A klinikai genetika alkalmazása a belgyógyászatban Lakatos Péter Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati Klinika
Klinikai genetikai alapfogalmak Gén (a teljes genom <1%) PCR polymerase chain reaction Szekvenálás SNP single nucleotide polymorphism WES whole exome sequencing WGS whole genome sequencing NGS next generation sequencing 1990-2003. 6 ország 3 milliárd dollár 1 humán genom Frederick Sanger
NGS = robusztus szekvenálási lehetőség
A genetikai tesztek számának növekedése
Öröklődő betegségek
Neurofibromatosis NF1, 58 exon, 8661 bp NF2, 17 exon, 1824 bp Oncogene. 2007 Jul 12;26(32):4609-16. Epub 2007 Feb 12.
Neurofibromatosis NF AmpliSeq panel, 130 amplikon c.2693t>c, p.leu898pro
Sok öröklődő betegség egyidejű vizsgálata 328 gén teljes kódolószekvenciája, 1.5 Mb 740 örökletes betegség 3 darab PCR cső Összesen több, mint 10 000 primer pár 799-1014 variáns / minta Komplex genetikai szűrés és tanácsadás Ismert fenotípusú betegségek hiányzó genetikai hátterének vizsgálata
WES Genetion Complete TargetSeq panel 30 000 gén teljes kódoló szekvenciája, 50 Mb 20-25 ezer variáns
Klinikai teljes exom szekvenálás (WES) A genom fehérje kódoló ~1,0% -a: exom (~30 ezer gén összes exonja, ~50 millió bp). Betegségekkel összefüggő ismert mutáció 85%- a az exomban található. NGS módszerrel, capture vagy PCR alapú könyvtárkészítéssel szekvenálható. Napjainkban a ritka genetikai betegségek hátterének meghatározásának alapmódszere, trió (érintett+szülők) szekvenálások esetén az eredményesség 50% feletti. Bioinformatikai kérdések: 75x lefedett exom akár 10 GB nyers szekvencia adat, ebben kell megtalálni az 1-2 kóroki mutációt. Esetbemutatás, saját példa: - 5 éves leánygyermek szívizom vastagodással (2011) - nincs biztos diagnózis a hagyományos vizsgáló eljárásokkal - 7 évesen ritmuszavar, hirtelen szívhalál sikeres reanimáció, ICD beültetés (2013) - laboratóriumunkban teljes exom szekvenálás és kiértékelés: HCM-mel kapcsolt kettős heterozigóta mutáció a MYBPC3 génben, p.r495q / p.s593fs*11 (2014) (Horvath et al, Cardiology, under review) - testvérek és szülők célzott genetikai vizsgálata - Testvérek és az apa ICD beültetése
Hematológia
Ismert genetikai eltérések lymphomákban Lymphoma Transzlokáció/mutáció Érintett gének Follicularis lymphoma t(14;18)(q21;q32) IgH/BCL2 Köpenysejtes lymphoma t(11;14)q13;q32) CCND1/IgH Burkitt lymphoma t(8;14)(q24;q32) cmyc/igh t(2;8)(p11;q24) IgK/cMYC t(8;22)(q24;q11) cmyc/igl Anaplasticus nagysejtes lymphoma t(2;5)(p23;q35) ALK1/NPM t(1;2)(q25;p23) TPM3/ALK1 inv(2)(p23;q35) ALK1/ATIC t(2;3)(p23;q21) ALK1/TFG t(2;17)(p23;q23) ALK1/CLTC t(2;x)(p23;q11) ALK1/MSN t(2;19)(p23;p13) ALK1TPM4 Gyomor MALT lymphoma t(11;18)(q21;q22) API2/MLT1 Diffúz nagy B-sejtes lymphoma t(14;18)(q21;q32) IgH/BCL2 t(8;14)(q24;q32) cmyc/igh 3q27 BCL6 Hajassejtes leukaemia 7q34 BRAF (V600G)
Döhner et al, N Engl J Med 2000, 343:1910 Genetika és a CLL prognózisa
Genetika és az AML prognózisa Chien-Yuan Chen, et al. BMC Cancer. 2013;13:107-107. Fiedler W et al, Br J Haematol. 2015 Mar 29. doi: 10.1111/bjh.13353.
Genetika és a CML prognózisa
Onkológia
Genetika és emlőrák
Az emlőrákok genomikai klasszifikációja Hierarchikus clustering 689 gén alapján HER2 Lum-B Lum-A Basal-like Rouzier R et al, Clin Cancer Res 2005;11:5678 5685
Az emlőrákok kezelése és genetika HER2-onkoprotein
Az emlőrákok kezelése és genetika ER HER2 terápia Her2 +/- +++ anti-her2 Luminal-A - - kemoterápia Luminal-B + - anti-ösztrogén Basal-like - -?
BRCA 1 és 2. Az emlőrák kockázata Laboratóriumunk által összeállított panel ATM, BARD1, BRIP1, CDH1, CHEK2, DIRAS3, ERBB2, NBN, PALB2, RAD50, RAD51, STK11, TP53, KRAS. ~30%
Genetika és tüdőrák
A tüdőrák differenciáldiagnosztikai algoritmusa Neurogén marker+ (TTF1+) SCLC/LCNEC Primer tüdőrák Neurogén marker- (TTF1-) NSCLC, NOS TTF1+, p63-,ck7+, HMWCKp63+, TTF1-, HMWCK+ adenocarcinoma NSCLC NOS laphámrák Rossi et al. Int J Surg Pathol 2009.3:206.
A tüdőrákok molekuláris klasszifikációja Sequist L V et al. Ann Oncol 2011;22:2616-2624.
A tüdő adenocarcinoma kezelése génhiba K-RAS, N-RAS mutáció EGFR mutáció ALK fúzió gyógyszer Tirozinkináz-gátló rezisztencia EGFR TK-gátló (gefitinib, erlotinib, afatinib) ALK-gátló (crizotinib)
Genetika és vastagbélrák
A vastagbélrák genomikai klasszifikációja The Cancer Genome Atlas Network Nature 2012. 487:330-337
Colon cc és EGFR jelpálya 27% 23% 34% 8% 8% Tol et al. EJC 2010. 46:1997.
Colon cc kezelése génhiba K-RAS, N-RAS mutáns K-RAS, N-RAS vad típus B-RAF mutáns Microsatellita instabilitás kezelés bevacizumab cetuximab, panitumumab anti-egfr rezisztencia 5-FU rezisztencia
Colon cc és septin-9 A Septin9 teszt a korai vastagbélrák szűrőteszt vérből mutatja ki vérből Módszer: A Septin9 a vastagbéltumor sejtek által termelt metilált DNS, amely vérmintából könnyen kimutatható. A teszt egy 8000 főt magában foglaló klinikai vizsgálatot követően 2011-ben került bevezetésre nemzetközi szinten. Eredmény: Amennyiben a Septin9 teszt negatív eredményt ad, abban az esetben több, mint 99% eséllyel nincs vastagbélrák. Pozitív eredmény esetében a 67-86%-os specificitás (függően a korai tumor I. vagy II. stádiumától) pedig meghaladja az eddig rutinszerűen használt bármelyik (székletvér, CEA vagy enzimatikus tumormarker) laboratóriumi diagnosztika értékét! Ajánlott fokozott vastagbélrák rizikójú, családi halmozódású pácienseknek, akiknél évek óta gyulladásos bélbetegség áll fent. A teszt eredményét követően csak pozitív esetben javasolt a vastagbél-tükrözés.
Genetika és melanoma
A melanoma molekuláris genetikája
A melanoma kezelése génhiba B-RAF mutáció N-RAS mutáció KIT mutáció terápia vemurafenib TK-gátló rezisztencia imatinib
Genetika és pajzsmirigyrák
A pajzsmirigyrákok molekuláris genetikája
Genetikai eltérések pajzsmirigy tumorokban Halászlaki Cs és mtsai, LAM 2012;22(1):9 16.
A CYP24A1 gén expresszió változása a normál pm szövethez képest A CYP24A1 aktivitás a tumor agresszivitásával arányos! betegek
250 FNAB minta három éves utánkövetése citológiailag negatív hideg göbök esetén Genetikai eltérés Gyakoriság BRAF 4 NRAS 1 HRAS 7 KRAS 1 RET/PTC3 1 14 Specificitás: 96,2%, szenzitivitás 46%
PentaCore Thyreon 46 96 4 2 2 Hodak SP, Rosenthal DS, Thyroid 2013. 23(2):131.
Célzott terápia a RAS jelátviteli útra TKI humán differenciált metastatikus pm cc-ben Sorafenib Sunitinib Pasopanib Vemurafenib Vandetanib Cabanillas ME et al, J Clin Endocrinol Metab, June 2010, 95(6):2588 2595. Brose MS et al, The Lancet. 2014; doi: 10.1016/S0140-6736(14)60421-9.
Genetika és egyéb endokrin tumorok MEN szindrómák Mellékvese tumorok Phaeochromocytomák Mellékpajzsmirigy cc. Hypopyhsis tumorok Ovarium cc.
Prostatarák szűrése: PCA3 vizsgálat A PCA3 gén terméke kizárólag prosztata szövetben mutatható ki. Tumoros elfajulás esetén a prosztata sejtek 60-100x több PCA3 mrns-t termelnek, mint a normál vagy benignus sejtek. A klinikai gyakorlatban a PSA érték és prosztata tapintással történő vizsgálata alapján döntenek a prosztata biopsziák elvégzéséről. Az így indikált biopsziák közel 77%-a felesleges beavatkozás. A PCA3 vizsgálat RDV utáni első vizeletből elvégezhető, eredménye 80%-os biztonsággal jelzi előre a biopszia eredményét. A PCA3 vizsgálat ajánlása: Emelkedett, szürke zónás szérum PSA érték (4-10 ng/ml) Negatív, nem egyértelmű RDV eredmény. Negatív biopszia vagy a biopsziát megelőzően. Negatív ultrahang eredmény. Családi kórelőzmény. Utánkövetés. Szenzitivitás Specificitás AUC ROC curve PCA3 Score Cut-off 35 67% 83% 0.658
Kardiológia
Néhányan Kolonics György 1972-2008 Zsiborás Gábor 1957-1993 Fehér Miklós 1979-2004
A hirtelen szívhalál hátterében álló betegségek megoszlása TTN LMNA MYH7 MYH6 SCN5A MYBPC3 TNNT2 MYH7 MYBPC3 TNNT2 TNNI3 TPM1 RYR2 (AVRD2) AVRD3 DSP (AVRD8) PKP2 (AVRD9) DSG2 (AVRD10) DSC3 (AVRD11) ACE / rs4646994 AGTR1 / rs5186 CMA1 / rs1800875 AGT1 / rs699 CYP11B2 / rs1799998 Maron BJ et al.: Circulation 115(12):1643; 2007)
A hirtelen szívhalál hátterében álló betegségek megoszlása SCN5A (BS1) GPD1L (BS2) CACNA1 C (BS3) CACNB2 (BS4) SCN1B (BS5) KCNE3 (BS6) SCN3B (BS7) KCNQ1 (LQTS1) KCNH2 (LQTS2) SCN5A (LQTS3) ANK2 (LQTS4) KCNE1 (LQTS5) KCNE2 (LQTS6) KCNJ2 (LQTS7) CACNA1c (LQTS8) CAV3 (LQTS9) SCN4B (LQTS10) AKAP1 (LQTS11) SNTA1 (LQTS12) Maron BJ et al.: Circulation 115(12):1643; 2007)
A hirtelen szívhalál hátterében álló betegségek megoszlása 78%
A laboratóriumunk által összeállított panel MYBPC3 TNNI3 TNNT2 MYH7 TTN LMNA MYH6 SCN5A KCNQ1 KCNH2 SCN4B KCNE1 KCNE2 KCNJ2 CACNA1C CASQ2 hryr2 DSP PKP2 ACE / rs4646994 AGTR1 / rs5186 CMA1 / rs1800875 AGT1 / rs699 CYP11B2 / rs1799998 GPD1L CAV3 KCNE3 SCN3B SCN4B SNTA1 AKAP9 ANK2 CACNB2 SCN1B TPMI1 DSG2 DSC2 KCNJ5
Prenatalis vizsgálatok
Nem invazív prenatális tesztelés - NIPT Módszerek: MPS Random DNS-szekvenálás SNP alapú Kritikus: Magzati DNS mennyisége (fetal fraction) Mozaicizmus (SNP alapú módszerek tudják) Ikerterhesség Elsővonalbeli teszt? (van ahol már igen) Down-szindróma (21-es triszómia) Edwards-szindróma (18-as triszómia) Patau-szindróma (13-as triszómia) Bizonyos nemi kromoszóma eltérések: - Turner-szindróma (X-monoszómia) - Klinefelter-szindróma (XXY) - Jacob-szindróma (XYY) - Tripla X-szindróma Triploidia A magzat neme Mikrodeléciók
A klinikai genetika alkalmazásai a belgyógyászatban Sikerrel módosítottak humán embryo DNS-t! Liang P et al, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-015-0153-5, 2015. April 23. Hasnyálmirigy-tumor sejtjeit "normális" sejtekké programozták vissza. Kim S et al, Pancreas doi: 10.1097/MPA.0000000000000328, 2015. April 18. Génmódosított salmonella baktériumokkal pusztíthatók el a daganatok. Frahm M et al, mbio 6(2):e00254-15. doi:10.1128/mbio.00254-15. 2015. April 14.