Histology FISH Accessory Kit Kód: K5799

Átírás

1 Histology FISH Accessory Kit Kód: K kiadás Fluoreszcens in situ hibridizációhoz (FISH) formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteken. A készlet 20 vizsgálatra elegendı reagenst tartalmaz. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

2 Tartalomjegyzék Javasolt alkalmazás... 3 Bevezetés... 3 Reagensek... 3 Mellékelt anyagok... 3 Szükséges, de nem biztosított anyagok... 4 Óvintézkedések... 5 Tárolás... 7 A minta elıkészítése... 8 Paraffinba ágyazott metszetek... 8 HASZNÁLATI UTASÍTÁS... 9 A. A reagensek elıkészítése... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Etanolsorozatok... 9 A.5 Pepszinoldat... 9 B. Festési eljárás B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések B.2 A szövetek kezelése festés elıtt B.3 Festési protokoll B.3.a. B.3.b. Festési protokoll etilén-karbonát alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz Festési protokoll formamid alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz Minıség-ellenırzés Az eredmények értelmezése Hibaelhárítás függelék függelék Irodalomjegyzék Szimbólumok magyarázata ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

3 MAGYAR Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai alkalmazás. A Histology FISH Accessory Kit készletet a fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) technika formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszet-mintákon történı alkalmazásához alakították ki. A Histology FISH Accessory Kit készlet a HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (kód: K5731, 3. üveg) próbakeverékkel együtt is használható. Amennyiben a Dako Histology FISH Accessory Kit készlet (kód: K5799) reagenseit a K5731-es készletek reagenseivel együtt használják, akkor az adott (K5731-es) készlet terméktájékoztatóját kell követni. Bevezetés A Histology FISH Accessory Kit készlet minden olyan fontos reagenst tartalmaz (a próba kivételével), amelyekre a FISH eljárás formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetmintákon történı elvégzéséhez szükség van. Paraffinmentesítés és rehidrálás után a mintákat Pre-Treatment Solution oldatban melegítik, amit a Pepsin felhasználásával végzett proteolitikus emésztés követ. A melegítési és proteolitikus elıkezelési lépések után a felhasználó által biztosított FISH próbákat alkalmazzák, és a mintákat a denaturálás és hibridizálás elıtt Coverslip Sealant tömítéssel zárják le. A hibridizációt követıen alapos mosást végeznek magas stringenciájú mosóoldattal, ami biztosítja a nem kötıdı, illetve az aspecifikusan kötıdı FISH próbák eltávolítását az etanolos dehidrálást megelızıen. Végül a mintákat kék fluoreszcens kontrasztfestéket tartalmazó Fluorescence Mounting Medium rögzítıszerrel rögzítik. Az eredményeket megfelelı szőrıkkel ellátott fluoreszcencia mikroszkóp segítségével értelmezik (lásd az 1. függeléket). Reagensek Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 20 vizsgálathoz elegendıek (egy vizsgálat egy darab, 22 x 22 mm-es célterület feldolgozását jelenti). A készlet legfeljebb 10 különálló FISH munkamenethez elegendı anyagot tartalmaz (pepszinimmerziós módszer esetében ez a mennyiség csak négy különálló festési folyamathoz elegendı). A Histology FISH Accessory Kit készletet szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a készlet komponensei nem voltak kitéve szállítás közben magas hımérsékleti hatásnak. Elıfordulhat, hogy a készlet egyes összetevıi nem fagynak meg. Ez nem fogja befolyásolni a Histology FISH Accessory Kit készlet teljesítményét. 1. üveg 2A. üveg 2B. üveg Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú MES (2-[N-morfolino]-etánszulfonsav) puffer. Pepsin 4 x 6,0 ml, azonnal felhasználható Pepsin oldat, ph 2,0; stabilizátort és antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, 10-szeres koncentrációjú Hígítópuffer, ph 2,0; antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

4 4. üveg 5. üveg 6. üveg Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú SSC (konyhasós nátrium-citrát) puffer Tween- 20 detergenssel. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Azonnal felhasználható Fluorescence Mounting Medium fluoreszcens rögzítıszer, amely 500 µg/l DAPI-t (4-6-diamidino-2-fenilindolt) tartalmaz. Wash Buffer (20x) 500 ml, 20-szoros koncentrációjú Tris/HCl puffer. 7. tétel Coverslip Sealant 1 csı Azonnal felhasználható oldat a fedılemezek eltávolítható tömítéseihez. MEGJEGYZÉS: Az összes reagens felcserélhetı a Dako HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) megfelelı reagenseivel. Amennyiben a Dako Histology FISH Accessory Kit készlet (kód: K5799) reagenseit a K5731-es készletek reagenseivel együtt használják, akkor az adott (K5731-es) készlet terméktájékoztatóját kell követni. Szükséges, de nem biztosított anyagok Laboratóriumi reagensek Desztillált vagy ionmentesített víz Etanol, 96%-os Xilol vagy xilol-szubsztituensek Laboratóriumi eszközök Abszorbens kendık Szabályozható pipetták Kalibrált merülı hımérı (mérési tartomány: ο C) Fedılemezek (18 mm x 18 mm vagy 22 mm x 22 mm és 24 mm x 50 mm vagy 24 mm x 60 mm) Csipeszek Vegyifülke Dako Hybridizer (kód: S2450/S2451)* Főtıblokk vagy hibridizáló kemence* Hibridizáló párakamra* Mikrocentrifuga Tárgylemezek, Dako Silanized Slides (kód: S3003), vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezek, vagy SuperFrost Plus tárgylemezek Festıedények vagy fürdık Fém vagy mőanyag bölcsık Idızítı (amely alkalmas 0-60 perces idıközök mérésére) Vízfürdı fedéllel (amely képes megtartani a hımérsékletet 37 (±2) C-on, 63 (±2) C-on, 65 (±2) C-on, valamint 95 C és 99 C között ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

5 Érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı, amennyiben az elıkezelést mikrohullámú sütıvel végzik** (lásd B3.a vagy B.3.b. szakasz 1. lépés Festési protokoll B módszer). Mikrohullám-biztos tartóedény, lyukacsos (pl. egy cm átmérıjő lyukakat tartalmazó) fedéllel * Bár lehet használni főtıblokkot az emésztési folyamathoz (37 (±2) C), főtıblokkot vagy hibridizáló kemencét a denaturáláshoz (66 (±2) C (B.3.a.) vagy 82 (±2) C) (B.3.b.) és hibridizációs párakamrát a hibridizáláshoz (45 (±2) C) a Dako Hybridizer (kód: S2450/S2451 használatát ajánljuk. ** A mikrohullámú sütı helyett lehet használni fedeles vízfürdıt (amely képes megtartani a hımérsékletet 95 és 99 C között) vagy mikroprocesszorral vezérelt nyomáskamrát (pl. Dako Pascal (kód: S2800)). Mikroszkóp és tartozékai Szőrık fluoreszcencia mikroszkóphoz: DAPI szőrı, valamint a használt fluorokrómnak megfelelı szőrı, pl. FITC/Texas Red kettıs szőrı, FITC és Texas Red monoszőrı a Dako FISH próbákhoz a részleteket lásd az 1. függelékben. Fényforrásként 100 wattos higanylámpát használó fluoreszcencia mikroszkópot kell használni a Dako FISH próbákhoz. Más fényforrások nem javasoltak ezekkel a szőrıkkel való használatra Mikroszkóptárgylemez-tartó (kartontálca felnyitható tetıvel 20 tárgylemezhez, vagy ehhez hasonló) Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai használatra. 2. Professzionális felhasználóknak üveg, Pre-Treatment Solution (20x), nem kell figyelmeztetı felirattal ellátni. Foglalkozásszerő felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 4. 2A. üveg, Pepsin, tartalma 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepszin A, <0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one és 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. 2A. üveg figyelmeztetı címkével van ellátva: Veszély H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Súlyos égési sérülést és szemkárosodást okoz. Allergiás bırreakciót válthat ki. Védıkesztyő/védıruha/szemvédı/arcvédı használata kötelezı. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegıre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BİRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bırt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 5. 2B. üveg, Pepsin Diluent (10-szeres koncentrációjú), tartalma 50-<75% propan-2-ol, and 5- <10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 2B. üveg figyelmeztetı címkével van ellátva: ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

6 Danger H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Fokozottan tőzveszélyes folyadék és gız. Súlyos szemirritációt okoz. Álmosságot vagy szédülést okozhat. Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. Hıtıl, forró felületektıl, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellıztetı/világító/berendezés használandó. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegıre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. HA BİRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bırt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Hővös helyen tartandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni üveg, Stringent Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride tartalmaz. 4. üveg figyelmeztetı címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bırirritáló hatású. Védıkesztyő/védıruha/szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása üveg, Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% trometamolt tartalmaz. 6. üveg figyelmeztetı címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bırirritáló hatású. Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása tétel, Coverslip Sealant, % arányban hidrogénezett könnyőbenzint (petróleumot) tartalmaz, és a következı felirattal látták el: ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

7 Veszély H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P510 Fokozottan tőzveszélyes folyadék és gız. Lenyelve és a légutakba kerülve halálos lehet. Mérgezı a vízi élıvilágra, hosszan tartó károsodást okoz. Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. Hıtıl, forró felületektıl, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellıztetı/ világító/berendezés használandó. Kerülni kell az anyagnak a környezetbe való kijutását. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BİRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bırt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Hővös helyen tartandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 9. További információkért olvassa el a biztonsági adatlapot (MSDS). 10. A megadottól eltérı szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. 11. A megadottól eltérı inkubációs idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 12. A reagensek az optimális mértékben vannak hígítva. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 13. A pepszinimmerziós módszerhez kizárólag tiszta festıedényeket szabad használni (2. lépés, C módszer). Tárolás Sötét helyen, 2 8 C fokon tárolandó. Alternatív le hetıségként az összes reagenst le lehet fagyasztani. A Pepsinre (2A. üveg) káros hatással lehet a magas hımérséklet. Ne hagyja ezt az anyagot szobahımérsékleten. A Fluorescence Mounting Medium rögzítıszerre (5. üveg) káros hatással lehet a túlzottan erıs fény. Ne tárolja ezt az anyagot fénynek kitéve. A csomagoláson feltüntetett lejárati idın túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenst a meghatározottól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak validálnia kell a reagensek teljesítményét (1). Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Ezért fontos, hogy az assay munkamenet kontrolljaként olyan normális szöveteket használjon, amelyek elızıleg megfelelı eredményt adtak a FISH vizsgálat során. Ha nem várt fluoreszcenciamintázatot figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi eljárásokban rejlı eltérésekkel, és a Histology FISH Accessory Kit készlettel kapcsolatos problémára gyanakszik, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

8 A minta elıkészítése A biopsziákból, kimetszésekbıl vagy reszekciókból származó mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet ép maradjon a FISH elemzés céljára. Kövesse az alábbiakban leírt, az immuncitokémiai festési eljárásokhoz ajánlott szövetfeldolgozási módszert. További információkért lásd az irodalomjegyzéket (2). A FISH eljáráshoz nem ajánlott olyan szövetet használni, amely savas dekalcifikáción esett át (3-6). Beszámoltak arról, hogy dekalcifikáló szerként az EDTA jobban megkíméli a DNS-t (6) a (F)ISH (3, 4, 7) technikákhoz. MEGJEGYZÉS: A Dako Histology FISH Accessory Kit készlet teljesítményét nem validálták dekalcifikált szöveteken. Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A mintákat például 3 4 mm-es szeletekre vágva órán keresztül kell fixálni semlegesre pufferelt formalinban. A szöveteket ezután etanol és xilol sorozathígítású oldatában kell dehidrálni, majd legfeljebb 60 C-os olvasztott paraffinnal átitatni. A megfelelıen fixált és beágyazott szövetek megfelelıen tárolva (15 25 C-on) korlátlan ideig eltarthatók a metszetek elkészítéséig és tárgylemezre helyezéséig. (2, 8) Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A hosszas fixálási idı megnövelheti a Pepsin pepszines emésztési lépésben szükséges inkubációs idıt. A szövetmintákból 2 6 µm vastag metszeteket kell készíteni, amelyeket vízfürdıbıl kivett tárgylemezekre kell helyezni, majd levegın megszárítani. A szövetmetszetek optimális vastagsága a Dako Split Signal FISH próbákhoz 2 3 µm. A 4 6 µm-es metszeteket egyéb FISH alkalmazásokhoz lehet használni. A paraffint 60 C-on kell felolvasztani percen át. Ezt követıen a metszeteket szobahımérsékletre (20-25 C) kell hőteni, majd 2-8 C-on kell tárolni. Ajánlott a szövetmetszeteket Dako Silanized Slides tárgylemezre (kód: S3003), vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezre, vagy SuperFrost Plus tárgylemezre helyezni. Általában a mintákat a metszetkészítést követı 6 hónapon belül ki kell értékelni, ha 2 8 C-on tárolják ıket. Amennyiben a szövetmetszeteket a megadottól eltérı körülmények között tárolják, a felhasználónak ellenıriznie kell a feltételeket. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

9 HASZNÁLATI UTASÍTÁS A. A reagensek elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elıkészíteni: A.1 Pre-Treatment Solution Elıfordulhat, hogy az 1. üvegben kristályok láthatóak, de ezek szobahımérsékleten feloldódnak. A reagens elkészítése elıtt gyızıdjön meg róla, hogy nincsenek benne kristályok. Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendı mennyiséget az 1. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú Pre-Treatment Solution oldatból) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított oldatot öntse ki, ha zavarossá válik. A.2 Stringent Wash Buffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendı mennyiséget a 4. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú, Stringent Wash Buffer mosópufferbıl) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig táro lható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.3 Wash Buffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendı mennyiséget a 6. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú Wash Buffer mosópufferbıl) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.4 Etanolsorozatok 96%-os etanolból készítsen 3 külön edényben 70%-os, 85%-os, illetve 96%-os oldatot. Tárolja a lefedett edényeket szobahımérsékleten vagy 2 8 C-on, és legfeljebb 200 tárgy lemezhez használja az oldatokat. Az oldatokat öntse ki, ha zavarossá válnak. A.5 Pepszinoldat Pepszinoldat csak a pepszinimmerziós módszer használata esetén szükséges (B.3.a és B.3.b szakasz 2. lépés C módszer). A pepszinoldatot a következıképpen készítse el: Egy hat metszetet befogadó edényhez készítsen 60 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 48 ml szoba-hımérséklető (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú Pepsin Diluent hígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) Pepsin pepszint (2A. üveg). Fedje le az edényt, és vízfürdıbe helyezve vigye 37 (±2) C-ra a pepszinoldat hımérsékletét. Egy 24 metszetet befogadó edényhez készítsen 240 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 192 ml szoba-hımérséklető (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú Pepsin Diluent hígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) Pepsin pepszint (2A. üveg). Fedje le az edényt, és vízfürdıbe helyezve vigye 37 (±2) C-ra a pepszinoldat hımérsékletét. A megfelelı hımérsékletre hozott pepszinoldatot 5 órán belül fel kell használni. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

10 B. Festési eljárás B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések Használat elıtt alaposan tanulmányozza át ezt az útmutatót, és alaposan ismerje meg az összes alkotóelemet (lásd Óvintézkedések). Amennyiben a készlet komponenseit fagyasztva tárolják, ajánlott áthelyezni a reagenseket 2 8 Cra az elemzést megelızı napon, hogy elérjék a megfelelı hımérsékletet. Használat elıtt minden reagenst a meghatározott hımérsékletre kell hozni. 1. üveg: A hígított Pre-Treatment Solution oldatnak fel kell melegednie C-ra, ha az elıkezeléshez szükséges vízfürdıt használnak (B.3.a vagy B.3.b szakasz Festési protokoll, 1. lépés: Elıkezelés, A módszer). Ha hıérzékelıvel ellátott mikrohullámú sütıt használ az elıkezeléshez (B3.a vagy B.3.b szakasz Festési protokoll, 1. lépés: Elıkezelés, B módszer), a hígított Pre-Treatment Solution oldatnak el kell érnie a szobahımérsékletet, C-ot. 2A. üveg: A Pepsin pepszint 2-8 C-os hımérsékleten kell alkalmazni (B3.a vagy B.3.b szakasz Festési protokoll, 2. lépés: A és B módszer) és folyamatosan fenn kell tartani ezt a hımérsékletet. 2B. üveg: A Pepsin Diluent (10x) hígítót 2 8 C-os hımérsékleten kell alkalmazni (B3.a vagy B.3.b szakasz Festési protokoll, 2. lépés: C módszer) 4. üveg: Használat elıtt a hígított Stringent Wash Buffer mosópufferbıl egy adagot egy edényben szobahımérsékletre kell hozni, egy másik edényben egy másik adagot pedig 63 (±2) C-ra (B.3.a. szakasz) vagy 65 (±2) C-ra (B.3.b szakasz). 5. üveg: A Fluorescence Mounting Medium rögzítıszer bármilyen 2 és 25 C közötti hımérsékleten alkalmazható. 6. üveg: A hígított Wash Buffer mosópuffert szobahımérsékletre (20 25 C-ra) kell melegíteni. 7. tétel: A Coverslip Sealant tömítést szobahımérsékleten (20 25 C-on) lehet alkalmazni. Valamennyi lépést a megadott hımérsékleten kell végrehajtani. A festés elıtti eljárás részét képezi a minták dehidrálása, majd szárítása. Mielıtt áttérne a következı lépésre, gyızıdjön meg arról, hogy a szövetmetszetek teljesen szárazak. A szövetmetszetek szárítását ne hagyja az eljárás egyéb lépéseinek idejére. Ha a festési eljárást meg kell szakítania, akkor paraffinmentesítést követıen a tárgylemezeket legfeljebb 1 órán át tárolhatja a Wash Buffer mosópufferben szobahımérsékleten (20 25 C-on). B.2 A szövetek kezelése festés elıtt Paraffinmentesítés és rehidrálás: Az elemzés elvégzése elıtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidrálni kell. Ügyeljen arra, hogy a paraffin teljes mértékben el legyen távolítva. A visszamaradó paraffin fokozottabb nem specifikus festıdést eredményezhet. Ezt a lépést szobahımérsékleten (20 25 C-on) végezze. 1. Helyezze a tárgylemezeket xilolfürdıbe, és inkubálja ıket 5 (±1) percig. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg ezt a lépést egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 96%-os etanolba. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg ezt a lépést egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 70%-os etanolba. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg ezt a lépést egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a tárgylemezeket legalább 2 percre a hígított Wash Buffer mosópufferbe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát). A B3.a vagy B.3.b szakasz Elıkezelés címő 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg a festési eljárást. Minden 200. metszet feldolgozása után friss xilol- és alkohololdatokat kell készíteni. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

11 Xilolszubsztituensek használata megengedett. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagenseket és útmutatót az optimális teljesítmény eléréséhez állították össze. A reagensek további hígítása vagy az inkubálási hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Az adott laboratóriumban alkalmazott eltérı szövetfeldolgozási módszerek és technikai eljárások érvénytelenné tehetik az assay eredményeit. A minták opcionális érlelése: Paraffinmentesítés és rehidrálás elıtt inkubálja a tárgylemezeket 60 C-on, pl. 1 órán át egy főtıblokkon, vagy a hibridizációs kemence egyik blokkján, vagy a Dako Hybridizer készülékben. Másik lehetıségként inkubálja a lemezeket 37 C-on 1-2 napig, majd 1 órán át 60 C-on. Folytassa paraffinmentesítéssel és rehidrálással. MEGJEGYZÉS: Ez a lépés opcionális. A minták érlelése csökkentheti az esetleges háttérzajt. B.3 Festési protokoll Kövesse a két festési protokoll változat, B.3.a vagy B.3.b egyikét. Ne cserélje fel a lépéseket a két eljárás között: A B.3.a festési protokoll az etilén-karbonát alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz használandó félnapos eljárást írja le. A B.3.b festési protokoll a formamid alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz használandó kétnapos eljárást írja le. B.3.a. Festési protokoll etilén-karbonát alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz 1. lépés: Elıkezelés (mikrohullámú sütı, vízfürdı, Pascal edény) Az elıkezelés vagy vízfürdı használatával, az A módszer szerint, vagy érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı használatával, a B módszernek megfelelıen, vagy Pascal túlnyomásos fızıedényben történhet, a C módszer leírása szerint. A módszer: Elıkezelés vízfürdı használatával Töltse meg a festıedényeket, pl. Coplin-edényeket a hígított Pre-Treatment Solution elıkezelı oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze a hígított Pre-Treatment Solution oldatot tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Főtse fel a vízfürdıt és a Pre-Treatment Solution oldatot C-ra. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében mérje meg kalibrált hımérı segítségével az edényben uralkodó hımérsékletet. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényeket. Merítse a szobahımérséklető, paraffinmentesített lemezeket a festıedényekben lévı elıre felmelegített Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatba. Ismételten ellenırizze a hımérsékletet, majd végezze el az inkubálást 10 (±1) percen át C-on. A tárgylemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Távolítsa el a fedelet és hagyja a tárgylemezeket a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatban szobahımérsékleten lehőlni 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20-25 C). Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. MEGJEGYZÉS: A Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. B módszer: Elıkezelés érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı segítségével Töltsön meg egy mőanyag edényt szobahımérséklető (20-25 C) Pre-Treatment Solution elıkezelı oldattal. Merítse bele a paraffinmentesített metszeteket a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatba, fedje le az edényt egy lyukacsos fedéllel és helyezze be a mikrohullámú sütıbe. Válassza ki a forrásérzékelı funkciót és egy olyan programot, amely a forrási hımérséklet elérése után 10 percig mőködik*. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

12 A 10 perces inkubációt követıen vegye ki a tárgylemezeket tartalmazó edényt a sütıbıl, vegye le a fedelét és hőtse szobahımérsékleten 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe és áztassa ıket szobahımérsékleten (20-25 C), 3 percen át. Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. * A hıérzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı használata azt jelenti, hogy a sütın kell lennie egy olyan érzékelınek, valamint olyan programoknak, amelyek elıször felmelegítik a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatot annak forráspontjára, majd ezt követıen megtartják a szükséges elıkezelési hımérsékletet (95 ºC felett), miközben megtörténik az elıre beállított idı visszaszámlálása (10 (±1) perc). Egyes, érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı modellek esetében elıfordulhat, hogy nem lehetséges a visszaszámlálási idı szabadon történı beállítása. Ha az adott modellen kizárólag elıre beállított programok vannak, akkor gyızıdjön meg róla, hogy olyan programot választott ki, amely alkalmas a szükséges (95 ºC feletti) elıkezelési hımérséklet fenntartására legalább 10 (±1) percen át és kézi vezérléssel 10 (±1) perc után leállítható. MEGJEGYZÉS: A Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. C módszer): Elıkezelés Pascal túlnyomásos fızıedénnyel Töltsön 500 ml ionmentesített vizet a Pascal edénybe. Töltsön meg egy mőanyag edényt 250 ml Pre-Treatment Solution elıkezelı oldattal. Merítse a paraffinmentesített metszeteket a Pre- Treatment Solution oldatba és helyezze a mőanyag edényt a Pascal edénybe. Inkubálja 121 C hımérsékleten 1 percig. Engedje ki a nyomást, miután a készülék lehőlt 90 C-ra. Tanulmányozza a Pascal Kézikönyvet a Pascal túlnyomásos fızıedény megfelelı kezelésével kapcsolatos információkért. Vegye ki az edényt, miután a készülék kiengedi a nyomást. Távolítsa el a fedeleket és hagyja a tárgylemezeket a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatban szobahımérsékleten lehőlni további 15 percen át. Tegye át a tárgylemezeket hígított, Stringent Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát). Áztassa a metszeteket 3 percig szobahımérsékleten. Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 2. lépéssel. MEGJEGYZÉS: A Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. Ne használjon tömített, légmentesen zárt edényt ha az elıkezelést mikrohullámú sütıben végzi, mivel az edényben megnı a nyomás és felrobbanhat vagy a felnyitáskor sérüléseket okozhat. Lehetıség van fém diatartó használatára a mikrohullámú sütıben, ha a fém tartó a teljes mikrohullámú kezelés alatt az elıkezelı oldatba merül. Egyébként NE használjon fémet a mikrohullámú sütıben. Kövesse a mikrohullámú sütı gyártójának utasításait. A 10 perces inkubáció során kerülje a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat folyamatos forralását. A megfelelı hımérsékleti körülmények biztosítása érdekében ellenırizze rendszeresen a hımérsékletet kalibrált hımérı segítségével. 2. lépés: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) pepszin vagy pepszinoldat A pepszines inkubálás történhet a tárgylemezekre RTU pepszin cseppentésével szobahımérsékleten (20-25 C) ( A módszer) vagy 37 C-on ( B módszer). Másik lehetıség a tárgylemezek pepszin oldatba merítése és 37 (±2) C hımérsékleten történı inkubálása ( C módszer). A és B módszer: Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert. Szöszmentes törlıvel (például abszorbens kendıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása érdekében, és hogy a reagensek a kijelölt területen maradjanak. Fedje le a mintát 5-8 csepp (250 µl) hideg (2-8 C) Pepsin pepszinnel (2A üveg). A Pepsin anyagot mindig 2-8 C hımérsékleten tárolja. A módszer: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) pepszin - inkubálás C hımérsékleten Végezze az inkubálást 5-15 percen át szobahımérsékleten (20-25 C) percig történı inkubálás a legtöbb minta esetében elegendı, de az optimális inkubálási idı függhet a korábbi szövetfixálástól és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell meghatároznia. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

13 Ütögetéssel távolítsa el a megmaradt Pepsin anyagot, és áztassa be a metszeteket a hígított Wash Buffer mosópufferbe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20-25 C). Cserélje le a hígított Wash Buffer mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Lépjen tovább a dehidrálásra. B módszer: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) pepszin - inkubálás 37 C hımérsékleten Helyezze a Pepsin pepszines mintát egy 37 C-os főtıblokkba pl. a Dako Hybridizerbe, és inkubálja 3-5 percen át. 3-5 percig történı inkubálás a legtöbb minta esetében elegendı, de az optimális inkubálási idı függhet a korábbi szövetfixálástól és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges Pepsin anyagot, és áztassa a metszeteket a hígított Wash Buffer mosópufferbe 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20 25 C). Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Lépjen tovább a dehidrálásra. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os, és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegın teljesen megszáradni. C módszer: Pepsin oldat - a tárgylemezek 37 C-os pepszinoldatba merítése A készletben lévı reagensek négy különálló munkamenethez (60 ml pepszinoldat, hat metszetet befogadó kisebb edényhez) vagy egyetlen munkamunkamenethez (240 ml pepszinoldat, 24 metszetet befogadó nagyobb edényhez) elegendıek. Készítse el a pepszinoldatot az A.5 szakaszban leírt módon. Fedje le az edényt, és vízfürdıbe helyezve vigye 37 (±2) C-ra a pepszinoldat hımérsékletét. Ellenırizze, hogy a hımérséklet stabilizálódott-e. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében kalibrált hımérıvel mérje meg az edényben uralkodó hımérsékletet. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges mosópuffert. Merítse a tárgylemezeket a 37 (±2) C-os pepszinoldatba, és végezzen perces inkubálást percig történı inkubálás a legtöbb minta esetében elegendı, de az optimális inkubálási idı függhet a korábbi szövetfixálástól és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges pepszinoldatot, és áztassa be a metszeteket a hígított Wash Buffer mosópufferbe 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20-25 C). Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Lépjen tovább a dehidrálásra. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os, és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegın teljesen megszáradni. 3. Lépés Etilén-karbonát alapú hibridizációs pufferben (felhasználó által biztosított) hígított FISH próba MEGJEGYZÉS: Az etilén-karbonát alapú hibridizációs pufferrel hígított FISH próbakeverékeket - 18 C-on kell tárolni két használat között. A -18 C hımérsékleten történı tárolás hatására a puffer két fázisra válik. Használat elıtt a próbakeveréket szobahımérsékletőre (20-25 C) melegítve keverje össze, annak érdekében, hogy csak egy fázis legyen jelen. Olvassza fel a FISH próbakeveréket szobahımérsékleten (20-25 C) legfeljebb 30 perc alatt (erıs fénytıl védve), majd keverje össze alaposan az üveg tartalmát 15 másodpercig 2500 rpm fordulattal egy vortex keverı segítségével. Vigyen fel megfelelı mennyiségő (pl. 10 µl) próbakeveréket a szövetmetszet közepére. Azonnal helyezzen fel egy 22x22 mm-es üveg fedılemezt a próbakeverékre, és hagyja, hogy egyenletesen szétterüljön a fedılemez alatt. Kerülje el a légbuborékok képzıdését. Ha légbuborékokat észlel, akkor azokat csipesz használatával finoman távolítsa el a szövettıl. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

14 Zárja le a fedılemezt a Coverslip Sealant fedılemez-tömítéssel úgy, hogy az utóbbit a fedılemez szélei köré fecskendezi. A Coverslip Sealant tömítés nyúljon át a fedılemezre és a tárgylemezre is, így alakítva ki tömítıréteget a fedılemez körül. Gondoskodjon arról, hogy a Coverslip Sealant fedılemez-tömítés teljesen lefedje a fedılemez széleit. Készítse elı a Dako Hybridizer* készüléket (kód: S2450 vagy S2451) egy hibridizálási munkamenetre. Gyızıdjön meg róla, hogy a Humidity Control Strips páratartalom-ellenırzı csíkok (kód: S2452) telítettek és a lehetı legjobb állapotban vannak a használathoz. Indítsa el a Hybridizert és válasszon ki egy olyan programot, amely: 66 C-on 10 percig tartó denaturálást végez, melyet percig tartó hibridizálás követ 45 C hımérsékleten. Helyezze a tárgylemezeket a Hybridizerbe, ellenırizze, hogy megfelelıen le van-e zárva, majd indítsa el a programot. A részletekért lásd a Dako Hybridizer kezelési útmutatóját. * A fent leírt feltételekkel megegyezı körülményeket biztosító más készülék is használható a denaturálás és hibridizálás elvégzésére: Helyezze a tárgylemezeket egy 66 (±1) C-ra elımelegített lapos fém- vagy kıfelületre (főtıblokkra vagy a hibridizációs kemence egyik blokkjára). Végezzen denaturálást pontosan 10 percig. Helyezze a tárgylemezeket egy elımelegített, párásított hibridizációs kamrába. Fedje le a kamrát egy fedıvel, és végezzen inkubálást 45 (±2) C-on percig. 4. lépés: Stringent Wash mosópuffer Töltsön meg két festıedényt, pl. Coplin-tartályokat, hígított Stringent Wash Buffer mosópufferrel (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). Legalább 100 ml össztérfogat vagy tárgylemezenként 15 ml térfogat alkalmazása ajánlott mindkét edényben. Helyezze az egyik hígított Stringent Wash Buffer mosópuffert tartalmazó festıedényt szobahımérsékleten a vegyifülkébe, a másikat pedig egy vízfürdıbe. Főtse fel a vízfürdıt és a hígított, Stringent Wash Buffer mosópuffert 65 (±2) C-ra. Ellenırizze, hogy a hımérséklet stabilizálódott-e. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében kalibrált hımérıvel mérje meg a hımérsékletet a vízfürdı edényében. A Stringent Wash Buffer mosópuffer detergenst tartalmaz és 63 C hımérsékleten zavarossá válhat. Ez nem befolyásolja a teljesítményt. Csipesszel vagy kesztyőt viselve vegye ki a tárgylemezeket a hibridizációs kamrából és finoman távolítsa el a Coverslip Sealant fedılemez-tömítést, valamint a fedılemezt, majd egyesével helyezze a tárgylemezeket a szobahımérséklető elımosó edénybe. Amint eltávolította az összes fedılemezt, helyezze át a tárgylemezeket a szobahımérséklető elımosó edénybıl a vízfürdıben lévı, 63 (±2) C-os edénybe. A tárgylemeznek vízfürdıben lévı, 63 (±2) C -os, hígított Stringent Wash Buffer mosópufferbe való helyezését követıen az idızítıt azonnal el kell indítani. A magas stringenciájú mosást pontosan 10 percig végezze. Vegye ki a tárgylemezeket a Stringent Wash Buffer mosópufferbıl, és áztassa be ıket hígított Wash Buffer mosópufferbe 3 percre, szobahımérsékleten (20-25 C-on). Cserélje le a hígított Wash Buffer mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os, és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket teljesen megszáradni. 5. lépés: Rögzítés Vigyen fel 15 µl DAPI-t tartalmazó Fluorescence Mounting Medium fluoreszcens rögzítıszert (5. üveg) a tárgylemez célterületére, majd helyezzen fel egy üveg fedılemezt. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

15 MEGJEGYZÉS: A tárgylemezek a rögzítést követıen 15 perc elteltével, illetve 7 napon belül értékelhetık ki. A lemezek elhalványulhatnak, ha fény vagy magas hımérséklet éri ıket. Az elhalványulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, C-on tárolja. B.3.b. Festési protokoll formamid alapú hibridizációs pufferben hígított FISH próbákhoz 1. NAP 1. lépés: Elıkezelés (mikrohullámú sütı, vízfürdı, Pascal edény) Az elıkezelés vagy vízfürdı használatával, az A módszer szerint, vagy érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı használatával, a B módszernek megfelelıen, vagy Pascal túlnyomásos edényben történhet, a C módszer leírása szerint. A módszer: Elıkezelés vízfürdı használatával Töltse meg a festıedényeket hígított Pre-Treatment Solution oldattal (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.1 szakaszát). Helyezze a hígított Pre-Treatment Solution oldatot tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Főtse fel a vízfürdıt és a Pre-Treatment Solution oldatot C-ra. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében mérje meg kalibrált hımérı segítségével az edényben uralkodó hımérsékletet. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényeket (lyuk nélküli fedéllel). Merítse a paraffinmentesített metszeteket a Pre-Treatment Solution oldatba. Ellenırizze újra a hımérsékletet, zárja le a vízfürdı fedelét, és inkubálja 10 (±1) percig C.on. A tárgylemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Vegye le a fedelet (a tárgylemezeket még ne vegye ki). Hagyja a tárgylemezeket a Pre-Treatment Solution oldatban szobahımérsékleten lehőlni 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten. Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 2. lépéssel. B módszer: Elıkezelés érzékelıvel ellátott mikrohullámú sütı segítségével Töltsön meg egy edényt szobahımérséklető (20 25 C-os) Pre-Treatment Solution oldattal. Merítse a paraffinmentesített metszeteket az oldatba, és csukja le a fedelet. A fedél lyukacsosnak kell lennie, hogy a nyomás kiegyenlítıdhessen. Helyezze a metszeteket tartalmazó edényt a mikrohullámú sütıbe, és indítsa el a sütıt. Mielıtt elkezdené a minták felmelegítését, gyızıdjön meg arról, hogy az edény külseje és a mikrohullámú sütı belseje száraz. Inkubálja egészen a forrásponthoz közel esı (az alatti) hımérsékleten (legalább 95 C-on) 10 percig. Inkubálás után vegye le a fedelet (a tárgylemezeket még ne vegye ki). Hagyja a tárgylemezeket a Pre-Treatment Solution oldatban szobahımérsékleten (20 25 C) lehőlni 15 percen át. Gondoskodjon arról, hogy a metszeteket a teljes elıkezelési folyamat alatt ellepje a puffer. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten. Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 2. lépéssel. C módszer: Elıkezelés Pascal túlnyomásos fızıedénnyel Töltsön 500 ml ionmentesített vizet a Pascal edénybe. Töltsön meg egy mőanyag edényt 250 ml Pre-Treatment Solution elıkezelı oldattal. Merítse a paraffinmentesített metszeteket a Pre- Treatment Solution oldatba és helyezze a mőanyag edényt a Pascal edénybe. Inkubálja 121 C hımérsékleten 1 percig. Engedje ki a nyomást, miután a készülék lehőlt 90 C-ra. Tanulmányozza a Pascal Kézikönyvet a Pascal túlnyomásos fızıedény megfelelı kezelésével kapcsolatos információkért. Vegye ki az edényt, miután a készülék kiengedi a nyomást. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

16 Távolítsa el a fedeleket és hagyja a tárgylemezeket a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldatban szobahımérsékleten lehőlni további 15 percen át. Tegye át a tárgylemezeket hígított, Stringent Wash Buffer mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát). Áztassa a metszeteket 3 percig szobahımérsékleten. Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 2. lépéssel. MEGJEGYZÉS: A Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. Ne használjon tömített, légmentesen zárt edényt ha az elıkezelést mikrohullámú sütıben végzi, mivel az edényben megnı a nyomás és felrobbanhat vagy a felnyitáskor sérüléseket okozhat. Lehetıség van fém diatartó használatára a mikrohullámú sütıben, ha a fém tartó a teljes mikrohullámú kezelés alatt az elıkezelı oldatba merül. Egyébként NE használjon fémet a mikrohullámú sütıben. Kövesse a mikrohullámú sütı gyártójának utasításait. A 10 perces inkubáció során kerülje a Pre-Treatment Solution elıkezelı oldat folyamatos forralását. A megfelelı hımérsékleti körülmények biztosítása érdekében ellenırizze rendszeresen a hımérsékletet kalibrált hımérı segítségével. 2. lépés: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) pepszin vagy pepszinoldat A pepszines inkubálás történhet a tárgylemezekre RTU pepszin cseppentésével szobahımérsékleten (20-25 C) ( A módszer) vagy 37 C-on ( B módszer). Másik lehetıség a tárgylemezek pepszin oldatba merítése és 37 (±2) C hımérsékleten történı inkubálása ( C módszer). A és B módszer: Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert. Szöszmentes törlıvel (például abszorbens kendıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása érdekében, és hogy a reagensek a kívánt területen maradjanak. A minta teljes lefedéséhez 5 8 csepp (250 µl) hideg (2 8 C-os) Pepsin pepszint használjon (a 2A. üvegbıl). A Pepsin anyagot mindig 2-8 C hımérsékleten tárolja. A módszer: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás C-on Végezze az inkubálást 5-50 percen át szobahımérsékleten (20-25 C). A perces inkubálás szobahımérsékleten a legtöbb minta esetében elegendı, de az optimális inkubálási idıt a felhasználónak kell meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a megmaradt Pepsin anyagot, és áztassa be a metszeteket a hígított Wash Buffer mosópufferbe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20-25 C). Cserélje le a hígított Wash Buffer mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 3. lépéssel, a FISH próbával, vagy lásd a 2. függeléket az emésztési idı optimalizálásához (opcionális). B módszer: Pepsin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 37 C-on Helyezze a pepszines mintákat 37 C-on a Dako Hybridizerre vagy egy felfőtött főtıblokkra. Inkubálja 2 6 percig 37 C-on. Ez megfelelı lesz a legtöbb olyan minta esetében, amelyet A minta elıkészítése címő szakaszban leírtak szerint készítettek elı. Az optimális inkubálási idı függ a szövet típusától, a szövetfixálástól, a minta vastagságától, a minta érettségi fokától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ezek a tényezık megnövelhetik a szükséges emésztési idıt 7 15 percre vagy még ennél is többre. Az elsı használatkor meg kell határozni az optimális emésztési idıt egy reprezentatív szövetminta 1, 3, 6, 12 és 18 perces tesztelésével. Ütögetéssel távolítsa el a Pepsin anyagot, és áztassa be a metszeteket a hígított Wash Buffer mosópufferbe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perc idıtartamra, szobahımérsékleten (20-25 C). Cserélje le a hígított Wash Buffer mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 3. lépéssel, a FISH próbával, vagy lásd a 2. függeléket az emésztési idı optimalizálásához (opcionális). ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

17 C módszer: Pepsin oldat - A tárgylemezek 37 C-os pepszinoldatba merítése A készlet négy különálló vizsgálathoz (60 ml pepszinoldat, hat metszetet befogadó kisebb edényhez) vagy egyetlen vizsgálathoz (240 ml pepszinoldat, 24 metszetet befogadó nagyobb edényhez) elegendı reagenst tartalmaz. Készítse el a pepszinoldatot az A.5 szakaszban leírt módon. Fedje le az edényt, és vízfürdıbe helyezve vigye 37 (±2) C-ra a pepszinoldat hımérsékletét. Ellenırizze, hogy a hımérséklet stabilizálódott-e. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében kalibrált hımérıvel mérje meg az edényben uralkodó hımérsékletet. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges mosópuffert. Merítse a tárgylemezeket a 37 (±2) C-os pepszinoldatba, és végezzen perces inkubálást percig történı inkubálás a legtöbb minta esetében elegendı, de az optimális inkubálási idı függhet a korábbi szövetfixálástól és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított Wash Buffer mosópufferbe, szobahımérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a Wash Buffer mosópuffert és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a 3. lépéssel, a FISH próbával, vagy lásd a 2. függeléket az emésztési idı optimalizálásához (opcionális). MEGJEGYZÉS: Ajánlott követni A minta elıkészítése címő szakaszban leírt eljárást. Ha a szövet alulemésztett, elıfordulhat, hogy nem kapunk jeleket, vagy csak elmosódott jeleket kapunk, gyakran nagy mennyiségő zöld citoszol háttérrel. 3. lépés: FISH próba (a felhasználó biztosítja) MEGJEGYZÉS: Amennyiben a Dako Histology FISH Accessory Kit készlet (kód: K5799) reagenseit a K5731-es készletek reagenseivel együtt használják, akkor az adott (K5731-es) készlet terméktájékoztatóját kell követni. A következı lépést vegyifülkében kell elvégezni. A fluorokrómmal megjelölt próbákat károsan befolyásolhatja a túlzottan erıs fény. Ne végezze a vizsgálat hátralévı részét erıs fényben, például közvetlen napsütésben. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os, és 2 percen át 96%-os etanolban (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.4 szakaszát). Hagyja a szövetmetszeteket levegın teljesen megszáradni. Vigyen fel megfelelı mennyiségő, fluorokrómmal jelölt próbát, pl. 10 µl Dako FISH próbát a szövetmetszet közepére. Azonnal helyezzen fel egy 18 mm x 18 mm-es (vagy pl. 22 mm x 22 mm-es) üveg fedılemezt a próbára, és hagyja, hogy az egyenletesen szétterüljön a fedılemez alatt. Kerülje el a légbuborékok képzıdését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével, finom ütögetéssel távolítsa el azokat. Zárja le a fedılemezt a Coverslip Sealant tömítéssel úgy, hogy az utóbbit felviszi a fedılemez szélei mentén. A Coverslip Sealant tömítés nyúljon át a fedılemezre és a tárgylemezre is, így alakítva ki tömítıréteget a fedılemez körül. Ügyeljen arra, hogy a Coverslip Sealant tömítés teljesen eltömítse a fedılemez szélei körüli részeket. Helyezze a tárgylemezeket a Dako Hybridizerbe (kód: S2450/S2451), és állítsa be a denaturálást 82 C-ra 5 percre, a hibridizálást pedig 45 C-ra egy éjszakára (14 20 órára) a Dako FISH próbák használata esetében. Folytassa a 2. napon a 4. lépéssel, a magas stringenciájú mosóoldattal történı mosással. További utasításokért lásd a Hybridizer kézikönyvét. MEGJEGYZÉS: Alternatív megoldásként használhat főtıblokkot, hibridizációs kemencét, vagy hibridizációs kamrát, lásd lentebb. Helyezze a metszetet egy 82 (±2) C-ra felfőtött lapos fém- vagy kıfelületre (főtıblokkra vagy a hibridizációs kemence egyik blokkjára). Végezzen 5 perces denaturálást, ügyelve arra, hogy a blokk hımérséklete ne süllyedjen 80 C alá. Helyezze a tárgylemezeket egy elımelegített, párásított hibridizációs kamrába. Fedje le a kamrát a fedıvel, és inkubálja egy éjszakán (14 20 órán) át 45 (±2) C-on, Dako FISH próbák használata esetében. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

18 2. NAP 4. lépés: Stringent Wash mosópuffer Töltsön meg két festıedényt hígított, Stringent Wash Buffer mosópufferrel (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát). Legalább 100 ml Stringent Wash Buffer mosópuffer alkalmazása ajánlott 1 6 tárgylemezt tartalmazó edény esetében. Ha több mint 6 tárgylemez van az edényben, akkor lemezenként használjon legalább 15 ml puffert. Helyezze az egyik hígított Stringent Wash Buffer mosópuffert tartalmazó festıedényt szobahımérsékleten a vegyifülkébe, a másikat pedig egy vízfürdıbe. Főtse fel a vízfürdıt és a hígított, Stringent Wash Buffer mosópuffert 65 (±2) C-ra. Ellenırizze, hogy a hımérséklet stabilizálódott-e. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. A megfelelı hımérséklet biztosítása érdekében mérje meg kalibrált hımérı segítségével az edényben uralkodó hımérsékletet. Vegye ki a tárgylemezeket a hibridizációs kamrából. Csipesszel finoman távolítsa el a Coverslip Sealant tömítést, valamint a fedılemezt, majd helyezze át a tárgylemezt a szoba-hımérséklető elımosó edénybe. Amint eltávolította az összes fedılemezt, helyezze át a tárgylemezeket a szobahımérséklető elımosó edénybıl a vízfürdıben lévı, 65 (±2) C-os edénybe. Csukja le az edény fedelét, majd a vízfürdı fedelét is. A magas stringenciájú mosást pontosan 10 percig végezze 65 (±2) C-on. Vegye ki a tárgylemezeket a Stringent Wash Buffer mosópufferbıl, és áztassa be ıket hígított Wash Buffer mosópufferbe 3 percre, szobahımérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított Wash Buffer mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os, és 2 percen át 96%-os etanolban (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.4 szakaszát). Hagyja, hogy a tárgylemezek levegın teljesen megszáradjanak. 5. lépés: Rögzítés Vigyen fel 15 µl kék fluoreszcens kontrasztfestéket tartalmazó Fluorescence Mounting Medium rögzítıszert (5. üveg) a lemez célterületére, és helyezzen rá egy (pl. 24 mm x 50 mm-es vagy 24 mm x 60 mm-es) fedılemezt. Hagyja, hogy a rögzítıszer egyenletesen szétterüljön a mintán. MEGJEGYZÉS: A tárgylemezek a rögzítést követıen 15 perc elteltével, illetve 7 napon belül értékelhetık ki. A lemezek elhalványulhatnak, ha fény vagy magas hımérséklet éri ıket. A tárgylemezeket sötét helyen kell tárolni C-on. Minıség-ellenırzés 1. A jeleknek fényesnek, jól elkülönülınek és könnyen értékelhetınek kell lenniük. 2. Az assay munkamenet kontrolljaként ajánlott olyan normális szöveteket használni, amelyek elızıleg FISH well, vagyis megfelelı eredményt adtak a FISH vizsgálat során. 3. A normál sejteknek jól látható fluoreszcens jelet kell tartalmazniuk, ami arra utal, hogy a FISH próba sikeresen hibridizálódott a célrégiókkal. 4. Amennyiben a normál szövet sejtjeiben nem észlelhetı jeladás, akkor ez az assay hibájára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 5. A szövetek metszése miatt néhány normál sejt a várható jelszámnál kevesebbet fog tartalmazni. 6. A sejtmag-morfológiának épnek, a festıdésnek pedig egyenletesnek kell lennie, amikor az értékelést DAPI szőrıvel végzik. A túl sok szellemképes vagy fánk alakú sejt, és az általánosan rossz minıségő sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére vagy túlzott mértékő denaturálására utal, ami jelvesztéshez vagy jelfragmentálódáshoz vezet. A perifériás festıdés, a lyukacsos sejtek jelenléte (DAPI filter) és/vagy Texas Red/FITC kettıs szőrıvel megfigyelt erıteljes zöld citoszol háttérfestıdés elégtelen emésztettségre utalhat, ami jelvesztéshez vezethet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 7. Az egyes laboratóriumokban a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárások eltérése módosíthatja az eredményeket, ezért a Dako által biztosított kontrollminták mellett szükséges a rendszeres belsı kontrollok alkalmazása. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

19 Az eredmények értelmezése Pásztázzon végig több sejtterületet, hogy felmérje az esetleges heterogenitásokat. Válasszon ki egy olyan területet, amelyben jó a sejtmagok eloszlása. Kezdje az elemzést a kiválasztott terület bal felsı kvadránsában, majd balról jobbra pásztázva, az alábbi irányelveknek megfelelıen számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag határon belül esı jeleit. Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölıdését. A jeleket nem tartalmazó sejtmagokat ne értékelje. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá esı sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat is, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestıdésük pedig nem specifikus vagy túl erıs. A felhasználónak kell meghatároznia az egyes próbák esetében megszámlálandó sejtmagszámot. Kerülje azokat a területeket, amelyekben a sejtmag határvonalai nem egyértelmőek. Korlátozások 1. A pepszines emésztés optimális inkubációs ideje a szövet fixálásától és/vagy a minta vastagságától függ, melyeket a felhasználónak kell meghatározni és ellenırizni. 2. A FISH próba rendeltetésszerő használatára vonatkozóan lásd a FISH próbához mellékelt tájékoztató részét képezı megfelelı termékinformációt. 3. A FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) egy többlépcsıs folyamat, amely speciális szakképzettséget igényel a megfelelı reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, a FISH lemez elıkészítése és a festési eredmények értelmezése területén. 4. A FISH eredmények függnek a festést megelızı szövetkezeléstıl és -elıkészítéstıl. A nem megfelelı fixálás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Az inkonzisztens eredményeket a fixálási és beágyazási módszerek közötti eltérések, illetve a szövetek eredendı szabálytalanságai okozhatják. 5. A szövetmetszetekbıl teljesen el kell távolítani a paraffint az optimális és reprodukálható eredmények elérése érdekében. A paraffinmentesítést a festési eljárás elején kell elvégezni. (Lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ B.2 szakaszát). 6. Kizárólag hımérséklet-kalibrált vízfürdı, főtıblokk és hibridizációs kemence használható. Más típusú berendezés használata a próbakeverék bepárlódását okozhatja hibridizáció közben, és a felhasználó felelıs a használat validálásáért. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

20 Hibaelhárítás Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. Nincs jel vagy a jelek gyengék 1a. Nem megfelelı emésztési idı. 1a. Ügyeljen arra, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon. 1b. A készletet magas hımérséklethatásnak tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt. 1c. Nem megfelelıek az elıkezelés feltételei. 1d. Nem megfelelı denaturálási körülmények. 1e. Helytelen hibridizációs hımérséklet. Segíthet, ha 37 C-on hosszabb (pl perces vagy ennél is hosszabb) emésztési idıt alkalmaz. Lásd a B.3.a vagy a B.3.b szakasz 2. lépését, a Hibaelhárítás fejezet 4d, illetve 4e pontját, valamint a 2. függeléket. 1b. Ellenırizze a tárolási körülményeket. Gyızıdjön meg arról, hogy átvételkor volt még szárazjég a küldeményben. Gyızıdjön meg róla, hogy a 2A. és az 5. üveget legfeljebb 2 8 Con, illetve hogy az 5. üveget egyben sötét helyen tárolták. 1c. Ügyeljen arra, hogy az ajánlott elıkezelési hımérsékletet és idıt alkalmazza. Gondoskodjon az emésztési inkubációs idı szükség szerinti optimalizálásáról is, lásd a B.3.a vagy B.3.b szakasz 2. lépését. Annál erısebb jeleket fog kapni, minél közelebb áll az elıkezelési hımérséklet a forrásponthoz. Bizonyosodjon meg arról, hogy a Pepsin pepszint megfelelı hımérsékleten kezelik. Lásd a B.1 szakaszt. 1d. Ügyeljen arra, hogy az ajánlott denaturálási hımérsékletet és idıt alkalmazza. 1e. Végezze a hibridizálást 45 (±2) C-on Dako FISH próbák használata esetében. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

21 2. Jelmentes területek 1f. A próbapuffer párolgása a hibridizálás ideje alatt. 1g. A magas stringenciájú mosási feltételek nem megfelelıek. 1h. A mikroszkóp nem mőködik megfelelıen - nem megfelelı szőrıkészlet - nem megfelelı lámpa - a higanylámpa túl régi - kiégett szőrık - piszkos és/vagy megrepedt kollektorlencsék - nem megfelelı immerziós olaj 1f. Gondoskodjon megfelelı páratartalomról a hibridizációs kamrában. Használjon Dako Hybridizert (kód: S2450/S2451) és Hybridizer Humidity Control Strips páratartalomellenırzı csíkokat (S2452). Használjon Coverslip Sealant tömítést. Lásd a Hibaelhárítás 5a és 5b pontját. 1g. Bizonyosodjon meg arról, hogy a magas stringenciájú mosáshoz ajánlott mosási térfogatot, hımérsékletet és idıtartamot alkalmazták, továbbá, hogy a fedılemezeket eltávolították a magas stringenciájú mosás elvégzése elıtt. 1h. Ellenırizze a mikroszkópot, és bizonyosodjon meg arról, hogy az alkalmazott szőrök alkalmasak fluorokrómmal történı használatra, hogy nem használódtak el, illetve hogy a higanylámpa megfelelı, és nem használják hosszabb ideje, mint amennyi a várható élettartama (lásd az 1. függeléket). Használjon a fluoreszcenciához megfelelı immerziós olajat. Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkóp-beszállítójával. 1i. Elhalványult jelek. 1i. Kerülje a hosszadalmas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erıs fényexpozíciót. 2a. A próbatérfogat túl kicsi. 2a. Ellenırizze, hogy a próba térfogata elegendı-e a fedılemez alatti terület lefedéséhez. 2b. Légbuborékzárványok keletkeztek a próbakeverék alkalmazása vagy a rögzítés közben. 2b. Kerülje el a légbuborékok képzıdését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével, finom ütögetéssel távolítsa el azokat. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

22 2c. Elégtelen paraffinmentesítés. 2c. Ügyeljen arra, hogy a paraffint teljes mértékben eltávolítsa a metszetekrıl. Lásd a B.2 szakaszt. 3. Túl erıs háttérfestıdés 3a. Nem megfelelı emésztési idı. Az erıteljes zöld citoszol háttér elégtelen emésztettségre utalhat. 3b. A metszetek megszáradtak a B.3. lépésben 3c. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3d. A magas stringenciájú mosás hımérséklete túl alacsony. 3e. A hibridizált részt túl hosszasan tették ki erıs fénynek. 3f. A lejárt vagy nem megfelelı üveg tárgylemezek túlzott mértékő, csillagos ég típusú piros festıdést okozhatnak. 3g. A nem fluoreszcens immerziós olaj összekeveredett a Fluorescence Mounting Medium rögzítıszerrel. 3a. Ügyeljen arra, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon. Segíthet, ha 37 C-on hosszabb (7 15 perces) emésztési idıt alkalmaz. Lásd a B.3.a vagy a B.3.b szakasz 2. lépését, a Hibaelhárítás 4e pontját és a 2. függeléket. 3b. Kövesse az utasításokat, és vigyázzon, hogy a metszetek ne száradjanak meg, hacsak az utasítás nem írja ezt elı. 3c. Kövesse a B.2 szakaszban leírt paraffinmentesítési és rehidrálási eljárásokat 3d. Bizonyosodjon meg arról, hogy a magas stringenciájú mosáshoz ajánlott hımérsékletet alkalmazták. 3e. Kerülje a hosszadalmas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erıs fényexpozíciót. 3f. Használja az ajánlott tárgylemeztípusokat, és ellenırizze, hogy nem jártak-e le. Lásd a Paraffinba ágyazott metszetek szakaszt. 3g. Használjon üveg fedılemezeket a javasolt metszetrögzítési eljáráshoz. Lásd a B.3.a vagy a B.3.b szakasz 5. lépését. Ezzel megelızhetı az immerziós olaj összekeveredése a rögzítıszerrel, elkerülhetı az autofluoreszcencia, valamint a fedılemezek véletlenszerő eltávolítása a mikroszkóp objektívjével. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

23 4. Szegényes sejtmagmorfológia vagy gyenge sejtmagfestıdés 4a. A nem megfelelı elıkezelési körülmények az oldat homályosodását vagy zavarosodását eredményezhetik. 4a. Ügyeljen arra, hogy az ajánlott elıkezelési hımérsékletet és idıt alkalmazza. Lásd még a Hibaelhárítás 4b e pontjait. 4b. Az elıkezelés alatt történı forralás károsíthatja a morfológiát, és jelhiányhoz vezethet. 4b. Kerülje a forralást. Lásd a B.3 szakasz 1. lépését Lásd még a Hibaelhárítás 4d pontját. 4c. Nem megfelelı pepszinkezelés. 4c. Tartsa be az ajánlott pepszininkubációs idıket. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését, valamint a 2. függeléket. Lásd továbbá a Hibaelhárítás 1a, 1c, 3a, 4d és 4e pontjait. 4d. A túl hosszas pepszines kezelés feloldja a szövetet, ami jelhiányhoz vezet. A túlzott mértékő emésztés szellemképes sejtek vagy fánk alakú sejtmagok megjelenését eredményezheti, szegényes általános sejtmagi morfológia mellett. 4e. A túl rövid ideig tartópepszines kezelés jelhiányhoz vezethet. A szövetek elégtelen emésztése perifériás magfestıdéshez, lyukas magok (DAPI szőrı) megjelenéséhez, illetve fokozott zöld citoszol háttér (Texas Red/FITC kettıs szőrı) kialakulásához vezethet. Megjegyzendı, hogy az elégtelenül megemésztett szövet morfológiája tetszetıs a túlemésztett szövethez viszonyítva. 4f. A denaturálási hımérséklet túl magas. 4g. Helytelen hibridizálási körülmények. 4d. Rövidítse le a pepszininkubációs idıt. Lásd a B.3.a vagy a B.3.b szakasz 2. lépését, valamint a 2. függeléket. Ügyeljen arra, hogy a metszet vastagsága 2 6 µm legyen. Lásd továbbá a Hibaelhárítás 1a, 1c, 4b és 4e pontjait. 4e. Alkalmazzon hosszabb pepszininkubációs idıt, pl. az alkalmazott emésztési idı 2 3-szorosát. Lásd még a Hibaelhárítás 1a, 1c, 3a, 4a és 4d pontjait. 4f. Bizonyosodjon meg arról, hogy az ajánlott denaturálási hımérsékletet alkalmazták. 4g. Lásd a Hibaelhárítás 1f és 5b pontját. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

24 5. Hibridizálás után a fedılemezek erısen hozzátapadnak az üveglemezhez, és ezért nehezen távolíthatók el. 6. Nagyfokú zöld autofluoreszcencia a tárgylemezen az FFPE szövet nélküli területeket is beleértve 5a. A fedılemezeket nem tömítették megfelelıen. 5b. Helytelen hibridizálási körülmények. Jelhiányhoz vagy kevés jel megjelenéséhez, szöveti károsodáshoz és háttérfestıdéshez vezethet. 6. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata 5a. Ne erıltesse a fedılemez eltávolítását, ha az túl erısen tapad az üveg tárgylemezhez. Merítse a tárgylemezt öt percre hígított, Stringent Wash Buffer mosópufferbe szobahımérsékleten, majd távolítsa el a fedılemezt. Kövesse a B.3a vagy B.3.b szakasz 3. lépésében leírt Coverslip Sealant tömítéssel kapcsolatos ajánlásokat. Lásd még a Hibaelhárítás 1f és 5b pontját. 5b. Gondoskodjon megfelelı páratartalomról a hibridizációs kamrában. Használjon Dako Hybridizer (kód: S2450/S2451) és Hybridizer Humidity Control Strips páratartalomellenırzı csíkokat (kód: S2452). Kövesse a Hybridizer Humidity Control Strips ellenırzıcsíkok dobozán található terméktájékoztatót. Lásd a B.3.a vagy B.3.b szakasz 3. lépésében ajánlott hibridizálási körülményeket. Lásd még a Hibaelhárítás 1f és 5a pontját. 6. Bizonyosodjon meg arról, hogy a bevonatos üveglemez (Dako Silanized Slides, kód: S3003, vagy poli-l-lizinnel bevont tárgylemezek) még nem járt le. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Mőszaki Szolgálatát. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

25 1. függelék Histology FISH Accessory Kit, kód: K5799 A fluoreszcencia mikroszkóp mőszaki leírása A Dako a következı eszközök használatát javasolja a Histology FISH Accessory Kit készlettel Dako FISH próbák használata esetében: 1. Mikroszkóp típusa Epifluoreszcencia mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (ezt általában minden 200. munkaóra után cserélni kell). 3. Objektívek A szövetek szőrıvizsgálatához 10-szeres nagyítású száraz fluoreszcenciás vagy 16-szoros nagyítású olajimmerziós fluoreszcenciás objektívek használhatók. A nagy erejő nagyításhoz és a jelek számlálásához kizárólag az olajimmerziós (pl. 63-szoros vagy 100-szoros nagyítású) fluoreszcencia objektívek használata ajánlott. 4. Szőrık A szőrıket egyénileg alakították ki a különbözı fluorokrómokhoz, így ezeket ennek megfelelıen kell kiválasztani. Dako FISH próbák használata esetén a Dako speciális DAPI szőrı használatát ajánlja, magas minıségő Texas Red/FITC kettıs szőrıvel kombinálva. DAPI szőrı, Omega Optical XF06-os számú szőrı vagy as számú Chroma szőrı. Texas Red/FITC kettıs szőrı, pl. Omega Optical XF53-as számú szőrı vagy os számú Chroma szőrı. Texas Red és FITC monoszőrıket az eredmények megerısítéséhez lehet használni, pl. Omega Optical XF102-2-es számú szőrıt az elıbbivel, illetve XF202-es számút az utóbbival. Fluorokróm Gerjesztı hullámhossz Kibocsátási hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Az egyes mikroszkóptípusokhoz különbözı szőrık tartoznak, és a megfelelı szőrık használata kulcsfontosságú az értékelés szempontjából. További részletes információkat a mikroszkóp gyártójától vagy a Dako képviselıtıl kérhet, illetve megtalálhatja ezeket a Dako honlapján. 5. Olaj Nem fluoreszkáló immerziós olaj. Óvintézkedések A speciális fluorokrómok eltérı felszerelést igényelnek. A Dako FISH próbák esetébe az 50 wattos higanylámpa használata nem ajánlott, rodamin szőrık nem használhatók, a hármas szőrık pedig általában nem ajánlottak. Problémákat okozhat a fluoreszcens jelek értékelésekor, ha a mikroszkóp kialakítása nem optimális. Fontos, hogy a fényforrás ne legyen lejárva, valamint hogy az igazítása és fókuszálása megfelelı legyen. A vevıknek ellenırizniük kell a higanylámpát, és követniük kell a gyártó lámpára vonatkozó utasításait, továbbá el kell végezniük a mikroszkóp karbantartását. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehetı legkisebb mértékben tegyék ki a gerjesztı hullámhossz hatásának, hogy a fluoreszcencia elhalványulása minimális legyen. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

26 Javasoljuk, hogy a fluoreszcencia in situ hibridizálás megkezdése elıtt egyeztesse az adott mikroszkóp beállítását a gyártóval, vagy tanulmányozza a vonatkozó szakirodalmat. 2. függelék Opcionális lépés a Pepsin pepszines emésztési idı optimalizálásához Ez az opcionális lépés a Pepsin pepszines emésztés hatásának felmérésére, valamint a 2. lépés, Pepsin során használandó emésztési idı optimalizálására használható. Annak ellenırzésére, hogy elég hosszú-e a használt Pepsin pepszines emésztési idı, fesse meg a megmosott, Pepsin pepszines emésztésen átesett szövetmetszetet a felhasználó által biztosított 10 µl propidium-jodiddal (400 ng/ml). Helyezzen fel egy 22 mm x 22 mm-es üveg fedılemezt a propidium-jodidra, és hagyja, hogy az egyenletesen szétterüljön a fedılemez alatt. Inkubálja 1 percig. Használjon Texas Red/FITC kettıs szőrıvel ellátott (lásd 1. függelék) fluoreszcencia mikroszkópot a sejtmagok propidium-jodidos piros festıdésének kiértékeléséhez. Ha a szövetemésztés elfogadható mértékő, akkor élesen körülrajzolódó kerülető vörös sejtmagokat kell látnia. Távolítsa el a propidium-jodidot a metszetek hígított mosóoldatban kétszer 3 percig szobahımérsékleten (20 25 C-on) történı áztatásával, majd folytassa a B3. szakasz Festési protokoll, 3. lépés, FISH próba lépéssel. Ha a sejtmagok továbbra is zöldek maradnak az autofluoreszcencia következtében, és nem festıdnek meg pirosra a propidium-jodiddal, akkor meg kell ismételni az emésztési ciklust. Merítse a metszeteket hígított mosóoldatba kétszer 3 percre szobahımérsékleten (20 25 C-on), hogy eltávolítsa a propidium-jodidot. Fedje le a mintát 5-8 csepp (250 µl) hideg (2-8 C) Pepsin pepszinnel (2. üveg). A Pepsin pepszint minden esetben 2 8 C-os hımérsékleten tárolja. Helyezze a tárgylemezeket 37 C-on a Dako Hybridizerre vagy egy felfőtött főtıblokkra. Inkubálja 10 percig, ha az emésztés elmaradt, vagy csak kis mértékben következett be. A 10 perc csupán irányérték; a felhasználónak kell meghatároznia az optimális idıt. Merítse ismét a metszeteket hígított Wash Buffer mosóoldatba kétszer 3 percre szobahımérsékleten (20 25 C-on), hogy eltávolítsa a pepszint. Vigyen fel ismét 10 µl propidium-jodidot (400 ng/ml) 1 percre. Értékelje a festıdést, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított Wash Buffer mosópufferbe, szobahımérsékleten (20 25 C-on). Szükség esetén ismételje meg a ciklust, vagy folytassa a B.3.a vagy a B.3.b szakasz Festési protokoll, 3. lépés, FISH próba lépéssel. MEGJEGYZÉS: A készlet 20 vizsgálatra elegendı reagenst tartalmaz. A Wash Buffer mosópuffer és Pepsin használata ebben az opcionális lépésben csökkenteni fogja a készlettel elvégezhetı vizsgálatok számát. ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

27 Irodalomjegyzék 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; ( ) P04094HU_02_K / /28 o.

28 Szimbólumok magyarázata Ka ta lógus-/kódszám Hõ mérsékleti korlátozások Kötegkód In vitro orvo sdiagnosztikai eszköz Nézzen utánaa Használati Utasítá sban Na pfén ytıl védett helyen tárolja (lásd a Tárolással foglalkozó részt) Tartalma <N> szá mú teszthez elegendõ Lejárati idõ Gyártó GHS piktogra m (lá sd az óvintézke dések címő részt) GHS piktogram (lá sd az ó vintézkedése k címő részt) GH S piktogram (lásd az óvintézkedése k címő részt) GHS piktogra m (lá sd az óvintézke dések címő részt) GHS piktogram (lá sd az ó vintézkedése k címő részt) Gyártó: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel.: DK-2600 Glostrup Fax: Dánia ( ) P04094HU_02_K / /28 o.