FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Ready-to-Use (Link) Kód: IR068 Felhasználási terület Az antigén szinonimája Összegzés és magyarázat Biztosított reagens In vitro diagnosztikai alkalmazás. A FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor,, Ready-to-Use, (Link) az EnVision FLEX+, High ph megjelenítırendszerrel együtt az Autostainer Link készülékekkel végzett immunhisztokémiai alkalmazásra szolgál a humán progeszteronreceptor formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlıkarcinómában való szemikvantitatív észlelésére. Az antitest a progeszteronreceptor-pozitív sejteket jelöli meg, és segítséget nyújt a humán emlıkarcinómák progeszteronreceptor-státuszának a meghatározásában. A festıdés, illetve a festıdés hiányának klinikai értékelését morfológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett, és a páciens kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálati eredményeinek figyelembevételével patológus szakorvosnak kell végeznie. PR A szteroid hormon receptorok szerepe az emlırákban jól ismert (1,2). Az ösztrogénreceptorok (ER) és progeszteronreceptorok (PR) hiánya korai visszaesésre és alacsony túlélési esélyre utal emlırákos betegek esetében (3-6). Emellett az ER és a PR tumorokban való jelenléte elırejelzi a tamoxifen és más endokrin-jellegő kezelések lehetséges hasznát is. Az ER és PR mennyisége szemikvantitatív módon IHC eljárás alkalmazásával, vagy kvantitatív módon DCC vagy EIA alkalmazásával határozható meg. A PR szemikvantitatív és kvantitatív értékelése közötti korreláció 73-91% között van, a laboratóriumtól és az alkalmazott antitesttıl függıen (7-9). Lásd a Dako General Instructions for Immunohistochemical Staining (Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez) címő kiadványát, vagy a kimutatási rendszerhez tartozó útmutatót az IHC eljárásokhoz: 1) Az eljárás alapelvei, 2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, 3) Tárolás, 4) Mintaelıkészítés, 5) Festési eljárás, 6) Minıségellenırzés, 7) Hibaelhárítás, 8) A festıdés értelmezése, 9) Általános korlátozások. Azonnal felhasználható monoklonális, egér eredető antitest folyadék formájában, stabilizáló fehérjét és 0,015 mol/l NaN 3-t tartalmazó pufferben. Klón: PgR 636 (10) Izotípus: IgG1, kappa Immunogén Formalinban fixált, rekombináns humán progeszteron receptor teljes hosszúságú A-formája (10). Specifitás Az anti-pr, PgR 636-ról egész sejt extraktumok Western blotjával kimutatták, hogy reagál a PR-A és PR-B formákkal, és reagál mind a szabad, mind a hormon-kötött PR-ral (10). Az epitópot a PR-A-ban és PR-B-ben közös amino-terminális doménben térképezték fel. Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai alkalmazáshoz. 2. Professzionális felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN 3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, ami során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Kiöntéskor, a fém-azidok vezetékekben történı lerakódását megelızendı, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni. 4. A biológiai anyagokból elıállított egyéb termékekhez hasonlóan ennél is ügyelni kell a megfelelı kezelési eljárások betartására. 5. A szemmel és bırrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelı személyi védıfelszerelést. 6. A fel nem használt oldatot a helyi és állami hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. Tárolás 2-8 C hımérsékleten tárolandó. Az üvegen feltüntetett lejárati idı után nem használható fel. Ha a reagenseket a megadottól eltérı körülmények között tárolják, a felhasználónak ellenıriznie kell az adott körülmények megfelelı voltát. A termék instabilitásának nincsenek egyértelmő jelei. Ezért a páciens mintájával együttesen egy pozitív és egy negatív kontrollvizsgálatot is el kell végezni. Ha nem várt festıdés jelenik meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és antitesttel kapcsolatos probléma gyanítható, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. (115566-004) 307141HU_004 o. 1/5
Mintaelıkészítés és a szükséges, de nem biztosított anyagok Festési eljárás és a szükséges, de nem biztosított anyagok Festés értelmezése Termékspecifikus korlátozások Teljesítményjellemzık Paraffinba ágyazott metszetek: Az antitest formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek jelölésére alkalmazható. A szövetmintákból körülbelül 4 µm-es metszeteket kell készíteni. Elıkezelés: A formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek elıkezelése javasolt. A legjobb eredményeket a szövetek hígított EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (kód: K8000/K8004) reagenst alkalmazó HIER technikával történı elıkezelésével lehet elérni. A deparaffinálás, rehidratálás és epitópfeltárás végrehajtható a Dako PT Link (kód: PT100/PT101/PT200) használatával. A részleteket illetıen lásd a PT Link Használati útmutatóját. A PT Link készüléknél az alábbi paramétereket kell alkalmazni: Elıhevítési hımérséklet: 65 C; az epitóp feltáráshoz szükséges hımérséklet és idı: 97 C 20 (±1) percre; hőtés 65 C-ra. Vegye ki a tartóállványt a PT tartály ából, és azonnal merítse a tárgylemezeket hígított, szobahımérséklető EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód: K8007) pufferoldatot tartalmazó edénybe/tartályba (pl. a PT Link Rinse Station (kód: PT109) edénybe). Hagyja a metszeteket 1-5 percen át a Wash Buffer pufferben. Az elıkezelés vagy az azt követı immunhisztokémiai festési eljárás során a szövetmetszeteknek nem szabad kiszáradniuk. A szövetmetszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítésére ajánlott a FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek használata. A festést követıen a metszeteket dehidratálni kell, meg kell tisztítani, majd tartós rögzítıszer használatával fel kell vinni a tárgylemezre. Megjelenítés: Az ajánlott megjelenítı-rendszer az EnVision FLEX+, High ph (Link) (kód: K8002). Program: A festési lépések és inkubálási idık az Autostainer Link szoftverében elıre be vannak programozva. A javasolt alkalmazandó reagenstérfogat tárgylemezenként 1 x 200 µl vagy 2 x 150 µl. Kérjük, a metszetek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos részletes utasításokat illetıen tájékozódjon a megfelelı Autostainer Link készülék Használati útmutatójából. Amennyiben a protokollok nem elérhetıek az alkalmazott Autostainer Link 48 platformon, akkor kérjük, forduljon a Dako Mőszaki Szolgálatához. Valamennyi inkubálási lépést szobahımérsékleten kell végezni. Kontrasztfestés: A javasolt kontrasztfesték az EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008). Nem vizes alapú, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Kontrollok: Egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell, ugyanazt a protokollt alkalmazva, mint a páciensmintákhoz. Ideális esetben a pozitív kontrolloknak tartalmaznia kell alacsony PR-expressziójú emlıkarcinóma-szövetet. Alternatívaként jóindulatú méhnyakszövet is alkalmazható. A sejteknek/struktúráknak az összes pozitív minta esetében a Teljesítményjellemzık részben az adott szövettípusra vonatkozóan ismertetett reakciómintázatot kell mutatniuk. Az ajánlott negatív kontroll reagens a FLEX Negative Control, Mouse (Link) (kód: IR750). A sejtfestıdési mintázat. Ha citoplazma jelölıdése is megfigyelhetı, azt nem specifikusnak kell tekinteni. Pozitív eredményt a tumorsejtek 1%-ának magfestıdése jelent bármely intenzitású festıdéssel. Ez megegyezik az ASCO/CAP által javasolt határértékkel: a pozitív eredmény határértéke 1% pozitív tumorsejt (11). 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A szobahımérsékleten tárolt mintákat a szövetek lemezre történı rögzítése után 2 hónapon belül meg kell festeni (12). 2. A limfociták és strómasejtek pozitív festıdést mutathatnak a FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human PR clone PgR 636 antitesttel, ezek nem értelmezhetık vagy számíthatók be PR-festı tumorsejtekként. 3. Az optimális és megismételhetı eredmények eléréséhez a PR fehérje olyan célkinyerést igényel, amelyben a szövetek fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása rutinszerően zajlik. 4. A Dako Anti-PR, használata a formalintól különbözı fixálószerekkel rögzített szövetek esetén még nem validált. Megbízhatóság: Vizsgálat céljára sorozatmetszetek készültek a 12 különbözı, formalinban fixált, paraffinba ágyazott emlıkarcinóma blokkból, amelyek a PR-expresszió széles skáláját reprezentálják. A vizsgálat a következı módon zajlott: Teszten belüli megbízhatóság: A standard EnVision FLEX+, High ph protokoll szerint az egyes szövetblokkokból három metszet került festésre az Anti-PR, alkalmazásával. Párhuzamosan mindegyik blokkból egy metszetet negatív kontrollreagenssel festettek. Tesztek közti megbízhatóság: Az egyes szövetblokkokból egy-egy metszettel megismételték a fenti eljárást öt további, nem egymást követı napon. Párhuzamosan mindegyik szövetblokkból egy metszetet negatív kontrollreagenssel festettek. Készülékek közti megbízhatóság: Az egyes szövetblokkokból összesen három metszettel megismételték a fenti eljárást három különbözı Autostainer készüléken, három különbözı kezelı által. Párhuzamosan mindegyik szövetblokkból egy tárgylemezt negatív kontrollreagenssel festettek. Az Anti-PR, reagenssel végzett megbízhatósági kísérletek következetes eredményeket hoztak a teszten belüli, a tesztek közti és a készülékek közti vizsgálatok során. Következetes vizsgálati körülményeket tartottak fenn a vizsgálat során, és a reagenseket a tesztek futtatása között 2-8 C-on tárolták. Normál szövetek: Az 1. táblázat összefoglalja az Anti-PR, immunreaktivitását a javasolt normál szöveti panelen. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott és a tájékoztatóban leírt módon Anti- PR, reagenssel festett. Az Anti-PR, reagenssel citoplazmatikus festıdést figyeltek meg különbözı szövetelemekben, köztük epithelium, stróma-, intersticiális és gyulladásos sejtekben. A megfigyelt citoplazmatikus festıdés azonban nem tekinthetı diagnosztikusnak az antitest rendeltetésszerő használata szerint. (115566-004) 307141HU_004 o. 2/5
1.táblázat: Az Anti-PR, normál szövetekkel való reaktivitásának összefoglalása Szövettípus Pozitív szövetelemek Szövettípus Pozitív szövetelemek (vizsgált #) (vizsgált #) Mellékvese (3) 1/3 sejtek a glomerulosa Perifériás ideg (3) 0/3 területben (50%), 1/3 sejtek a glomerulosa területben (50%), Petefészek (3) 3/3 Strómasejtek (50-70%), Csontvelı (3) 0/3 Hasnyálmirigy (3) 2/3 Langerhans-szigetek (50-90%), Emlı (3) 2/3 Glanduláris epithelialis sejtek (50-90%), Mellékpajzsmirigy (3) 3/3 Glanduláris epithelialis sejtek (1-10%), Kisagy (3) 0/3 Agyalapi mirigy (3) 3/3 Agyalapi mirigy glanduláris sejtjei (1-40%), Nagyagy (3) 1/3 Meningeális sejtek (100%), Prosztata (3) 3/3 Strómasejtek (30-80%), Méhnyak (3) 3/3 Epithelialis sejtek (50-90%), Nyálmirigy (3) 3/3 Glanduláris epithelialis sejtek (<1%-60%), 3/3 Stróma, beleértve a Bır (3) 0/3 gyulladásos sejteket (50%), Vastagbél (3) 1/3 Limfoid/gyulladásos sejtek (10%), Vékonybél (3) 3/3 Stróma- és gyulladásos sejtek (30-50%), 1/3 Limfoid/gyulladásos sejtek Lép (3) 0/3 (10%), Nyelıcsı (3) 1/3 Strómasejtek (50%), Gyomor (3) 1/3 Intersticiális sejtek (20%), Vese (3) 3/3 Intersticiális sejtek (1-5%), Here (3) 3/3 Intersticiális sejtek (5-80%), Máj (3) 0/3 Csecsemımirigy (3) 0/3 Tüdı (3) 2/3 Intersticiális sejtek (1-10%), Pajzsmirigy (3) 0/3 2/3 Gyulladásos sejtek (1-10%), Mandula (3) 0/3 Mezoteliális sejtek (2) 0/2 Méh (2) 2/2 Glanduláris epithelialis sejtek (100%), Szívizom (3) 3/3 Szívizomsejtek (30%), peri 2/2 Myometriális strómasejtek (100%), Vázizom (3) 0/3 Módszerek összehasonlítása: A Monoclonal Mouse Anti-Human PR, tesztelése EnVision FLEX+ rendszerrel lett elvégezve, és az ASCO/CAP irányelvei szerint kerültek értékelésre (határérték 1%) (11). Az Anti-PR (Clone 1294) tesztelése Dako ER/PR pharmdx Kit használatával lett elvégezve, és a termékismertetıben leírt Allred számlálási irányelvek szerint kerültek értékelésre. A módszer összehasonlítási adatai a 2. táblázatban találhatók. A megfelelı számlálási irányelveket használva a Monoclonal Mouse Anti-Human PR, korrelációt mutatott a Dako ER/PR pharmdx Kit PR antitest komponensével. Az összes egyezés 94,5%, a pozitív egyezés 95,8%, a negatív egyezés 93,1% volt. A 3. táblázat mindkét teszt összehasonlítását mutatja úgy, hogy mindkettıt az ASCO/CAP irányelvek szerint értékelték. 2. táblázat: Egyezés az Anti-PR, (ASCO/CAP) és az ER/PR pharmdx Kit (Allred) Anti-PR komponense között ER/PR pharmdx Kit Anti-PR komponense Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Pozitív 115 8 123 Negatív 5 108 113 Összesen 120 116 236 Pozitív százalékos egyezés = 95,8% (95% CI: 91,1-96,8) Negatív százalékos egyezés = 93,1% (95% CI: 90,5-96,7) Összes százalékos egyezés = 94,5% (95% CI: 90,8-96,8) (115566-004) 307141HU_004 o. 3/5
3. táblázat: Egyezés az Anti-PR, (ASCO/CAP) és az ER/PR pharmdx Kit (ASCO/CAP) Anti- PR komponense között ER/PR pharmdx Kit Anti-PR komponense Monoclonal Mouse Anti- Human PR, Pozitív 115 8 123 Negatív 1 112 113 Összesen 116 120 236 Pozitív százalékos egyezés = 99,1% (95% CI: 93,0-98,0) Negatív százalékos egyezés = 93,3% (95% CI: 92,8-98,0) Összes százalékos egyezés = 96,2% (95% CI: 93,0-98,0) Laboratóriumok közötti megismételhetıség: Anti-PR, megismételhetıségi vizsgálatot végeztek három különbözı laboratóriumban, öt, nem egymást követı napon 21 egyedi emlırák mintán, amelyeket az ASCO/CAP irányelvek szerint (határérték 1%) értékeltek, összesen 315 alkalommal. A 4., 5. és 6. táblázatok a tesztek ek közötti megismételhetıségét részletezik. Az átlagos pozitív, átlagos negatív és összes százalékos egyezés értékek alátámasztják a PR (PgR 636) teszt nagymértékő megismételhetıségének eredményeit, amikor a PR státuszát klinikai környezetben határozzák meg. 4. táblázat: 1. vs. 2., az Anti-PR, laboratóriumok közötti 2. sz. 1. sz. Pozitív 55 0 55 Negatív 4 46 50 Összesen 59 46 105 Átlagos pozitív százalékos egyezés = 96,5% Átlagos negatív százalékos egyezés = 95,8% 5. táblázat: 1. vs. 3., az Anti-PR, laboratóriumok közötti 3. sz. 1. sz. Pozitív 59 1 60 Negatív 0 45 45 Összesen 59 46 105 Átlagos pozitív százalékos egyezés = 99,2% Átlagos negatív százalékos egyezés = 98,9% 6. táblázat: 2. vs. 3., az Anti-PR, laboratóriumok közötti 3. sz. 2. sz. Pozitív 55 5 60 Negatív 0 45 45 Összesen 55 50 105 Átlagos pozitív százalékos egyezés = 95,7% Átlagos pozitív százalékos egyezés = 94,7% (115566-004) 307141HU_004 o. 4/5
Irodalomjegyzék 1. Henderson C. Breast cancer. In: Harrison s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, 1991 2. Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. Diseases of the Breast, Harris et al, eds. Lippincott-Raven, 1996. old. 261. 3. McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol 1983;10:2. 4. Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in stage II breast cancer. N Engl J Med 1983;39:1343. 5. Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, et al. Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: Results of a prospective southwest oncology group study. JCO 1992;10:1284. 6. Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M, Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62:2517 7. Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can Res Treat 1998;51:195. 8. Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998;11:155. 9. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966. 10. Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, et al. Comparison of different antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67:799. 11. Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907 22. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999. Edition 11/15 (115566-004) 307141HU_004 o. 5/5