Bevezetés, alapfogalmak, komplex molekuláris diagnosztika és jelentősége a daganatos megbetegedések szempontjából

Átírás

1 Bevezetés, alapfogalmak, komplex molekuláris diagnosztika és jelentősége a daganatos megbetegedések szempontjából Dr. Enyedi Márton Zsolt, PhD Dr. Priskin Katalin, PhD

2 Kik vagyunk? Molekuláris diagnosztikai laboratórium: Tudományos közlemények: Molekuláris diagnosztika: Évente több ezer mintát vizsgálunk. Elsősorban tüdő és vastagbél daganatokban KRAS és EGFR meghatározás. Továbbá: NRAS, HRAS, BRAF, PIK3CA c-kit, IDH1-2, BRCA1-2, VHL stb

3

4 PRECÍZIÓS ONKOLÓGIA I. Tumorevolúció és célzott terápia II. Tumor heterogenitás és egysejt diagnosztika III. Folyékony biopsia

5 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) Science March 29; 339(6127): A karcinogenezis darwini evolúciós modellje : Vastagbél-tumor evolúció:

6 Driver gének és mutációk: Szelekciós előnyt biztosító mutációk Onkogének és tumorszuppresszorok Daganat típusonként általában 2-5 driver gén/mutáció Driver gének 138 azonosított: 74 Tumorszuppresszor 64 Onkogén Vogelstein et al. Science 339, 1546, 2013

7 Célzott tumorterápiás szerekhez szükséges diagnosztika: Szomatikus/sporadikus mutációk FFPE és natív tumorszövet mintából történő vizsgálat Magyarországon használt, célzott tumorterápiás gyógyszerek diagnosztikai célpontjait vizsgáljuk. A petefészek daganatokban szerepet játszó BRCA1-2 diagnosztikát az AstraZeneca céggel kötött megállapodás szerint FFPE mintából is végezzük.

8 Daganatok kialakulásában szerepet játszó BRCA mutációk: Pathogén, driver mutációk Inaktiválják a BRCA fehérjéket Elsősorban emlő és petefészek daganatok kialakulásában van szerepük Más daganatok kialakulásában is közrejátszanak: prosztata, hasnyálmirigy, vastagbélrák, stb Nature, Vol. 474, PNAS, Vol.108/44, Nature, Vol. 534, 2016

9 A BRCA génekhez kapcsolt tumorigenezis: American Association for Cancer Research, 2012 Human Molecular Genetics, Vol. 10, No. 7, 2001

10 Célzott tumorterápia BRCA mutáns ovárium daganatokban: PARP (Poly-ADP ribose polymerase 1 and 2) Olaparib: Lynparza (AstraZeneca) EMA:2015 F1000 Biology Reports 2010, 2:10

11 BRCA1 és BRCA2 Diagnosztikai munkafolyamat 1. DNS izolálás 2. Fragmentkönyvtár készítés 3. Újgenerációs szekvenálás vérmintából szövetmintából (FFPE) nyálkahártya kenetből Szonikálás Genom-amplifikálás Target (BRCA1, BRCA2) hibridizálás Target-amplifikálás IonTorrent PGM Illumina MiniSeq Illumina NextSeq Quality control: Quality control: Quality control: FFPE mintáknak Multiplex PCR BioAnalyzer Qubit Fragment analízs Leolvasás szám Átlagos lefedettség

12 NGS eredmények kiértékelése: bioinformatika Mutációk validálása: Független PCR Sanger szekvenálás Minőségbiztosítás: Külső nemzetközi validációs program: InVitro diagnosztikai eszközzé nyilvánítva 2014-ben:

13 Ovárium tumorminták diagnosztikájának összegzése: között vizsgált 100 high grade serosus ovárium tumor FFPE minta

14 Génpanelek a tumor-genetika szolgálatában: * Teljes gén szekvenálása, kivéve: CYLD: exon12-20; MET: exon2, 14-21; KIT: exon5,9,11,13,14,17,19,21; HRAS: exon2-3; SDHD: exon1; ERCC3: exon1; TERT: promoter

15 PRECÍZIÓS ONKOLÓGIA I. Tumorevolúció és célzott terápia II. Tumor heterogenitás és egysejt diagnosztika III. Folyékony biopsia

16 Tumor heterogenitás és egysejt genetikai diagnosztika A daganatokban a tumorsejtek genetikai háttere nem azonos Különböző genetikai hátterű sejtcsoportok/klónok/klaszterek Adott terápiás szer alkalmazásával előtérbe kerülhetnek azok a klónok, amelyek rezisztens genetikai háttérrel rendelkeznek A személyre szabott tumorterápia hatékonyságának gátja Teljes tumor elemzése során alacsony számuk miatt rejtve maradhatnak. Erre lehet megoldás a tumorsejtek egyedi genetikai jellemzése.

17 2.Normal urothel Bladder lumen 5. Early invasive 1.Tumor-free bladder 4. Late invasive 3.Dysplasia

18 Mutációk detektálása egyetlen sejtből: FGFR3 Y375C

19 Gépi tanulással egybekötött sejtizolálás automatizálása és direkt- PCR technika Brasko et al. Nat. Commun. 2018

20 PRECÍZIÓS ONKOLÓGIA I. Tumorevolúció és célzott terápia II. Tumor heterogenitás és egysejt diagnosztika III. Folyékony biopsia

21 Liquid biopsy testfolyadékból történő mintavételi eljárás Precíziósonkológia: specifikus genetikai elváltozások azonosítása, és a terápiasorána tumor adaptív evolúciójának monitorozása Szomatikusgenetikai elváltozásokat detektálhatunk testfolyadékokból(perifériás vérből, vizeletből, cerebrospinálisfolyadékból, vagy anyatejből) Alapja az utóbbi évtized tumor genom projectjei által azonosított genetikai markerek

22 INVAZÍV MINTAVÉTEL- SEBÉSZETI BIOPSZIA NEM-INVAZÍV MINTAVÉTEL- FOLYÉKONY BIOPSZIA Intratumor heterogenitás Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients Nature Reviews Cancer 11, (June 2011) doi: /nrc 3066 Extrametasztatikus heterogenitás Drága, időigényes és nem szövődmény-mentes A minta csak egy időbeli pillanatkép a tumorigenezisből Térben is korlátozott Komplikáció-mentes mintavétel Diagnosztikus előnye a korai kimutatás, minimal residual disease Komplex képet ad a tumor heterogenitásról Terápiás válasz real time detektálása Nagy kiújulási rizikójú csoportok azonosítása

23 TECHNIKAI KIHÍVÁSOK Tumor DNS: CTC, ctdna, tumor exoszóma Extracellulárisan előforduló szabad DNS mennyisége a vérplazmában nagyon kevés Ennek maxnéhány %-a származik a tumorból, korai stádiumban <1% Elkülönítése a normál DNS-től problematikus DNS fragmentált(átlaghossz: kb. 150bp) A mutáns allélek pontos aránya nehezen meghatározható, Szabad DNS féléletideje kb. 17perc!! Vérplazma elkülönítése a sejtes elemektől speciális, a fehérvérsejtek stabilizálását biztosító vérvételi cső használata! DNS izolálás optimalizálása Liquid biopsy for cancer screening, patient stratification and monitoring Graham Brock, Elena Castellanos-Rizaldos, LanHu, Christine Coticchia, Johan Skog Exosome Diagnostics, Cambridge, MA 02139, USA Correspondenceto:Johan Skog. ExosomeDiagnostics, 840 MemorialDrive, Cambridge, MA 02139, USA. Johan@exosomedx.com.

24 Szabad DNS: Kb. 150bp hosszú (nukleoszómálishossz) dupla szálú DNS a perifériás vérben és egyéb testfolyadékokban A perifériás vér plasma frakciójában fiziológiás kondíciók mellett kevés fehérvérsejt-eredetű szabad DNS (cellfreedna) Clearance: 1. Nukleázok 2. Máj 3. vese Milyen kondíciók vezetnek a szabad DNS mennyiségének növekedéséhez? Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patints Nature Reviews Cancer 11, (June 2011) doi: /nrc3066 e Clearance akadályozott (hepatocelluláris károsodás) Gyulladásos folyamatok Szöveti trauma Tumor Várandósság--- magzati DNS

25 The cobas EGFR Mutation Test v2 első liquidbiopsyteszt a piacon, melyet tüdő tumornál alkalmaznak -mert az EGFR génben azonosított driver mutációkkal szemben hatékony célzott terápiás szerek kerültek forgalomba (TKI) - mert tüdőtumor esetén gyakran nem áll rendelkezésre szöveti biopszia PCR-alapú tesztek Digital PCR BEAMing Allélspecifikus PCR (Cobas, ARMS) NGS-alapú tesztek WGS, WES Targetált amplikon panel Targetált hibridizációs panel

26 Allélspecifikus PCRalapú tesztek Érzékenység>5% Digitális PCR-alapú tesztek Érzékenység>0,01% Hátrány, hogy csak kis számú ismert célpont vizsgálható egyszerre

27 Érzékenység >1% Előny, hogy nagyszámú célpont vizsgálható egyszerre Hátránya a technológiai pontatlanság

28

29 Az ideális detekcióseljárás szabad DNS-re Deltagene ctdna panel Érzékeny(<1) UMI Multiplexálható Szabadalmazás alatt álló fejlesztés, mely meggátolja a multiplexálássorán problémát jelentő aspecifikus hibridizációt Kicsi a templátigénye (<10ng) Amplikonalapú

30 EGFR T790M plasmadetekciója optimalizálása TKI rezisztenciában szerepet játszanak: betegség-specifikus génpanel Emlő Prosztata Tüdő vastagbél primary minta mutation T790M ST-L001 72% 7% ST-L002 48,20% 19,40% ST-L003 23,40% 7,20% ST-L004 0% 0% ST-L005 5,80% 0% L01 38,92% 18,12% L02 6,30% 0% L03 26% 0% Eddig 100db emlőtumoros plasmaminta

31 30. dia KP1 Katalin Priskin;

32 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!