TOP2A IQFISH pharmdx. 3. kiadás. In vitro diagnosztikai használatra A készlet 20 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz.

Átírás

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Kód: K kiadás In vitro diagnosztikai használatra A készlet 20 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. P04092HU_02/K o. 1/39.

2 Tartalom Javasolt alkalmazás... 3 Összegzés és magyarázat... 3 Az eljárás elve... 4 Oldal Reagensek... 4 Mellékelt anyagok... 4 Szükséges, de nem biztosított anyagok... 6 Óvintézkedések... 6 Tárolás... 9 A minta előkészítése Paraffinba ágyazott metszetek HASZNÁLATI UTASÍTÁS A. A reagensek előkészítése A.1 Előkezelő oldat A.2 Magas stringenciájú mosópuffer A.3 Mosópuffer A.4 Etanolsorozatok A.5 Pepszinoldat B. A festési eljárás B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések B.2 A szövetek kezelése festés előtt B.3 Festési protokoll Minőség-ellenőrzés A festődés értelmezése Korlátozások Általános korlátozások Teljesítményjellemzők Analitikai érzékenység Analitikai specificitás A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok Megismételhetőség Reprodukálhatóság Klinikai alkalmazhatóság Próbavizsgálat (pilot study) Megerősítő jellegű vizsgálat DBCG 89D/TOP2A A vizsgálat célja Statisztikai módszertan Eredmények Megbeszélés és következtetések Hibaelhárítás függelék függelék függelék Irodalomjegyzék Jelmagyarázat P04092HU_02/K o. 2/39.

3 Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A TOP2A IQFISH pharmdx a TOP2A gén amplifikációinak és delécióinak (mennyiségi változások a génmásolatban) kimutatására szolgál, fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) technika alkalmazásával, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott humán emlőrák-szövetmintákon. A TOP2A gén deléciós és amplifikációs eltérései a kedvezőtlen prognózis markerei magas rizikójú emlőrákos betegeknél. ATOP2A génamplifikáció TOP2A IQFISH pharmdx teszttel történő kimutatása ezenkívül segítséget nyújt az epirubicin alapú adjuváns kemoterápiával kezelt magas rizikójú emlőrákos betegek recidívamentes túlélési idejének előrejelzésében. A TOP2A IQFISH pharmdx assay révén nyert eredmények a meglévő klinikai és patológiai információk kiegészítésére szolgálnak. Összegzés és magyarázat A TOP2A gén a topoizomeráz IIα (topo IIα) nevű enzimet kódolja, amely a kettős szálú DNS spirálok szétbontását és újraegyesítését katalizálja, ami a DNS szuperspirálok ( supercoil -ok) feloldásához vezet. A II-es típusú topoizomerázok létfontosságú enzimek, amelyek a különféle topológiájú DNS-formák közötti konverziót segítik elő azáltal, hogy átmeneti kettős szálú spirálokat alakítanak ki a DNS-láncban (1). Ezek az enzimek fontos szerepet játszanak számos alapvető sejtmagi folyamatban (2), ideértve a DNS replikációt, transzkripciót, kromoszóma struktúrát, kondenzációt és szegregációt (3). A topoizomeráz IIα gén, a TOP2A 2 példányban van jelen az összes normál diploid sejtben a 17q21-es kromoszómán (4). A TOP2A gén egy kb. 27,5 kb-os területet foglal el, és egy 170 kda-os fehérjét kódoló 35 exont tartalmaz (5). Felismerték, hogy a topo IIα fehérje proliferációs markerként működik, és a topo IIα expressziója változik a sejtciklus folyamán a normál és a rákos sejtekben egyaránt (6). A topo IIα expressziója az emlődaganatokban összefüggésben áll a Ki-67- expresszióval (7-10). Fehérje és gén szinten nem mutattak ki semmilyen egyértelmű kapcsolatot a topo IIα esetében (7, 9, 10). A topo IIα fehérje fokozott expresszióját mutató esetek csupán 20%-ánál van jelen TOP2A génamplifikáció, azonban a TOP2A génamplifikációs esetek 93%-ában a topo IIα fehérje túlzott mértékben expresszálódik (11). Úgy tűnik, hogy a topo IIα fokozott expressziójához több tényező is hozzájárul, többek között a rákspecifikus amplifikáció és a magas sejtproliferációs arány. A Ki-67 és a topo IIα fehérjék párhuzamosan expresszálódnak, ami a sejtproliferációs aránynak a topo IIα expressziót befolyásoló hatása igazolásaként értelmezhető, még a TOP2A amplifikációs esetekben is (12). A II-es típusú topoizomerázok a doxorubicinhez és epirubicinhez hasonló antraciklinek célpontjai, így ezeket topoizomeráz-gátlóknak is nevezik (13-15). A HER2 státusz, mint az antraciklinekkel szembeni reakció prediktív markere vitatott, és megállapították, hogy ennek az összefüggésnek nem bizonyítható a biológiai alapja. Mi több, az is felmerült, hogy a HER2-re inkább a valódi antraciklin célpont, vagyis a topoizomeráz II pót- vagy pszeudomarkereként kell tekinteni (16-18). Kimutatták, hogy a TOP2A másolatok száma befolyásolja a daganatok topoizomerázokkal szembeni érzékenységét (16-28). A Dako TOP2A FISH pharmdx készlet klinikai eredményességét a koppenhágai Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) által végzett két vizsgálatban tanulmányozták (21, 29, 30). A legutóbbi vizsgálatban (21, 30) az emlőrákok mintegy 10%-ában számolnak be TOP2A génamplifikációról és azonos gyakoriságú delécióról, amikor a HER2-pozitív és -negatív tumorokat egyaránt bevették a vizsgálatokba. Kezdetben azt feltételezték, hogy az amplifikáció vagy deléció eredményeként kialakuló rendellenes TOP2A génmásolatszám csak a HER2- P04092HU_02/K o. 3/39.

4 amplifikált tumorokra jellemző (16, 31). Az utóbbi időben a TOP2A génmásolatok mennyiségi változásait normális HER2 génstátusszal rendelkező tumormintákban is kimutatták (21, 23, 29, 30, 32, 33). A DBCG vizsgálatban a TOP2A változásokat a HER2 amplifikált elsődleges emlőtumorok mintegy 60%-ában kimutatták, ugyanakkor a rendellenes TOP2A státuszú tumorok 20%-ának normális volt a HER2 státusza (21, 23, 29, 30, 32). A vizsgálat eredményeit egy kanadai klinikai vizsgálat is alátámasztotta, és kimutatták azt is, hogy a TOP2A génstátusz (amplifikáció vagy deléció) jelentős prediktív tényező az epirubicin alapú kemoterápiából származó előnyök tekintetében (23). Ebben a vizsgálatban a betegek mintegy 35%-ának HER2 amplifikált daganata volt, és statisztikailag szignifikáns összefüggést találtak a HER2 státusz és a TOP2A aberrációk között (23, 34). A TOP2A génaberrációkra vonatkozó klinikai vizsgálatok többsége megegyezett a TOP2A teszt prediktív értéke tekintetében (21-25, 30), miközben a HER2 tesztekkel kapcsolatos eredmények ellentmondásosabbak voltak (35). Habár a HER2 és a TOP2A gén egyazon amplikonban helyezkedik el, és egyes vizsgálatok a gének koamplifikációjára fókuszáltak (22, 24, 25), a DBCG 89D és más vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy ezekre a génekre inkább egymástól függetlenül kell tekinteni, és így is kell tesztelni őket (10, 20, 21, 26-30). Az eljárás elve A TOP2A IQFISH pharmdx készlet a rutinszerűen feldolgozott formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek FISH vizsgálatához szükséges valamennyi fontos reagenst tartalmazza. Paraffinmentesítés és rehidrálás után a mintákat előkezelő oldatban melegítik, amit a pepszin felhasználásával végzett proteolitikus emésztés követ. A melegítési és proteolitikus előkezelési lépéseket ebben a készletben egy PNS (polinukleinsav) (36) és DNS technológia kombinációján alapuló, nem toxikus, azonnal felhasználható FISH próbakeverék alkalmazása követi. Ez a próbakeverék egyrészt Texas Red festékkel megjelölt, a TOP2A amplikon összesen 228 kb-át képviselő DNS kozmid klónok keverékéből áll, másrészt a 17-es kromoszóma centromer régiójára irányuló, fluoreszceinnel megjelölt PNS próbák keverékéből. A két célszekvencia specifikus hibridizációja világosan látható piros színű fluoreszcens jelet eredményez minden egyes TOP2A amplikonján, és ugyancsak jól látható, de zöld színű fluoreszcens jelet valamennyi 17-es kromoszóma centromer régióján. Alapos (magas stringenciájú oldattal történő) mosást követően a mintákat DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol) tartalmú fluoreszcens rögzítőszerrel rögzítik, majd fedőlemezzel látják el. Az eredményeket megfelelő szűrőkkel ellátott fluoreszcencia mikroszkóp segítségével értelmezik (lásd a 3. függeléket). Lokalizálásuk után a ráksejteket a TOP2A/CEN-17 jelarány tekintetében vizsgálják meg. Az elemzett szövetmetszetben lévő normál sejtek az előkezelés és a hibridizáció hatékonyságának belső pozitív kontrolljaként szolgálnak. A részleteket illetően lásd A festődés értelmezése című szakaszt. A TOP2A IQFISH pharmdx készlet (kód: K5733) kézi festéshez használható. Reagensek Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 20 vizsgálathoz elegendőek (egy vizsgálat egy darab, 22 x 22 mm-es célterület feldolgozását jelenti). Az elvégezhető vizsgálatok számát a következő mennyiségek alapján számítottuk: lemezenként 250 µl (5 8 csepp) a 2.A üvegből, 10 µl a 3. üvegből és 15 µl az 5. üvegből. A 3. és 5. üvegben lévő oldatok viszkózus állagúak, ezért előfordulhat, hogy ezeket rövid ideig centrifugálni kell egy mikrocentrifugában, a biztosított reagens teljes felhasználása érdekében. A készlet 10 különálló festési folyamathoz elegendő anyagot tartalmaz (a pepszinimmerziós módszer alkalmazásakor ez a mennyiség csak négy különálló festési folyamathoz elegendő). P04092HU_02/K o. 4/39.

5 A TOP2A IQFISH pharmdx készletet szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a készlet komponensei nem voltak kitéve szállítás közben magas hőmérsékleti hatásnak. Előfordulhat, hogy a készlet egyes összetevői nem fagynak meg. Ez nem fogja befolyásolni a TOP2A IQFISH pharmdx készlet teljesítményét. 1. üveg 2A. üveg Előkezelő oldat (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú MES (2-[N-morfolino]-etánszulfonsav) puffer. Pepszin 4 x 6,0 ml, azonnal felhasználható Pepszinoldat, ph 2,0; stabilizátort és antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. 2B. üveg 3. üveg 4. üveg 5. üveg 6. üveg Pepszinhígító (10x) 24 ml, 10-szeres koncentrációjú Hígítópuffer, ph 2,0; antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék 0,2 ml, azonnal felhasználható Texas Red festékkel megjelölt TOP2A DNS próbák és fluoreszceinnel megjelölt CEN-17 PNS próbák keveréke; IQISH hibridizációs pufferben kerül kiszállításra. Magas stringenciájú mosópuffer (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú SSC (konyhasós nátrium-citrát) puffer, detergenssel (Tween20). Fluoreszcens rögzítőszer 0,4 ml, azonnal felhasználható Fluoreszcens rögzítőszer, amely 500 µg/l DAPI-t (4-6-diamidino-2-fenilindolt) tartalmaz. Mosópuffer (20x) 500 ml, 20-szoros koncentrációjú Tris/HCl puffer. Fedőlemez-tömítés 1 cső, azonnal felhasználható Oldat a fedőlemezek eltávolítható tömítéseihez. MEGJEGYZÉS: A készlet következő reagensei felcserélhetők a K5799 kódszámú Dako Histology FISH Accessory kit megfelelő reagenseivel: előkezelő oldat (20x), pepszin, pepszinhígító (10x), magas stringenciájú mosópuffer (20x), fluoreszcens rögzítőszer, mosópuffer (20x) és fedőlemez-tömítés. P04092HU_02/K o. 5/39.

6 Szükséges, de nem biztosított anyagok Laboratóriumi reagensek Desztillált vagy ionmentesített víz Etanol, 96%-os Xilol vagy xilolszubsztituensek Laboratóriumi eszközök Abszorbens kendők Szabályozható pipetták Kalibrált merülő hőmérő (mérési tartomány: C) Kalibrált felületi hőmérő (mérési tartomány: C) Fedőlemezek (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (kód: S2450/S2451)* Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence* Hibridizáló párakamra* Csipeszek Vegyifülke Mikrocentrifuga tárgylemezek, Dako Silanized Slides tárgyelemezek (kód: S3003), vagy poli-llizin bevonatú tárgylemezek (lásd A minta előkészítése című szakaszt) Festőedények vagy fürdők Időzítő (amely alkalmas 2 15 perces időközök mérésére) Vortex keverő Vízfürdő fedéllel (a hőmérsékletet 37(±2) C-on, 63 (±2) C-on, valamint 95 C és 99 C között képes megtartani) Érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő, amennyiben az előkezelést mikrohullámú sütővel végzik (lásd B3. Festési protokoll. 1. lépés: Előkezelés, B módszer) * Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence denaturálás (66 (±1) C-on) és hibridizálás (45 (±2) C-on) céljára, amely párakamrával kombinálva használható. Mikroszkóp és tartozékai Szűrők fluoreszcencia mikroszkóphoz: DAPI és FITC/Texas Red kettős szűrő, vagy FITC és Texas Red monoszűrő további részletekért lásd a 3. Függeléket. Fényforrásként 100 wattos higanylámpát használó fluoreszcencia mikroszkópot kell használni. Más fényforrások nem javasoltak ezekkel a szűrőkkel való használatra. Mikroszkópos tárgylemeztartó (kartontálca 20 tárgylemezhez, felnyitható tetővel, vagy más hasonló doboz). Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai alkalmazáshoz. 2. Foglalkozásszerű felhasználóknak üveg, előkezelő oldat (20x), nem kell figyelmeztető felirattal ellátni. Foglalkozásszerű felhasználóknak kérésre anyagbiztonsági adatlapot (Safety Data Sheet, SDS) adunk. 4. 2A. üveg, pepszin, a következőket tartalmazza: 5-<10% propán-2-ol, 0.1-<0.3% pepszin A, <0.1% 5-klór-2-metil-4-izothiazolin-3-egy, 2-metil-2H-izothiazol-3-egy. A 2a. üveg felirata: P04092HU_02/K o. 6/39.

7 Veszély H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Súlyos égési sérüléseket és szemkárosodást okoz. Allergiás bőrreakciót okozhat. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. Védőruha használata kötelező. BELÉGZÉS ESETÉN: Vigye ki az illetőt a friss levegőre, és biztosítsa a kényelmes légzést. Azonnal hívja fel a TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTOT vagy orvosát. LENYELÉS ESETÉN: azonnal hívja fel a TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTOT vagy orvosát. TILOS hánytatni. HA BŐRREL ÉRINTKEZIK (vagy hajjal): Vegye le azonnal a szennyezett ruhát. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozással. Azonnal hívja fel a TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTOT vagy orvosát. SZEMBER KERÜLÉS ESETÉN: azonnal hívja fel a TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTOT vagy orvosát. Elzárva tárolandó. A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 5. V2B. üveg, pepszinhígító (10x), a következőket tartalmazza: 50-<75% propán-2-ol, 5- <10% 2-amino-2-(hidroximetil) propán-1,3-diol hidroklorid. A 2B. üveg felirata: Veszély H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és pára. Súlyos szemirritációt okoz. Álmosságot vagy szédülést okozhat. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/világító/.../berendezés használandó. BELÉGZÉS ESETÉN: Vigye ki az illetőt a friss levegőre, és biztosítsa a kényelmes légzést. HA BŐRREL ÉRINTKEZIK (vagy hajjal): Vegye le azonnal a szennyezett ruhát. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozással. Hűvös helyen tartandó. A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni üveg, HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék, a következőket tartalmazza: 10-<25% etilén-karbonát, 3-<5% nátrium-klorid. A 3. üveg felirata: H319 P280 P264 Figyelmeztetés Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P04092HU_02/K o. 7/39.

8 P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása üveg, magas stringenciájú mosópuffer (20x), a következőket tartalmazza: 10-<25% nátrium-klorid, 10-<20% 2-amino-2-(hidroximetil) propán-1,3-diol hidroklorid. A 4. üveg felirata: Figyelmeztetés H319 Súlyos szemirritációt okoz. H315 Bőrirritációt okoz. P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P264 A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása üveg, mosópuffer (20x), a következőket tartalmazza: 10-<25% nátrium-klorid, 10- <20% trometamol. A 6. üveg felirata: Figyelmeztetés H319 Súlyos szemirritációt okoz. H315 Bőrirritációt okoz P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P264 A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 9. A fedőlemez-tömítés 100% arányban hidrogénezett könnyűbenzint (petróleumot) tartalmaz, és következő felirattal látták el: Veszély H225 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és pára. H304 Lenyelve és a légutakba kerülve halálos lehet. H411 Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P210 Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. P241 Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/világító/.../berendezés használandó. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P301 + P310 + P331 LENYELÉS ESETÉN: azonnal hívja fel a TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTOT vagy orvosát. TILOS hánytatni. P303 + P361 + P353 HA BŐRREL ÉRINTKEZIK (vagy hajjal): Vegye le azonnal a szennyezett ruhát. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozással. P235 Hűvös helyen tartandó. P04092HU_02/K o. 8/39.

9 P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 10. A fixálás előtt és után lévő mintákat, valamint az összes velük érintkező anyagot potenciális fertőzéshordozóként kell kezelni, és ennek megfelelően kell ártalmatlanítani. (37) A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bőrrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bő vízzel. 11. A téves eredmények elkerülése érdekében gondoskodjon arról, hogy a reagensek mikrobiológiai szennyeződése a lehető legkisebb mértékű legyen. 12. A megadottól eltérő inkubációs idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 13. A megadottól eltérő szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. 14. A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás közbeni párolgásának elkerülése érdekében gondoskodjon a hibridizációs kamra megfelelő páratartalmáról. 15. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 16. Megfelelő személyi védőfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bőrre. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 17. A pepszin bemerítéses módszer alkalmazásához csak tiszta festőedény használható (2. lépés, C módszer). Tárolás A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék (3. üveg) -18 C-on, sötét helyen tárolandó. Az összes többi reagenst 2 8 C-on, sötét helyen lehet tárolni. Az összes reagenst lehet fagyasztva tárolni. A reagensek legfeljebb 10 alkalommal történő lefagyasztása és felolvasztása nem befolyásolja a teljesítményüket. Az azonnal felhasználható pepszinre, a TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (2A., 3. és 5. üveg) káros hatással lehet a magas hőmérséklet. Ne hagyja ezeket az anyagokat szobahőmérsékleten. A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (3. és 5. üveg) káros hatással lehet a túlzottan erős fény. Ne tárolja ezeket a komponenseket, illetve ne végezzen vizsgálatot erős fényben, például közvetlen napsütésben. A csomagoláson feltüntetett lejárati időn túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a terméktájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak validálnia kell a reagensek teljesítményét (38). Nincsenek olyan jelek, amelyekből egyértelműen megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt fontos a vizsgált szövetmetszetben lévő normál sejtek kiértékelése is. Ha nem várt fluoreszcencia-mintázatot figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi eljárásokban rejlő eltérésekkel, és a TOP2A IQFISH pharmdx készlettel kapcsolatos problémára gyanakszik, forduljon azonnal a Dako Műszaki szolgálatához. P04092HU_02/K o. 9/39.

10 A minta előkészítése A biopsziás mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon FISH elemzésre. Minden minta esetében az immunhisztokémiai festési eljárásokhoz rutinszerűen használt szövetfeldolgozási módszereket kell alkalmazni (39). Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A biopsziából származó mintákat például, 3 4 mm-es szeletekre vágva órán keresztül kell fixálni semlegesre pufferelt formalinban. A szöveteket ezután etanol és xilol sorozathígítású oldatában dehidrálják, majd legfeljebb 60 C-os olvasztott paraffinnal itatják át. A megfelelően fixált és beágyazott szövetek hűvös helyen (15 25 C-on) korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és tárgylemezre helyezés előtt(39, 40). Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A szövetmintákból 4 6 µm vastagságú metszeteket kell készíteni. A TOP2A génaberráció elemzéséhez és a tumor jelenlétének ellenőrzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Ajánlott legalább 3 metszetből álló sorozatot készíteni, 1 hematoxillin-eozinnal festett (HE-festés) metszetet a tumorjelenlét ellenőrzésére, 1 metszetet a TOP2A génaberráció elemzéséhez, továbbá 1 metszetet biztonsági tartalékként. Ajánlott a szövetmetszeteket Dako Silanized Slides tárgylemezre (kód: S3003), SuperFrost Plus tárgylemezre, vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezre helyezni. A mintákat a metszetkészítés után 4 6 hónapon belül elemezni kell, amennyiben azokat szobahőmérsékleten (20 25 C) tárolják, illetve 2 éven belül 2 8 C-on történő tárolás esetében. P04092HU_02/K o. 10/39.

11 HASZNÁLATI UTASÍTÁS A. A reagensek előkészítése Érdemes a következő reagenseket a festés előtt előkészíteni: A.1 Előkezelő oldat Előfordulhat, hogy az 1. üvegben kristályok alakulnak ki, de ezek szobahőmérsékleten feloldódnak. A reagens elkészítése előtt győződjön meg arról, hogy nincsenek benne kristályok. Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget az 1. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú előkezelő oldatból) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.2 Magas stringenciájú mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 4. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú magas stringenciájú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.3 Mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 6. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.4 Etanolsorozatok 96%-os etanolból készítsen 3 külön edényben 70%-os, 85%-os, illetve 96%-os oldatot. Tárolja a lefedett edényeket szobahőmérsékleten vagy 2 8 C-on, és legfeljebb 200 tárgylemezhez használja az oldatokat. Öntse ki az oldatokat, ha zavarossá válnak. A.5 Pepszinoldat Pepszinoldatra csak a pepszinimmerziós módszer ( C módszer) alkalmazásakor van szükség. A pepszinoldatot a következőképpen készítse el: Egy hat metszetet befogadó edényhez készítsen 60 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 48 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Egy 24 metszetet befogadó edényhez készítsen 240 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 192 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) azonnal felhasználható (RTU) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. A megfelelő hőmérsékletre hozott pepszinoldatot 5 órán belül fel kell használni. P04092HU_02/K o. 11/39.

12 B. A festési eljárás B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések Használat előtt alaposan tanulmányozza át ezt az útmutatót, és alaposan ismerje meg az összes alkotóelemet (lásd Óvintézkedések). Használat előtt minden reagenst a meghatározott hőmérsékletre kell hozni az alábbiak szerint. 1. üveg, A hígított előkezelő oldatnak fel kell melegednie C-ra, ha az előkezeléshez vízfürdőt használnak (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, A módszer). Ha hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütőt használ az előkezeléshez (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, B módszer), a hígított előkezelő oldatnak el kell érnie a szobahőmérsékletet, C-ot. 2A. üveg, A pepszint 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés: A és B módszer), és folyamatosan fenn kell tartani ezt a hőmérsékletét. 2B. üveg: A 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés: C módszer). 3. üveg, a -18 C-on tárolttop2a/cen-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egyfázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-es fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tegye vissza a -18 C-os tárolóhelyére. 4.üveg, Használat előtt a hígított, magas stringenciájú mosópufferből egy adagot egy edényben szobahőmérsékletre kell hozni, egy másik edényben egy másik adagot pedig 63 (±2) C-ra. 5. üveg, A fluoreszcens rögzítőszer bármilyen 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. 6. üveg, A hígított mosópuffert szobahőmérsékletre kell hozni, C-ra. A fedőlemez-tömítés bármilyen, 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. Valamennyi lépést a megadott hőmérsékleten kell végrehajtani. Az eljárás részét képezi a szövetmetszetek többszöri dehidrálása majd szárítása. Mielőtt továbbhaladna a következő lépésre, győződjön meg arról, hogy a szövetmetszetek teljesen szárazak-e. A szövetmetszetek szárítását ne hagyja az eljárás egyéb lépéseinek idejére. Ha a festési eljárást meg kell szakítania, akkor paraffinmentesítést követően a tárgylemezeket tárolhatja a mosópufferben szobahőmérsékleten (20 25 C-on) legfeljebb 1 órán át anélkül, hogy ez az eredményeket befolyásolná. B.2 A szövetek kezelése festés előtt Paraffinmentesítés és rehidrálás: Az elemzés elvégzése előtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidrálni kell. Ügyeljen arra, hogy a paraffin teljes mértékben el legyen távolítva. A visszamaradó beágyazó anyag fokozott nem specifikus festődést eredményez. Ezt a lépést szobahőmérsékleten (20 25 C-on) végezze. 1. Helyezze a tárgylemezeket xilolfürdőbe, és inkubálja őket 5 (±1) percig. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 96%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 70%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a tárgylemezeket legalább 2 percre a hígított mosópufferbe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.3 P04092HU_02/K o. 12/39.

13 szakaszát). A B.3 szakasz Előkezelés című 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg a festési eljárást. A xilolos és alkoholos oldatokat legfeljebb 200 tárgylemez után cserélni kell. Xilolszubsztituensek használata megengedett. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagenseket és útmutatót optimális teljesítmény eléréséhez állították össze. A reagensek további hígítása vagy az inkubálási hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Az adott laboratóriumban alkalmazott eltérő szövetfeldolgozási módszerek és technikai eljárások érvénytelenné tehetik az assay eredményeit. B.3 Festési protokoll 1. lépés: Előkezelés Az előkezelés vagy az alább leírt A módszerrel, vízfürdő használatával, vagy másik lehetőségként érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használatával, az alább leírt B módszernek megfelelően történhet. A módszer: Vízfürdős előkezelés Töltse meg a festőedényeket hígított előkezelő oldattal (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.1 szakaszát). Helyezze a hígított előkezelő oldatot tartalmazó festőedényeket vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és az előkezelő oldatot C-ra. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. Merítse a szoba-hőmérsékletű, paraffinmentesített metszeteket a festőedényekben lévő előmelegített előkezelő oldatba. Ismételten ellenőrizze a hőmérsékletet, majd on végezze el az inkubálást 10 (±1) percen át. A tárgylemezekkel együtt vegye ki az egész edényt a vízfürdőből. Vegye le a fedelet, és hagyja a tárgylemezeket az előkezelő oldatban szobahőmérsékleten lehűlni 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakaszát), 3 perces időtartamra, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. B módszer: Előkezelés érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő segítségével Töltsön meg egy műanyag edényt szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) előkezelő oldattal. Merítse bele a paraffinmentesített metszeteket az előkezelő oldatba, fedje le az edényt egy lyukacsos fedéllel, és helyezze be a mikrohullámú sütőbe. Válassza ki a forrásérzékelő funkciót és egy olyan programot, amely a forrási hőmérséklet elérése után 10 percig működik*. A 10 perces inkubációt követően vegye ki a tárgylemezeket tartalmazó edényt a sütőből, vegye le a fedelét, és hűtse szobahőmérsékleten 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe, és áztassa őket 3 percig szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. * A hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használata azt jelenti, hogy a sütőn kell lennie egy olyan érzékelőnek, valamint olyan programoknak, amelyek először felmelegítik az előkezelő oldatot annak forráspontjára, majd ezt követően megtartják a szükséges előkezelési hőmérsékletet (95 ºC felett), miközben megtörténik az előre beállított idő visszaszámlálása (10 (±1) perc). Egyes, érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő modellek esetében előfordulhat, hogy nem lehetséges a visszaszámlálási idő szabadon történő beállítása. Ha az adott modellen kizárólag előre beállított programok vannak, akkor győződjön meg arról, hogy olyan programot választott ki, amely alkalmas a szükséges (95 C feletti) előkezelési hőmérséklet fenntartására legalább 10 (±1) percen át, és kézi vezérléssel leállítható a program 10 (±1) perc után. MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. 2. lépés: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) vagy pepszinoldat P04092HU_02/K o. 13/39.

14 A pepszininkubációt az azonnal felhasználható (RTU) pepszincseppeknek a metszetekre történő közvetlen alkalmazásával lehet elvégezni szobahőmérsékleten (20 25 C-on) ( A módszer), vagy 37 C-on ( B módszer). Egy másik lehetőség, ha a metszeteket pepszinoldatba merítjük, és 37 (±2) C-on inkubáljuk ( C módszer). A és B módszer: Ütögetéssel távolítsa el a pufferfelesleget. Szálmentes törlővel (például abszorbens kendővel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása, valamint a reagensek kijelölt területen belül tartása érdekében. A minta lefedéséhez helyezzen rá 5 8 csepp (250 µl) hideg (2 8 C-os) pepszint (a 2A. üvegből). A pepszint minden esetben 2 8 C-os hőmérsékleten tárolja. A módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás C-on Az inkubálást 5 15 percig végezze szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Az 5 15 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be 3 percre a metszeteket hígított mosópufferbe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.3 szakaszát), szobahőmérsékleten (20 25 Con). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. B módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 37 C-on Helyezze a pepszines mintát egy 37 C-os fűtőblokkba pl. a Dako Hybridizerbe és inkubálja 3 5 percen át. A 3 5 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. C módszer: Pepszinoldat A metszetek bemerítése 37 C-os pepszinoldatba A készlet négy különálló vizsgálathoz (60 ml pepszinoldat, hat metszetet befogadó kisebb edényhez) vagy egyetlen vizsgálathoz (240 ml pepszinoldat, 24 metszetet befogadó nagyobb edényhez) elegendő reagenst tartalmaz. Készítse el a pepszinoldatot az A.5 szakaszban leírt módon. Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. Ütögetéssel távolítsa el a mosópuffer-felesleget. Merítse a lemezeket a 37 (±2) C-os pepszinoldatba, és inkubálja őket percig. Az perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. P04092HU_02/K o. 14/39.

15 A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. 3. lépés: TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék A -18 C-on tárolt TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egyfázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-as fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tárolja -18 C-on. Vigyen fel 10 µl TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeveréket (3. üveg) a szövetmetszet közepére. Azonnal helyezzen fel egy 22 x 22 mm-es üveg fedőlemezt a próbakeverékre, és hagyja, hogy egyenletesen szétterüljön a fedőlemez alatt. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor azokat csipesz használatával finoman távolítsa el a szövettől. Ne felejtse el használat után azonnal visszatenni a 3. üveget -18 C-os tárolóhelyére. Zárja le a fedőlemezt a fedőlemez-tömítéssel úgy, hogy az utóbbit a fedőlemez szélei köré fecskendezi. A fedőlemez-tömítés nyúljon át a fedőlemezre és a tárgylemezre is, így alakítva ki tömítőréteget a fedőlemez körül. Ügyeljen arra, hogy a fedőlemez-tömítés teljesen lefedje a fedőlemez széleit. Készítse elő a Dako Hybridizer* készüléket (kód: S2450/S2451) a hibridizálási munkamenethez. Győződjön meg arról, hogy a Humidity Control Strips páratartalom-ellenőrző csíkok (kód: S2452) nedvesek, és a lehető legjobb állapotban vannak a használathoz. Indítsa el a Hybridizert és válasszon ki egy olyan programot, amely: 66 C-on és 10 percen át denaturálást, majd 45 C-on és percen át hibridizálást végez. Helyezze be a tárgylemezeket a Hybridizer készülékbe, ellenőrizze, hogy a fedelet megfelelően lezárta-e, majd indítsa el a programot. A részleteket lásd a Dako Hybridizer kezelési útmutatójában. *A fent leírt feltételekkel azonos körülményeket biztosító más készülék is használható a denaturálás és hibridizálás elvégzésére, pl. az alábbiakban leírt módon: Helyezze a metszeteket egy 66 (±1) C-ra felfűtött lapos fém- vagy kőfelületre (fűtőblokkra vagy a hibridizációs kemence egyik blokkjára). A denaturálást pontosan 10 percen át végezze. Helyezze a tárgylemezeket előre felmelegített hibridizációs párakamrába. Helyezze fel a kamra fedelét, és inkubálja 45 (±2) C-on percen át. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a 37 C-os hibridizációs hőmérséklet nem felel meg az ebben a készletben található próbákkal történő használathoz. 4. lépés: Magas stringenciájú mosás Töltsön meg két festőedényt hígított, magas stringenciájú mosópufferrel (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.2 szakaszát). Legalább 100 ml össztérfogat vagy tárgylemezenként 15 ml térfogat alkalmazása ajánlott mindkét edényben. Helyezze az egyik hígított, magas stringenciájú mosópuffert tartalmazó festőedényt szobahőmérsékleten a vegyifülkébe, a másikat pedig egy vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és a hígított, magas stringenciájú mosópuffert 63 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérővel mérje meg a hőmérsékletet a vízfürdő edényében. A magas stringenciájú mosópuffer detergenst tartalmaz, és 63 C-os hőmérsékleten zavarossá válhat. Ez nem befolyásolja a teljesítményt. Csipesszel vagy kesztyűt viselve vegye ki a tárgylemezeket a hibridizációs kamrából, finoman távolítsa el a fedőlemez-tömítést és a fedőlemezt, majd egyesével helyezze a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edénybe. A tárgylemezeket ne tegye bele a magas stringenciájú mosópufferbe, amíg el nem távolította a fedőlemezeket. Amint eltávolította az összes fedőlemezt, helyezze át a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edényből a 63 (±2) C-os vízfürdőben lévő edénybe. P04092HU_02/K o. 15/39.

16 Amint behelyezte a tárgylemezeket a 63 (±2) C-os edénybe, a vízfürdőbe, az időzítőt azonnal indítsa el. A magas stringenciájú mosást pontosan 10 percig végezze. Vegye ki a tárgylemezeket a magas stringenciájú mosópufferből, és áztassa be őket hígított mosópufferbe 3 percre, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket teljesen megszáradni. 5. lépés: Rögzítés Tegyen 15 µl DAPI tartalmú fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg) a tárgylemez célterületére, majd helyezzen rá egy üveg fedőlemezt. MEGJEGYZÉS: A lemezeket rögzítés után 15 perccel vagy 7 napon belül bármikor ki lehet értékelni. Mindemellett, a lemezek kifakulhatnak, ha fény vagy magas hőmérséklet éri őket. Az elhalványulás minimalizálása érdekében tárolja a tárgylemezeket sötét helyen, Con. P04092HU_02/K o. 16/39.

17 Minőség-ellenőrzés 1. A jeleknek világosnak, jól elkülönülőnek és könnyen értékelhetőnek kell lenniük. 2. A normál sejtek a festési folyamat belső kontrolljának lehetőségét biztosítják. A normál sejteken 1-2 jól látható zöld jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a CEN-17 PNS próba sikeresen hibridizálódott a 17. kromoszóma centromer régiójával. A normál sejteken 1-2 jól látható piros jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a TOP2A DNS próba sikeresen hibridizálódott a TOP2A célrégióval. A szövetek metszése miatt néhány normál sejt a várható 2 jelnél kevesebbet fog tartalmazni az egyes színekből. Előfordulhat, hogy a normális, osztódó sejtekben a normális 1-2 jelnél több van jelen egyegy színből. Amennyiben a normál sejtekben nem észlelhető jeladás, akkor ez az assay eljárás hibájára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 3. A sejtmag morfológiájának épnek kell lennie, amikor az értékelést DAPI szűrővel végzik. A túl sok szellemképes sejt és általánosan rossz minőségű sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére utal, ami jelvesztéshez vagy a jel fragmentálódásához vezet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 4. Az egyes laboratóriumok közötti eltérések a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásokban az eredmények változóak lehetnek, ami rendszeres belső kontrollok alkalmazását teszi szükségessé. A festődés értelmezése A kiértékelésre alkalmas szövet A vizsgálatot csak invazív karcinómás betegek mintáin szabad végezni. Ha egyazon mintában in situ és invazív karcinóma is megtalálható, akkor csak az invazív komponenst értékelje. Kerülje a nekrotikus területeket és azokat a részeket, ahol a sejtmag határvonalai nem egyértelműek. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá eső sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat is, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestődésük pedig nem specifikus vagy túl erős. Használjon DAPI szűrőt annak ellenőrzésére, hogy a sejtmagok egyenletesen festődtek-e. A jelek megszámlálása: Lokalizálja a tumort a HE-módszerrel festett tárgylemezen, majd ugyanazt a területet értékelje ki a FISH-eljárással festett lemezen is. Pásztázzon végig több tumorsejtes területet, hogy felmérje az esetleges heterogenitásokat. Válasszon ki egy olyan területet, amelyben jó a sejtmagok eloszlása. Kezdje az elemzést a kiválasztott terület bal felső kvadránsában, majd balról jobbra pásztázva, számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag határon belül eső jeleit, az alábbi irányelveknek megfelelően (lásd a 3. függeléket is). Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölődését. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet tekintse egynek. A nagyfokú TOP2A génamplifikációt mutató sejtmagokban a TOP2A jelek olyan közel kerülhetnek egymáshoz, hogy jelcsoportot hoznak létre. Ilyen esetekben a TOP2A jeleket nem lehet megszámolni, de értéküket meg kell becsülni. Külön figyelmet kell fordítani a zöld jelekre, mert atop2a jelcsoportok könnyen elfedhetik a zöld jeleket, amelyek ezáltal nehezen láthatóak lesznek. Kétséges esetekben vizsgálja meg a zöld jeleket speciális FITC-szűrő segítségével. A zöld jeleket nem tartalmazó sejtmagokat ne értékelje. Kizárólag azokat a sejtmagokat használja az értékeléshez, amelyek egy vagy több zöld referenciajelet mutatnak. Jegyezze fel az értékeket a 2. függelékben bemutatotthoz hasonló táblázatban. P04092HU_02/K o. 17/39.

18 Jelszámlálási útmutató 1 Ne számolja. A sejtmagok átfedik egymást, nem minden részük látható. 2 Számolja két zöld jelnek 3 Két piros jel, ne értékelje a kizárólag piros jeleket tartalmazó sejtmagokat 4 3 zöld és 12 piros jelként számolandó (csoportos becslés) 5 1 zöld és 1 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 6 Ne számolja (túlemésztett vagy emésztetlen sejtmagok). vagy A sejtmagok közepéből hiányoznak a jelek (fánk alakú sejtmagok). 7 2 zöld és 3 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 8 1 zöld és 5 piros jelként kell számolni 9 3 zöld (1 zöld jel a fókuszon kívül) és 3 piros jelként számolandó. 10 A zöld jeleket elfedő piros jelcsoport, a zöld jeleket vizsgálja meg egy speciális FITC-szűrővel, vagy hagyja ki a számolásból A jeleket vagy a hagyományos módszerrel lehet értékelni, (41) vagy egy időt és labort kímélő alternatív módszerrel (21, 29). A hagyományos módszer helyett, amelyben 60 sejtmag jeleit számláljuk meg, összesen 60 eseményt számlálunk meg (egy esemény egy piros génszignálnak felel meg). Ezzel az alternatív számlálási módszerrel a 60 piros TOP2A jel megszámlálásához értékelendő sejtmagok száma változó. Az ugyanezekben a sejtmagokban látható zöld CEN-17 jelek számát feljegyezzük. Minimum 6 sejtmagot kell kiértékelni. A normál mintákban átlagban 35 sejtmag kiértékelése már elég ahhoz, hogy elérjük a szükséges 60 piros jelszámot. Az amplifikált esetekben 6 35 sejtmag kerül értékelésre. Még a deléciós esetekben is gyakran elégségesnek bizonyul 60-nál kevesebb sejtmag megszámlálása. Ha lehetséges, 3 különböző tumorterületről származó sejtmagokat számláljon meg (42). Számolja ki a TOP2A/CEN-17 arányt oly módon, hogy elosztja a piros TOP2A jelek összegét a zöld CEN-17 jelek összegével. Azok a mintákat, amelyekben a TOP2A/CEN-17 arány 2 vagy ennél magasabb, úgy tekintjük, hogy TOP2A amplifikációval rendelkeznek, míg a 0,8-nál alacsonyabb TOP2A/CEN-17 arányt mutató minták TOP2A deléciósnak tekintendők (18, 21, 29). A határértékre vagy a kritikus cut-off érték közelébe (1,8 2,2 az amplifikáció és 0,7 0,9 a deléció esetében) eső minták eredményeinek kiértékelését óvatosan kell végezni. Ilyenkor ajánlatos ellenőrizni, hogy vajon a normális sejtmagok nem kerültek-e be túl nagy százalékban az értékelésbe. Ha az arány értéke a két kétséges tartomány bármelyikébe esik, vagy más bizonytalan esetekben, ajánlott ellenőrizni a minta eredményét úgy, hogy egy másik személy újra kiértékeli azt, mégpedig 3 további tumorterület sejtmagjainak és/vagy összesen 60 sejtmag megszámlálásával. Az eredmény elfogadhatónak tekinthető, ha a variációs koefficiens (CV) P04092HU_02/K o. 18/39.

19 ±10%-os. A végleges arányt újra ki kell számolni a két értékelésből származó összeredmények alapján. Határesetekben ajánlott, hogy a patológus és a kezelőorvos konzultáljon egymással. Korlátozások Általános korlátozások 1. A FISH eljárás egy többlépcsős folyamat, amely speciális szakképzettséget igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint a FISH tárgylemez előkészítése és a festési eredmények értelmezése terén. 2. A FISH eredményei függnek a szövetek festést megelőző kezelésétől és előkészítésétől. A nem megfelelő fixálás, mosás, szárítás, felfűtés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyeződés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Inkonzisztens eredményekhez vezethetnek a fixálási és beágyazási módszerek eltérései vagy a szövet inherens egyenetlenségei. 3. Optimális és reprodukálható eredmények elérése érdekében a szövetmetszeteket teljes mértékben paraffinmentesíteni kell. Ezt a paraffinmentesítést a festési eljárás kezdetén kell elvégezni. (Lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ B.2 szakaszát.) 4. Kizárólag kalibrált hőmérsékletű vízfürdőt, fűtőblokkot és hibridizáló kemencét szabad használni. Egyéb típusú berendezések használata a TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás alatti párolgását okozhatja, ezért ezeket a berendezéseket a felhasználónak validálnia kell. Teljesítményjellemzők Analitikai érzékenység A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék érzékenységét 18 normál humán emlőepitélium-minta segítségével vizsgálták. A TOP2A és a CEN-17 jelszámok arányát mintánként 60 sejtmag megszámlálása alapján számolták ki. A 18 normál humán emlőepitélium-minta esetében a TOP2A/CEN-17 arány értéke a 0,97 és 1,11 közötti tartományban mozgott. Analitikai specificitás A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő TOP2A DNS próbákat úgy végszekvenálták és térképezték fel, hogy biztosan és teljesen lefedjenek egy 228 kb nagyságú szakaszt, amely tartalmazza a TOP2A gént. A TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő CEN-17 PNS próbákat egyenként és kombinációban is tesztelték annak ellenőrzésére, hogy specifikusan hibridizálódnak-e a 17-es kromoszóma centromer régiójával. Annak megítélésére, hogy alkalmas-e az assay a célanyagok, vagyis a TOP2Aés a CEN-17 kizárólagos azonosítására, egyéb anyagokkal való interferencia nélkül, normál humán emlőepitélium-mintákat vizsgáltak meg a 3. üvegben lévő hibridizáló pufferrel, de próbakeverék nélkül. Összesen 18 mintát értékeltek a próbakeverékkel nem kapcsolatos jelek jelenlétének felmérése céljából. A 18 minta egyikében sem mutatták ki egyéb kromoszóma célszekvenciák jelenlétét, és interferenciát sem tapasztaltak szoros rokonságban lévő anyagokkal. A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok A TOP2A IQFISH pharmdx assay robusztusságát az előkezelési idő, a hőmérséklet és az előkezelési puffer felmelegítésére szolgáló módszerek (mikrohullámú sütő vagy vízfürdő), a pepszininkubációs idő és módszer (RTU pepszin vagy immerzió), a denaturációs hőmérséklet és idő, a hibridizálási idő, valamint a magas stringenciájú mosóoldattal történő mosási idő és hőmérséklet változtatásával tesztelték. A következő kísérleti feltételek mellett az eredmények között nem voltak szignifikáns különbségek: P04092HU_02/K o. 19/39.

20 Előkezelés A módszer: 10 perces vízfürdő 95 C-on, C-on, illetve 99 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces vízfürdő C-on Előkezelés B módszer: mikrohullámú sütő 9, 10, illetve 11 percig >95 C-on. Pepszines emésztés A módszer: 5, 10, illetve 15 perces inkubációs időkkel szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Pepszines emésztés B módszer: 3, 4, illetve 5 perces inkubációs időkkel 37 Con). Pepszines emésztés C módszer: 20, 25, illetve 30 perces inkubációs időkkel, amelyek mindegyikét 35, 37, illetve 39 C-os hőmérsékletekkel kombináltak. 10 perces denaturálás 65, 66, illetve 67 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces denaturálás 66 C-on. 60, 90, és 120 perces hibridizálási idő 45 C-on. Magas stringenciájú 10 perces mosás 61, 63, illetve 65 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces, 63 C-on történő mosás. A toleranciahatáron lévő egyes idő és hőmérséklet kombinációk a szöveti struktúra enyhe csökkenését eredményezték, bár a jelintenzitás tekintetében nem figyeltek meg szignifikáns eltéréseket. A TOP2A IQFISH pharmdx készlet különféle hő-előkezelési, pepszines emésztési és hibridizálási idők alkalmazását teszi lehetővé a festési eljárási protokollban. Minden egyes kombinációs lehetőséget a TOP2A génstátuszra vonatkozóan validáltak. A validálást 10 formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) humán emlőrákos szövetmintán végezték, mind a 12 kombinációs lehetőség esetében. Referenciaként a TOP2A FISH pharmdx készletet (kód: 5333) használták. Az egyes mintákra vonatkozó TOP2A/CEN-17 arányokat az 1. táblázatban tüntettük fel. A 12 tesztvizsgálat és a referenciafestések kereszttáblázata 100%-os (10/10) általános egyezést igazolt a TOP2A génstátuszban, 78,3%-os alsó és 100%-os felső határral a kétoldalas, 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa érték 1,00 volt, a McNemars teszt pedig a torzítás hiányát igazolta (az 1,00 kétoldalas p-értéke). P04092HU_02/K o. 20/39.

21 1. ábra. Egyéni TOP2A/CEN-17 arányok a TOP2A IQFISH pharmdx (Kód: K5733) készlettel, a lehetséges 12 kombinációs protokollvariációban (1 12 teszt), valamint a TOP2A FISH pharmdx referenciakészlettel (kód: K5333) megfestett (R) 10 humán emlőrákminta esetében. A felső vízszintes vonal a 2,0-es cut-off értéket ábrázolja, az alsó vízszintes vonal pedig a 0,8-as cut-off értéket. Megismételhetőség A TOP2A/CEN-17 arány megismételhetőségét a TOP2A IQFISH pharmdx assay segítségével vizsgálták, kilenc deletált, normál, vagy amplifikálttop2a génstátuszos humán emlőrákminta egymást követő metszetein. Egyazon vizsgálati meneten belül az egyes minták három-három metszetét vizsgálták. Az átlagos variációs koefficiens a TOP2A deletált minták esetében 3%-os (1% és 4% közötti tartomány), a normál TOP2A mintáknál 7%-os (2% és 10% közötti tartomány), atop2a amplifikált mintáknál pedig 5,3-os (4% és 7% közötti tartomány) volt. Összesen öt, különböző ( 3, 4, 5, 6, illetve 7 µm) vastagságú és négy humán emlőrákmintából származó, egymás után következő metszetet vizsgáltak meg a TOP2A IQFISH pharmdx készlettel. A TOP2A/CEN-17 arány átlagos variációs koefficiense 9,8%-os volt (6% és 13% közötti tartomány). Reprodukálhatóság A TOP2A IQFISH pharmdx assay tételek, illetve értékelők közötti reprodukálhatóságát három TOP2A IQFISH pharmdx assay felhasználásával, és három értékelő személlyel vizsgálták. A reprodukálhatóságot kilenc deletált, normál vagy amplifikált TOP2A génstátusszal rendelkező humán emlőrákmintán vizsgálták. A tételek közti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 3,7%-os volt a TOP2A deletált minták esetében (2% és 6% közötti tartomány), 10,3%-os a normál TOP2A státuszú mintáknál (10% és 11% közötti tartomány), illetve 9,3%-os a TOP2A amplifikált mintáknál (5% és 12% közötti tartomány). Az értékelők közti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 13,7%-os volt a TOP2A deletált minták esetében (7% és 17% közötti tartomány), 7%-os a normál TOP2A státuszú mintáknál (2% és 11% közötti tartomány), illetve 12,7%-os a TOP2A amplifikált mintáknál (10% és 15% közötti tartomány). Klinikai alkalmazhatóság A doxorubicin és az epirubicin a legszélesebb körben alkalmazott tumorellenes gyógyszerek közé tartozó antraciklinek, és kimutatták, hogy ezen készítmények farmakológiai hatása tekintetében a topoizomeráz IIα képviseli a molekuláris célpontot (14, 15). A doxorubicin és az epirubicin számos különféle tumor kezelésében bizonyultak hasznosnak, az emlőrákot is ideértve, amely esetében ezeket a szereket áttétes esetekben és adjuváns kezelésként is alkalmazzák (15). Az emlőrák adjuváns kezelését illetően a klinikai adatok azt igazolják, hogy a doxorubicint vagy epirubicint is tartalmazó kemoterápiás sémák statisztikailag szignifikáns mértékben növelik a túlélési időt, az antraciklint nem tartalmazó sémákhoz viszonyítva (43, 44). Az antraciklinek terápiás indexe alacsony, így a fokozott hatásosság nagyobb toxicitás árán érhető csak el más kemoterápiás protokollokhoz viszonyítva, mint amilyen pl. a CMF-séma (ciklofoszfamid/metotrexát/5-fluoro-uracil) (19, 45). Az akut toxicitáson túl, a doxorubicines vagy epirubicines kezelés hosszú távú kardiotoxikus hatásokkal is járhat, továbbá másodlagos akut mieloid leukémia kialakulásával (AML) (6, 15). A kezelés által indukált kardiomiopátia gyakran irreverzibilis, és pangásos szívelégtelenség kialakulásához vezethet a kemoterápia befejezését követő néhány hónapon vagy éven belül. A doxorubicines és epirubicines kezelés optimalizálása érdekében fontos, hogy a klinikusok rendelkezésére álljanak olyan eszközök, amelyek segítségével azonosíthatják azokat a betegeket, akiknek leginkább javára szolgálhat a doxorubicin vagy epirubicin kezelés.a Dako TOP2A FISH pharmdx készlet (kód: K5333) klinikai eredményességét a koppenhágai Danish P04092HU_02/K o. 21/39.

22 Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) által végzett két vizsgálatban tanulmányozták (21, 29, 30, 46). Próbavizsgálat (pilot study) A TOP2A FISH pharmdx készlet klinikai eredményességét 120 emlőrákos betegből származó mintákon tanulmányozták a (29) DBCG-vel együttműködésben végzett próbavizsgálatban. Összesen 20 tumorban mutattak ki a TOP2A génmásolatok mennyiségi változásait. A húsz tumorban szinte egyenlő arányban fordultak elő az amplifikációs (n=11), illetve a deléciós (n=9) elváltozások. TOP2A változásokat nem csak a HER2-pozitív tumorokban találtak, ugyanis ezek közül 4 daganat (a TOP2A rendellenességgel járó esetek 20%-a) HER2-negatív volt. A 2-es vagy ennél magasabb jelarány (piros jel/zöld jel) az amplifikált eseteket különíti el a normális esetektől, míg a 0,8-as értéknél alacsonyabb arány géndelécióhoz társul. A próbavizsgálatban kimutatták, hogy 2 különböző számlálási módszer azonos eredményekhez vezetett: A jeleket vagy 60 sejtmagban számlálták meg, vagy összesen 60 piros jelet számláltak meg az ugyanazokban a sejtmagokban előforduló zöld jelekkel együtt. Az utóbbi módszer előnye, hogy a deléciós és normális esetekben a lehetséges legnagyobb számú sejtet fognak megszámlálni, míg az amplifikált esetekben a lehető legkisebb számú sejtet. Az amplifikált eseteket gyakran egyértelműen lehet azonosítani puszta mikroszkópos megtekintéssel, és több időt vesz igénybe, ha az értékeléshez 60 sejtmagot kell megszámlálni. Megerősítő jellegű vizsgálat DBCG 89D/TOP2A A TOP2A FISH pharmdx készlet klinikai teljesítményét szélesebb körben vizsgálták a DBCG 89D adjuváns vizsgálat keretében prospektív módon begyűjtött minták alapján (21, 30, 46, 47). A vizsgálat célja A DBCG 89D/TOP2A vizsgálat elsődleges célja annak megítélése volt, hogy vajon a TOP2A génaberrációk (amplifikáció vagy deléció) szolgálhatnak-e prognosztikai markerekként a recidívamentes és az általános túlélést illetően a magas rizikójú emlőrákos betegek esetében, akiknél adjuváns epirubicin-alapú kemoterápia alkalmazását tervezik. A másodlagos cél a TOP2A génaberrációk prognosztikai tulajdonságainak, valamint a TOP2A és a HER2 gének közötti összefüggések tanulmányozása volt. A DBCG 89D vizsgálatot nyílt, prospektív, randomizált vizsgálatnak szánták. A műtéti eltávolítást követően 980, magas rizikójú invazív emlőrákban szenvedő pre- and posztmenopauzális nőt randomizáltak CMF vagy CEF (ciklofoszfamid/epirubicin/5-fluoro-uracil) sémájú kemoterápiára. Az elsődleges hatásossági kimenetel a recidívamentes túlélés (RFS, recurrence free survival) volt, másodlagos végpontnak pedig a teljes túlélést (OS, overall survival) tekintették. A biológiai DBCG 89D/TOP2A alvizsgálatban a DBCG 89D vizsgálatban részt vevő betegektől nyert szövetblokkokat begyűjtötték a vizsgálóhelyekről, és retrospektív módon központilag elemezték a TOP2A és HER2 génaberrációk (Dako HER2 FISH pharmdx készlettel), valamint a HER2 túlzott mértékű expressziója (Dako HercepTest segítségével) tekintetében. A DBCG 89D vizsgálatba bevont betegtől származó szöveti blokkok álltak rendelkezésre. A TOP2A és HER2 génaberrációkat illetően az arányokat úgy számolták ki, hogy elosztották a génpróbák jelszámát a centromer 17-re vonatkozó jelszámmal. Az eseteket HER2 vagy TOP2A FISH amplifikáltnak tekintették, amikor az arány 2 volt. TOP2A deléció jelenlétére utaló aránynak a <0,8 arányt tekintették. A TOP2A státusz szempontjából a következő két csoportba sorolták a mintákat: Deléciós: TOP2A/CEN-17 arány <0,8 Normál: 0,8 TOP2A/CEN-17 arány <2,0 Amplifikált: TOP2A/CEN-17 arány 2,0 P04092HU_02/K o. 22/39.

23 A HercepTest esetében az összes 1+, 2+ és 3+ pozitív mintát HER2 FISH elemzésnek vetették alá. A HER2 pozitivitást (48) a következőképpen értékelték a vizsgálatban: Pozitív: HercepTest=3+, vagy HercepTest=2+ és FISH HER2 arány 2,0 Negatív: HercepTest=0,1+, vagy HercepTest=2+ és FISH HER2 arány <2,0 A klinikai vizsgálatot (DBCG 89D) és a biológiai alvizsgálatot (DBCG 89D/TOP2A) a Helsinki egyezmény értelmében folytatták le a helyi Etikai Bizottságok hozzájárulásával. Statisztikai módszertan A vizsgálat elsődleges végpontja a recidívamentes túlélés (RFS) volt, amelyet a randomizációtól valamely eseményig vagy a minta kizárásáig eltelt időként határozták meg. A másodlagos végpont a teljes túlélés (OS) volt, amelyet a randomizációtól a halál bekövetkeztéig vagy a minta kizárásáig letelt időként definiálták. A CEF és CMF kezelések egymáshoz viszonyított hatását az RFS és OS értékekre a Cox-féle arányos hazárd modell alapján becsült kockázati arány formájában kvantifikálták. A Cox-féle arányos hazárd modellt az illeszkedésvizsgálatok és az interakciós vizsgálatok eredményei alapján kiigazították, és az RFS és OS elemzéséhez meghatározták az alap többváltozós Cox-modellt. A Cox-modell minden egyes kovariánsa és interaktív tagja esetében megadták a kockázati arányt (HR, hazard ratio), a 95-os megbízhatósági tartományt (konfidenciaintervallumot) és a Wald-tesztből származó p-értéket. A CEF kezelésből származó kockázati arányt a CMF kezelés kockázati arányával szemben minden egyes TOP2A-alcsoportban (és HER2- alcsoportban) az eredmények alapján következtették ki és Forrest-diagram formájában ábrázolták. Miután az illeszkedésvizsgálatok és interakciós vizsgálatok eredményei alapján kiigazították az RFS-re és OS-re vonatkozó Cox-féle arányos hazárd modellt, a következő 3 féle másodlagos elemzést végezték el: Többváltozós becslés a 3 TOP2A-alcsoportban: deléciós, normál, amplifikált. Többváltozós becslés a 2 HER2-alcsoportban: negatív, pozitív. Egyesített többváltozós becslés az összes betegre vonatkozóan a TOP2A és HER2 interakciót is beleszámítva. A TOP2A státusz, illetve a klinikai és patológiai változók közötti összefüggéseket (a Her2-státuszt is beleértve) χ2-teszttel vizsgálták. Az utánkövetési időt a potenciális utánkövetés Kaplan Meier-féle becslése szerint számszerűsítették. A χ2-teszt és a logaritmikus besorolású (logrank) teszt segítségével elvégezték az esetleges szelekciós torzításra vonatkozó elemzést. Azokat a betegeket, akiknek az értékei hiányosak voltak (a receptor státuszt kivéve) kizárták a Cox-féle arányos hazárd modell többváltozós elemzéséből. Eredmények A TOP2A FISH elemzés a 806 emlőrákos mintából 773 esetben (96%-ban) sikeres volt. A TOP2A státusz eloszlását a beválasztható betegek között az 1. táblázatban tüntettük fel. A 773 vizsgálatra alkalmas beteg közül 92 esetben (11,9%) találtak TOP2A amplifikációt, deléciót pedig 87 esetben (11,3%). 1. táblázat. A TOP2A státusz eloszlása TOP2A státusz n (%) Deléciós Normál 87 (11,3) 594 (76,8) P04092HU_02/K o. 23/39.

24 Amplifikált 92 (11,9) Összesen 773 (100) A TOP2A amplifikációk és deléciók eloszlását a HER2 státuszhoz viszonyítva a 2. táblázatban tüntettük fel 2. táblázat. A HER2 státusz eloszlása a TOP2A státuszhoz viszonyítva TOP2A N n (%) Deléció s n (%) Normál n (%) Amplifikál t n (%) HER2 státusz Negatív 527 (100) Pozitív 246 (100) Összesen 773 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) (24,8) (43,5) (11,3) (76,8) 14 (2,7) 78 (31,7) 92 (11,9) p-érték χ 2 p <0,0001 A HER2 státuszt tekintve, a HER2-pozitív tumorok között több TOP2A aberrációt találtak. TOP2A aberrációkat találtak a 246 HER2-pozitív tumor közül 139 esetben, (56,5%), és az 527 HER2-negatív tumor közül 40 esetben (7,6%). Ily módon a TOP2A aberrációt mutató beteg közül 40 esetben (22,3%-ban) nem derült volna ki az eltérés, ha csupán a HER2-pozitív mintákat elemezték volna. A TOP2A aberrációk HER2 FISH státuszhoz viszonyított eloszlását a 3. táblázatban tüntettük fel. Akárcsak a HER2 státusz esetében jelentős összefüggést találtak a TOP2A státusszal. 3. táblázat. A HER2 FISH státusz eloszlása a TOP2A státuszhoz viszonyítva HER2 FISH TOP2A N n (%) Normál 539 (100) Amplifiká 234 lt (100) Összese 773 n (100) Deléció s n (%) Normál n (%) 31 (5,8) 493 (91,5) (23,9) (43,2) (11,3) (76,8) Amplifikál t n (%) 15 (2,8) 77 (32,9) 92 (11,9) p-érték χ 2 p <0,0001 A TOP2A aberrációk a HercepTest eredményeihez viszonyított eloszlását a 4. táblázatban tüntettük fel. Akárcsak a HER2 státusz esetében jelentős összefüggést találtak a TOP2A státusszal. 4. táblázat. A HercepTest pontértékek eloszlása a TOP2A státuszhoz viszonyítva HercepTes t TOP2A N n (%) (100) (100) (100) (100) Deléció s n (%) Normál n (%) 11 (5,3) 192 (91,9) 13 (5,1) 238 (92,6) 3 (3,9) 65 (83,3) (26,2) (43,3) Amplifikál t n (%) 6 (2,9) 6 (2,3) 10 (12,8) 70 (30,6) p-érték χ 2 p <0,0001 P04092HU_02/K o. 24/39.

25 Összese n 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) A 773 TOP2A adatokkal rendelkező beteg közül hatnak hiányosak voltak a klinikai adatai, ezért őket kizárták a többváltozós elemzésből. A TOP2A teszteredményekkel rendelkező betegek esetében a potenciális RFS utánkövetési idő 9,4 év volt, az ennek megfelelő események száma pedig 371. A potenciális OS utánkövetési idő medián értéke 11,1 év volt, az ennek megfelelő események száma pedig 336. a 3 TOP2A csoport 2 kezelési csoportjára vonatkoztatott, RFS-el kapcsolatos Kaplan-Meier diagramok a 2 4. ábrán láthatók. 2. ábra A TOP2A amplifikált tumoros betegek recidívamentes túlélési ideje (RFS) CMF illetve CEF kezelési séma esetében. 3. ábra A normál TOP2A státuszú tumoros betegek recidívamentes túlélési ideje (RFS) CMF illetve CEF kezelési séma esetében. P04092HU_02/K o. 25/39.

26 4. ábra A TOP2A deléciós tumoros betegek recidívamentes túlélési ideje (RFS) CMF illetve CEF kezelési séma esetében. A CEF-kezelés a CMF-kezelésnél hatásosabbnak bizonyult a betegek TOP2A amplifikált és a TOP2A deléciós csoportjában egyaránt. A TOP2A amplifikált betegek esetében a különbség szignifikáns volt (p=0,037). Ilyesfajta különbséget a normál TOP2A státuszú csoportban nem mutattak ki. Az elsődleges vizsgálati végpont (RFS) esetében, a Cox-féle arányos hazárd modell segítségével végzett elemzéssel igazolták, hogy a TOP2A génaberrációk szignifikáns prediktív értékkel rendelkeznek (p=0,016). A TOP2A amplifikációt mutatót betegek csoportjában a relatív kockázat több mint 60%-kal csökkent CEF-kezelés mellett a CMF-kezeléshez viszonyítva (HR=0,389, p-érték=0,0017). A TOP2A deléciós esetekben is csökkent a kockázta, habár statisztikailag nem szignifikáns mértékben (HR=0,608, p-érték=0,0828). Az 5. ábrán a CEF-kezelésnek a recidívamentes túlélésre (RFS) kifejtett relatív hatását mutatjuk be az egyes TOP2A és HER2 alcsoportokban. P04092HU_02/K o. 26/39.

27 5. ábra A CEF-kezelés relatív hatása az RFS-re az egyes TOP2A és HER2 alcsoportokban (Forrest-diagram) A teljes túlélés (OS) tekintetében az RFS-hez hasonló eredményeket igazoltak, de ezek nem voltak szignifikánsak (p=0,14). A TOP2A amplifikációt mutatót betegek csoportjában a relatív kockázat több mint 50%-kal csökkent CEF-kezelés mellett a CMF-kezeléshez viszonyítva (HR=0,485, p=0,0142). Az RFS tekintetében a TOP2A deléciós esetekben a kockázat nem szignifikáns mértékű csökkenését találták (HR=0,678, p-érték=0,155). Az 6. ábrán a CEF-kezelés teljes túlélésre (OS) kifejtett relatív hatását mutatjuk be az egyes TOP2A és HER2 alcsoportokban. 6. ábra A CEF-kezelés relatív hatása az OS-re az egyes TOP2A és HER2 alcsoportokban (Forrest-diagram) A HER2 státusz prediktív értékét is megvizsgálták, és az így kapott adatok sem az RFS, sem az OS esetében nem igazolták, hogy ez a státusz szignifikánsan befolyásolná a kezelésekre adott választ. A TOP2A aberrációk a kiindulási jellemzőkkel kapcsolatos eloszlásának elemzése szignifikáns összefüggést igazolt néhány ismert hisztopatológiai prognosztikai tényezővel. Ezek az adatok továbbá azt is igazolták, hogy a TOP2A aberrációt mutató nők aránya növekszik az életkorral, vagyis ezek az aberrációk gyakrabban jelennek meg a posztmenopauzális nőknél a premenopauzális nőkhöz viszonyítva. Az egyváltozós túlélési elemzések negatív szignifikáns hatást igazoltak az RFS és OS tekintetében egyaránt, ugyanis az amplifikációs és deléciós eltéréseket mutató betegek esetében a túlélés szignifikáns mértékben csökkent a normál TOP2A státuszúakhoz viszonyítva. A túlélési görbék arra is utaltak, hogy a deléciós elváltozásokat mutató betegek prognózisa még az amplifikált vagy a normál TOP2A státuszú betegekénél is P04092HU_02/K o. 27/39.

28 rosszabb. Az amplifikált, normális vagy deléciós TOP2A státuszú betegek túlélési görbéit a 7. ábrán tüntettük fel. 7. ábra.top2a státusz az RFS és OS tekintetében (N=767) Kimutatták, hogy a TOP2A aberrációk azon túl, hogy összefüggésbe hozhatók az ismert klinikai prognosztikai tényezőkkel önálló prognosztikai értékkel is rendelkeznek. A Cox-féle arányos hazárd modell segítségével kimutatták, hogy a TOP2A génaberráció szignifikánsan rosszabb prognózissal társul az RFS (p=0,0169) és az OS (p=0,0118) tekintetében egyaránt. A recidívamentes túlélésre (RFS) és a teljes túlélésre (OS) vonatkozó, Cox-modellen alapuló kockázati arányokat (HR) és 95%-os konfidenciahatárokat az 5. és a 6. táblázatban tüntettük fel. P04092HU_02/K o. 28/39.

29 5. táblázat. Az RFS-re vonatkozó HR a TOP2A státusszal és a kezelésre adott reakciókkal együtt Változó p-érték HR 95%-os KI Menopauza 0,0576 Előtt Után 1 (0,99 1,60) 1,26 Tumorméret <0,0001 fokozatosan növekedő 1,15 (1,09 1,22) (cm) Pozitív nyirokcsomók <0, ,01 4,16 (1,39 2,91) (2,88 6,02) TOP2A státusz Deléciós Normál Amplifikált HER2 státusz Negatív Pozitív 0,0169 0,2998 1,66 1 1,56 (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) 6. táblázat. Az OS-re vonatkozó HR a TOP2A státusszal és a kezelésre adott reakciókkal együtt Változó p-érték HR 95%-os KI Menopauza 0,0124 Előtt Után 1 1,37 (1,07 1,75) Tumorméret fokozatosan növekedő <0,0001 1,16 (1,10 1,23) (cm) Pozitív nyirokcsomók TOP2A státusz Deléciós Normál Amplifikált HER2 státusz Negatív Pozitív <0,0001 0,0118 0, ,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Ha az 5. táblázatban (RFS) szereplő különböző változók kockázati arányát a prognosztikai érték szempontjából rangsoroljuk, a következő eredményt kapjuk: pozitív nyirokcsomók száma > TOP2A státusz > menopauzális státusz > HER2 státusz és tumorméret. Ebből az osztályozásból kitűnik, hogy az egyes változók közül a pozitív nyirokcsomók száma rendelkezik a legnagyobb prognosztikus hatással, és ezt a TOP2A státusz, a menopauzális státusz, a tumorméret és a HER2 státusz követi a rangsorban. Ha a rangsorolást az OS esetében (6. táblázat) is elvégeznénk az RFS-hez hasonló eredményeket kapnánk, ami a TOP2A státusz erőteljes prognosztikus értékét igazolja. P04092HU_02/K o. 29/39.

30 A HER2 státusz prognosztikai értékét szintén megvizsgálták, és az egyváltozós túlélési elemzések arra utaltak, hogy ez a státusz szignifikánsan és negatív irányban hat a túlélésre (RFS és OS), tekintve, hogy a HER2-pozitív betegek túlélési ideje rövidebb a normális HER2 státuszú betegekhez viszonyítva. A recidívamentes túlélés (RFS) Cox-féle arányos hazárd regressziós analízis segítségével végzett elsődleges elemzés nem igazolt szignifikáns hatást a HER2 státusz részéről. Amikor az elemzést megismételték a teljes túlélésre (OS) vonatkozóan, kiderült, hogy a pozitív HER2 státusz szignifikáns negatív hatást gyakorol a túlélésre. Megbeszélés és következtetések A DBCG 89D/TOP2A vizsgálat a TOP2A génaberrációk szignifikáns prediktív és prognosztikai értékét igazolta. A HER2 státusszal összehasonlítva megállapítható, hogy a HER2 státusz és a TOP2A státusz nem helyettesítik egymást sem a prediktív sem a prognosztikai érték tekintetében. A TOP2A az epirubicin farmakológiai hatásmechanizmusának molekuláris célpontját képviseli, és a vizsgálat kimutatta, hogy a TOP2A génaberráció (különösen ami az amplifikáció) hasznos prediktív marker az epirubicin kezeléssel szembeni reakció tekintetében. Az antraciklin alapú (doxorubicines vagy epirubicines) kemoterápia az egyik legaktívabb séma az emlőrák kezelésében. Mindemellett ezek a készítmények jelentős mértékű, akut és hosszú távú súlyos mellékhatásokkal járhatnak, mint pl. a kardiotoxicitás és a leukémia. A TOP2A FISH pharmdx készlet és a TOP2A IQFISH pharmdx készlet összehasonlító vizsgálata A Dako TOP2A IQFISH pharmdx készletet (kód: K5733) 80 humán emlőrákos mintával végzett összehasonlító vizsgálatban hasonlították össze a Dako TOP2A FISH pharmdx készlettel (kód: K5333). A két assay segítségével kapott TOP2A státusz kereszttáblázata 100%-os általános egyezést mutatott, 96,9%-os alsó és 100%-os felső határral a 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa-érték 1 volt. P04092HU_02/K o. 30/39.

31 Hibaelhárítás Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 1. Nincs jel, vagy a jel gyenge 1a. A készletet magas hőmérséklet-hatásnak tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt. 1b. A mikroszkóp nem működik megfelelően - nem megfelelő szűrőkészlet - nem megfelelő lámpa - a higanylámpa túl régi - piszkos és/vagy megrepedt kollektorlencsék - nem megfelelő immerziós olaj 1a. Ellenőrizze a tárolási körülményeket. Győződjön meg arról, hogy átvételkor volt még szárazjég a szállítmányban. Győződjön meg arról, hogy a 3. üveget sötét helyen és -18 C-on tárolták. Győződjön meg arról, hogy a 2A. és az 5. üveget legfeljebb 2 8 C-on tárolták, sötét helyen. 1b. Ellenőrizze a mikroszkópot, és bizonyosodjon meg arról, hogy az alkalmazott szűrök alkalmasak a készlet fluorokrómjaival történő használatra, illetve, hogy a higanylámpa megfelelő, és nem használják hosszabb ideje, mint amennyi a várható élettartama (lásd a 3. függeléket). Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkóp-beszállítójával. 1c. Elhalványult jelek 1c. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 1d. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 1e. A próbakeverék párolgása a hibridizálás ideje alatt 1d. Ügyeljen arra, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazza. 1e. Gondoskodjon megfelelő páratartalomról a hibridizációs kamrában 2. Nincsenek zöld jelek 3. Nincsenek piros jelek 2a. A magas stringenciájú mosási feltételek nem megfelelőek 3a. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 2a. Bizonyosodjon meg arról, hogy az ajánlott magas stringenciájú mosási hőmérsékletet és időtartamot alkalmazták, továbbá, hogy a fedőlemezeket eltávolították a magas stringenciájú mosás elvégzése előtt 3a. Gondoskodjon róla, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák P04092HU_02/K o. 31/39.

32 Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 4. Jelmentes területek 4a. A próbatérfogat túl kicsi 4a. Győződjön meg arról, hogy a próba térfogata elegendő-e a fedőlemez alatti terület lefedéséhez 4b. Légbuborékzárványok keletkeztek a próbakeverék alkalmazása vagy a rögzítés közben 4b. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével finoman ütögetve távolítsa el azokat 5. Túl erős háttérfestődés 5a. Nem megfelelő szövetfixálás 5a. Gondoskodjon róla, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon 6. Gyenge minőségű szövetmorfológia 7. Nagyfokú zöld autofluoreszcenci a a tárgylemezen az FFPE szövet nélküli területeket is beleértve 5b. A paraffinmentesítés nem tökéletes 5c. A magas stringenciájú mosás hőmérséklete túl alacsony 5d. A hibridizált részt túl hosszasan tették ki erős fénynek 6a. Nem megfelelő pepszinkezelés 6b. A nem megfelelő előkezelési körülmények az oldat homályosodását vagy zavarosodását eredményezhetik 6c. A túl hosszú pepszinkezelés vagy a nagyon vékony metszetek szellemképes vagy fánk alakú sejtek megjelenését eredményezhetik. 7. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata 5b. Kövesse a B.2 szakaszban leírt paraffinmentesítési és rehidrálási eljárásokat 5c. Győződjön meg arról, hogy a magas stringenciájú mosás hőmérséklete 63 (±2) C 5d. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 6a. Tartsa be az ajánlott pepszininkubációs időket. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Bizonyosodjon meg arról, hogy a pepszint megfelelő hőmérsékleten kezelik. Lásd a B.1 szakaszt 6b. Gondoskodjon róla, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák 6c. Rövidítse le a pepszininkubációs időt. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Gondoskodjon róla, hogy a metszet vastagsága 4 6 µm legyen. 7. Bizonyosodjon meg arról, hogy a bevonatos üveglemez (Dako Silanized Slides, kód: S3003, vagy poli-l-lizinnel bevont tárgylemezek) még nem járt le. P04092HU_02/K o. 32/39.

33 MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Műszaki Szolgálatát. 1. függelék TOP2AIQFISH pharmdx (kód: K5733) Ellenőrzőlista a protokollhoz A munkamenet dátuma: TOP2A IQFISH pharmdx (K5733) Tétel: Minta azonosító száma: Készülék azonosító száma: A festési munkamenet naplóazonosítója: Az 1 x mosópuffer (6. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma: / A szövet fixálása semlegesre pufferelt formalinnal történt Igen Nem 1. lépés: Előkezelés Az előkezelő oldat (1. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma / Az előkezelő oldat mért hőmérséklete (95 99 C) C Előkezelés (10 perc) és hűtés (15 perc) Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) 2. lépés: Pepszin A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama 37 C-on, vagy A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama szobahőmérsékleten vagy A pepszinimmerzió időtartama 37 (±2) C-on Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn 3. lépés: TOP2A/CEN-17 IQISH próbakeverék Adja hozzá a próbakeveréket (3. üveg), helyezze fel a fedőlemezt, és zárja le a fedőlemez-tömítéssel Mért denaturálási hőmérséklet (66 ±1 C) C Denaturálás 10 percen át Mért hibridizálási hőmérséklet (45 ±2 C) C Az éjszaka folyamán történő hibridizálás (fénytől védve) 4. lépés: Magas stringenciájú mosás A magas stringenciájú mosópuffer (4. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma A magas stringenciájú mosópuffer mért hőmérséklete (63 ±2 C) C Magas stringenciájú mosás (10 perc) a fedőlemezek eltávolítása után Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn 5. lépés: Rögzítés Vigyen fel 15 μl fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg) és helyezze fel a fedőlemezt / perc perc perc Megjegyzések: Dátum és aláírás, labortechnikus: P04092HU_02/K o. 33/39.

34 2. függelék TOP2A IQFISH pharmdx (kód: K5733) Számlálási vázlat A festési munkamenet naplóazonosítója: A munkamenet dátuma: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Tétel: Minta azonosító száma: Sejtmag száma TOP2A érték CEN-17 érték Sejtmag száma TOP2A érték CEN-17 érték Sejtmag száma TOP2A érték CEN-17 érték Összes (1-20) Összes (21-40) Összes (41-60) A TOP2A/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a TOP2A jeleket és a CEN-17 jeleket bármely 60 sejtmagban, vagy a 60 TOP2A jel megszámlálásához szükséges sejtmagszámot (lásd A festődés értelmezése című szakaszt). A TOP2A jelek összegét ossza el a CEN-17 jelek összegével. Ha a TOP2A/CEN-17 arány a határérték közelébe (0,7 0,9 vagy 1,8 2,2) esik, akkor számlálja meg újra a mintát, és ismét számítsa ki az arányt az összes megszámolt sejtből származó adatok alapján. A megszámolt sejtek száma TOP2A jelek CEN-17 jelek TOP2A/CEN-17 arány TOP2A géndeléció (Arány < 0,8) Normál TOP2A génstátusz (0,8 Arány < 2) TOP2A génamplifikáció (Arány 2) Dátum és aláírás, labortechnikus: Dátum és aláírás, patológus: Megjegyzések: P04092HU_02/K o. 34/39.

35 Számlálási útmutatások tekintetében lásd A festődés értékelése című szakaszt 3. függelék TOP2A IQFISH pharmdx (kód: K5733) A fluoreszcencia mikroszkóp műszaki leírása A Dako a következő berendezés használatát ajánlja a TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 készlettel: 1. Mikroszkóp típusa Epifluoreszcencia mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (vezessen nyilvántartást a használati időről). 3. Objektívek A szövetek szűrővizsgálatához 10-szeres nagyítású száraz fluoreszcenciás vagy 16-szoros nagyítású olajimmerziós fluoreszcenciás objektívek használhatók. A nagy erejű nagyításhoz és a jelek számlálásához kizárólag az olajimmerziós (pl. 100-szoros nagyítású) fluoreszcencia objektívek használata ajánlott. 4. Szűrők A szűrőket egyénileg alakították ki a különböző fluorokrómokhoz, így ezeket ennek megfelelően kell kiválasztani. A Dako speciális DAPI szűrő használatát ajánlja, magas minőségű Texas Red/FITC kettős szűrővel kombinációban. DAPI szűrő Texas Red/FITC kettős szűrő A Texas Red és FITC monoszűrőket az eredmények megerősítéséhez lehet használni. Fluorokróm Gerjesztő hullámhossz Kibocsátási hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Az egyes mikroszkóptípusokhoz különböző szűrők tartoznak, és a megfelelő szűrők használata kulcsfontosságú az értékelés szempontjából. Részletes információkért vegye fel a kapcsolatot a mikroszkóp szállítójával vagy a Dako képviselőjével. 5. Olaj Nem fluoreszkáló olaj Óvintézkedések Az 50 wattos higanylámpa használata nem ajánlott. Rodamin szűrőket nem lehet használni. Tripla szűrők használata nem ajánlott. Problémákat okozhat a fluoreszcens jelek értékelésekor, ha a mikroszkóp kialakítása nem optimális. Fontos, hogy a fényforrás ne legyen lejárva, valamint hogy az igazítása és fókuszálása megfelelő legyen. A vevőknek ellenőrizniük kell a higanylámpát, és követniük kell a gyártó lámpára vonatkozó utasításait. Az eredmények értékelése előtt el kell végezni a mikroszkóp karbantartását, és ellenőrizni kell, hogy a higanylámpa megfelelően van-e a helyére illesztve. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehető legkisebb mértékben tegyék ki a gerjesztő hullámhossz hatásának, hogy a fluoreszcencia elhalványulása minimális legyen. Javasoljuk, hogy a fluoreszcencia in situ hibridizálás megkezdése előtt egyeztesse az adott mikroszkóp beállítását a gyártóval, vagy tanulmányozza a szakirodalmat. P04092HU_02/K o. 35/39.

36 Irodalomjegyzék 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIa associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: P04092HU_02/K o. 36/39.

37 20. Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER- 2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIa Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001:85-7. P04092HU_02/K o. 37/39.

38 36. Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092HU_02/K o. 38/39.

39 Jelmagyarázat Katalógus-/kódszám Hõmérsékleti korlátozások Kötegkód In vitro orvosdiagnosztikai eszköz Nézzen utánaa Használati Utasításban Napfénytől védett helyen tárolja (lásd a Tárolással foglalkozó részt) Tartalma <N> számú teszthez elegendõ Lejárati idõ Gyártó GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) átdolgozás Gyártó: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánia Tel.: Fax P04092HU_02/K o. 39/39.