HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

Átírás

1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kód: GM kiadás A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) egy direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) vizsgálat, amelyet arra terveztek, hogy formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) emlırákszövetmintákból, valamint áttétes gyomor- vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómás betegek FFPE szövetmintáiból meghatározzák a HER2 génamplifikáció mértékét. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat a HercepTest vizsgálattal együtt használandó azon páciensek felmérésére, akiknél felmerül a Herceptin kezelés lehetısége. Az üveg 20 vizsgálatra elegendı reagenst tartalmaz. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálathoz használandó kiegészítı reagensek: Kód Terméknév GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 1/55

2 Tartalom Oldal Javasolt alkalmazás... 3 Az eljárás elve - emlı... 4 Reagensek - emlı... 5 Óvintézkedések - emlı... 6 Tárolás - emlı... 7 A minta elıkészítése - emlı... 7 HASZNÁLATI UTASÍTÁS - emlı... 8 A. A reagens elıkészítése - emlı... 8 B. Festési eljárás - emlı Minıség-ellenırzés - emlı A festés értelmezése - emlı Korlátozások - emlı Teljesítményjellemzık emlı Hibaelhárítás - emlı sz. függelék - emlı sz. függelék - emlı Összefoglaló és magyarázat gyomor Az eljárás elve gyomor Reagensek gyomor Óvintézkedések gyomor Tárolás gyomor A minta elıkészítése gyomor HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor A. A reagens elıkészítése gyomor B. Festési eljárás - gyomor Minıség-ellenırzés gyomor A festés értelmezése gyomor Korlátozások gyomor Teljesítményjellemzık gyomor Hibaelhárítás gyomor sz. függelék - gyomor sz. függelék - gyomor sz. függelék - gyomor Irodalomjegyzék Jelmagyarázat ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 2/55

3 Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai alkalmazás. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a hibridizációs próba a Dako Omnis készüléken történı automatizált direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) vizsgálathoz, amelyet a kiegészítı reagensek használatával együtt arra terveztek, hogy formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) emlırák-szövetmintákból, valamint gyomor- vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómás betegek FFPE szövetmintáiból meghatározzák a HER2 génamplifikáció mértékét. A HER2 IQFISH pharmdx vizsgálat a HercepTest vizsgálattal együtt használandó azon páciensek felmérésére, akiknél felmerül a Herceptin (trastuzumab) kezelés lehetısége (lásd Herceptin betegtájékoztatója). Emlırákos páciensek esetén a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálati eredmények kiegészítı információkat jelenthetnek azokhoz a klinikopatológiai információkhoz, amelyeket a II. stádiumú, nyirokcsomó-pozitív emlırákban szenvedı páciensek prognózisának értékelésében jelenleg használnak. A gyomor és a gyomor-nyelıcsı határ adenokarcinómája ebben a dokumentumban gyomorrákként is szerepel. Az emlırák esetében történı alkalmazással kapcsolatban, kérjük, tájékozódjon a oldalról. A gyomorrák esetében történı alkalmazással kapcsolatban kérjük, tájékozódjon a oldalról. Fontos: Kérjük, hogy különösen a megfestett szövetmetszetek értékelésekor vegye figyelembe a különbségeket az emlırák és a gyomorrák szövetei között ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 3/55

4 Emlırák Összefoglaló és magyarázat emlı A humán HER2 gén (más néven ERBB2 vagy NEU) a 17-es kromoszómán helyezkedik el, és a HER2 fehérje (p185 HER2 ) kódolásáért felelıs. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozinkináz, amely homológ az epidermális növekedési faktor receptorral (EGFR vagy HER1) (1-2). A HER2 gén minden normál diploid sejtben két példányban van jelen. Az emlırákos betegek egy kis hányadánál a HER2 gén amplifikált a malignus transzformáció és a tumorfejlıdés folyamat részeként (3-8). A HER2 gén amplifikációja általában a HER2 fehérje emelkedett expressziójához vezet az emlırákos sejtek felszínén (9). A HER2 gén amplifikációját és/vagy a kódolt fehérje emelkedett expresszióját az emlırákos betegek 20-25%-nál mutatták ki (10). Ez a felül-szabályozás rossz prognózissal, fokozott kiújulási kockázattal és csökkent túlélési idıvel jár. Több tanulmány igazolta, hogy a HER2-státusz korrelál bizonyos kemoterápiás kezelési protokollokra való érzékenységgel illetve rezisztenciával (11). A HER2 fehérje fokozott expressziójának vagy a HER2 gén amplifikációjának kimutatása alapvetı fontosságú a Herceptin -nel, a HER2 fehérje egy monoklonális antitestével történı kezelés megkezdése szempontjából. Klinikai tanulmányok igazolták, hogy azoknál a betegeknél a leghasznosabb a Herceptin terápia, akiknek daganatában megfigyelhetı a HER2 protein emelkedett expressziója és/vagy a HER2 gén amplifikációja (12). Ez a termék (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) egy IQISH próbakeverék az automatizált, direkt FISH eljáráshoz, amely a HER2 génamplifikáció észlelésére szolgál. Ezt a terméket a Dako Omnis készülékkel kell használni a felsorolt kiegészítı reagensekkel együtt. A termék a manuálisan végrehajtott HER2 génamplifikációs vizsgálatból HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) származik. Az eljárás elve - emlı A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) egy IQISH próba, amely egyrészt Texas Red festékkel megjelölt DNS próbák keverékébıl (ezek egy 218 kb nagyságú régiót ezen belül a 17-es kromoszómán lévı HER2 gént fednek le), másrészt a 17-es kromoszóma centromer régiójára (CEN-17) irányuló, fluoreszceinnel megjelölt peptid-nukleinsav (PNS) (13) próbák keverékébıl áll. A két célszekvencia specifikus hibridizációja világosan látható piros színő fluoreszcens jelet eredményez minden egyes HER2 gén lókuszán, és ugyancsak jól látható, de zöld színő fluoreszcens jelet eredményez valamennyi 17-es kromoszóma centromer régióján. A HER2 génamplifikácónak a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) használatával történı értékelése teljes mértékben automatizált eljárás a Dako Omnis készüléken. Három különbözı hitelesített HER2 FISH festési protokoll választható ki a Dako Link Omnis Munkaállomás programban. A protokollok csak a pepszin emésztési idı tekintetében különböznek, így választható 10 perces (Rövid protokoll), 15 perces (Közepes protokoll) vagy 20 perces (Hosszú protokoll) emésztési idı (a részleteket lásd alább). A Közepes protokoll ajánlott a kezdeti analízishez. A Dako Omnis készülékben történt festést követıen a mintákat Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszerrel fixálják, amely 4',6-diamidino-2-fenilindolt (DAPI) tartalmaz, majd pedig lefedik. Megfelelı szőrıkkel ellátott fluoreszcens mikroszkóp használatával (lásd 2. sz. függelék) meghatározható a tumorsejtek elhelyezkedése, és megszámlálhatók a piros (HER2) és zöld (CEN-17) jelek. Ezt követıen a HER2/CEN-17 arány kerül kiszámításra. Az elemzett szövetmetszetben lévı normál sejtek a festés belsı pozitív kontrolljaként szolgálnak. A részleteket illetıen tanulmányozza A festés értékelése címő szakaszt. A lemezek, ISH fedelek (Dako Omnis), reagensek, öblítıfolyadékok ill. hulladék betöltésével és eltávolításával kapcsolatos részletes útmutatásért, kérjük, lapozza fel a Dako Omnis felhasználói útmutatóját. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 4/55

5 Emlırák Reagensek - emlı A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a kiegészítı reagensek önmagukban, külön is rendelhetık. Mellékelt anyagok A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, azonnal felhasználható Texas Red festékkel megjelölt HER2 DNS próba és fluoreszcens festékkel megjelölt CEN-17 PNS próba, IQISH hibridizációs pufferoldatban. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) terméket szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a reagens nem volt kitéve magas hımérsékletnek a szállítás közben. A reagenst tartalmazó üvegeket mindig álló helyzetben kell tárolni vagy mozgatni. Az üveg egy arany bevonatú fémgolyót tartalmaz, amely lehetıvé teszi a reagens elkeverését a Dako Omnis keverı készülékben (Dako Omnis Mixing Device) (lásd a Dako Omnis keverı készülék felhasználói útmutatóját). Fontos, hogy alaposan el legyen keverve a reagens, mielıtt betölti azt a Dako Omnis készülékbe. Szükséges, de nem biztosított anyagok Kiegészítı reagensek Az alábbiakban felsorolt reagensek jelenléte szükséges a Dako Omnis készülékben ahhoz, hogy a HER2 génamplifikációs elemzést végre lehessen hajtani a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbával: ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, 20-szoros koncentrációjú; 1:20 arányban hígítandó Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályban (kód: GC109). A termék antimikróbás szert, valamint inaktív zöld színezéket tartalmaz a könnyő azonosítás és kezelés érdekében. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml, 96%-os etanol (azonnal felhasználható). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepszin A oldat (azonnal felhasználható), ph 2,0; stabilizátort és antimikróbás szert tartalmaz. A pepszint szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a reagens nem volt kitéve magas hımérsékletnek a szállítás közben. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml konyhasós nátrium-citrát puffer 20x-os koncentrációjú;1:20 arányban hígítandó Dako Omnis 3,5 L öblítıfolyadék-tartályban (kód: GC109). A termék antimikróbás szert, detergenst, valamint inaktív sárga színezéket tartalmaz a könnyő azonosítás és kezelés érdekében. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluoreszcens rögzítıszer (azonnal felhasználható) DAPI-val. Bár a fenti reagenseket nem szállítják a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) termékkel együtt, az alábbiakban röviden ismertetjük ıket. További információért, kérjük, tanulmányozza az egyes reagensek használati útmutatóját. Kiegészítı reagensek és eszközök Dako Omnis (kód: GI100) Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) (kód: GC807) Clearify (kód: GC810) Dako Omnis Mixing Device (kód:gc116) ISH Lid (kód: GC102) ISH Cleaning Solution (kód: GC207) Üveg fedılemezek a rögzítéshez (24 mm x 50 mm) ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 5/55

6 Emlırák A kiegészítı reagensek és eszközök használatával kapcsolatban lásd a Dako Omnis kezdı és haladó felhasználók számára írt használati útmutatókat. Mikroszkóp berendezés és tartozékok Flureszcens mikroszkóphoz használt szőrık: DAPI és FITC/Texas Red kettıs szőrı, vagy FITC és Texas Red mono szőrık- a részleteket lásd a 2. sz. függelékben. A DAPI szőrı erıs nagyításon való használata negatívan befolyásolja a jelerısséget. Kerülni kell a hosszú expozíciós idıket. A fluoreszcens mikroszkóphoz fényforrásként 100 wattos higanylámpát kell használni. Más fényforrások használata nem javasolt ezekkel a szőrıkkel. Mikroszkóp lemeztartó (lemeztartó tálca 20 lemezhez csuklópántos - vagy hasonló - fedéllel). Óvintézkedések - emlı 1. In vitro diagnosztikai alkalmazás. 2. Kizárólag hozzáértı felhasználóknak. 3. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 10-<25% etilén-karbonátot tartalmaz, és 3- <5% sodium chloride. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) figyelmeztetı címkével van ellátva: Figyelem H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért olvassa el a biztonsági adatlapot. 4. A fixálás elıtt és után lévı szövetmintákat, valamint az összes velük érintkezı anyagot potenciális fertızı anyagként kell kezelni, és ennek megfelelıen kell ártalmatlanítani (14). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bırrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bı vízzel. 5. A téves eredmények elkerülése érdekében gondoskodjon arról, hogy a reagensek mikrobiológiai szennyezıdése a lehetı legkisebb mértékő legyen. 6. A megadottól eltérı szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. 7. A reagens hígítása optimális. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 8. Megfelelı személyi védıfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bırre. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 9. A fel nem használt oldatot a helyi és országos elıírásoknak megfelelıen kell ártalmatlanítani. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 6/55

7 Emlırák Tárolás - emlı A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst sötét helyen, <-18 C hımérsékleten (-18 C C a javasolt tartomány) kell tárolni. A reagenst tartalmazó üvegeket mindig álló helyzetben kell tárolni vagy mozgatni. A reagens legfeljebb 10 alkalommal való lefagyasztása és felolvasztása nem befolyásolja a termék hatékonyságát. Ne hagyja ezt az anyagot szobahımérsékleten. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst és a kiegészítı reagenseket (ISH pepsin (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis)) károsan befolyásolhatja, ha hı hatásának vannak kitéve. Ne hagyja ezeket az anyagokat szobahımérsékleten. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst és a kiegészítı reagenseket (ISH pepsin (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis)) károsan befolyásolhatja, ha erıs fénynek vannak kitéve. Ne tárolja ezeket a komponenseket és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. Tárolja a kiegészítı reagenseket (ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) sötétben és 2-8 C hımérsékleten. Tárolja az ISH Pepsin (Dako Omnis) reagenst C hımérsékleten. A tárolás során valamennyi reagens üvegét a kupakkal, beleértve a felpattintható kupakot is, zárva kell tartani. A hígított oldatok (ISH Stringent Wash Buffer munkaoldat és ISH Pre-Treatment Solution munkaoldat) 2-8 C hımérsékleten 30 napig tárolhatók. A reagensek csomagolásán feltüntetett lejárati idın túl ne használja fel a reagenseket. A tárolás során a reagens üvegét a kupakkal, beleértve a felpattintható kupakot is, zárva kell tartani. A felhasználónak ellenırizni kell a reagens hatékonyságát, ha a reagenst a meghatározottól eltérı feltételek között tárolták (15). Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt fontos a vizsgált szövetmetszetben lévı normál sejtek kiértékelése is. Ha nem várt festıdést figyel meg, amelyre nem talál magyarázatot, és úgy gondolja, hogy probléma lehet a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vagy a kiegészítı reagensekkel, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Stabilitás a Dako Omnis készüléken belül A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a kiegészítı reagensek: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) és ISH Pepsin (Dako Omnis) készüléken belüli stabilitása 80 óra. A hígított ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) és ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) készüléken belüli stabilitása 7 nap. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi. Lejárt reagens használata esetén a Dako Omnis készülék figyelmezteti a felhasználót; minden olyan lemez, amelyet lejárt reagenssel festettek meg, fenntartással kezelendı státuszúra változik, és a munkaállomáson a lemeznapló jelzi, hogy lejárt reagenst használtak. A minta elıkészítése - emlı A biopsziákból, kimetszésekbıl vagy reszekciókból származó mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet épen maradjon a FISH elemzés céljára. Az immunhisztokémiai festéshez minden minta esetében a standard szövetfeldolgozási módszereket kell alkalmazni (16). Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A mintákat például 3-4 mm-es szeletekre vágva órán keresztül fixálja semlegesre pufferelt formalinban. A szöveteket ezután dehidratálja etanol és xilén hígítási sorával, majd infiltrálja 60 C-nál nem nagyobb hımérsékleten tartott olvasztott parafinnal. A megfelelıen fixált és beágyazott szövetek hővös helyen (15-25 C) (16-17)korlátlan ideig ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 7/55

8 Emlırák tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt. Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A szövetmintákat 4-6 µm-es metszetekre kell vágni. A HER2 génamplifikációs elemzéshez és a tumor jelenlét igazolásához szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább két sorozatmetszet javasolt, az egyik a tumor jelenlét igazolásához hematoxilin és eozin festéssel (H&E), egy másik pedig a HER2 génamplifikációs elemzéshez. Javasoljuk, hogy a szövetmetszeteket Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) lemezekre rögzítse. Superfrost Plus lemezek (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) is alkalmasak erre a célra. Ellenırizze, hogy az üveglemezek szavatossági ideje nem járt le. A mintákat a metszetkészítéstıl számított <6 hónapon belül elemezni kell, ha 2-25 C-on tárolják azokat. MEGJEGYZÉS: A szövetmintákat a meghatározott lemezfestési területen belül kell az üvegre helyezni. Kérjük, tájékozódjon a Dako Omnis kezdı felhasználók számára szóló felhasználói útmutatójából a lemezfestési terület kiterjedésével kapcsolatban. HASZNÁLATI UTASÍTÁS - emlı A. A reagens elıkészítése - emlı A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) üvege egy arany bevonatú fémgolyót tartalmaz a keveréshez. Az üveg Dako Omnis készülékbe való betöltése elıtt a reagenst fel kell olvasztani és alaposan fel kell keverni, mivel a fázisa különválik a fagyasztás során. Használja a Dako Omnis Mixing Device készüléket a próba keveréséhez. Kövesse az alábbi eljárást a próba Dako Omnis Mixing Device készüléken való keveréséhez. További információkért lásd a keverı készülék használati útmutatóját. 1. Vegye ki a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) üvegét a fagyasztóból. 2. Töltse be az üveget a Dako Omnis keverı készülékbe. 3. Csatlakoztassa a keverı készüléket, és ellenırizze, hogy világít a zöld állapotjelzı. Válassza Thaw + mix (Olvasztás+keverés) programot. Fontos: A -25 C alatt tárolt üvegeket közvetlenül a Dako Omnis keverı készülékbe való betöltés elıtt szabad csak felolvasztani, és a Mix programot kell használni. 4. Távolítsa el az üveget a keverı készülékbıl. 5. Nyissa fel a felpattintható kupakot, hajtsa hátra és pattintsa be a kivágott pozícióba (a részleteket lásd a Dako Omnis kezdı felhasználóknak szóló használati útmutatójában). 6. Rögtön ezután töltse be az üveget a Dako Omnis készülék reagenseket tároló moduljába. Ha a folyamatos reagens betöltési funkciót használja a festési munkamenet során, a reagens keverése és a Dako Omnis készülékben történı felszívása között eltelt idı legalább 10 perc legyen. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbát legfeljebb 10 alkalommal lehet újra felolvasztani és felhasználni. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) keveréket mindig közvetlenül a készülékbe való betöltés elıtt keverje el. Ne rázza fel. Az ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbát a Dako Omnis készülékben való használat után azonnal < -18 C-ra kell hőteni (-18 C C javasolt). ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 8/55

9 Emlırák A.2 ISH Pre-Treatment Solution (elıkezelı oldat) (20x) (Dako Omnis) Készítse el a munkaoldatot az ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 arányú hígításával az alábbiak szerint: 1. Töltsön fel egy Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályt (PTB jelöléső, kék címkés) ionmentesített vízzel a jelölı vonalig (3,325 L). Feltöltés elıtt ellenırizze, hogy az öblítıfolyadék-tartály vízszintes felületen áll. 2. Töltsön egy 175 ml-es ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) koncentrátumot az öblítıfolyadék-tartályba. 3. Helyezze át a levehetı címkét a koncentrátum palackjáról az öblítıfolyadék-tartályra. Rögzítse a fedelet, és óvatosan fordítsa át az öblítıfolyadék-tartályt 2-3-szor. 4. A kézi Dako Omnis vonalkódolvasó használatával azonosítsa a reagenst (olvassa be a levehetı címkét és az öblítıfolyadék-tartályt). 5. Rögtön ezután helyezze az öblítıfolyadék-tartályt a Dako Omnis készülékre. A Dako Omnis készüléken belül tárolt hígított oldat 7 napig használható fel. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A fel nem használt hígított oldat 2-8 C-on 30 napig tárolható. Ha a h ígított oldatot hidegben tárolták, hagyja, hogy felmelegedjen legalább 18 C-ra, mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe. MEGJEGYZÉS: A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Készítse el a munkaoldatot az ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 arányú hígításával az alábbiak szerint: 1. Töltsön fel egy Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályt (PTB jelöléső, kék címkés) ionmentesített vízzel a jelölı vonalig (3,325 L). Feltöltés elıtt ellenırizze, hogy az öblítıfolyadék-tartály vízszintes felületen áll. 2. Töltsön egy 175 ml-es ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) készítményt az öblítıfolyadék-tartályba. 3. Helyezze át a levehetı címkét a koncentrátum palackjáról az öblítıfolyadék-tartályra. Rögzítse a fedelet, és óvatosan fordítsa át az öblítıfolyadék-tartályt 2-3-szor. 4. A kézi Dako Omnis vonalkódolvasó használatával azonosítsa a reagenst (olvassa be elıször a levehetı címkét, majd pedig az öblítıfolyadék-tartályt). 5. Rögtön ezután helyezze az öblítıfolyadék-tartályt a Dako Omnis készülékbe. A Dako Omnis készüléken belül tárolt hígított oldat 7 napig használható fel. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A fel nem használt hígított oldat 2-8 C-on 30 napig tárolható. Ha a hígított oldatot hidegben tárolták, hagyja, hogy felmelegedjen legalább 18 C-ra, mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe. MEGJEGYZÉS: A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) Az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) azonnal felhasználható reagens. Mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe, pattintsa fel a kupakot, hajtsa hátra és rögzítse a kivágásban. Az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A futtatás befejezıdése után az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) oldatot le lehet hőteni a tárolási hımérsékletre (2-8 C) a készüléken belüli stabilitási idı megırzése érdekében. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) Az ISH Pepsin (Dako Omnis) azonnal felhasználható reagens. Mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe, gyızıdjön meg róla, hogy a reagens fel van olvasztva, majd pattintsa fel a kupakot, hajtsa hátra és rögzítse a kivágásban. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 9/55

10 Emlırák Az ISH Pepsin (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A futtatás befejezıdése után az ISH Pepsin (Dako Omnis) oldatot le kell hőteni a tárolási hımérsékletre (-18-8 C) a készüléken belüli stabilitási idı megırzése érdekében. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) A Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) azonnal felhasználható rögzítıszer, amelyet a Dako Omnis készüléken kívül használunk. A Fluorescence Mounting Medium rögzítıszert a használat után azonnal hőtse le (2-8 C) tárolási hımérsékletre. A.7 További tartozékok A következı tartozékok is betöltendık a Dako Omnis készülékbe: ionmentesített víz, hígított Wash Buffer 20x (Dako Omnis) (kód: GC807), Clearify (kód: GC810), ISH Cleaning Solution (kód: GC207) és ISH Lid (Dako Omnis) (kód: GC102), a Dako Omnis felhasználói útmutatóban meghatározottak szerint. B. Festési eljárás - emlı B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a hibridizációs próba a Dako Omnis készülékben történı automatizált direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) vizsgálathoz, amelyet a kiegészítı reagensek GM300, GM301, GM302, GM303 és GM304 (GM304 a készüléken kívül) használatával együtt a HER2 génamplifikáció kvantitatív meghatározására terveztek. A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozzon minden utasítást, és ismerkedjen meg minden komponenssel és a vonatkozó óvintézkedésekkel. Az automatizált FISH festési eljárás a Dako Omnis készülékben tartalmazza a szövetmetszetek paraffinmentesítését (, a cél kinyerését, a pepszines emésztést, a hibridizációt és a magas stringenciájú mosást. A lemezek kiadása a száraz kiadó állomáson történik. A protokoll valamennyi lépése elıre be van programozva a Dako Omnis szoftverben. Kérjük tanulmányozza a Dako Omnis felhasználói útmutató(ka)t a lemezekkel, ISH fedéllel, reagensekkel stb. kapcsolatban. Három hitelesített HER2 IQFISH protokoll: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium és HER2 IQFISH Pepsin Long amelyek csak a pepszines emésztési idıben különböznek van elıre programozva a Dako Omnis szoftverben, és ezek közül lehet választani a lemeztartó állvány (Slide Rack) mind az öt lemezére. Ez lehetıvé teszi a szöveti emésztés optimalizálását, amelyet a preanalitikai feltételek módosíthatnak. A HER2 IQFISH Pepsin Medium protokollt tekintjük standard potokollnak. A különbözı festési protokollok a Dako Link Omnis munkaállomáson tekinthetık meg. B.2. A festést megelızı eljárás 1. Válassza ki az egyes lemezekhez az alkalmazni kívánt HER2 IQFISH protokollt a DakoLink Omnis munkaállomás programjában az IQFISH protokoll részben. 2. Nyomtassa ki a lemezcímkéket, és csatolja ıket az üveglemezekhez. 3. Rakja a lemezeket a lemeztartó állványba. További információt a Dako Omnis Használati útmutatójában talál. Egy lemeztartó állványba 1-5 lemez helyezhetı. Javasolt legalább két lemez megfestése egy HER2 IQFISH festési menetben. 4. Töltse be a lemeztartó állványt a Dako Omnis készülékbe. 5. Töltse be az ISH fedelet (ISH Lid) (egy ISH fedelet állványonként) a Dako Omnis készülékbe. 6. Gyızıdjön meg róla, hogy az öblítıfolyadék tartályok a készülékben vannak, és hogy a Dako Omnis regisztrálta ıket. Öblítıfolyadékok: Clearify, hígított ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), hígított ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) és hígított Wash Buffer (Dako Omnis). ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 10/55

11 Emlırák 7. Töltse be az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) és ISH Pepsin (Dako Omnis) reagenseket és a frissen elkevert HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és ISH Cleaning Solution próbát a reagenseket tároló modulba (Reagent Storage Modul). Ellenırizze, hogy valamennyi felpattintható kupak nyitva van. 8. Kövesse a képernyın megjelenı utasításokat, és koppintson a Done (Kész) feliratra a festés elindításához. B.3. Festési eljárás A Dako Omnis készüléken történı HER2 IQFISH festési eljárás (amelyet az 1. táblázat foglal össze) a Dako Link Omnis munkaállomáson követhetı nyomon: 1. táblázat: A HER2 IQFISH festési protokoll lépéseinek egyszerősített vázlata. Lépés Reagens Idı és hımérséklet Viasztalanítás Clearify (tisztítószer) 10 perc 38 C-on. Cél kinyerése ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 15 perc 97 C-on. Mosás ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 perc, 32 C Emésztés* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 perc, 15 perc vagy 20 perc Szárítás Denaturálás Hibridizálás Magas stringenciájú mosás HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 15 perc 45 C-on. 10 perc 66 C-on. 75 perc 45 C-on. 10 perc 61 C-on. * Három hitelesített pepszines emésztési idı választható a fenti HER2 IQFISH protokollok használatával. Ha nem tervez további ISH festést, hőtsön le minden reagenst a javasolt tárolási hımérsékletre. B.4. Utófestési eljárás Vegye ki a lemezeket és alkalmazzon legfeljebb 30 µl, DAPI-t tartalmazó Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszert a lemezek célterületén. A Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszernek teljesen be kell fednie a szövetmetszetet. Használjon üveg fedılemezt. MEGJEGYZÉS: A tárgylemezek a rögzítést követıen 15 perc elteltével, illetve 7 napon belül értékelhetık ki. A lemezek elhalványulhatnak, ha fény vagy magas hımérséklet éri ıket. Az elhalványulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, C-on tárolja. Minıség-ellenırzés - emlı 1. A jeleknek világosnak, jól elkülönülınek és könnyen értékelhetınek kell lennie. 2. A normál sejtek a festési folyamat belsı kontrolljának lehetıségét biztosítják. A normál sejteken 1-2 jól látható zöld jelnek kell lennie, amelyek arra utalnak, hogy a CEN-17 PNS próba sikeresen hibridizálódott a 17. kromoszóma centromer régiójával. Továbbá, a normál sejteken 1-2 jól látható piros jelnek kell lennie, amelyek arra utalnak, hogy a HER2 DNS próba sikeresen hibridizálódott a HER2 génnel/génekkel.

12 A szövetmetszetek elkészítésébıl adódóan néhány normál sejt a várható 2 jelnél kevesebbet fog tartalmazni az egyes színekbıl. Emlırák A normál sejtek jelészlelési hibája vizsgálati hibára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 3. A sejtmagnak morfológiailag épnek kell lennie a DAPI szőrıvel történı értékeléskor. A túl sok szellemképes sejt és általánosan rossz minıségő sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére utal, ami jelvesztéshez vagy a jel fragmentálódásához vezet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 4. Legalább 20 értékelhetı tumorsejtnek kell lenni a mintában. 5. Az egyes laboratóriumokban a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárások eltérése módosíthatja az eredményeket, ezért a Dako által biztosított kontrollminták mellett szükséges a rendszeres belsı kontrollok alkalmazása. A festés értelmezése - emlı A kiértékelésre alkalmas szövet Csak invazív karcinómás betegek mintáit értékelje. Ha egyazon mintában megtalálható in situ és invazív karcinóma, akkor csak az invazív komponenst értékelje. Kerülje a nekrotikus területeket és azokat a részeket, ahol a sejtmag határvonalai nem egyértelmőek. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá esı sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestıdésük pedig nem specifikus vagy túl erıs. Jelszámlálás Határozza meg a tumor helyét a H&E-vel festett lemezen, és értékelje ugyanezt a területet a FISH festett lemezen. Pásztázzon végig több tumorsejt-területet, hogy felmérje az esetleges heterogenitásokat. Válasszon ki egy olyan területet, amelyben jó a sejtmagok eloszlása. Kezdje az elemzést a kiválasztott terület bal felsı kvadránsában, majd balról jobbra pásztázva, az alábbi irányelveknek megfelelıen számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag maghatáron belül esı jeleit (valamint lásd: 2. függelék). - Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölıdését. - Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. - A nagyfokú HER2 génamplifikációt mutató sejtmagokban a HER2 jelek olyan közel kerülhetnek egymáshoz, hogy jelcsoportot hoznak létre. Ilyenkor a HER2 jeleket nem lehet megszámolni, a számukat becsléssel kell megállapítani. Külön figyelmet kell fordítani a zöld jelekre, mert a HER2 jelcsoportok elfedhetik ıket. Kétséges esetben, kérjük, használjon speciális FITC szőrıt a zöld jelek ellenırzésére. Ne vegye figyelembe a számlálásnál a jelet nem adó sejtmagokat és azokat sem, amelyek csak egyszínő jelet adnak. Kizárólag azokat a sejtmagokat használja az értékeléshez, amelyek mindkét színbıl legalább egy FISH jelet mutatnak. Jelszámlálási útmutató 1 Ne számolja. A sejtmagok átfedik egymást, nem minden részük látható. 2 Két zöld jel: ne vegye figyelembe a számlálásnál a csupán egyszínő jeleket kibocsátó sejtmagokat 3 3 zöld és 12 piros jelként számolandó (csoportos becslés) ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 12/55

13 Emlırák 4 1 zöld és 1 piros jelként számolandó. - Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. 5 Ne számolja (túl vagy alulemésztett sejtmagok) vagy Hiányzó jelek a sejtmagok közepén (fánk alakú sejtmagok) 6 2 zöld és 3 piros jelként számolandó. - Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. 7 1 zöld és 5 piros jelként számolandó 8 3 zöld (1 zöld jel a fókuszon kívül) és 3 piros jelként számolandó 9 Piros jelcsoport fedi el a zöld jeleket, ellenırizze a zöld jeleket speciális FITC szőrıvel, vagy ne számolja ıket Jegyezze fel az eredményeket egy táblázatban az 1. függelékben bemutatott módon. Szövetmintánként 20 sejtmag jeleit számolja meg, ha lehetséges, akkor elkülönülı tumorterületekrıl (18). Számolja ki a HER2/CEN-17 arányt úgy, hogy elosztja a piros HER2 jelek teljes számát a kék CEN-17 jelek teljes számával. A 2-nél nagyobb vagy azzal egyenlı HER2/CEN-17 arányt mutató mintákat HER2 génre nézve amplifikáltnak kell tekinteni (3, 18-20). A határérték közelébe esı eredményeket (1,8-2,2) csak óvatosan szabad értelmezni. Ha az arány közel esik a határértékhez (1,8-2,2), akkor számolja meg 20 további sejtmag jeleit, és számolja ki újra az arányt a 40 sejtmagra. Kétséges esetben az ilyen mintát tartalmazó tárgylemezt újra kell számolni. Határesetekben ajánlott, hogy a patológus és a kezelıorvos konzultáljon egymással. Korlátozások - emlı 1. Kizárólag a Dako Omnis készülékeken történı automatizált használatra. 2. Speciális szakképzettséget igényel a szövetek kiválasztása, fixálása, valamint a lemez elıkészítése és a IQFISH festés értelmezése területén. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) festést ne végezzék olyan személyek, akik színtévesztık. 3. A FISH eredmények függenek a szövet festést megelızı kezelésétıl és elıkészítésétıl. A nem megfelelı fixálás, mosás, szárítás, felfőtés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Az inkonzisztens eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek változtatása, illetve a szövetben eredendıen található szabálytalanságok is lehetnek. 4. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálatot nem értékelték mikrokalcifikációt tartalmazó emlırák mintákon. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 13/55

14 Teljesítményjellemzık emlı Emlırák A hibridizálás hatékonysága A HER2 IQFISH pharmdx hibridizációs hatékonyságát 180 formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszet felhasználásával vizsgálták három vizsgálati helyszínen. Mind a 180 szövetmetszet a termékre vonatkozó jelszámlálási útmutatók alapján lehetett értékelni. A hibridizáció hatékonysága 100%. A teljesítményjellemzıkre vonatkozó vizsgálatokban szereplı HER2/CEN-17 arányok meghatározása a jelen használati utasítás A festés értékelése címő szakaszában megadott pontozási irányelvek alapján, 20 sejtmagban a jelek megszámolásával történt. Analitikai érzékenység A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) analitikai érzékenységének vizsgálata 20 különbözı emlırák-szövetminta alapján történt (10 HER2 génamplifikált és 10 nem amplifikált minta). A HER2 jelek és a CEN-17 jelek számarányának megállapítása a jelek megszámolásával történt a szövetminta 20 normál sejtmagjában. A HER2/CEN-17 arány az emlırák-szövetmintákban beazonosított normál sejtek esetén 0,97-1,11 között volt. Analitikai specificitás A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat HER2 DNS próbáit végszekvenálták és feltérképezték, hogy megerısítsék egy 218 kb nagyságú, a HER2 gént is tartalmazó régió teljes lefedését. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) CEN-17 PNS próbáit FISH segítségével ellenırizték egyénileg és kombinációban, hogy megerısítsék azok specifikus hibridizációját a 17. kromoszóma centromer régiójához. A 17. kromoszómától eltérı kromoszómákhoz történı kereszthibridizáció kizárása érdekében a vizsgálatok metafázisban történtek a hagyományos Dako QC eljárásoknak megfelelıen. Összesen 275 elkülönülı jellel bíró metafázis terjedést értékeltek a HER2 DNS és CEN-17 PNS próba keverékek specifikus hibridizációjához. A hibridizáció mind a 275 esetben specifikus volt a 17-es kromoszómára. A 275 eset egyikében sem volt megfigyelhetı kereszthibridizáció valamely másik kromoszóma lókuszára. A próba specificitása tehát 100% volt (275 a 275-bıl). Annak mérésére, hogy az IQFISH vizsgálat hogyan tudja azonosítani kizárólag a HER2 és CEN-17 célanyagot, más anyagokkal való interferencia nélkül, emlırákszövetmintákon végeztek vizsgálatokat a HER2 és CEN-17 próbák kihagyásával a hibridizációs keverékbıl, és kizárólag a hibridizációs puffer használatával. Összesen 20 minta kiértékelése történt meg annak igazolására, hogy a jelek jelenléte nem kapcsolódik a próbakeverékhez. A 20 minta egyikében sem volt észlelhetı másik célkromoszóma vagy interferencia közeli kapcsolatban álló anyagokkal. A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat robosztusságát a PNS próba koncentrációjának, a cél kinyerési idı, a pepszin inkubálási idı, a denaturálási idı, a hibridizálási idı és a magas stringenciájú mosás idejének, valamint a hımérséklet változtatásával vizsgálták. A különbözı paramétereket öt FFPE emlırák-szövetmintán tesztelték (mind amplifikált, mind nem amplifikált szövetminták esetén). A PNS próbakoncentráció és a magas stringenciájú mosás hımérsékletének kivételével, amelyek esetén a hagyományos protokollbeállítás a beállítás része, minden paramétert teszteltek a hagyományos protokollbeállítások alatt és felett is. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 14/55

15 A vizsgálati paraméterek az alábbiak voltak: Emlırák PNS próba koncentrációja: 100% és +/-17% esetén vizsgálva. Cél kinyerési idı: 13 perc 45 másodperc és 16 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. Pepszin inkubálási idı: 14 perc 45 másodperc és 16 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. Denaturálási idı: 9 perc 45 másodperc és 10 perc 45 másodperc esetén vizsgálva. Hibridizálási idı: 70 perc és 80 perc esetén vizsgálva. Magas stringenciájú mosás ideje: 8 perc 45 másodperc és 11 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. Magas stringenciájú mosás hımérséklete: 59 C, 61 C és 63 C esetén vizsgálva. A három PNS próba koncentráció értékelése a frakcionált Design of Experiment kísérlettervezıben (JMP eszköz, SAS) történt, amelyet 12 különbözı festési protokollal végeztek el, amint azt a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat A robosztussági vizsgálatban alkalmazott tizenkét különbözı festési protokoll. Robosztussá gi protokoll száma Cél kinyerési idı (perc) Pepszin idı (perc) Denaturációs idı (perc) Vizsgálati paraméter Hibridizálási idı (perc) Magas stringenciájú mosás ideje (perc) Magas stringenciájú mosás hımérsékl ete ( 0 C) PNS konc. a próbakeverékben 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Mind az öt szövetminta festése mind a 12 protokoll alapján el lett végezve. A robosztussági vizsgálat eredménye a jelintenzitás és a morfológia minısége volt. Minden protokoll festıdést eredményezett az összes szövetmintában (összesen 60) világos, elkülönülı, könnyen értékelhetı jelekkel, amelyek jelszámításra alkalmasak voltak. Továbbá a szövetvastagság hatását a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat eredményeire úgy ellenırizték, hogy változtatták az FFPE emlırák-szövetminták metszetvastagságát. Összesen öt, különbözı vastagságú (3, 4, 5, 6 és 7 µm) humán emlırák minta öt egymást követı metszetét ellenırizték a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) segítségével. A HER2/CEN-17 arány átlagos variációs koefficiense 5,8% (4,3% és 7,1% között változik). ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 15/55

16 Emlırák Reprodukálhatóság A laboratóriumon belüli napi és tételszám szerinti reprodukálhatóság ellenırzése a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) segítségével történt. A vizsgálatot a HER2/CEN-17 arányok belsı, vak, randomizált vizsgálataként tervezték nyolc különbözı, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott emlırák minta használatával, amelyek különbözı HER2 génamplifikációs szinttel rendelkeznek. A nyolc minta ellenırzése a HercepTest segítségével történt, és két mintán HER2 IHC 0/1+, két mintán HER2 IHC 2+, két mintán HER2 IHC 3+ és két mintán elıre meghatározott, 1,5 és 2,5 közti, a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával megadott HER2/CEN-17 FISH arány jelentkezett. Az egyes mintákat három különbözı HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tétellel festették öt, nem egymást követı napon. A teljes vizsgálathoz összesen 240 szövetfestést dolgoztak fel, mivel minden kombináció duplán volt festve. Az 1. ábra mutatja a napok és tételek közti arányok variációit. Az adatok elemzése a Box-Cox transzformációval történt, egy random hatásmodellel az adatvariabilitás homogenitásának elérése érdekében. A teljes variációs koefficiens becsült értéke 4,3%, a napok, illetve tételek szerinti variáció részesedése pedig 1,5%, ill. 0%. 1. ábra A laboratóriumon belüli reprodukálhatósági vizsgálatban kapott HER2/CEN-17 arányok HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) használatával, beleértve a tételszám szerinti és a napi reprodukálhatósági végpontokat. Ezenkívül a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) napi és helyszín szerinti reprodukálhatóságát is vizsgálták három külsı helyszínen (egy USA-beli és két európai helyszínen), többrétegő, vak vizsgálattal 12 különbözı, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott emlırák mintán. Három minta HER2 IHC 0/1+ volt, három minta HER2 IHC 2+ volt, három minta HER2 IHC 3+ volt, és három minta elıre meghatározott HER2/CEN-17 FISH aránya 1,5 és 2,5 közötti a HercepTest, illetve a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával. A minták festését és elemzését a vizsgálati helyszíneken végezték. Minden minta legalább öt alkalommal lett festve öt nem egymást követı napon, és az egyes helyszíneken egy-egy megfigyelı értékelte ıket. 192 metszet festésére és statisztikai kiértékelésére került sor. Az adatok elemzését a Box-Cox transzformációval végezték és kiszámították a varianciakomponenseket. A felsı 95%-os konfidencia határon alapuló teljes variációs koefficiens 15%. A HER2/CEN-17 arány változása napok és helyszín szerint a 2. ábrán látható. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 16/55

17 Emlırák 2. ábra A HER2/CEN-17 arányok variabilitási diagramja nem átalakított egységekben a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) mellrák-szövetmintákon végzett napi és helyszín szerinti reprodukálhatósági vizsgálata alapján. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat megfigyelıtıl függı reprodukálhatóságát ellenırizték a belsı vezetéső módszerösszehasonlító vizsgálat részeként, amely három független megfigyelıvel értékelte a festett mintákat. A reprodukálhatósági vizsgálatot 140 különbözı, nem amplifikált és amplifikált HER2 génállapotú humán emlırák-mintán végezték el. Az adatok elemzése a Box-Cox transzformációval történt. A megfigyelık közti variációs koefficiens átlagos értéke 9%. Megismételhetıség A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) laboratóriumon belüli megismételhetıségi vizsgálatát nem amplifikált és amplifikált HER2 génállapotú humán emlırák-minták nyolc egymást követı metszetén végezték. A szöveteket duplán vizsgálták, összesen 240 lemezt (120 metszet duplán vizsgálva) öt nem egymást követı napon három különbözı tétel felhasználásával. Az adatok elemzéséhez használt random hatásmodell alapján lettek megállapítva a napok és tételek szerinti variancia értékek (amint az a belsı reprodukálhatósági vizsgálatban szerepel). A reziduális variancia megegyezik a másolatok közti varianciával és így a megismételhetıséggel. A megismételhetıségi variációs koefficiens felsı 95%-os konfidenciahatára 4,4%. Módszerösszehasonlító vizsgálatok A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eredmények összehasonlítása a HER2 IQFISH pharmdx eredményekkel A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) összehasonlító vizsgálatára került sor 140 humán emlırák-szövetminta esetén. A minták 77 HER2-nem amplifikált esetbıl és 63 HER2-amplifikált esetbıl álltak, ismert HercepTest eredménnyel, ahogy azt a 3. táblázat mutatja 3. táblázat A minták megoszlása a HercepTest eredmények és a HER2 FISH eredmények (HER2 génállapot) alapján, a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával. HercepTest festési Összesen eredmény n HER2 FISH állapot Amplifikált Nem amplifikált Az összes FISH vizsgálattal tesztelt minta ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 17/55

18 Emlırák A teljes egyezési százalék (OPA), a pozitív egyezési százalék (PPA) és a negatív egyezési százalék (NPA) számításával, a két vizsgálatban kapott HER2 génállapot kereszttáblázatos ábrázolásának eredményei a 4. táblázatban láthatók. A két vizsgálattal kapott HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggést a 3. ábra mutatja. 4. táblázat A HER2 génállapot kereszttáblázatos ábrázolása HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) és HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) felhasználásával. Nem amplifikált HER2 génállapot (K5731) Amplifikált Összesen HER2 génállapot Nem amplifikált (Dako Omnis) Amplifikált Összesen OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% 3. ábra A HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggés HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával 140 emlırák minta esetén (lineáris illeszkedés: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. A lineáris illeszkedés érdekében az inverz varianciával súlyozva). Az elemzéshez a HER2/CEN-17 arányok logaritmikus transzformációnak lettek alávetve. A két festési módszer közötti átlagos különbség 95%-os konfidencia intervallum értéke HER2/CEN-17 arány = 2 esetén [0,002; 0,031]. Ez azt jelenti, hogy nem várható 3%-nál nagyobb eltérés 95%-os konfidencia esetén. A közepes négyzetes hiba négyzetgyökének (RMSE) értéke 9%, ami azt jelzi, hogy az átlagos fluktuáció mértéke az átlagérték körül van. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 18/55

19 Emlırák A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eredmények összehasonlítása a PathVysion HER2 DNS próba készlet eredményekkel A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a PathVysion HER2 DNS próba készlet összehasonlító vizsgálatára került sor 140 humán emlırák-szövetminta esetén. A minták 80 HER2-nem amplifikált esetbıl és 80 HER2-amplifikált esetbıl álltak, ismert HercepTest eredménnyel, ahogy azt az 5. ábra mutatja. 5. táblázat A minták eloszlása a HercepTest eredmény és a HER2 FISH eredmény (HER2 génállapot) alapján, a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával. HercepTest festési Összesen eredmény n HER2 FISH állapot Amplifikált Nem amplifikált Az összes FISH vizsgálattal tesztelt minta A teljes egyezési százalék (OPA), a pozitív egyezési százalék (PPA) és a negatív egyezési százalék (NPA) számításával, a két vizsgálatban kapott HER2 génállapot kereszttáblázatos ábrázolásának eredményei a 6. táblázatban láthatók. A két vizsgálattal kapott HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggést a 4. ábra mutatja. 6. táblázat A HER2 génállapot kereszttáblázatos ábrázolása HER2 DNS próba készlet és HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) felhasználásával. Nem amplifikált HER2 génállapot (PathVysion) Amplifikált Összesen HER2 génállapot Nem amplifikált (Dako Omnis) Amplifikált Összesen OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 19/55

20 Emlırák 4. ábra A HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggés HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és PathVysion felhasználásával 140 emlırák minta esetén (lineáris illeszkedés: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. A lineáris illeszkedés érdekében az inverz varianciával súlyozva). Az elemzéshez a HER2/CEN-17 arányok logaritmikus transzformációnak lettek alávetve. A két festési módszer közötti átlagos különbség 95%-os konfidencia intervallum értéke HER2/CEN-17 arány = 2 esetén [0,001; 0,031]. Ez azt jelenti, hogy nem várható 3%-nál nagyobb eltérés 95%-os konfidencia esetén. A közepes négyzetes hiba négyzetgyökének (RMSE) értéke 10%, ami azt jelzi, hogy az átlagos fluktuáció mértéke az átlagérték körül van. Klinikai használhatóság a Herceptin (trastuzumab) kezelést kapó páciensek kiválasztásában A HER2 FISH pharmdx készletet PathVysion HER-2 DNS próba készlet és Dako HercepTest segítségével vizsgálták összehasonlító vizsgálat keretein belül. A HER2 FISH tesztelés eredményei összesen 940 emlırák minta esetén érhetık el. A HER2 FISH pharmdx Kit eredmények összehasonlítása a PathVysion HER2 DNS próba készlet eredményekkel Három vizsgálatot végeztek a HER2 FISH pharmdx készlet eredményeinek a PathVysion HER-2 DNS próba készlet eredményeivel való összehasonlítására (lásd a 7. táblázatot). A vizsgálatokat földrajzilag eltérı helyeken végezték, és nem volt átfedés a minták használatában. Összesen 328 mintát vizsgáltak. 7. táblázat A FISH módszer összehasonlító vizsgálatok összesített adatai. Vizsgálat megnevezése Konkordancia (95% konfidencia intervallum) Pozitív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum) Negatív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum) Konkordancia vizsgálat (dán minta, N=190) 93,68% (90,22% - 97,14%) 86% (77,34% - 95,08%) 97% (94,05% - 99,89%) Konkordancia vizsgálat (japán minta, N=52) 96,15% 97% Konkordancia vizsgálat (francia minta, N=86) (21)* * A cikk tartalmazza az összehasonlító adatokat, de a HER2 FISH vizsgálatot nem azonosították. Összesen 12 eltérı vizsgálati eredmény volt a HER2 FISH pharmdx készlet és a PathVysion HER-2 DNS próba között a dán klinikai minta esetén (lásd a 8. táblázatot). 96% ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 20/55

21 8. táblázat A 12 eltérı vizsgálati eredmény adatainak összefoglalása. HER2 FISH(pozitív)/PathVysion(negatív) HER2 FISH arány 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) PathVysion arány 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) HercepTest eredmény Azonosító Azonosító Emlırák HER2 FISH(negatív)/PathVysion(pozitív) HER2 FISH arány ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1,52-1,95) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) PathVysion arány 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) HercepTest eredmény * az átlagos logaritmikus arányok CI értékébe a 2,0 is beletartozik. A zárójelben szereplı számok a 95% CI (konfidencia intervallum) értékek Ebben az eltérés-elemzésben logaritmikus arányok szerepelnek. A 95%-os konfidencia intervallum kiszámítása 60 logaritmikus arányhoz történt azokból a sejtmagokból, amelyeket a PathVysion HER-2 DNS próba arányának számításához használtak. A 4 esetben, ahol a HER2 FISH pharmdx készlet pozitív volt és a PathVysion HER-2 DNS próba negatív, a kritikus 2 érték nem szerepel az intervallumban. A 8 esetben, ahol a HER2 FISH pharmdx készlet negatív volt és a PathVysion HER-2 DNS próba pozitív, a kritikus 2 érték 3 esetben (#234, 284 és 735) szerepel a 95%-os konfidencia intervallumban. Hasonlóképpen, a 95%-os konfidencia intervallum kiszámítása a logaritmikus arányokra azokból a sejtmagokból történt, amelyeket a HER2 FISH pharm Dx készlet arányszámításához használtak. A 4 esetben, ahol a HER2 FISH pharmdx készlet pozitív volt és a PathVysion HER-2 DNS próba negatív, a kritikus 2 érték 2 esetben (#160 és 306) szerepel a konfidencia intervallumban. A nyolc esetben, ahol a HER2 FISH pharmdx készlet negatív volt és a PathVysion HER-2 DNS próba pozitív, a kritikus 2 érték 1 esetben (#881) szerepel a 95%-os konfidencia intervallumban. A HER2 FISH pharmdx készlet eredményeinek és a HercepTest eredményeinek összehasonlítása Négy vizsgálatot végeztek a HER2 FISH pharmdx készlet és a HercepTest eredményeinek összehasonlítására. Összesen 940 mintát hasonlítottak össze, 3+ festési eredmény pozitív IHC eredményként való felhasználásával a HercepTest vizsgálatban (lásd: 9. táblázat) ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 21/55

22 Emlırák 9. táblázat A HER2 FISH pharmdx készlet és az IHC (HercepTest ) összehasonlító vizsgálatainak összefoglalása. Vizsgálat megnevezése Konkordancia (95% konfidencia intervallum) Pozitív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum) Negatív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum) Dán klinikai minta (N=682) 93,11% (91,21% - 95,01%) 91% (87,39% - 94,57%) 94% (92,12% - 96,46%) Japán klinikai minta (N=52) Francia vizsgálat (N=86) (31) Dán kísérleti vizsgálat (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% A HercepTest és a HER2 FISH vizsgálat eredményeinek eloszlása a dán klinikai minta esetén a 10. táblázatban látható. 10. táblázat A HER2 állapot eloszlása a HercepTest és a HER2 FISH pharmdx készlet alapján. HercepTest festési Összesen eredmény n % % HER2 FISH állapot Amplifikált Nem amplifikált Az összes FISH vizsgálattal tesztelt minta ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 22/55

23 Emlırák Hibaelhárítás - emlı Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. Nincs jel, vagy a jel gyenge 1a. A reagenseket magas hımérséklet hatásának tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt 1b. A mikroszkóp nem mőködik megfelelıen - Nem megfelelı szőrıkészlet - Nem megfelelı lámpa - A higanylámpa túl régi - Piszkos és/vagy repedt kollektor lencsék - Nem megfelelı immerziós olaj 1a. Ellenırizze a tárolási körülményeket. Gyızıdjön meg róla, hogy az IQISH próbakeverék és pepszin küldemény átvételekor volt szárazjég a csomagolásban. Gyızıdjön meg róla, hogy a reagenseket az elıírt körülmények között tárolták. 1b. Ellenırizze a mikroszkópot, és gyızıdjön meg arról, hogy a használatban lévı szőrık illenek a próbakeverék fluorokrómhoz, és hogy a higanylámpa megfelelı és nem használták a várható élettartamán túl (lásd: 2. függelék). Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkóp-beszállítójával. 1c. Gyengült jelek 1c. Ne végezze túl hosszú ideig a mikroszkópos vizsgálatot, és a lehetı legkisebb mértékben tegye ki a mintákat az erıs fényforrások hatásának. 1d. Tévesen azonosított pufferek 1d. Cserélje ki a puffereket, és gyızıdjön meg róla, hogy helyes a pufferek regisztrációja (a munkaállomáson) és azonosítása (az érintıképernyın). További információt a Dako Omnis Használati útmutatójában talál. Megjegyzés: Az ISH Pre-Treatment Solution színe zöld, az ISH Stringent Wash Buffer színe sárga. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 23/55

24 Emlırák Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 2. Jelmentes területek 3. Túl erıs háttérfestés 4. Gyenge minıségő szövetmorfológia 5. Fokozott zöld autofluoreszcencia a lemezen, FFPE szövetet nem tartalmazó területeken is 2. Rögzítés során keletkezett légbuborékok 3a. Nem megfelelı szövetfixálás 3b. A hibridizált metszet túl sokáig lett kitéve erıs fény hatásának 4a. Nem megfelelı pepszinkezelés 4b. A túl hosszú pepszinkezelés vagy a nagyon vékony metszetek szellemszerő vagy fánk alakú sejtek megjelenését eredményezhetik 5. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata 2. Akadályozza meg a légbuborékok képzıdését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével finoman ütögetve távolítsa el azokat. 3a. Ügyeljen arra, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon. 3b. Ne végezze túl hosszú ideig a mikroszkópos vizsgálatot, és a lehetı legkisebb mértékben tegye ki a mintákat az erıs fény hatásának. 4a. Használjon egy másik festési protokollt a három lehetséges protokoll közül. Gondoskodjon róla, hogy az ISH Pepsin (Dako Omnis) reagenst a megfelelı hımérsékleten tárolják. 4b. Próbáljon meg rövidebb pepszines inkubációs idıvel rendelkezı festési protokollt használni. Ügyeljen arra, hogy a metszetvastagság 4-6 µm legyen. 5. Válasszon az elıírt üveglemezek közül. Ellenırizze, hogy az üveglemezek szavatossági ideje nem járt le. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Mőszaki Szolgálatát. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 24/55

25 Emlırák 1. sz. függelék - emlı HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) (kód: GM333) Számlálási vázlat Festési menet azonosítója (Log ID): Festési menet dátuma: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tételszám: Mintaazonosító: Számlálja meg a jeleket 20 sejtmagban Sejtmagszám HER2 eredmény (piros) CEN-17 eredmény (zöld) Sejtmagszám Összes (1-10) Összes (11-20) HER2 eredmény (piros) CEN-17 eredmény (zöld) A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 20 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN-17 jelek számának összegével. Ha a HER2/CEN-17 arány közel esik a határértékhez (1,8--2,2), akkor számolja meg 20 további sejtmag jeleit, és számolja ki újra az arányt a 40 sejtmagra. A határértékre vagy a kritikus cut-off érték közelébe (1,8-2,2) esı arányt eredményezı minták kiértékelését különös gonddal kell végezni.(lásd a számlálási útmutatót). Végeredmény (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 25/55

26 Emlırák Számlálja meg a jeleket további 20 sejtmagban Sejtmagszám HER2 eredmény (piros) CEN-17 eredmény (zöld) Sejtmagszám Összes (21-30) Összes(31-40) HER2 eredmény (piros) CEN-17 eredmény (zöld) Számolja ki a HER2/CEN-17 arányt a 40 megszámolt sejtmag alapján Végeredmény (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány Arány < 2: HER2 génamplifikáció nem volt megfigyelhetı Arány 2: HER2 génamplifikáció megfigyelhetı volt Dátum és aláírás, technikus: Dátum és aláírás, patológus: A pontozási irányelveket lásd a Festés értelmezése címő részben. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 26/55

27 Emlırák 2. sz. függelék - emlı HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) (kód: GM333) A fluoreszcens mikroszkóp mőszaki jellemzıi A Dako az alábbi eszközöket javasolja használatra a HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333 termékhez: 1. Mikroszkóp típus Epifluoreszcens mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (jegyezze fel a használati idıt) 3. Objektívek A szöveti szőréshez használhatók az olajimmerziós 16X vagy 20X objektívek Erıs nagyításhoz és jelszámláláshoz csak olajimmerziós objektívek, pl. 100X használata javasolt 4. Szőrık A speciális fluorokrómokhoz egyedi szőrıket terveznek, és ezeket kell használni. A Dako egy speciális DAPI szőrı használatát javasolja egy jó minıségő Texas Red/FITC kettıs szőrıvel. DAPI szőrı, pl. Chroma filter # Texas Red/FITC kettıs szőrı, pl. Omega Optical filter # XF53 vagy Chroma filter # A Texas Red és FITC egyes szőrık használhatók a megerısítéshez és a számláláshoz Fluorokróm Gerjesztési hullámhossz Emissziós hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm A különbözı mikroszkóptípusokhoz különbözı szőrık valók, és a minták értelmezéséhez elengedhetetlen a megfelelı szőrık használata. A további részletekért, kérjük, lépjen kapcsolatba a mikroszkóp-beszállítójával vagy a Dako képviselıjével. 5. Olaj Nem-fluoreszcens olaj Óvintézkedések 50 wattos higanylámpa nem javasolt Rhodamine szőrık nem használhatók Hármas szőrık használata nem javasolt Egy nem-optimalizált mikroszkóp problémákat okozhat a fluoreszcens jelek leolvasásakor. Ügyeljen rá, hogy ne használja a fényforrást a lejárati idején túl, és hogy megfelelıen igazítsa be és fókuszálja azt. A vásárlónak tájékozódnia kell a higanylámpa gyártójának ajánlásai felıl, és be kell azokat tartania. Gondoskodjon arról, hogy a mikroszkóp karban legyen tartva és a higanylámpa elhelyezése megfelelı legyen, még mielıtt értelmezi az eredményeket. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehetı legkisebb mértékben tegyük ki a gerjesztı fénynek, hogy a fluoreszcencia halványulása minimális legyen. Javasoljuk, hogy beszélje meg a gyártóval a használt mikroszkóptípus beállításait, vagy tájékozódjon a vonatkozó irodalomból, mielıtt elkezdi az in situ fluoreszcens hibridizációs vizsgálatot. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 27/55

28 Gyomorrák Összefoglaló és magyarázat gyomor A humán HER2 gén (más néven ERBB2 vagy NEU) a 17-es kromoszómán helyezkedik el, és a HER2 fehérje (p185 HER2 ) kódolásáért felelıs. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozinkináz, amely homológ az epidermális növekedési faktor receptorral (EGFR vagy HER1) (1-2). A HER2 gén minden normál diploid sejtben két példányban van jelen. A HER2 fehérje túlzott mértékő expresszióját és a HER2 gén amplifikációját gyomorrákban számos tanulmányban kimutatták (23). IHC vagy FISH módszerrel a páciensek körülbelül 20%-ában mutatható ki a HER2-pozitivitás (23). Preklinikai in vitro és in vivo tanulmányok során bebizonyították, hogy a trastuzumab (Herceptin ) hatékony különbözı gyomorrák-modellekben, ami klinikai tanulmányok elindításához vezetett (23-27). A Hoffmann-La Roche cég által szponzorált III. fázisú BO18255 (ToGA HER2 pozitív, elırehaladott stádiumú gyomorrákos betegeken történı, a trastuzumab nyílt jelöléső, randomizált, több tumortípusra terjedı, III. fázisú vizsgálata fluoropirimidin és cisplatin kezeléssel kombinálva, szemben a kizárólagosan alkalmazott kemoterápiával, mint elsıdleges terápiával) tanulmányban részt vevı betegek mindegyikét a Dako HercepTest (IHC) és a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) használatával választották ki, ahol a HER2 pozitivitást ily módon definiálták: IHC 3+ vagy FISH+ (HER2/CEN ). A tanulmány igazolta mindkét teszt, a HercepTest (IHC) és a HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) klinikai használhatóságát az olyan elırehaladott stádiumú gyomorrákban vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı betegek HER2-státuszának felmérésében, akik esetében trastuzumab kezelés jön szóba (28). Nem választottak ki olyan pácienseket, akiknél a tumor nem volt génamplifikált, de a HER2 fehérje kisebb vagy nagyobb mértékben emelkedetten expresszált volt [FISH(-)/IHC 2+]. Kérdéses ezért, hogy azoknál a pácienseknél is eredményes lehet a Herceptin kezelés, akiknél a tumor nem génamplifikált, de a HER2 fehérje emelkedetten expresszált [vagyis FISH(-), IHC 2+ vagy 3+]. A vizsgálat azt is megmutatta, hogy a génamplifikáció (FISH) és a fehérje emelkedett expressziója (IHC) között nincsen olyan összefüggés, mint a mellrák esetében, ezért a HER2 státusz megállapítása nem korlátozódhat egyetlen módszerre. Ez a termék (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) egy IQISH próbakeverék az automatizált FISH eljáráshoz, amely a HER2 génamplifikáció észlelésére szolgál. Ezt a terméket a Dako Omnis készülékkel kell használni a felsorolt kiegészítı reagensekkel együtt. A termék a manuálisan végrehajtott HER2 génamplifikációs vizsgálatból HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) származik. Az eljárás elve gyomor A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) egy IQ ISH próba, amely egyrészt Texas Red festékkel megjelölt DNS próbák keverékébıl (ezek egy 218 kb nagyságú régiót ezen belül a 17-es kromoszómán lévı HER2 gént fednek le), másrészt a 17-es kromoszóma centromer régiójára (CEN-17) irányuló, fluoreszceinnel megjelölt peptid-nukleinsav (PNS)(13) próbák keverékébıl áll. A két célszekvencia specifikus hibridizációja világosan látható piros színő fluoreszcens jelet eredményez minden egyes HER2 gén lókuszán, és ugyancsak jól látható, de zöld színő fluoreszcens jelet eredményez valamennyi 17-es kromoszóma centromer régióján. A HER2 génamplifikácónak a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) használatával történı értékelése teljes mértékben automatizált eljárás a Dako Omnis készüléken. Három különbözı hitelesített HER2 FISH festési protokoll választható ki a Dako Link Omnis Munkaállomás programban. A protokollok csak a pepszin emésztési idı tekintetében különböznek, így választható 10 perces (Rövid protokoll), 15 perces (Közepes protokoll) vagy 20 perces (Hosszú protokoll) emésztési idı (a részleteket lásd alább). A Közepes protokoll ajánlott a kezdeti analízishez. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 28/55

29 Gyomorrák A Dako Omnis készülékben történt festést követıen a mintákat Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszerrel fixálják, amely 4',6-diamidino-2-fenilindolt (DAPI) tartalmaz, majd pedig lefedik. Megfelelı szőrıkkel ellátott fluoreszcens mikroszkóp használatával (lásd 5. függelék) meghatározható a tumorsejtek elhelyezkedése, és megszámlálhatók a piros (HER2) és zöld (CEN-17) jelek. Ezt követıen a HER2/CEN-17 arány kerül kiszámításra. Az elemzett szövetmetszetben lévı normál sejtek az elıkezelés és a hibridizáció hatékonyságának belsı pozitív kontrolljaként szolgálnak. A részleteket illetıen tanulmányozza A festés értékelése címő szakaszt. A lemezek, ISH fedelek (Dako Omnis) (kód: GC102), reagensek, öblítıfolyadékok és hulladék betöltésével és eltávolításával kapcsolatos részletes útmutatásért, kérjük, laspozza fel a Dako Omnis felhasználói útmutatóját, ill. útmutatóit. Reagensek gyomor A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a kiegészítı reagensek önmagukban, külön is rendelhetık. Mellékelt anyagok A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, azonnal felhasználható Texas Red festékkel megjelölt HER2 DNS próba és fluoreszcens festékkel megjelölt CEN-17 PNS próba, IQISH hibridizációs pufferoldatban. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) terméket szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a reagens nem volt kitéve magas hımérsékletnek a szállítás közben. A reagenst tartalmazó üvegeket mindig álló helyzetben kell tárolni vagy mozgatni. Az üveg egy arany bevonatú fémgolyót tartalmaz, amely lehetıvé teszi a reagens elkeverését a Dako Omnis keverı készülékben (Dako Omnis Mixing Device) (lásd a Dako Omnis keverı készülék felhasználói útmutatóját). Fontos, hogy alaposan el legyen keverve a reagens, mielıtt betölti azt a Dako Omnis készülékbe. Szükséges, de nem biztosított anyagok Kiegészítı reagensek Az alábbiakban felsorolt reagensek jelenléte szükséges a Dako Omnis készülékben ahhoz, hogy a HER2 génamplifikációs elemzést végre lehessen hajtani a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbával: ISH Pre-Treatment Solution (elıkezelı oldat) (20x) (Dako Omnis): 175 ml, 20-szoros koncentrációjú; Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályban (termékkód: GC109) hígítandó. A termék antimikróbás szert, valamint inaktív zöld színezéket tartalmaz a könnyő azonosítás és kezelés érdekében. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml, 96%-os etanol (azonnal felhasználható). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepszin A oldat (azonnal felhasználható), ph 2,0; stabilizátort és antimikróbás szert tartalmaz. A pepszint szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a reagens nem volt kitéve magas hımérsékletnek a szállítás közben. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml konyhasós nátrium-citrát puffer 20x-os koncentrációjú;1:20 arányban hígítandó Dako Omnis 3,5 L öblítıfolyadék-tartályban (GC109). A termék antimikróbás szert, detergenst, valamint inaktív sárga színezéket tartalmaz a könnyő azonosítás és kezelés érdekében. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluoreszcens rögzítıszer (azonnal felhasználható) DAPI-val. Bár a fenti reagenseket nem szállítják a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) termékkel együtt, az alábbiakban röviden ismertetjük ıket. További információért, kérjük, tanulmányozza az egyes reagensek használati útmutatóját. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 29/55

30 Gyomorrák Kiegészítı reagensek és eszközök Dako Omnis (kód: GI100) Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) (kód: GC807) Clearify TM, (kód: GC810) Dako Omnis Mixing Device (kód:gc116) ISH Lid (kód: GC102) ISH Cleaning Solution (kód: GC207) Üveg fedılemezek a rögzítéshez (24 mm x 50 mm) A kiegészítı reagensek és eszközök használatával kapcsolatban lásd a Dako Omnis kezdı és haladó felhasználók számára írt használati útmutatókat. Mikroszkóp berendezés és tartozékok Flureszcens mikroszkóphoz használt szőrık: DAPI és FITC/Texas Red kettıs szőrı, vagy FITC és Texas Red mono szőrık- a részleteket lásd az 5. függelékben. A DAPI szőrı erıs nagyításon való használata negatívan befolyásolja a jelerısséget. Kerülni kell a hosszú expozíciós idıket. A fluoreszcens mikroszkóphoz fényforrásként 100 wattos higanylámpát kell használni. Más fényforrások használata nem javasolt ezekkel a szőrıkkel. Mikroszkóp lemeztartó (lemeztartó tálca 20 lemezhez csuklópántos - vagy hasonló - fedéllel). Óvintézkedések gyomor 1. In vitro diagnosztikai alkalmazás. 2. Kizárólag hozzáértı felhasználóknak. 3. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 10-<25% etilén-karbonátot tartalmaz, és 3- <5% sodium chloride. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) figyelmeztetı címkével van ellátva: Figyelem H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért olvassa el a biztonsági adatlapot. 4. A fixálás elıtt és után lévı szövetmintákat, valamint az összes velük érintkezı anyagot potenciális fertızı anyagként kell kezelni, és ennek megfelelıen kell ártalmatlanítani (14). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bırrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bı vízzel. 5. A téves eredmények elkerülése érdekében gondoskodjon arról, hogy a reagensek mikrobiológiai szennyezıdése a lehetı legkisebb mértékő legyen. 6. A megadottól eltérı szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 30/55

31 Gyomorrák 7. A reagens hígítása optimális. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 8. Megfelelı személyi védıfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bırre. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 9. A fel nem használt oldatot a helyi és országos elıírásoknak megfelelıen kell ártalmatlanítani. 10. A gyomorrák mintáinak heterogén volta miatt fontos, hogy gondosan átvizsgálja a teljes mintát, és értékelje a jeleloszlást, mielıtt kiválasztana egy területet jelszámlásra. 11. Nem javasolt túl kicsi minták értékelése (a minták morfológiája legyen ép és legyen elegendı sejtmag a számoláshoz). 12. Ha a HER2 FISH analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2 státusz megbízható meghatározása érdekében javasolt, hogy több (7-8) értékelhetı biopsziás mintát elemezzen a tumor különbözı régióiból. 13. Egy biopsziában valamennyi mag azonosításához fontos a H&E-vel festett lemez vizsgálata. 14. A HER2 génamplifikáció és a HER2 fehérje emelkedett expressziója között nincsen olyan szoros összefüggés, mint a mellrák esetében, ezért a HER2 státusz megállapítása nem korlátozódhat egyetlen módszerre. Tárolás gyomor A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst sötét helyen, <-18 C hımérsékleten (-18 C -25 C a javasolt tartomány) kell tárolni. A reagenst tartalmazó üvegeket mindig álló helyzetben kell tárolni vagy mozgatni. A reagens legfeljebb 10 alkalommal való lefagyasztása és felolvasztása nem befolyásolja a termék hatékonyságát. Ne hagyja ezt az anyagot szobahımérsékleten. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst és a kiegészítı reagenseket (ISH Pepsin (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis)) károsan befolyásolhatja, ha hı hatásának vannak kitéve. Ne hagyja ezeket az anyagokat szobahımérsékleten. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenst és a kiegészítı reagenseket (ISH pepsin (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis)) károsan befolyásolhatja, ha erıs fénynek vannak kitéve. Ne tárolja ezeket a komponenseket és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. Tárolja a kiegészítı reagenseket (ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20) (Dako Omnis) és Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) sötétben és 2-8 C hımérsékleten. Tárolja az ISH Pepsin (Dako Omnis) reagenst C hımérsékleten. A tárolás során valamennyi reagens üvegét a kupakkal, beleértve a felpattintható kupakot is, zárva kell tartani. A hígított oldatok (ISH Stringent Wash Buffer munkaoldat és ISH Pre-Treatment Solution munkaoldat) 2-8 C hımérsékleten 30 napig tárolhatók. A csomagoláson feltüntetett lejárati dátumon túl ne használja fel a reagenseket. A tárolás során a reagens üvegét a kupakkal, beleértve a felpattintható kupakot is, zárva kell tartani. Ha a reagenst a meghatározottól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak ellenırizni kell a reagens hatékonyságát (15). Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt fontos a vizsgált szövetmetszetben lévı normál sejtek kiértékelése is. Ha nem várt festıdést figyel meg, amelyre nem talál magyarázatot, és úgy gondolja, hogy probléma lehet a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) reagenssel, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Stabilitás a Dako Omnis készüléken belül A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a kiegészítı reagensek: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) és ISH Pepsin (Dako Omnis) készüléken belüli stabilitása 80 óra. A hígított ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) és ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) készüléken belüli stabilitása 7 nap. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi. Lejárt reagens használata esetén a Dako Omnis készülék figyelmezteti a ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 31/55

32 Gyomorrák felhasználót; minden olyan lemez, amelyet lejárt reagenssel festettek meg, fenntartással kezelendı státuszúra változik, és a munkaállomáson a lemeznapló jelzi, hogy lejárt reagenst használtak. A minta elıkészítése gyomor A biopsziákból, kimetszésekbıl vagy reszekciókból származó gyomor ill. gyomornyelıcsı határon lévı adenokarcinóma mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet épen maradjon a FISH elemzés céljára. Az immunhisztokémiai festéshez minden minta esetében a standard szövetfeldolgozási módszereket kell alkalmazni (16). Kis biopsziás minták vizsgálata esetében ügyeljen arra, hogy az intakt tumormorfológia megmaradjon, illetve, hogy elegendı tumorsejt legyen a számoláshoz. Ha a HER2 FISH analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2 státusz megbízható meghatározása érdekében javasolt, hogy több (7-8) értékelhetı biopsziás mintát elemezzen a tumor különbözı régióiból. Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A mintákat például 3-4 mm-es szeletekre vágva órán keresztül fixálja semlegesre pufferelt formalinban. A ToGA vizsgálatban 6-8 órán keresztül fixálták a biopszia mintákat (a vizsgálati referenciákat lásd: (28)). A szöveteket ezután dehidratálja etanol és xilén hígítási sorával, majd infiltrálja 60 C-nál nem nagyobb hımérsékleten tartott olvasztott parafinnal. A megfelelıen fixált és beágyazott szövetek hővös helyen (15-25 C) (16-17)korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt. Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A szövetmintákat 3-6 µm-es metszetekre kell vágni. A HER2 génamplifikációs elemzéshez és a tumor jelenlét igazolásához szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább két sorozatmetszet javasolt, az egyik a tumor jelenlét igazolásához hematoxilin és eozin festéssel (H&E), egy másik pedig a HER2 génamplifikációs elemzéshez. Javasoljuk, hogy a szövetmetszeteket Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) lemezekre rögzítse. Superfrost Plus lemezek (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) is alkalmasak erre a célra. Ellenırizze, hogy az üveglemezek szavatossági ideje nem járt le. A mintákat a metszetkészítéstıl számított <6 hónapon belül elemezni kell, ha 2-25 C-on tárolják azokat. MEGJEGYZÉS: A szövetmintákat a meghatározott lemezfestési területen belül kell az üvegre helyezni. Kérjük, tájékozódjon a Dako Omnis kezdı felhasználók számára szóló felhasználói útmutatójából a lemezfestési terület kiterjedésével kapcsolatban. HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor A. A reagens elıkészítése gyomor A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) üvege egy arany bevonatú fémgolyót tartalmaz a keveréshez. Az üveg Dako Omnis készülékbe való betöltése elıtt a reagenst fel kell olvasztani és alaposan fel kell keverni, mivel a fázisa különválik a fagyasztás során. Használja a Dako Omnis Mixing Device készüléket a próba keveréséhez. Kövesse az alábbi eljárást a próba Dako Omnis Mixing Device készüléken való keveréséhez. További információkért lásd a keverı készülék használati útmutatóját. 1. Vegye ki a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) üvegét a fagyasztóból. 2. Töltse be az üveget a Dako Omnis keverı készülékbe ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 32/55

33 Gyomorrák 3. Csatlakoztassa a keverı készüléket, és ellenırizze, hogy világít a zöld állapotjelzı. 4. Válassza Thaw + mix (Olvasztás+keverés) programot. Fontos: A -25 C alatt tárolt üvegeket közvetlenül a Dako Omnis keverı készülékbe való betöltés elıtt szabad csak felolvasztani, és a Mix programot kell használni. 5. Távolítsa el az üveget a keverı készülékbıl. 6. Nyissa fel a felpattintható kupakot, hajtsa hátra és pattintsa be a kivágott pozícióba (a részleteket lásd a Dako Omnis kezdı felhasználóknak szóló használati útmutatójában). 7. Rögtön ezután töltse be az üveget a Dako Omnis készülék reagenseket tároló moduljába. Ha a folyamatos reagens betöltési funkciót használja a festési munkamenet során, a reagens keverése és a Dako Omnis készülékben történı felszívása között eltelt idı legalább 10 perc legyen. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbát legfeljebb 10 alkalommal lehet újra felolvasztani és felhasználni. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) keveréket mindig közvetlenül a készülékbe való betöltés elıtt keverje el. Ne rázza fel. Az ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) próbát a Dako Omnis készülékben való használat után azonnal < -18 C-ra kell hőteni (-18 C C javasolt). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (elıkezelı oldat) (20x) (Dako Omnis) Készítse el a munkaoldatot az ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 arányú hígításával az alábbiak szerint: 1. Töltsön fel egy Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályt (PTB jelöléső, kék címkés) ionmentesített vízzel a jelölı vonalig (3,325 L). Feltöltés elıtt ellenırizze, hogy az öblítıfolyadék-tartály vízszintes felületen áll. 2. Töltsön egy 175 ml-es ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) koncentrátumot az öblítıfolyadék-tartályba. 3. Helyezze át a levehetı címkét a koncentrátum palackjáról az öblítıfolyadék-tartályra. Rögzítse a fedelet, és óvatosan fordítsa át az öblítıfolyadék-tartályt 2-3-szor. 4. A kézi Dako Omnis vonalkódolvasó használatával azonosítsa a reagenst (olvassa be a levehetı címkét és az öblítıfolyadék-tartályt). 5. Rögtön ezután helyezze az öblítıfolyadék-tartályt a Dako Omnis készülékre. A Dako Omnis készüléken belül tárolt hígított oldat 7 napig használható fel. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A fel nem használt hígított oldat 2-8 C-on 30 napig tárolható. Ha a hígított oldatot hidegben tárolták, hagyja, hogy felmelegedjen legalább 18 C-ra, mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe. MEGJEGYZÉS:A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Készítse el a munkaoldatot az ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 arányú hígításával az alábbiak szerint: 1. Töltsön fel egy Dako Omnis 3,5 L-es öblítıfolyadék-tartályt (PTB jelöléső, kék címkés) ionmentesített vízzel a jelölı vonalig (3,325 L). Feltöltés elıtt ellenırizze, hogy az öblítıfolyadék-tartály vízszintes felületen áll. 2. Töltsön egy 175 ml-es ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) készítményt az öblítıfolyadék-tartályba. 3. Helyezze át a levehetı címkét a koncentrátum palackjáról az öblítıfolyadék-tartályra. Rögzítse a fedelet, és óvatosan fordítsa át az öblítıfolyadék-tartályt 2-3-szor. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 33/55

34 Gyomorrák 4. A kézi Dako Omnis vonalkódolvasó használatával azonosítsa a reagenst (olvassa be elıször a levehetı címkét, majd pedig az öblítıfolyadék-tartályt). 5. Rögtön ezután helyezze az öblítıfolyadék-tartályt a Dako Omnis készülékbe. A Dako Omnis készüléken belül tárolt hígított oldat 7 napig használható fel. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A fel nem használt hígított oldat 2-8 C-on 30 napig tárolhat ó. Ha a hígított oldatot hidegben tárolták, hagyja, hogy felmelegedjen legalább 18 C -ra, mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe. MEGJEGYZÉS: A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) Az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) azonnal felhasználható reagens. Mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe, pattintsa fel a kupakot, hajtsa hátra és rögzítse a kivágásban. Az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A futtatás befejezıdése után az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) oldatot le lehet hőteni a tárolási hımérsékletre (2-8 C) a készüléken belüli stabilitási idı megırzése érdekében. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) Az ISH Pepsin (Dako Omnis) azonnal felhasználható reagens. Mielıtt betölti a Dako Omnis készülékbe, gyızıdjön meg róla, hogy a reagens fel van olvasztva, majd pattintsa fel a kupakot, hajtsa hátra és rögzítse a kivágásban. Az ISH Pepsin (Dako Omnis) teljes készüléken belüli stabilitása 80 óra, ha a reagenst a Dako Omnis reagenseket tároló moduljában tartják. A hátralévı, készüléken belüli stabilitást a Dako Omnis szoftver nyomon követi (lásd fent). A futtatás befejezıdése után az ISH Pepsin (Dako Omnis) oldatot le kell hőteni a tárolási hımérsékletre (-18-8 C) a készüléken belüli stabilitási idı megırzése érdekében. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) A Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) azonnal felhasználható rögzítıszer, amelyet a Dako Omnis készüléken kívül használunk. A Fluorescence Mounting Medium rögzítıszert a használat után azonnal hőtse le (2-8 C) tárolási hımérsékletre. A.7 További tartozékok A következı tartozékok jelenléte is szükséges a Dako Omnis készülékben: ionmentesített víz, hígított Wash Buffer 20x (Dako Omnis) (kód: GC807), Clearify (Dako Omnis) (kód: GC810), ISH Cleaning Solution (kód: GC207) és ISH Lid (Dako Omnis) (kód: GC102), a Dako Omnis felhasználói útmutatóban meghatározottak szerint. B. Festési eljárás - gyomor B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a hibridizációs próba a Dako Omnis készülékben történı automatizált direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) vizsgálathoz, amelyet a kiegészítı reagensek GM300, GM301, GM302, GM303 és GM304 (GM304 a készüléken kívül) használatával együtt a HER2 génamplifikáció kvantitatív meghatározására terveztek. A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozzon minden utasítást, és ismerkedjen meg minden komponenssel és a vonatkozó óvintézkedésekkel. Az automatizált FISH festési eljárás a Dako Omnis készülékben tartalmazza a szövetmetszetek paraffinmentesítését, a cél kinyerését, a pepszines emésztést, a hibridizációt és a magas stringenciájú mosást. A lemezek kiadása a száraz kiadó állomáson történik. A protokoll valamennyi lépése elıre be van programozva a Dako Omnis szoftverben. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 34/55

35 Gyomorrák Kérjük, tanulmányozza a Dako Omnis felhasználói útmutató(ka)t a lemezekkel, ISH fedéllel, reagensekkel stb. kapcsolatban. Három hitelesített HER2 IQFISH protokoll: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium és HER2 IQFISH Pepsin Long amelyek csak a pepszines emésztési idıben különböznek van elıre programozva a Dako Omnis szoftverben, és ezek közül lehet választani a lemeztartó állvány (Slide Rack) mind az öt lemezére. Ez lehetıvé teszi a szöveti emésztés optimalizálását, amelyet a preanalitikai feltételek módosíthatnak. A HER2 IQFISH Pepsin Medium protokollt tekintjük standard potokollnak. A különbözı festési protokollok a Dako Link Omnis munkaállomáson tekinthetık meg. B.2. A festést megelızı eljárás 1. Válassza ki az egyes lemezekhez az alkalmazni kívánt HER2 IQFISH protokollt a DakoLink Omnis munkaállomás programjában az IQFISH protokoll részben. 2. Nyomtassa ki a lemezcímkéket, és csatolja ıket az üveglemezekhez. 3. Rakja a lemezeket a lemeztartó állványba. További információt a Dako Omnis Használati útmutatójában talál. Egy lemeztartó állványba 1-5 lemez helyezhetı. Javasolt legalább két lemez megfestése egy HER2 IQFISH festési menetben. 4. Töltse be a lemeztartó állványt a Dako Omnis készülékbe. 5. Töltse be az ISH fedelet (ISH Lid) (egy ISH fedelet állványonként) a Dako Omnis készülékbe. 6. Gyızıdjön meg róla, hogy az öblítıfolyadék tartályok a készülékben vannak, és hogy a Dako Omnis regisztrálta ıket. Öblítıfolyadékok: Clearify, hígított ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), hígított ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) és hígított Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Töltse be az ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) és ISH Pepsin (Dako Omnis) reagenseket, a frissen elkevert HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és ISH Cleaning Solution próbát a reagenseket tároló modulba (Reagent Storage Modul). Ellenırizze, hogy valamennyi felpattintható kupak nyitva van. 8. Kövesse a képernyın megjelenı utasításokat, és koppintson a Done (Kész) feliratra a festés elindításához. B.3. Festési eljárás A Dako Omnis készüléken történı HER2 IQFISH festési eljárás (amelyet az 11. táblázat foglal össze) a Dako Link Omnis munkaállomáson követhetı nyomon: 11. táblázat A HER2 IQFISH festési protokoll lépéseinek egyszerősített vázlata. Lépés Reagens Idı és hımérséklet Viasztalanítás Clearify (tisztítószer) 10 perc 38 C-on. Cél kinyerése ISH Pre-Treatment Solution 15 perc, 97 C (Dako Omnis) Mosás ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 perc, 32 C (Dako Omnis) Emésztés* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 perc, 15 perc vagy 20 perc Szárítás Denaturálás Hibridizálás Magas stringenciájú mosás HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 15 perc 45 C-on. 10 perc 66 C-on. 75 perc 45 C-on. 10 perc 61 C-on. * Három hitelesített pepszines emésztési idı választható a fenti HER2 IQFISH protokollok használatával. Ha nem tervez további ISH festést, hőtsön le minden reagenst a javasolt tárolási hımérsékletre. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 35/55

36 Gyomorrák B.4. Utófestési eljárás Vegye ki a lemezeket és alkalmazzon legfeljebb 30 µl, DAPI-t tartalmazó Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszert a lemezek célterületén. A Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) rögzítıszernek teljesen be kell fednie a szövetmetszetet. Használjon üveg fedılemezt. MEGJEGYZÉS: A tárgylemezek a rögzítést követıen 15 perc elteltével, illetve 7 napon belül értékelhetık ki. A lemezek elhalványulhatnak, ha fény vagy magas hımérséklet éri ıket. Az elhalványulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, C-on tárolja. Minıség-ellenırzés gyomor 1. A jeleknek világosnak, jól elkülönülınek és könnyen értékelhetınek kell lennie. 2. A normál sejtek a festési folyamat belsı kontrolljának lehetıségét biztosítják. A normál sejteken 1-2 jól látható zöld jelnek kell lennie, amelyek arra utalnak, hogy a CEN-17 PNS próba sikeresen hibridizálódott a 17. kromoszóma centromer régiójával. Továbbá, a normál sejteken 1-2 jól látható piros jelnek kell lennie, amelyek arra utalnak, hogy a HER2 DNS próba sikeresen hibridizálódott a HER2 génnel/génekkel. A szövetmetszetek elkészítésébıl adódóan néhány normál sejt a várható 2 jelnél kevesebbet fog tartalmazni az egyes színekbıl. Amennyiben a normál sejtekben nem észlelhetı jeladás, akkor ez az vizsgálat hibájára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 3. A sejtmagnak morfológiailag épnek kell lennie a DAPI szőrıvel történı értékeléskor. A túl sok szellemképes sejt és általánosan rossz minıségő sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére utal, ami jelvesztéshez vagy a jel fragmentálódásához vezet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 4. Legalább 20 értékelhetı tumorsejtnek kell lenni a mintában. 5. Az egyes laboratóriumokban a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárások eltérése módosíthatja az eredményeket, ezért a Dako által biztosított kontrollminták mellett szükséges a rendszeres belsı kontrollok alkalmazása. A festés értelmezése gyomor A kiértékelésre alkalmas szövet Határozza meg a tumor helyét a H&E-vel festett lemezen, és értékelje ugyanezt a területet a FISH festett lemezen (a DAPI szőrıben). Csak a gyomor vagy a gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı páciensek mintáit értékelje. Ha ugyanabban a mintában megtalálható intesztinális metaplázia és adenokarcinóma is, akkor csak az adenokarcinóma komponenst értékelje. Kerülje az erısen gyulladt vagy nekrotikus területeket és azokat részeket, ahol a sejtmag határvonalai nem egyértelmőek. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá esı sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestıdésük pedig nem specifikus vagy túl erıs. Kezdje a mikroszkópos értékelést a teljes FISH festett résszel, illetve a H&E metszet alapján meghatározott területtel. Mielıtt számlálást végez a FISH festett metszeten, figyelje meg a teljes jeleloszlást (homogén vagy heterogén) a jelszámláló lapon. Heterogén eloszlás esetén figyelje meg, hogy fokális amplifikáció vagy sejtenkénti (mozaik) amplifikáció van-e jelen. 1) Homogén jeleloszlás Ha a jeleloszlás homogén, állapítsa meg a kromoszóma centromérek (zöld jelek) és a HER2 gének (piros jelek) számát 20 tumorsejtben, 1-2 reprezentatív tumor régióban. 2) Heterogén jeleloszlás Heterogén jeleloszlás esetén számoljon meg 20 sejtet az alábbiak szerint kiválasztott területekrıl: ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 36/55

37 Gyomorrák A) Fokális amlifikáció esetén amplifikált sejteket tartalmazó területeket kell kiválasztani. B) Mozaik eloszlás vagy amplifikált, poliszómás és diszómás sejtek jelenléte esetén az amplifikált sejteket tartalmazó területeken kell számolni. Ezeken a területeken belül nem csak az amplifikált sejteket, hanem a szomszédos sejteket is bele kell foglalni a számolásba, összesen 20 sejtet. Ha lehetséges, ne válasszon ki egymást átfedı területeket. Hagyja figyelmen kívül a bakteriális DNS-t Amikor speciális sejtek (hízósejtek és makrofágok) vannak jelen elszórtan a gyomor szövetében, a HER2 próba általi erıs festıdés figyelhetı meg a bakteriális DNS jelenléte miatt. Ez igen piros fluoreszcens sejteket eredményez, amelyek tisztán elkülöníthetık a tumorsejtektıl az erıs HER2 amplifikáció miatt. Jelszámlálás Miután kiválasztott egy területet a jelek értékelésére, kezdje az elemzést a kiválasztott 20 egymással szomszédos sejtmag egyikében; haladjon sejtrıl sejtre, és csak azokat a sejtmagokat hagyja ki, amelyek nem felelnek meg a minıségi követelményeknek. Határozza meg a tumor helyét a H&E-vel festett lemezen, és értékelje ugyanezt a területet a FISH festett lemezen. Pásztázza végig a teljes festett lemezt az esetleges heterogenitás felmérése érdekében. Válasszon ki egy olyan területet, amelyben jó a sejtmagok eloszlása. Kezdje az elemzést a kiválasztott terület bal felsı kvadránsában, majd balról jobbra pásztázva, az alábbi irányelveknek megfelelıen számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag maghatáron belül esı jeleit (lásd: 5. függelék). - Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölıdését. - Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. Két jel között a távolságnak legalább egy normál mérető jel méretével kell megegyezınek lennie, hogy a két jelet külön számoljuk. Ha két jel között kisebb a távolság, mint egy jel átmérıje, a jeleket egy jelnek kell számolni. - A nagyfokú HER2 génamplifikációt mutató sejtmagokban a HER2 jelek olyan közel kerülhetnek egymáshoz, hogy jelcsoportot hoznak létre. Ilyenkor a HER2 jeleket nem lehet megszámolni, a számukat becsléssel kell megállapítani. Külön figyelmet kell fordítani a zöld jelekre, mert a piros HER2 jelcsoportok elfedhetik ıket. Kétséges esetben, kérjük, használjon egy speciális FITC szőrıt a zöld jelek ellenırzésére. Ne vegye figyelembe a számlálásnál a jelet nem adó sejtmagokat és azokat sem, amelyek csak egyszínő jelet adnak. Kizárólag azokat a sejtmagokat használja az értékeléshez, amelyek mindkét színbıl legalább egy FISH jelet mutatnak. Jelszámlálási útmutató 1 Ne számolja. A sejtmagok átfedik egymást, nem minden részük látható. 2 Két zöld jel: ne vegye figyelembe a számlálásnál a csupán egyszínő jeleket kibocsátó sejtmagokat 3 3 zöld és 12 piros jelként számolandó (csoportos becslés) 4 1 zöld és 1 piros jelként számolandó. Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. 5 Ne számolja (túl vagy alulemésztett sejtmagok) vag Hiányzó jelek a sejtmagok közepén (fánk alakú sejtmagok) y ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 37/55

38 Gyomorrák 6 2 zöld és 3 piros jelként számolandó. Egynek számoljon két olyan jelet, amelyek mérete megegyezik és a közöttük lévı távolság ugyanakkora vagy kisebb, mint a jel átmérıje. 7 1 zöld és 5 piros jelként számolandó 8 3 zöld (1 zöld jel a fókuszon kívül) és 3 piros jelként számolandó 9 Piros jelcsoport fedi el a zöld jeleket, ellenırizze a zöld jeleket speciális FITC szőrıvel, vagy ne számolja ıket Jegyezze fel az eredményeket egy táblázatban a 3. és 4. függelékben bemutatott módon. Szövetmintánként 20 sejtmag jeleit számolja meg, ha lehetséges, akkor elkülönülı tumorterületekrıl. Számolja ki a HER2/CEN-17 arányt úgy, hogy elosztja a piros HER2 jelek teljes számát a kék CEN-17 jelek teljes számával. A 2-nél nagyobb vagy azzal egyenlı HER2/CEN-17 arányt mutató mintákat HER2 génre nézve amplifikáltnak kell tekinteni (29). A határérték közelébe esı eredményeket (1,8-2,2) csak óvatosan szabad értelmezni. Ha az arány közel esik a határértékhez (1,8-2,2), akkor számoljon meg 40 különbözı sejtmagot, és számolja ki az arányt a 40 sejtmagra. Ha a számolás ismét határérték körüli eredményt hoz, a második számolást fogadjuk el érvényesnek. Ha hozzáférhetı, a HER2 immunhisztokémiai festést is figyelembe kell venni a második számolásnál a jobb tájékozódás érdekében. Kétséges esetben az ilyen mintát tartalmazó tárgylemezt újra kell számolni. Határesetekben ajánlott, hogy a patológus és a kezelıorvos konzultáljon egymással. Korlátozások gyomor 1. Kizárólag a Dako Omnis készülékeken történı automatizált használatra. 2. Speciális szakképzettséget igényel a szövetek és a lemez elıkészítése és a IQFISH festés értelmezése területén. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) festést ne végezzék olyan személyek, akik színtévesztık. 3. A FISH eredmények függenek a szövet festést megelızı kezelésétıl és elıkészítésétıl. A nem megfelelı fixálás, mosás, szárítás, felfőtés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Az inkonzisztens eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek változtatása, illetve a szövetben eredendıen található szabálytalanságok is lehetnek. Teljesítményjellemzık gyomor A hibridizálás hatékonysága A HER2 IQFISH pharmdx hibridizációs hatékonyságát 180 formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszet felhasználásával vizsgálták három vizsgálati helyszínen. Mind a 180 szövetmetszet a termékre vonatkozó jelszámlálási útmutatók alapján lehetett értékelni. A hibridizáció hatékonysága 100%. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 38/55

39 Gyomorrák A teljesítményjellemzıkre vonatkozó vizsgálatokban szereplı HER2/CEN-17 arányok meghatározása a jelen használati utasítás A festés értékelése címő szakaszában megadott pontozási irányelvek alapján, 20 sejtmagban a jelek megszámolásával történt. Analitikai érzékenység A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) analitikai érzékenységének vizsgálata 20 különbözı gyomorrák adenokarcinóma minta alapján történt (10 HER2 génamplifikált és 10 nem amplifikált minta). A HER2 jelek és a CEN-17 jelek számarányának megállapítása a jelek megszámolásával történt a szövetminta 20 normál sejtmagjában. A HER2/CEN-17 arány a 20 gyomorrák adenokarcinóma minta esetén 0,94 és 1,19 között volt. Analitikai specificitás A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat HER2 DNS próbáit végszekvenálták és feltérképezték, hogy megerısítsék egy 218 kb nagyságú, a HER2 gént is tartalmazó régió teljes lefedését. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) CEN-17 PNS próbáit egyénileg és kombinációban ellenırizték, hogy megerısítsék azok specifikus hibridizációját a 17. kromoszóma centromer régiójához. A 17. kromoszómától eltérı kromoszómákhoz történı kereszthibridizáció kizárása érdekében a vizsgálatok metafázisban történtek a hagyományos Dako QC eljárásoknak megfelelıen. Összesen 275 elkülönülı jellel bíró metafázis terjedést értékeltek a HER2 DNS és CEN-17 PNS próba keverékek specifikus hibridizációjához. A hibridizáció mind a 275 esetben specifikus volt a 17-es kromoszómára. A 275 eset egyikében sem volt megfigyelhetı kereszthibridizáció valamely másik kromoszóma lókuszára. A próba specificitása tehát 100% volt (275 a 275-bıl). Annak mérésére, hogy az IQFISH vizsgálat hogyan tudja azonosítani kizárólag a HER2 és CEN-17 célanyagot, más anyagokkal való interferencia nélkül, gyomor adenokarcinóma mintákon végeztek vizsgálatokat a HER2 és CEN-17 próbák kihagyásával a hibridizációs keverékbıl, és kizárólag a hibridizációs puffer használatával. Összesen 20 minta kiértékelése történt meg annak igazolására, hogy a jelek jelenléte nem kapcsolódik a próbakeverékhez. A 20 minta egyikében sem volt észlelhetı másik célkromoszóma vagy interferencia közeli kapcsolatban álló anyagokkal. A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat robosztusságát a PNS próba koncentrációjának, a cél kinyerési idı, a pepszin inkubálási idı, a denaturálási idı, a hibridizálási idı és a magas stringenciájú mosás idejének, valamint a hımérséklet változtatásával vizsgálták. A különbözı paramétereket három különbözı FFPE gyomor adenokarcinóma szövetmintán és két, a gyomor-nyelıcsı határról (GEJ) származó FFPE szövetmintán tesztelték (mind amplifikált, mind nem amplifikált szövetminták esetén mindkét csoportban). A PNS próbakoncentráció és a magas stringenciájú mosás hımérsékletének kivételével, amelyek esetén a hagyományos protokollbeállítás a beállítás része, minden paramétert teszteltek a hagyományos protokollbeállítások alatt és felett is. A vizsgálati paraméterek az alábbiak voltak: PNS próba koncentrációja: 100% és +/-17% esetén vizsgálva. Cél kinyerési idı: 13 perc 45 másodperc és 16 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 39/55

40 Pepszin inkubálási idı: 14 perc 45 másodperc és 16 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. Gyomorrák Denaturálási idı: 9 perc 45 másodperc és 10 perc 45 másodperc esetén vizsgálva. Hibridizálási idı: 70 perc és 80 perc esetén vizsgálva. Magas stringenciájú mosás ideje: 8 perc 45 másodperc és 11 perc 15 másodperc esetén vizsgálva. Magas stringenciájú mosás hımérséklete: 59 C, 61 C és 63 C esetén vizsgálva. A három PNS próba koncentráció értékelése a frakcionált Design of Experiment kísérlettervezıben (JMP eszköz, SAS) történt, amelyet 12 különbözı festési protokollal végeztek el, amint azt a 12. táblázat mutatja. 12. táblázat A robosztussági vizsgálatban alkalmazott tizenkét különbözı festési protokoll. Robosztussági protokoll száma Cél kinyerési idı (perc) Pepszin idı (perc) Denaturációs idı (perc) Tesztparaméter Hibridizációs idı (perc) Magas stringenciájú mosás ideje (perc) Magas stringenciájú mosás hımérséklete ( 0 C) PNS konc. a próbakeverékben 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Mind az öt szövetminta festése mind a 12 protokoll alapján el lett végezve. A robosztussági vizsgálat eredménye a jelintenzitás és a morfológia minısége volt. Minden protokoll festıdést eredményezett az összes szövetmintában (összesen 60) világos, elkülönülı, könnyen értékelhetı jelekkel, amelyek jelszámításra alkalmasak voltak. Továbbá a szövetvastagság hatását a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat eredményeire úgy ellenırizték, hogy változtatták az FFPE gyomorrák-szövetminták metszetvastagságát. Összesen öt, különbözı vastagságú (3, 4, 5, 6 és 7 µm) gyomor adenokarcinóma minta öt egymást követı metszetét ellenırizték a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) segítségével. A HER2/CEN-17 arány átlagos variációs koefficiense 3,9% (3,2% és 5,0% között változik). Reprodukálhatóság A laboratóriumon belüli napi és tételszám szerinti reprodukálhatóság ellenırzése a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) segítségével történt. A vizsgálatot a HER2/CEN-17 arányok belsı, vak, randomizált vizsgálataként tervezték nyolc különbözı, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott, a gyomor-nyelıcsı határt (GEJ) is tartalmazó gyomorrák minta használatával, amelyek különbözı HER2 génamplifikációs szinttel rendelkeznek. A nyolc ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 40/55

41 Gyomorrák minta ellenırzése a HercepTest segítségével történt, és két mintán HER2 IHC 0/1+, két mintán HER2 IHC 2+, két mintán HER2 IHC 3+ és két mintán elıre meghatározott, 1,5 és 2,5 közti, a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával megadott HER2/CEN-17 FISH arány jelentkezett. Az egyes mintákat három különbözı HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) tétellel festették öt, nem egymást követı napon. A teljes vizsgálathoz összesen 240 szövetfestést dolgoztak fel, mivel minden kombináció duplán volt festve. Az 8. ábra mutatja a napok és tételek közti arányok variációit. Az adatok elemzése a Box-Cox transzformációval történt, egy random hatásmodellel az adatvariabilitás homogenitásának elérése érdekében. A teljes variációs koefficiens becsült értéke 6,5%, a napok, illetve tételek szerinti variáció részesedése pedig 0,7%, ill. 0,8%. 8. ábra A laboratóriumon belüli reprodukálhatósági vizsgálatban kapott HER2/CEN-17 arányok HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) használatával, beleértve a tételszám szerinti és a napi reprodukálhatósági végpontokat. Az egyes szövetmintákhoz tartozó középértéket egy vízszintes vonal jelzi. Ezenkívül a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) napi és helyszín szerinti reprodukálhatóságát is vizsgálták három külsı helyszínen (egy USA-beli és két európai helyszínen), többrétegő, vak vizsgálattal 12 különbözı, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott, a gyomor-nyelıcsı határt (GEJ) is tartalmazó gyomorrák mintán. Három minta HER2 IHC 0/1+ volt, három minta HER2 IHC 2+ volt, három minta HER2 IHC 3+ volt, és három minta elıre meghatározott HER2/CEN-17 FISH aránya 1,5 és 2,5 közötti a HercepTest TM, illetve a HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával. A minták festését és elemzését a vizsgálati helyszíneken végezték. Minden minta legalább hét alkalommal lett festve hét nem egymást követı napon, és az egyes helyszíneken egy-egy megfigyelı értékelte ıket. 314 metszet festésére és statisztikai kiértékelésére került sor. Az adatok elemzését a Box-Cox transzformációval végezték és kiszámították a varianciakomponenseket. A felsı 95%-os konfidencia határon alapuló teljes variációs koefficiens 24%. A HER2/CEN-17 arány változása napok és helyszín szerint a 9. ábrán látható. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 41/55

42 Gyomorrák 9. ábra A HER2/CEN-17 arányok variabilitási diagramja nem átalakított egységekben a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) gyomorrák-szövetmintákon végzett napi és helyszín szerinti reprodukálhatósági vizsgálata alapján. A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vizsgálat megfigyelıtıl függı reprodukálhatóságát ellenırizték a belsı vezetéső módszerösszehasonlító vizsgálat részeként, amely három független megfigyelıvel értékelte a festett mintákat. A reprodukálhatósági vizsgálatot 139 különbözı, nem amplifikált és amplifikált HER2 génállapotú gyomor adenokarcinóma mintán végezték el. Az adatok elemzése a Box-Cox transzformációval történt. A megfigyelık közti variációs koefficiens átlagos értéke 18%. A gyomor adenokarcinóma minták 96,4%-a reszekciós és 5,6%-a biopsziás minta A minták 81,3%-a a gyomorból és 18,7%-a a gyomor-nyelıcsı határról származik. Megismételhetıség A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) laboratóriumon belüli megismételhetıségi vizsgálatát nem amplifikált és amplifikált HER2 génállapotú gyomor adenokarcinóma minták nyolc egymást követı metszetén végezték. A szöveteket duplán vizsgálták, összesen 240 lemezt (120 metszet duplán vizsgálva) öt nem egymást követı napon három különbözı tétel felhasználásával. Az adatok elemzéséhez használt random hatásmodell alapján lettek megállapítva a napok és tételek szerinti variancia értékek (lásd a fenti belsı reprodukálhatósági vizsgálatban). A reziduális variancia megfelel a másolatok közti varianciának és így a megismételhetıségnek. A megismételhetıségi variációs koefficiens felsı 95%-os konfidenciahatára 7,1%. Módszerösszehasonlító vizsgálat A HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és a HER2 IQFISH pharmdx (K5731) összehasonlítása A vizsgálat 140 gyomorrák mintára terjedt ki, amelyek különbözı gyomor adenokarcinóma szövettípusokat tartalmaztak, pl. gyomor vagy gyomor-nyelıcsı határ (GEJ), reszekciók vagy biopsziák, homogén vagy heterogén (fokális vagy mozaik) jeleloszlással, amint azt a 13. táblázat mutatja. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 42/55

43 Gyomorrák 13. táblázat Minták eloszlása gyomorrák típusok esetén (gyomor vagy GEJ), jeleloszlási kategória (homogén vagy heterogén), és szövettípus (reszekció vagy biopszia). Gyomorrák típusa Minták száma Jeleloszlás Minták száma Szövettípus Minták száma Gyomor 113 Homogén: 58 Reszekció 134 Gyomornyelıcsı határ (GEJ) 27 Heterogén - fokális Heterogén - mozaik Biopszia 6 Összesen 140 Összesen 140 Összesen 140 A minták 76 HER2-nem amplifikált esetbıl és 64 HER2-amplifikált esetbıl álltak, ismert HercepTest eredménnyel, ahogy azt az 14. táblázat14. ábra mutatja. 14. táblázat A minták eloszlása a HercepTest eredmény és a HER2 FISH eredmény HER2 FISH pharmdx Kit (K5731) felhasználásával. HercepTest festési Összesen eredmény n HER2 FISH állapot Amplifikált Nem amplifikált Az összes FISH vizsgálattal tesztelt minta A teljes egyezési százalék (OPA), a pozitív egyezési százalék (PPA) és a negatív egyezési százalék (NPA) számításával, a két vizsgálatban kapott HER2 állapot kereszttáblázatos ábrázolásának eredményei a 15. táblázat 15. táblázatban láthatók. A két vizsgálattal kapott HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggést a 10. ábra mutatja. 15. táblázat. A HER2 génállapot kereszttáblázatos ábrázolása HER2 IQFISH pharmdx (K5731) és HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) felhasználásával. HER2 génállapot (Dako Omnis) Nem amplifikált Nem amplifikált HER2 génállapot (K5731) Amplifikált Összesen Amplifikált Összesen OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 43/55

44 Gyomorrák 10. ábra A HER2/CEN-17 arányok közötti összefüggés HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) és HER2 IQFISH pharmdx (kód: K5731) felhasználásával 140 gyomorrák minta esetén (lineáris illeszkedés: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. A lineáris illeszkedés érdekében az inverz varianciával súlyozva). A két festési módszer közötti átlagos különbség 95%-os konfidencia intervallum értéke HER2/CEN-17 arány = 2 esetén [0,007; 0,022]. Ez azt jelenti, hogy nem várható 2%-nál nagyobb különbség. Klinikai adatok A trastuzumab (Herceptin ) klinikai biztonságát és hatékonyságát a BO18255 vizsgálat demonstrálta (a ToGA vizsgálat HER2 pozitív, elırehaladott stádiumú gyomorrákos betegeken történı, a trastuzumab nyílt jelöléső, randomizált, multicentrikus, III. fázisú vizsgálata cisplatin és fluoropirimidin (capecitabin vagy 5-Fluorouracil) (FC+H) kezeléssel kombinálva szemben a kizárólagosan alkalmazott kemoterápiával (FC), mint elsıdleges terápiával ) (28). A vizsgálat elırehaladott gyomor-nyelıcsı-adenokarcinómában és gyomor-adenokarcinómában szenvedı, HER2-pozitív páciensek bevonásával végrehajtott nyílt, randomizált, multicentrikus, III. fázisú vizsgálat. A BO18255 vizsgálatban a HER2 pozitivitást IHC-pozitivitásként (3+) adták meg HercepTest (Dako) használatával és/vagy FISH pozitivitásként (HER2/CEN-17 2,0) HER2 FISH pharmdx készlet (Dako) használatával. A vizsgálatba történı bevonás után a pácienseket random módon csoportokba osztották, amelyek kemoterápiás (5-FU vagy capecitabin és ciszplatin) vagy kemoterápiát és trasztuzumabot magában foglaló, kombinált kezelésben részesültek. A fı hatékonysági eredményt jelzı mérıszám a teljes túlélés (OS) volt, rétegezett logrank próbával elemezve. A végsı, 351 haláleseten alapuló OS elemzés statisztikailag jelentıs (névleges szignifikanciaszint 0,0193). Egy évvel a végsı elemzés után sor került egy frissített OS elemzésre is. A 13,5 hónapos teljes túlélés középértéke a Herceptin és kemoterápiás kezelésben részesült ágon szignifikánsan hosszabb volt a kizárólag kemoterápiát kapott ág 11,0 hónapos teljes túlélés középértékénél. A végsı és a frissített elemzés hatékonysági eredményei a 16. táblázatban és a 11. ábrán vannak összefoglalva. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 44/55

45 Gyomorrák 16. táblázat Teljes túlélés beválasztás szerinti (ITT) populációban. Végsı teljes túlélés szám Halálozás (%) Medián 95% CI (mos.) Kockázati arány 95% CI p-érték*, kétoldali Frissített teljes túlélés szám Halálozás (%) Medián 95% CI (mos.) Kockázati arány 95% CI FC ág N= (62,2%) 11,0 (9,4 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3 13,0) *Összehasonlítva a névleges szignifikanciaszinttel 0,0193 0,73 (0,60 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67 0,97) FC + H ág N= (56,0%) 13,5 (11,7 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9 15,1) 11. ábra Frissített teljes túlélés metasztatikus gyomorrákos betegek esetén A teljes túlélés génamplifikációs (FISH) és fokozott fehérjeexpressziós (IHC) vizsgálaton alapuló feltáró elemzésének összefoglalója a 17. táblázatban található. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 45/55

46 Gyomorrák 17. táblázat Feltáró elemzések a HER2 állapot alapján, frissített teljes túlélési eredményekkel. FISH+ / IHC 0, 1+ alcsoport (N=133) szám Halálozás / n (%) A teljes túlélési idıtartam medián értéke (mos.) 95% CI (mos.) FC N=296 a FC+H N=298 a 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4 11,7) Kockázati arány (95% CI) 1,33 (092, 1,92) FISH+ / IHC2+ alcsoport (N=160) szám Halálozás / n (%) 65/80 (81%) A teljes túlélési idıtartam medián értéke 10,8 (mos.) (6,8 12,8) 95% CI (mos.) Kockázati arány (95% CI) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+ vagy FISH-/IHC3+ c alcsoport (N=294) szám Halálozás / n (%) 104/143 (73%) A teljes túlélési idıtartam medián értéke 13,2 (mos.) (11,5. 15,2) 95% CI (mos.) Kockázati arány (95% CI) 0,66 (0,5, 0,87) 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2 10,7) 64/80 (80%) 12,3 (9,5 15,7) 96/151 (64%) 18,0 (15,5 21,2) A közepes túlélés becslése a Kaplan-Meier görbék alapján történt. a Az elemzésekbıl kizártak két FISH+, de ismeretlen IHC állapotú beteget az FC ágon. b Az elemzésekbıl kizártak öt FISH+, de ismeretlen IHC állapotú beteget a Herceptin ágon. c A kemoterápiás ágon 6, a Herceptin ágon 10 FISH-, IHC3+ beteg, illetve a kemoterápiás ágon 8 és a Herceptin ágon is 8 ismeretlen FISH állapotú, IHC3+ beteg szerepel a vizsgálatban. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 46/55

47 Gyomorrák Hibaelhárítás gyomor Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. Nincs jel, vagy a jel gyenge 1a. A reagenseket magas hımérséklet hatásának tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt 1b. A mikroszkóp nem mőködik megfelelıen - Nem megfelelı szőrıkészlet - Nem megfelelı lámpa - A higanylámpa túl régi - Piszkos és/vagy repedt kollektor lencsék - Nem megfelelı immerziós olaj 1a. Ellenırizze a tárolási körülményeket. Gyızıdjön meg róla, hogy az IQISH próbakeverék és pepszin küldemény átvételekor volt szárazjég a csomagolásban. Gyızıdjön meg róla, hogy a reagenseket az elıírt körülmények között tárolták. 1b. Ellenırizze a mikroszkópot, és gyızıdjön meg arról, hogy a használatban lévı szőrık illenek a próbakeverék fluorokrómhoz, és hogy a higanylámpa megfelelı és nem használták a várható élettartamán túl (lásd: 5. függelék). Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkóp-beszállítójával. 1c. Gyengült jelek 1c. Ne végezze túl hosszú ideig a mikroszkópos vizsgálatot, és a lehetı legkisebb mértékben tegye ki a mintákat az erıs fényforrások hatásának. 1d. Tévesen azonosított pufferek 1d. Cserélje ki a puffereket, és gyızıdjön meg róla, hogy helyes a pufferek regisztrációja (a munkaállomáson) és azonosítása (az érintıképernyın). További információt a Dako Omnis Használati útmutatójában talál. Megjegyzés: Az ISH Pre-Treatment Solution színe zöld, az ISH Stringent Wash Buffer színe sárga. 2. Jelmentes területek 2. Rögzítés során keletkezett légbuborékok 2. Akadályozza meg a légbuborékok képzıdését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével finoman ütögetve távolítsa el azokat. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 47/55

48 Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 3. Túl erıs háttérfestés 3a. Nem megfelelı szövetfixálás 3b. A hibridizált metszet túl sokáig lett kitéve erıs fény hatásának Gyomorrák 3a. Gondoskodjon róla, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon. 3b. Ne végezze túl hosszú ideig a mikroszkópos vizsgálatot, és a lehetı legkisebb mértékben tegye ki a mintákat az erıs fény hatásának. 4. Gyenge minıségő szövetmorfológia 5. Fokozott zöld autofluoreszcencia a lemezen, FFPE szövetet nem tartalmazó területeken is 4a. Nem megfelelı pepszinkezelés 4b. A túl hosszú pepszinkezelés vagy a nagyon vékony metszetek szellemszerő vagy fánk alakú sejtek megjelenését eredményezhetik. 5. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata. 4a. Használjon egy másik festési protokollt a három lehetséges protokoll közül. Gondoskodjon róla, hogy az ISH Pepsin reagenst a megfelelı hımérsékleten tárolják. 4b. Próbáljon meg rövidebb pepszines inkubációs idıvel rendelkezı festési protokollt használni. Ügyeljen arra, hogy a metszetvastagság 3-6 µm legyen. 5. Válasszon az elıírt üveglemezek közül. Ellenırizze, hogy az üveglemezek szavatossági ideje nem járt le. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Mőszaki Szolgálatát. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 48/55

49 Gyomorrák 3. sz. függelék - gyomor HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) (kód: GM333) Számlálási vázlat Festési menet dátuma: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tételszám: Festési menet azonosítója (Log ID): Mintaazonosító: A szöveti jeleloszlás tulajdonságai: Homogén: Heterogén Fokális: vagy Heterogén Mozaik: Sejtmagszám Számlálja meg a jeleket 20 sejtmagban CEN-17 eredmény Sejtmagszám (zöld) HER2 eredmény (piros) Összes(1-10) Összes(11-20) HER2 eredmény (piros) CEN-17 eredmény (zöld) A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 20 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN-17 jelek számának összegével. Ha a HER2/CEN-17 arány közel esik a határértékhez (1,8--2,2), akkor számoljon meg 40 különbözı sejtmagot, és számolja ki újra az arányt a 40 sejtmagra (lásd: Újraszámlálási vázlat, 4. függelék). A határértékre vagy a kritikus cut-off érték közelébe (1,8-2,2) esı arányt eredményezı minták kiértékelését különös gonddal kell végezni.(lásd a számlálási útmutatót). ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 49/55

50 Gyomorrák HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány Végeredmény (1-20) Arány < 2: HER2 génamplifikáció nem volt megfigyelhetı Arány 2: HER2 génamplifikáció megfigyelhetı volt Dátum és aláírás, technikus: Dátum és aláírás, patológus: A pontozási irányelveket lásd a Festés értelmezése címő részben. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 50/55

51 Gyomorrák 4. sz. függelék - gyomor HER2 IQFISH pharmdx, (kód: GM333) Újraszámlálási vázlat Festési menet dátuma: HER2 IQFISHpharmDx (Dako Omnis) tételszám: Festési menet azonosítója (Log ID): Mintaazonosító: Jelek további 40 sejtmagban (1-40) HER2 (piros) CEN17 (zöld) HER2 (piros) CEN-17 (zöld) HER2 (piros) CEN-17 (zöld) Sejtmagszám Sejtmagszám Sejtmagszám Sejtmagszám HER2 (piros) CEN-17 (zöld) Összesen Összesen Összesen Összesen (1-10) (11-20) (21-30) (31-40) A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 40 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN-17 jelek számának összegével. Jegyezze fel az 1-40 sejtmagokból származó összesített eredményt az alábbi táblázatban. Végeredmény (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány Arány < 2: HER2 génamplifikáció nem volt megfigyelhetı Arány 2: HER2 génamplifikáció megfigyelhetı volt Dátum és aláírás, technikus: Dátum és aláírás, patológus: A pontozási irányelveket lásd a Festés értelmezése címő részben. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 51/55

52 Gyomorrák 5. sz. függelék - gyomor HER2 IQFISH pharmdx, (kód: GM333) A fluoreszcens mikroszkóp mőszaki jellemzıi A Dako az alábbi eszközöket javasolja használatra a HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333 termékhez: 1. Mikroszkóp típus Epifluoreszcens mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (jegyezze fel a használati idıt) 3. Objektívek A szöveti szőréshez használhatók az olajimmerziós 16X vagy 20X objektívek Erıs nagyításhoz és jelszámláláshoz csak olajimmerziós objektívek, pl. 100X használata javasolt 4. Szőrık A speciális fluorokrómokhoz egyedi szőrıket terveznek, és ezeket kell használni. A Dako egy speciális DAPI szőrı használatát javasolja egy jó minıségő Texas Red/FITC kettıs szőrıvel. DAPI szőrı, pl. Chroma filter # Texas Red/FITC kettıs szőrı, pl. Omega Optical filter # XF53 vagy Chroma filter # A Texas Red és FITC egyes szőrık használhatók a megerısítéshez és a számláláshoz Fluorokróm Gerjesztési hullámhossz Emissziós hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm A különbözı mikroszkóptípusokhoz különbözı szőrık valók, és a minták értelmezéséhez elengedhetetlen a megfelelı szőrık használata. A további részletekért, kérjük, lépjen kapcsolatba a mikroszkóp-beszállítójával vagy a Dako képviselıjével. 5. Olaj Nem-fluoreszcens olaj Óvintézkedések 50 wattos higanylámpa nem javasolt Rhodamine szőrık nem használhatók Hármas szőrık használata nem javasolt Egy nem-optimalizált mikroszkóp problémákat okozhat a fluoreszcens jelek leolvasásakor. Ügyeljen rá, hogy ne használja a fényforrást a lejárati idején túl, és hogy megfelelıen igazítsa be és fókuszálja azt. A vásárlónak tájékozódnia kell a higanylámpa gyártójának ajánlásai felıl, és be kell azokat tartania. Gondoskodjon arról, hogy a mikroszkóp karban legyen tartva és a higanylámpa elhelyezése megfelelı legyen, még mielıtt értelmezi az eredményeket. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehetı legkisebb mértékben tegyük ki a gerjesztı fénynek, hogy a fluoreszcencia halványulása minimális legyen. Javasoljuk, hogy beszélje meg a gyártóval a használt mikroszkóptípus beállításait, vagy tájékozódjon a vonatkozó irodalomból, mielıtt elkezdi az in situ fluoreszcens hibridizációs vizsgálatot. ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 52/55

53 Irodalomjegyzék 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 53/55

54 17. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 54/55

55 Jelmagyarázat Katalógusszám Hımérsékleti korlátozások Felhasználható In vitro diagnosztikai orvosi eszköz Napfénytıl távol tartandó (lásd tárolási szakasz) Gyártó Lásd a Használati útmutatót Tételkód GHS piktogram (lásd az óvintézkedések címő részt) Gyártó: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánia Tel.: Fax Az Egyesült Államokban forgalmazza: Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tel.: 805/ , Díjmentesen hívható: 800/ Rendelési információ: Tel.: 800/ Fax 805/ Mőszaki szolgálat: 800/ ( ) P04125HU_01_GM333/ o.: 55/55