., - a tumor supresszor menin, mely a htert direkt represszora (49). 15
Fentiek közül a myc-et tanulmányozták a legrészletesebben. A humán daganatokban a c- myc gének gyakran dereguláltak, a tel reaktiváció, a TA indukciója általában a myc gén overexpressziójával kapcsolatos (50). A htert promoter számos c-myc köto helyet tartalmaz, melyek közvetlenül mediálják a transzkripciós aktivációt. Mindezek alapján valószínusítheto, hogy a tel a humán daganatokban onkociter mutációk által reaktiválódik. Ugyanakkor nem biztos, hogy ezek a faktorok elégségesek a htert transzkripció teljes ki-be-kapcsolásához. Az egyik tanulmány eros pozitiv korrelációt talált a htert promoter metiláció és a génexpresszió között, mely szöges ellentétben áll a metilációszabályozott transzkripcióról általában elfogadott modellel. A direkten és indirekten a telomerekhez kötodo, fentebb már részletezett telomer asszociált proteinek nem csak a tel felépülésében, hanem regulációjában is fontosak. A két fo paralog telomerikus DNS-köto fehérje, a TRF1 és TRF2, minden humán sejttípusban expresszálódik, és a sejtciklus során nagy affinitással kötodik a dupla szálú telomerikus DNS-hez. Így részben direkt módon, részben ko-faktorokkal történo interakció által vesz részt a telomerhossz szabályozásában (12,51). Ha a TRF2-t eltávolitjuk a telomerrol, 3 túlnyúló vég-vesztés, telomerfúzió, valamint p53 függo apoptózis következik be. A primer TRF2 overexpresszió a tel negatív sejtekben megvéd a telomerfúziótól és késlelteti a senescenciát (52). A telomer maga is szabályozza a tel muködését. A telomer guanin-gazdag oligonukleotid szekvenciái (3 túlnyúló vég) -hidrogénkötések révén- egy speciális szerkezetet, négyes gyurut alakítanak ki (ún.g-kvartettek), melyek gátolják a TA-t. (5. ábra) 16
G-kvartet 5. ábra 3 szomszéd G-kvartet intramolekuláris G-kvadruplex struktúrát alkot (ezt tetraplexnek is nevezik), mely megakadályozza a tel elongációs lépését (53,54). Fentiekbol következoen az antitumor terápia egyik célpontja lehet a ligand-indukált G-kvadruplex stabilizáció (55). Ilyen antitumor szerek pl. a quinolin-bázisú G- quadruplex ligandok (56). Számos élolényben a tel pozitiv sejtek telomerjének hossza állandó, tehát az elongáció és a rövidülés egyensúlyban van (57). A tel nemcsak a telomerek hosszabbítására képes, hanem gátolhatja a telomerhossz megtartásának rekombinációs alapú útját is, többféle módon: 1. Képes direkten leválasztani a DNS-rol a rekombinációs alapú út iniciációjához szükséges proteineket. 17
2. A reiniciációt a telomer végek sapkával való ellátásával gátolhatja meg. 3. Egyszeruen megváltoztathatja a telomer struktúrát, mely önmagában is elégséges lehet ahhoz, hogy a rekombinációs út funkcionálisan elégtelenné váljék. Az enzim meghatározó komponense - egy viszonylag nagy (127 kda) protein - a htert, mely a tel reaktiválásához szükséges. A halhatatlan humán sejtvonalak szignifikáns TA-t és emelkedett htert expressziót mutatnak. A halandó sejtek analízise negatív TA esetén nem mutatott szignifikáns htert expressziót. Ez a megfigyelés alátámasztja azt a feltételezést, miszerint a htert expresszió szorosan korrelál a TAval, és azt sugallja, hogy segíthet a tel szerepének értelmezésében a carcinogenezisben (58). Több közleményben szerepel, hogy a carcinomákban csak a htert expresszió mutat szignifikáns összefüggést az enzimaktivitással, míg a htr és a TEP1 nem. A htr minden sejtben alapvetoen jelen van, többé-kevésbé állandó, de a carcinomás sejtvonalakénál alacsonyabb expressziós szinten. A htert expresszió azonban a tel negatív sejtekben visszaállítja - és szintje meg is határozza - a TA-t, meghosszabbítva a sejt élettartamát. Mivel a htert és TA közt szoros korreláció van, vizsgálatainkban a tel htert katalitikus alegysége által kódolt mrns mennyiségének mérése (59) lehetové tette a tel expresszió indirekt meghatározását, amplifikációs (RT-PCR) módszerrel. A RT- PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) eljárás mrns templát megsokszorozását jelenti. A TA különbözo fagyasztott hisztológiai mintákon kívül citológiai anyagokban is mérheto, így vizeletüledékben vagy hólyagmosó folyadékban (60), egyéb mosófolyadékokban - szájüregi, vastagbél (61), epeúti, tüdo (bronchiolo-alveolaris lavage) -, szívadékban és kefe-anyagban, pancreas-nedvben (62), testüregi folyadékgyülemekben, köpetben (63-66). De nem csak az exfoliativ, hanem a vékonytu aspirációs biopsziás (FNAB, fine needle aspiration biopsy) minták is (pl. emlo, pajzsmirigy, nyirokcsomó, stb.) alkalmasak TA kimutatására (67,51). 18
A tel expresszió meghatározásának különbözo módjai ismeretesek, így pl.: - in situ módszerek, melyek a tel expressziót topográfiai összefüggésükben teszik láthatóvá (68) (6. ábra) Telomeráz kimutatása in situ hibridizációval 6. ábra Felül colorectalis adenomából származó mirigy részlete, mérsékelt TA-val, a kép alsó felében intenzív TA-t mutató adenocarcinoma látható - FISH (69) (fluorescens in situ hybridisation), mellyel a telomerek hossza vizualizálható TRF (Terminal Restriction Fragment) demonstrációval. A metafázikus kromoszómákat kettosen festjük DAPI-val (kék színu, DNS-t és kromoszómákat jelöl) és in situ hibridizáljuk PNA (peptide nucleic acid) fluoreszcensz telomer próbával (piros vég minden kromoszómán). A tel-hossz, a fluoreszcensz szignál intenzitása direkten arányos az enzimaktivitással (70,71). (7. ábra) 19
Telomeráz kimutatása FISH módszerrel 7. ábra - PCR alapú módszerek. A TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) egy PCR-alapú, szenzitív vizsgálati mód, mely apró szövetmintából képes szemikvantitative detektálni a TA-t (72,73). A Kim és munkatársai által bevezetett módszer fontos mérföldko volt a tel kutatásban, és standard technikává vált az enzim tulajdonságainak tanulmányozásában (74). A módszer két lépcsos enzimaktivitás-mérés: a) A tel-extrakció után, tel-mediált oligonukleotid primer extenzió történik, a tel 5 - TTAGGG-3 ismétlodo szekvenciákat ad a szintetikus TS (telomerase substrate) primer végéhez b) A második lépésben az extendált primer termékek amplifikációja következik, reverz primerek (CX primerek) felhasználásával, melyek komplementerek az ismétlodo szakaszokkal. (A reverz primerek a primer-dimer artefaktok képzodését hivatottak megelozni, bár teljesen nem eliminálják azokat.) A vizualizálás autoradiográfiával, polyacrilamid gél electroforesissel (PAGE) vagy 20