FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human podoplanin Clone D2-40 Ready-to-Use (Link) Code: IR072. Javasolt alkalmazás

Átírás

1 FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human podoplanin Clone D2-40 Ready-to-Use (Link) Code: IR072 Javasolt alkalmazás Összefoglalás és magyarázat Biztosított reagens In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human podoplanin, Clone D2-40, Ready-to-Use (Link), az Autostainer Link készülékekkel végzett immunhisztokémiai felhasználásra szolgál. Ez az antitest a podoplanin markert jelöli meg limfatikus endotéliumnál normál és neoplasztikus szövetekben. Ez az antitest jól használható a limfatikus invázió azonosítására többféle rák esetében (1, 2). A festıdés, illetve a festıdés hiányának klinikai értékelését morfológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett, és a páciens kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálati eredményeinek figyelembevételével, patológus szakorvosnak kell végeznie. A podoplanin egy ~38 kda-os, egy oxigénhez kapcsolódó transzmembrán szialoglikoprotein, amely az endotélium limfatikus kapillárisaiban expresszálódik, de véredényekben nem (3). A limfatikus endotélium mellett a podoplanin más egyéb szövetekben is megtalálható, úgy mint a mezoteliális sejtekben, retikuláris sejtekben, follikuláris dendritikus sejtekben, petefészek és here csírasejtjeiben (4). Az anti-podoplaninról azt is kimutatták, hogy reagál a limfatikus endotéliummal, viszont a vaszkuláris endotélium nem ad vele reakciót (1, 2). Neoplasztikus szövetben a limfatikus endotélium anti-podoplaninnal történı immunfestése hasznosnak bizonyult a primer tumorok limfatikus inváziójának kimutatásában (1, 2). A kalretinin és podoplanin markerek együttes használata elısegíti a mezotelióma differenciációját a metasztatikus adenokarcinómával szemben (5). A podoplanin szintén hasznos marker a szeminómák és follikuláris dendritikus sejtek tumorjának differenciális meghatározásában (6). Lásd a Dako Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványát, illetve az IHC eljáráshoz alkalmazott detektálórendszer útmutatóját az alábbiak tekintetében: 1) Az eljárás elve, 2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, 3) Tárolás, 4) Minta-elıkészítés, 5) A festési eljárás, 6) Minıség-ellenırzés, 7) Hibaelhárítás, 8) A festıdés értékelése, 9) Általános korlátozások. Azonnal felhasználható monoklonális, egér eredető antitest folyadék formájában, stabilizáló fehérjét és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferben. Klón: D2-40 (7). Izotípus: IgG1, kappa. Immunogén Diszgerminóma szövet (7). Specificitás A monoklonális anti-podoplanin, Clone D2-40-et többféle tumorsejtvonal sejtlizátumának Western blot tesztjével vizsgálták. Az antitest HEY epitél petefészek-karcinómasejtjeinek immunblotjában egy ~40 kda-os sávot, a MGH-U3 sejtek blotjában egy valamivel nagyobb molekulatömegő formát mutatott ki. Immunreaktivitást figyeltek meg továbbá SK-OV-3 és Caov-3 epitél petefészek-karcinóma sejtek, PA-1PA-1 petefészek-teratokarcinóma sejtek, Tera-1 és Tera-2 here-teratokarcinóma sejtek, 833 embrionális karcinómasejtek, RT-4 húgyhólyag átmeneti sejtes karcinómasejtek és U-2 OS oszteoszarkóma sejtek Western blotjaiban is. Egyéb, többféle karcinómából származó tumor sejtvonalak Western blotjában nem figyeltek meg reaktivitást (1). Az enzimes emésztésnek a D2-40-klón immunreaktivitására tett hatását HEY sejtekbıl származó, affinitás módszerrel tisztított antigénnel és ép HEY sejtekkel vizsgálták. Nem befolyásolta az immunreaktivitást a tisztított antigén Western blotjában és az áramlásos citometriában a sziálsav maradékainak eltávolítása, amelyet a sejtek vagy a fehérje neuramidázkezelésével végeztek. A fehérje vagy a sejtek O-szialoglikoproteázzal történı kezelése megszüntette a D2-40-klón immunreaktivitását a Western blotban és az áramlásos citometriában is, ami azt mutatja, hogy a felismert antigén egy O-kötést tartalmazó glikoprotein (7). Óvintézkedések 1. Szakképzett felhasználók részére! 2. A termék nátrium-azidot (NaN 3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, amely során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor, megelızendı a fém-azidok képzıdését a vízvezetékekben, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni. 3. Mint bármely biológiai eredető termék esetében, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 4. Megfelelı személyi védıfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bırre. 5. A fel nem használt oldatot a helyi, állami és szövetségi hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. Tárolás 2 8 C-on tárolandó. Az üvegen feltüntetett lejárat i idı után nem használható fel. Ha a reagenseket a meghatározottól eltérı körülmények között tárolják, akkor a felhasználónak ellenıriznie kell a feltételek megfelelıségét. Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. ( ) HU_002 1/5. o.

2 Emiatt a páciens mintáival egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell. Ha nem várt festıdést figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és az antitesttel kapcsolatos problémákra gyanakszik, akkor forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Minta-elıkészítés és a szükséges, de nem biztosított anyagok A festési eljárás és a szükséges, de nem biztosított anyagok A festıdés értékelése Teljesítményjellemzõk Az antitest formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek jelölésére alkalmazható. A szövetmintákból körülbelül 4 µm-es metszeteket kell készíteni. Elıkezelés szükséges hıindukált epitópfeltárási (HIER) technikával. A legjobb eredményeket a szövetek EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (Link) (kód: K8000/K8004) reagenssel végzett elıkezelésével lehet elérni. Paraffinmentesített metszetek: A paraffinmentesített, formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek elıkezelése javasolt a Dako PT Link (kód: PT100/PT101) termék használatával. Kérjük, a részleteket illetıen lapozza fel a PT Link Használati útmutatóját. Az elıkezelést az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (Link) (kód: K8000/K8004) reagens terméktájékoztatójában ismertetett eljárás szerint végezze. A PT Linkhez az alábbi paramétereket kell alkalmazni: Elıhevítési hımérséklet: 65 C; az epitópfeltáráshoz szükséges hımérséklet és idı: 97 C 20 (±1) percre; hőtés 65 C-ra. Vegye ki az Autostainer tartóállványokat a tárgylemezekkel együtt a PT Link tartályából, és azonnal merítse ıket hígított, szobahımérséklető EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Link) (kód: K8000) termékkel töltött edénybe/tartályba (pl.: PT Link Rinse Station, kód: PT109). Hagyja a metszeteket 1-5 percen át a Wash Buffer pufferben. Paraffinba ágyazott metszetek: A minta elıkészítését illetıen alternatív lehetıségként paraffinmentesítés és epitópfeltárás is végezhetı a PT Link rendszerben, egy módosított eljárás alkalmazásával. Az útmutatások a PT Link Használati útmutatójában találhatók. A festési eljárás elvégzését követıen a metszeteket vízmentesíteni kell, meg kell tisztítani a reagensmaradványoktól, majd tartós rögzítıszer használatával fel kell vinni tárgylemezre. A szövetmetszeteknek a kezelés, illetve az azt követı immunhisztokémiai festési eljárás során nem szabad kiszáradniuk. A szöveti metszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítésére ajánlott az S3003 kódszámú Dako Silanized Slides termék használata. Az ajánlott megjelenítı-rendszer az EnVision FLEX, High ph, (Link) (kód: K8000). A festési lépések és inkubálási idık az Autostainer Link szoftverében elıre be vannak programozva. Kérjük, a metszetek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos részletes utasításokat illetıen lapozza fel a megfelelı Autostainer Link Használati útmutatót. Amennyiben a protokollok nem állnak rendelkezésre az alkalmazott Autostainer készüléken, akkor kérjük, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Valamennyi inkubálási lépést szobahımérsékleten kell végezni. Az optimális körülmények a mintától és az elıkészítés módjától függıen változhatnak, ezeket az egyes laboratóriumoknak kell meghatározniuk. Ha az értékelést végzı patológus úgy véli, hogy változtatni kellene a festıdés intenzitásán, akkor a protokoll újraprogramozására vonatkozóan tájékoztatást kérhet a Dako Alkalmazási/Mőszaki szolgálati szakértıjétıl. Ellenırizze, hogy a módosított protokoll továbbra is hiteles eredményeket biztosít-e. Ehhez vizsgálja meg a kapott festıdési mintázatot, és állapítsa meg, hogy megegyezik-e a Teljesítményjellemzık pontban ismertetett festıdési mintázattal. Hematoxilinnal történı kontrasztfestés javasolt az EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (kód: K8008) reagenssel. Nem vizes alapú, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell, ugyanazt a protokollt alkalmazva, mint a páciensmintákhoz. A pozitív kontroll szövetnek tartalmaznia kell appendix- és mandulaszövetet, és a sejteknek/sejtstruktúráknak az összes pozitív minta esetében a Teljesítményjellemzık részben, az adott szövettípusokra vonatkozóan ismertetett reakciómintázatot kell mutatniuk. Az ajánlott negatív kontroll reagens a FLEX Negative Control, Mouse, (Link) (kód: IR750). A sejtfestıdési mintázat citoplazmatikus és membránhoz kötıdı. Normál szövetek: Az antitest erısen megjelöli a limfatikus endotélt, a ganglionsejteket és az idegeket sok normál szövettípusban. A vaszkuláris endotél sejtek minden vizsgált normál szövetben negatívak (8). Szövettípus (# vizsgált) Mellékvese (3) Féregnyúlvány (11) Csontvelı (3) 0/3 Agy, kisagy (3) Agy (3) Emlı (3) Méhnyak (3) Vastagbél (3) Nyelıcsı (3) Pozitív festıdéső szövetelemek 2/3 kapszuláris fibroblasztok citoplazmája 1/3 intersticiális fibroblasztok citoplazmája 1/3 perikapszuláris limfociták citoplazmája 9/11 endotél sejtek citoplazmája 3/3 neuropil citoplazmája 3/3 egyes asztrociták sejtmagjai 3/3 mioepitél sejtek citoplazmája 3/3 a baziláris epitél sejtek membránja és/vagy citoplazmája 3/3 a stróma fibroblasztjainak citoplazmája 2/3 limfociták 1/3 az izom ganglionsejtjeinek citoplazmája ( ) HU_002 2/5. o.

3 Szív (3) Vese (3) Máj (3) 0/3 Tüdõ (3) Mezoteliális sejtek (3) Petefészek (3) Hasnyálmirigy (3) Mellékpajzsmirigy (3) 0/3 Perifériás ideg (3) Agyalapi mirigy (3) Prosztata (3) Nyálmirigy (3) Vázizom (3) Bır (3) Vékonybél (3) Lép (3) 0/3 Gyomor (3) Herék (3/3) Csecsemımirigy (3) Pajzsmirigy (3) 0/3 Mandula (3) Méh (3) 1/3 a baziláris epitél citoplazmája 2/3 szívizomsejtek citoplazmája 1/3 perikapszuláris fibroblasztok citoplazmája 2/3 bronchiális epitélsejtek citoplazmája; 3/3 alveoláris sejtek citoplazmájának pereme 1/3 mezotél sejtek citoplazmája 3/3 az ovárium strómasejtjeinek citoplazmája 1/3 az inklúziós ciszták felszíni epitélsejtjeinek citoplazmája 2/3 periduktális fibroblasztok citoplazmája 1/3 duktális mioepitél sejtek citoplazmája 2/3 perineurium citoplazmája 1/3 neurohipofízis perikapszuláris fibroblasztjának citoplazmája; 1/3 a neuropil citoplazmája a neurohipofízisben 3/3 a duktális bazális sejtek citoplazmája 3/3 a stróma fibroblasztjainak citoplazmája 3/3 duktális és acinus-mioepitél sejtek citoplazmája 3/3 perimizium citoplazmája 3/3 kapcsolódó struktúrák mioepitél sejtjeinek citoplazmája 3/3 plexus myentericus citoplazmája 3/3 periglanduláris fibroblasztok citoplazmája 1/3 plexus myentericus citoplazmája 1/3 a csíracentrum limfocitáinak citoplazmája és membránja 3/3 peritubuláris fibroblasztok citoplazmája 3/3 medulláris limfociták citoplazmája és membránja 3/3 bazális epitél sejtek és a csíracentrum limfocitáinak citoplazmája és membránja 3/3 miometrium citoplazmája 1/3 endometriális mirigyek citoplazmája Rendellenes szövetek (2, 7): Szövettípus (# vizsgált) Kaposi-szarkóma (24): Folt, plakk és noduláris fázisok Limfangióma (10) Pozitívan festıdı szövet 24/24 Angioszarkóma (7) 3/7 Leiomioszarkóma (10) 3/10 Dermatofibróma (6) 2/6 Malignus rostos hisztiocitóma (2) 1/2 Hemangióma (10) 0/10 Glomusz tumor (3) 0/3 Angiolipóma (2) 0/2 Piogén granulóma (2) 0/2 Vaszkuláris malformáció (2) 0/2 Hemangiopericitóma (1) 0/1 Hemangioendotelióma (1) 0/1 Dermatofibrosarcoma protuberans (4) 0/4 Neurofibrómák (6) 0/6 Tiszta csírasejtes tumorok Szeminómák (35) 34/35 Embrionális karcinómák (5) 1/5 Éretlen és érett teratóma (1) 0/1 10/10 sinusoid terek endotél bélése ( ) HU_002 3/5. o.

4 Kevert csírasejtes tumorok Szeminómák (12) 12/12 Embrionális karcinómák (21) 17/21 Éretlen és érett teratóma (16) 5/16 Yolk sac tumor (4) 1/4 Koriokarcinóma (2) 0/2 ( ) HU_002 4/5. o.

5 Szakirodalom 1. Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors. Lab Invest 2002; 82: Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas. Mod Pathol 2002; 15: Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, Horvat R, Amann G, Kriehuber E, et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol 1999; 154: Kalof AN and Cooper K. D2-40 Immunohistochemistry So Far! Adv Anat Pathol 2009; 16: Chu AY, Litzky LA, Pasha TL, Acs G, Zhang PJ. Utility of D2-40, a novel mesothelial marker, in the diagnosis of malignant mesothelioma, Mod Pathol 2005, 18: Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128: Marks A, Sutherland DR, Bailey D, Iglesias J, Law J, Lei M, et al. Characterization and distribution of an oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours. Br J Cancer 1999; 80: IHC003 Report On File Kiadás: 07/12 ( ) HU_002 5/5. o.