Helicobacter pylori fertozés biopsziás mintákból történo kimutatásának újabb lehetoségei a gyomor idült gyulladásos betegségeiben Dr. Ruzsovics Ágnes PhD értekezés tézisei 2004, Budapest Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika A munka a Gastroenterológia doktori program Újabb tényezok az emésztorendszer nyálkahártya lézióinak kialakulásában címu alprogramjának része. Programvezeto: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Semmelweis Egyetem, ÁOK, II. Belgyógyászati Klinika Témavezeto: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Dr. Molnár Béla Semmelweis Egyetem, ÁOK, II. Belgyógyászati Klinika
Bevezetés Régóta ismert a szoros összefüggés a gasztritisz és a peptikus fekélybetegség között. Ha a kórkép epidemiológiai alapjait tekintjük, a krónikus gasztritiszes betegek túlnyomó részében ez a betegség mikrobiális eredetu, amely a Helicobacter pylori (H.pylori) fertozés ellen fellépo gyulladásos válaszreakció következtében alakul ki. A baktérium fekélyképzodést elosegíto és a fekély gyógyulását gátló hatásának mechanizmusa még nem teljesen ismert. A gasztrointesztinális traktus epithelium integritásának fenntartásában alapveto szerepet játszik a sejtek proliferációjának és apoptózisának szabályozása. Feltételezzük, hogy a H.pylori eltéro genotípusai fontos szerepet játszanak a gyomornyálkahártya sejtkinetikai paramétereinek változásaiban és a sejtkárosodás kimenetelében, ezért ismeretük különös jelentoséggel bír. A különbözo H.pylori altípusok vizsgálata segíthet felderíteni, hogy az egyes gasztrointesztinális megbetegedésben és a szövodmények kialakulásában milyen bakteriális tényezok szerepelhetnek. A kvalitatív vizsgálatok mellett ez idáig nem állt rendelkezésünkre kvantitatív diagnosztikai módszer, friss és paraffin blokkokból történo genotipizálásra. A genotípus ismeretének összevetése a szövettani és endoszkópos diagnózissal, valamint az egyéb nem DNS-alapú diagnosztikai módszerekkel (immunhisztokémiai technikák, tenyésztés, urea kilégzési teszt, immunblot) és a baktérium jelenlétének egyideju kvantitatív felbecslése még nem történt meg, sem a diagnosztikában, sem a tudományos kutatások területén. 2
Nincs egységes álláspont abban a kérdésben sem, vajon a gyermekkori H.pylori fertozés enyhébb vagy súlyosabb kimenetelu, mint a felnottkori. Célkituzések Célunk volt 1. kidolgozni H.pylori kimutatásának polimeráz láncreakcióval (PCR) történo módszerét, paraffinba ágyazott és friss fagyasztott biopsziás mintákból. 2. felállítani egy új, real-time PCR módszert in situ kvalitativ-kvantitatív H.pylori kimutatásra és tipizálásra. 3. összehasonlítani, hogy az új módszer korrelál-e a többi nem DNS-alapú H.pylori kimutatási módszer (szövettan, tenyésztés, urea kilégzési teszt, immunblot) eredményével. 4. megvizsgálni, hogy H.pylori jelenlétében, illetve különbözo genotípusainak hatására hogyan változik a gyomor nyálkahártya sejtproliferációjának mértéke eltéro szövettani stádiumokban (ép nyálkahártya, gyulladás, fekély, atrófia, intesztinális metaplázia). 5. megvizsgálni, van-e összefüggés a H.pylori genotípusa és a szövettani diagnózis valamint a makroszkópos (endoszkópos) kép között. 6. meghatározni, hogy H.pylori, illetve különbözo genotípusainak jelenléte és intesztinális metaplázia kialakulása hatással van-e az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) expresszióra és a sejtproliferációra a gyomor mucosában. 7. meghatározni H.pylori genotípusainak sejtproliferációra, apoptózisra, p53 tumor szuppresszor gén és intesztinális mucin antigén (SIMA és LIMA) expressziójára kifejtett hatását felnott és gyermek gyomor biopsziás mintákban. 3
Vizsgálati anyagok és módszerek A vizsgálatban 232 beteg (116 férfi és 116 no) vett részt, akiknél emésztorendszeri panaszok miatt felso panendoszkópiás vizsgálatra volt szükség. Összehasonlító vizsgálathoz 40 gyermek biopsziás mintáját vizsgáltuk (17 fiú és 23 leány, átlag életkor 12,6±0,56 év a 4-21 éves tartományban), akik hasi fájdalom, hányás és/vagy súlyvesztés miatt kerültek endoszkópiás vizsgálatra. Kontrollként 32 (paraffinba ágyazott és frissen fagyasztott) ép gyomor nyálkahártya szövetbol készült minta szolgált, valamint intesztinális mucin antigén expresszió meghatározásához 5-5 ép vékony- és vastagbél szövetminta. Gyermekek kontrollcsoportjában 5 paraffinba ágyazott ép gyomor nyálkahártya szövetminta szerepelt. Makroszkópos (endoszkópos) jelek alapján a mintákat normál gyomornyálkahártya, endoszkópos gasztritisz, erózió és fekély csoportokba soroltuk. A felnottek paraffinba ágyazott szövetmintáit a szövettani diagnózis alapján csoportosítottuk a következoképpen: ép gyomor epithel (n=32), krónikus gasztritisz (n=115), krónikus gasztritisz intesztinális metapláziával (n=75). A minták osztályozásánál a Sydney-klasszifikációt vettük alapul. A szövetminták lízise és a DNS izolálása után hagyományos PCR alapú H.pylori caga, vaca, urea és icea gén kimutatását végeztük. Ezután real-time PCR protokoll szerint, SYBR Green alapú kvalitatív H.pylori gén kimutatást, valamint kvantitatív FRET-PCR alapú urea és ß-globin gén meghatározást végeztünk. A sejtkinetikai paraméterek jellemzésére immunhisztokémiai módszereket alkalmaztunk. A sejtproliferáció kimutatására a PCNA módszert, apoptózis 4
vizsgálatára TUNEL reakciót használtunk. Továbbá p53 oncoprotein és EGFR receptor expresszió, valamint intesztinális mucin antigének (SIMA, LIMA) kimutatását is végeztük. Munkánkban egyéb H.pylori kimutatási módszereket is alkalmaztunk (urea kilégzési teszt /UBT/, immunblot). Eredmények 1. Hagyományos PCR alapú H.pylori kimutatás: H.pylori caga, vaca gén kimutatása paraffin blokkokból és fagyasztott biopsziás mintából is, míg urea, icea2 kimutatása csak fagyasztott biopsziás mintákból sikerült. 2. Real-time PCR SYBR Green módszer összevetve a minták szövettani, EGFR és PCNA festés eredményeivel: Mind caga, mind vaca jelenlétében csökkent EGFR expressziót találtunk. 3. Kvantitatív H.pylori meghatározás real-time PCR FRET-technikával összevetve a szövettan, UBT, PCR SYBR Green és immunblot eredményével: A gyomor biopszia H.pylori suruségének meghatározása real-time PRC FRET technikával történt. A PCR során amplifikálódott urea-termék mennyisége nem volt azonos, az erózió területén az urea szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a szomszédos területeken a gyomor antrumában és corpusában is. UBT kvantitatív értékét (DOB) és ezzel párhuzamosan ureasea/ß-globin relatív arányát meghatározva, a két módszer között szignifikáns korrelációt találtunk (p<0,05). Az UBT vizsgálat szürke zónájában (DOB: 0-4 ), ahol a diagnózis megbízhatatlan, real-time FRET-PCR technikával számos, egyértelmuen pozitív eredményt kaptunk. 4. EGFR és PCNA expresszió vizsgálata: 5
IM társult H.pylori-pozitív gasztritisz esetén az EGFR-pozitív sejtek aránya szignifikánsan csökkent a normál epithelhez és az IM társult H.pylori-negatív gasztritiszhez képest. Hasonló, de nem szignifikáns különbség volt IM nélküli gasztritiszek esetében is. A PCNA-pozitív sejtek száma hasonló volt a H.pyloripozitív és negatív csoportban. 5. p53, PCNA és intesztinális mucin antigén (SIMA, LIMA) expresszió vizsgálata: Az IM esetek legtöbbje inkomplett típusú volt. Komplett típusú IM az esetek 23%-ban volt kimutatható. Tíz IM társult gasztritisz minta metaplasztikus régiója mutatott SIMA és LIMA-pozitivitást is. Eros, bár nem szignifikáns korrelációt találtunk a H.pylori-pozitivitás és a kettosen pozitív immunreakció között. Markáns szignifikáns különbséget találtunk a növekedett p53 expresszió és SIMA reaktivitás között az IM társult gasztritisz csoportban. Hasonló eredményre jutottunk LIMA esetében is Statisztikailag szignifikáns különbséget találtunk PCNA (p=0,0297) és p53 (p=0,0436) eredményeiben az I. és II. típusú IM esetek között. 6. Gyermek biopsziás minták vizsgálata H.pylori jelenléte és intesztinális mucin antigén expresszió tekintetében: Nem találtunk statisztikailag szignifikáns kapcsolatot caga, vaca genotípus jelenléte és a klinikai tünetek megjelenése között. IM 4 esetben volt kimutatható mikroszkóposan, míg SIMA és LIMA pozitivitást 16 esetben találtunk. Kapcsolatot találtunk a fokozott p53 és SIMA expresszió között a H.pyloripozitív csoportban. Fokozott proliferációs aktivitást találtunk gasztritiszben a normál mintákhoz képest, de nem volt szignifikáns különbség a szövettani H.pylori-pozitív és negatív gasztritisz esetek között. 6
Az apoptotikus index közel szignifikánsan emelkedett H.pylori-pozitív gasztritisz esetekben a normál mintákhoz képest. P53 expressziója szignifikánsan magasabb volt a szövettani vizsgálattal H.pylori-pozitív gasztritisz esetekben a normál mintákhoz képest, mint a H.pylori-negatív esetekben. Következtetések Kidolgoztuk a H.pylori különbözo genotípusainak hagyományos PCR módszerrel történo kimutatási módszerét. Kidolgoztuk real-time PCR készülékkel, SYBR Green festéket használva, majd az olvadáspont analízis módszert alkalmazva H.pylori caga, vaca és urea genotípusának tipizálási technikáját. Kvantitatív real-time PCR vizsgálatot is felállítottuk FRET- technikát alkalmazva, H.pylori urea gén kimutatása alapján. Azonos gyomor több területén szignifikánsan különbözo H.pylori suruséget mértünk. Összehasonlítva, a kidolgozott DNS-alapú H.pylori diagnosztikai technikák eredményét a hagyományos biopszia-alapú módszerekkel, megállapíthatjuk, hogy a biopszia-alapú H.pylori fertozés kvantitatív értékelés megbízhatósága korlátozott atrófiás gasztritisz esetében a foltos eloszlás és csökkent baktériumszám miatt. Továbbá elmondhatjuk, hogy a real-time PCR jóval érzékenyebb, mint a hagyományos H.pylori kimutatási módszerek. H.pylori caga genotípusának jelenlétében a gasztritisz csoportban, vaca jelenlétében az IM-el társult gasztritisz mintákban találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget az ép gyomornyálkahártyához viszonyítva. A caga-pozitív H.pylori törzzsel történo fertozés fokozott sejtproliferációt okoz. 7
Nem volt szignifikáns proliferáció fokozódás, sem H.pylori-pozitív, sem negatív gasztritisz esetén a normál nyálkahártyához képest. A fokozott proliferáció nem egy H.pylori jelenlététol függo szervezeti válaszreakció a sejtsérülésre gasztritisz esetén. A H.pylori fertozés szignifikánsan csökkenti az EGFR expresszióját IM esetén, és hasonló, de nem szignifikáns változás figyelheto meg a gasztritiszes mintákban is. Az EGFR jobb immunhisztokémiai mutatónak bizonyult a gyomornyálkahártya negváltozott sejtfunkciójára, mint a proliferáció vizsgálata. Felnottek mintáiban IM esetében SIMA és p53 expressziója az elváltozás súlyosságával fokozódott, amely alapján feltételezheto, hogy a gyomornyálkahártya p53 és vékonybél eredetu mucin termelése egy korai esemény a gyomor metaplasztikus átalakulásának többlépcsos folyamatában. Gyermekek mintáiban szignifikáns kapcsolatot találtunk p53 expresszió és caga jelenléte között. Kimutattuk, hogy a H.pylori fertozött gasztritiszben a p53 proteint expresszáló sejtek aránya jelentosen emelkedett, és ezt SIMA expressziójának növekedése követte. Gyermekeknél SIMA pozitivitást találtunk, ahol atypia vagy metaplázia szövettani jelét nem sikerült azonosítani. Eredményeink ellentmondanak a carcinogenezis kialakulását magyarázó Correa-modellnek, amelyben IM megjelenése nem elozi meg a gasztritisz és/vagy atrófia kialakulását, azonban közvetlenül elofordul az apoptózis indukálta gyomornyálkahártya sérülésre adott válaszreakcióban. 8
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Ruzsovics Á., Molnár B., Tulassay Zs.: A Helicobacter pylori molekuláris biológiai jellemzoi. Orvosi Hetilap 2000; 141(47): 2535-2540. Ruzsovics Á., Molnár B., Unger Zs., Tulassay Zs., Prónai L.: Helicobacter pylori caga, vaca genotípusának meghatározása real-time PCR módszerrel. Orvosi Hetilap 2001; 142(10): 509-514. Ruzsovics A., Molnár B., Tulassay Z.: Determination of caga, vaca genotypes of Helicobacter pylori with real-time PCR method. Journal of Physiology, Paris 2001; 95:369-377. Ruzsovics A., Unger Zs., Molnár B., Prónai L., Tulassay Z.: Effect of Helicobacter pylori infection on epidermal growth factor receptor (EGFR) expression and cell proliferation of gastric epithelial mucosa: correlation to macroscopic and microscopic diagnosis. International Journal of Experimental Pathology 2002; 83: 257-263. Ruzsovics A, Molnar B, Tulassay Z.: Deoxyribonucleic acid-based diagnostic techniques to detect Helicobacter pylori. Aliment Pharmacol Ther 2004; 19(11): 1137-1146. Ruzsovics Á, Molnár B, Tulassay Zs.: A Helicobacter pylori kimutatás DNSalapú diagnosztikai módszerei. Lege Artis Medicinae 2004; 14(5): 337-42. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó eloadások és absztraktok CagA, vaca genotypes of Helicobacter pylori determination from paraffin embedded tissue samples with real-time PCR method. Ruzsovics Á, Molnár B, Tulassay Z: Z Gastroenterol 2000; 38(5): 423, 101. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 42. Nagygyulése, 2000. CagA, vaca genotypes of Helicobacter pylori determination from paraffin embedded tissue samples with real-time PCR method. Ruzsovics A, Molnár B, Tulassay Z: The 2nd East-West Bridging Meeting in Gastroenterology, Gothenburg 2000. Determination of caga, vaca genotypes of Helicobacter pylori with real-time PCR method. Ruzsovics A, Molnár B., Tulassay Z. 9
Dig Dis Sci 2001; 46(3):677 Joint meeting of the 10th International Conference on Ulcer Research and 5th International Symposium on Cell Injury and Protection in the Gastrointestinal Tract: From basic Sciences to Clinical Perspectives, Budapest, 2000. Determination of H.pylori vaca, caga and ureasea genes with real-time PCR analysis and its correlation with immunohistochemistry. Ruzsovics A, Molnár B, Prónai L, Unger Zs, Tulassay Z: Z Gastroenterol 2001; 39(5): 417 A149 Magyar Gasztroenterológiai Társaság 43. Nagygyulése, 2001. Different effect of H.pylori on p53 oncoprotein expression and apoptosis of gastric epithelium in presence and absence of intestinal metaplasia. Unger Zs, Prónai L, Molnár B, Ruzsovics A, Schandl L, Tulassay Z: Z Gastroenterol 2001; 39(5): 428 A193 Magyar Gasztroenterológiai Társaság 43. Nagygyulése, 2001. Determination of Helicobacter pylori caga, vaca genotypes with real-time PCR in gastric biopsy specimen. Correlation to proliferation immunohistochemical data. Ruzsovics A., Unger Zs., Ebert M., Molnár B., Prónai L., Malfertheiner P., Tulassay Z: Digestive Disease Week, Atlanta, 2001, poster of distinction Comparison of traditional and a quantitative real-time PCR diagnostic techniques for detection of Helicobacter pylori infection in gastric tissues. Ruzsovics Á, Molnár B, Prónai L, Tulassay Z: Z Gastroenterol 2002; 40(5): 353 A105. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 44. Nagygyulése, 2002. Quantitative CK20 RT-PCR is in correlation with progression and CA19-9, but not with CEA and CA72-A immunoassays in the follow-up of Dukes D stage colorectal patients. Molnár B, Floro L, Ruzsovics A, Ladányi A, Tulassay Z: Z Gastroenterol 2002; 40(5): 347 A77 Magyar Gasztroenterológiai Társaság 44. Nagygyulése, 2002. Comparison of traditional and a quantitative real-time PCR diagnostic techniques for detection of Helicobacter pylori infection in gastric tissues. Ruzsovics A, Molnar B., Tulassay Z.: Gastroenterology. 2002; 122: Suppl 4. A204, S1313. Digestive Disease Week, San Francisco, 2002. 10
Quantitative CK20 RT-PCR is in correlation with progression and CA19-9, but not with CEA and CA72-A immunoassays in the follow-up of Dukes D stage colorectal patients under chemotherapy. Molnár B, Floro L, Ruzsovics A, Ladányi A, Tulassay Z: Gastroenterology. 2002; 122: Suppl 4. A599, S1273. Digestive Disease Week, San Francisco, 2002. Chip technológiák alkalmazása ritka sejtes mintákon. Molnár B, Galamb O, Sipos F, Ruzsovics Á: III. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, 2002, Budapest. Quantitative RT-PCR of peripherial blood cytokeratin 20 (CK20), thymidilate synthase (TS), telomerase related RNA (TELORNA) with tumormarker determinations are useful for the evaluation of responder status to chemotherapy in Dukes stage D CRC patients. Floro L, Molnár B, Ruzsovics A, Sipos F, Sréter L, Tulassay Z: Z Gastroenterol. 2003; 41(5): 436, 25. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 45. Nagygyulése, 2003. Follow-up evaluation of Dukes BC stage patients for the presence of circulating tumor cells by mrna magnetic cell isolation and serum tumormarkers. Molnár B, Sipos F, Ruzsovics A, Floro L, Sréter L, Tulassay Z: Z Gastroenterol. 2003; 41(5): 447, 71. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 45. Nagygyulése, 2003. Effect of short term omeprasol therapy on the cell proliferation and p53 expression of the gastric epithelia. Németh A, Ruzsovics A, Molnár B, Sipos F, Prónai L, Tulassay Z: Z Gastroenterol. 2003; 41(5): 449, 80. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 45. Nagygyulése, 2003. Assesment of gastric epithelial proliferation, apoptotic activity, p53 and intestinal mucin antigens expression, and caga, vaca genotypes in H.pylori infected children. Ruzsovics A, Dezsofi A, Molnár B, Tulassay T, Tulassay Z: Z Gastroenterol. 2003; 41(5): 456, 105. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 45. Nagygyulése, 2003. 11
Quantitative RT-PCR of peripherial blood cytokeratin 20 (CK20), thymidilate synthase (TS), telomerase related RNA (TELORNA) with tumormarker determinations are useful for the evaluation of responder status to chemotherapy in Dukes stage D CRC patients. Floro L, Molnár B, Ruzsovics A, Sipos F, Sréter L, Tulassay Z: Gastroenterology. 2003; (124) Suppl 4. A646, W1317. Follow-up evaluation of Dukes BC stage patients for the presence of circulating tumor cells by mrna magnetic cell isolation and serum tumormarkers. Molnár B, Sipos F, Ruzsovics A, Floro L, Sréter L, Tulassay Z: Gastroenterology. 2003; (124) Suppl 4. A655, W1360. Validation of intestinal mucin antigens in the gastric epithelium with intestinal metaplasia and their relationship with p53 expression and proliferation activity. Ruzsovics A, Sipos F, Molnar B, Tulassay Z: Gastroenterology. 2003; (124) Suppl 4. A450, T923. Follow-up evaluation of Dukes BC stage patients for the presence of circulating tumor cells by mrna magnetic cell isolation and serum tumormarkers. Sipos F, Molnár B, Ruzsovics A, Floro L, Sréter L, Tulassay Z: Ph.D. Tudományos Napok 2003. április, Budapest. Quantitative RT-PCR of peripherial blood cytokeratin 20 (CK20), thymid ilate synthase (TS), telomerase related RNA (TELORNA) with tumormarker determinations are useful for the evaluation of responder status to chemotherapy in Dukes stage D CRC patients. Ruzsovics A, Floro L, Molnár B, Sipos F, Sréter L, Tulassay Z: Ph.D. Tudományos Napok 2003. április, Budapest. Assesment of gastric epithelial proliferation, apoptotic activity, p53 and intestinal mucin antigens expression, and caga, vaca genotypes in H.pylori infected children. Ruzsovics A, Dezsofi A, Molnár B, Tulassay T, Tulassay Z: Ph.D. Tudományos Napok 2003. április, Budapest. Effect of short term omeprasol therapy on the cell proliferation and p53 expression of the gastric epithelia. Hritz I, Ruzsovics A, Molnár B, Sipos F, Németh A, Tulassay Z: Ph.D. Tudományos Napok 2003. április, Budapest. 12
DNA-based diagnostic techniques to detect H.pylori Ruzsovics A, Molnar B, Tulassay Z: Magyar gasztroenterológiai társaság 46. Nagygyulése, 2004. Evaluation of immunhistochemical labelling and detection of intestinal mucin antigens in the gastric epithelium with and without intestinal metaplasia. Correlation to microscopical diagnosis Németh A, Ruzsovics A, Sipos F, Molnar B, Tulassay Z: Magyar gasztroenterológiai társaság 46. Nagygyulése, 2004. 13