A vastagbélhám sejtkinetikai változásainak vizsgálata gyulladásos vastagbélbetegségekben a gyulladás szövettani aktivitásának függvényében

Átírás

1 A vastagbélhám sejtkinetikai változásainak vizsgálata gyulladásos vastagbélbetegségekben a gyulladás szövettani aktivitásának függvényében Doktori (PhD) dolgozat Gastroenterológia c. PhD program keretében Írta: Dr. Sipos Ferenc Témavezető: Dr. Molnár Béla PhD. Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinika

2 BEVEZETÉS A colitis ulcerosa és a Crohn-betegség idiopathiás gyulladásos bélbetegségek, amelyek a fejlett országok morbiditási adatainak jelentős tényezőjeként szerepelnek. Hazánkban évente új megbetegedéssel kell számolni. Az etiológiájuk, az egymáshoz való viszonyuk, valamint más betegségekkel való kapcsolatuk évek óta intenzív kutatás tárgyát képezik. A Crohn-betegség és a colitis ulcerosa számos hasonlóságot mutat (aktív epizódokkal kisért krónikus gyulladás; extraintesztinális manifesztációk stb.), mégis az esetek többségében a két betegség egymástól elkülöníthető. Az esetek 10%-ában azonban még alapos szövettani vizsgálat után is nehéz különbséget tenni a két betegség között. Ilyenkor meghatározatlan colitisről (indeterminate colitis) beszélünk. A kezdeti kísérletek, amelyek arra irányultak, hogy specifikus kórokozót vagy immunológiai eltérést igazoljanak a krónikus folyamatok hátterében, sikertelenek voltak. A legújabb eredmények bepillantást nyújtanak a két betegségek pathogenezisébe. Ma már tudjuk, hogy a tünetek aktiválódásában környezeti faktorok, pszichés tényezők, fertőzéses állapotok, stressz-helyzetek, gyógyszeres behatások (pl.: antibiotikumok), és veleszületett adottságok mellett még számos felederítésre váró komponens játszhat szerepet. A humán vastagbélben a mirigyhámsejtek gyors turnovere a nyálkahártya szöveti integritásának megőrzése miatt nélkülözhetetlen, ugyanis ennek segítségével a bakteriális, toxikus ill. mitogén faktorok által kiváltott genetikai defektusok felhalmozódása elkerülhető. A gyulladásos bélbetegségek pathogenezisének első lépése, azaz az epitheliális turnover zavarának elsődleges oka részleteiben ma még nem ismert. Kóros körülmények között megváltozik a bélhám sejtkinetikája, ami fekélyképződéshez ill. kóros sejtosztódáshoz vezethet. Ismert téyn az is, hogy gyulladásos bélbetegségekben szenvedő betegek között, főként a colitis ulcerosásoknál, szignifikánsan magasabb a colorectalis rákok kialakulásának kockázata, különösen a betegség hosszabb, 10 éven túli fennállása esetén. Feltételezhető, hogy a sejtkinetikai egyensúly zavara szoros összefüggésben van a submucosalis immunitás eltéréseivel. A tudományos irodalomban nem található egyértelmű adat arra nézve, hogy a krónikusan aktív gyulladás során miként változik a hámsejtek osztódása, apoptosisa, öregedése, - 2 -

3 valamint az epitheliális regeneráció. Szintén ismeretlen ezeknek a sejtkinetaikai paramétereknek a betegség-specificitása. A nyálkahártya turnover zavarának megismerése nélkülözhetetlen a pathogenezis pontosabb leírása, valamint a malignus transzformáció kezdeti lépéseinek megismerése szempontjából

4 CÉLKITŰZÉSEK 1. A gyulladásos vastagbélbetegségekben tapasztalt nyálkahártya barrier funkció megváltozás fehérjeszinten jelentkező sejtkinetikai okainak leírása. 2. A gyulladásos aktivitás hatásának vizsgálata a vastagbél hámsejtek proliferációját és apoptosisát elsődlegesen és másodlagosan meghatározó tényezőkön. 3. Az egyes sejtkinetikai változások betegség-specificitásának vizsgálata. 4. A hosszú távon fennálló, aktív epizódokkal kísért krónikus gyulladással összefüggésben lévő, és hosszú távon kóros sejt-túléléshez és sejtproliferációhoz vezető, fehérje szinten megnyilvánuló epitheliális eltérések vizsgálata

5 BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Vizsgálataimat a II. sz. Belgyógyászati Klinika Sejtanalitika Laboratóriumában végeztem. Előzetes felvilágosítás és beleegyező nyilatkozat kitöltését követően összesen 33 colitis ulcerosás, 26 Crohn-colitises, 30 ún. aspecifikus colitises betegtől, valamint 10 egészséges, nem colitises, nem vastagbélrákos egyéntől történt biopsziás mintavétel a rutin vastagbéltükrözések során, a betegség által leginkább érintett bélszakaszokból. 8 colitis ulcerosás és 8 Crohn-colitises betegnél első diagnózisként lett megállapítva a betegség. Fenntartó gyógyszeres kezelésben (aminoszalicilsav-vegyületek) 43 beteg részesült. Az aktuális vizsgálat előtt 3 hónappal kortikoszteroid, antibiotikus, ill. immunszupprimáns szerek adásában egyik beteg sem részesült. A gyulladás szövettani aktivitásának meghatározását tapasztalt pathológus kolléga végezte (I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet). Apoptosis, proliferáció, p53 és EGFR kimutatás összesen 345 formalin fixált, paraffinba ágyazott szövettani metszeten történt. További vizsgálataimat összesen 160 (IGF1R, C- met, TERT és TP1) colitis ulcerosás és egészséges mintán végeztem. A minták betegségcsoportonként és vizsgált paraméterenként való megoszlása a táblázatban látható. APOPTOSIS PROLIFERÁCIÓ P53 EGFR IGFR C- TERT TP1 MET Normális [10 egyén] Colitis Enyhe ulcerosa Mérsékelt [33 beteg] Súlyos Crohncolitis Enyhe Mérsékelt [26 beteg] Súlyos Aspecifikus Enyhe colitis Mérsékelt [30 beteg] Súlyos Összesen Az apoptosis vizsgálatához TUNEL-reakciót, a sejtosztódáshoz PCNA-, a tumorszuppresszor gén kifejeződéséhez p53-, növekedési faktor receptor kifejeződéshez - 5 -

6 EGFR-, IGFR-, HGFR-, telomeráz kifejeződés vizsgálatához pedig TERT és TP-1 immunhisztokémiai módszereket alkalmaztam. Kiegészítő vizsgálatként CD45/CD68/CD83-EGFR multifluoreszcens immunhisztokémiai jelölést alkalmaztam. Szemikvantitatív kiérétkelést követően a statisztikai elemzést variancia-analízis, korreláció analízis és LSD-teszt segítségével végeztem

7 EREDMÉNYEK TUNEL pozitivitás Erősen szignifikáns különbségeket találtam enyhe, mérsékelt és súlyos gyulladások között (p<0.0001). Enyhe gyulladás és ép minták között nem volt szignifikáns különbség. A vizsgált gyulladásos csoportok mindegyikében hasonló TUNELpozitivitási karakterisztikát találtam. PCNA expresszió Szignifikáns különbséget találtam az enyhe, mérsékelt és súlyos gyulladásos csoportok között egymáshoz (p<0.05), valamint egészséges mintákhoz hasolítva (p<0.001). A vizsgált gyulladásos csoportok mindegyikében hasonló PCNA-kötési karakterisztikát találtam. p53 expresszió Egészséges mintákban viszonylag nagy p53 hámsejt pozitivitást találtam. Néhány súlyosan gyulladt colitis ulcerosás minta subepithel rétegében p53 pozitív mononukleáris sejtet tartalmazó lymphoid aggregátumot találtam. Crohn-colitises mintákban és egészséges mintákban nem találtam hasonlót. A p53 kötési index minden gyulladásos csoportban szignifikánsan magasabb volt az egészséges mintákhoz viszonyítva (p<0.05). Enyhe, mérsékelt és súlyos gyulladások között szignifikáns különbséget (p<0.05) csak colitis ulcerosás mintákban találtam. EGFR expresszió Az EGFR kötési indexek minden gyulladásos csoportban erősen szignifikánsan alacsonyabbak voltak ép mintákhoz hasonlítva (p<0.005). Ahogy a gyulladás súlyossága fokozódott, az EGFR expressziója szignifikánsan csökkent a gyulladásos csoportokban, kivéve a súlyos Crohn-colitis és aspecifikus colitis eseteket. Enyhe colitis ulcerosában az EGFR expresszió csökkenése szignifikánsan nagyobb volt az enyhe Crohn-colitisben ill. aspecifikus colitisben észleltnél (p<0.05). Mérsékelt és súlyos gyulladásos esetekben számos, diffúz citoplazmatikus EGFR pozitivitást mutató mononukleáris sejtet (plazmasejtek és leukocyták) találtam az epitheliumhoz közel eső lamina propriában. Multifluorescens immunhisztokémiai vizsgálattal ezek a sejtek EGFR/CD45 dupla pozitivitást mutattak, de sem CD68-7 -

8 makrofág, sem CD83 dendritikus sejt marker pozitivitást (antigén prezentáló sejt eredet) nem találtam rajtuk. IGFR expresszió Az IGFR-I expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe (22.3±9.46%) és mérsékelt (50.2±8.6%) colitis ulcerosában súlyos (6.4±3.66%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (7.2±3.15%) (p<0.005) hasonlítva. C-met expresszió A C-met expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe (35.3±22.8%) gyulladásban, mérsékelt (5.8±3.67%), súlyos (5.9±2.33%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (0.7±0.9%) (p<0.005) viszonyítva. TERT és TP1 expresszió A TERT és a TP-1 immunreaktivitás mind számban, mind a cryptán belüli, mind intracelluláris lokalizációban hasonló eloszlást mutatott. A TERT és TP1 expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe gyulladásban (2.1±1.87%/2 ±1.32%), mérsékelt (0.06±0.1%/0.1±0.2%), súlyos (0/0%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (1.1±1.4%/0.5±0.9%) (p<0.005) hasonlítva. Korreláció analízis Az epitheliális apoptosisban és proliferációban tapasztalt szoros pozitív korreláció mellett a p53 expresszió erős pozitív, az EGFR expresszió pedig erős negatív korrelációt mutatott a hámsejtproliferációval, és a gyulladás súlyossági fokával

9 KÖVETKEZTETÉSEK - IBD-ben az apoptosis mértéke szorosan összefügg a gyulladás szövettani aktivitásának mértékével, és az egyes betegségekben az apoptosis jelátviteli útjainak zavaraitól függetlenül, az apoptosis tényét tekintve, nem betegségspecifikus tényező, pusztán a hám sérülékenységét jellemzi. - Normális vastagbélhámban és enyhe gyulladásban nincs különbség az apoptosis mértékében. - A vastagbélhámsejt proliferációban jelentkező eltérések nem betegség-specifikusak, egyedül a gyulladásos folyamat kiterjedése határozza meg ezen eltérések mértékét. - A hámsejt proliferáció zavara előbb alakul ki IBD-ben, mint a hámsejtek apoptosisának zavara. - Az állandó, enyhén fokozott hámsejt proliferációs aktivitás kedvez a malignusan transzformálódott hámsejt klónok osztódásának. - Az aktív fázisban tapasztalható proliferáció fokozódás a vastagbélhám önvédő mechanizmusa lehet, amellyel igyekszik a gyulladás során fokozott apoptosisnak kitett hámsejteket pótolni, és ezzel regeneratív faktorként hat. - Magas p53 (DO-7) immunreaktivitás jellemzi az ép, egészséges vastagbélhámot. - A p53 fehérje expressziója colitis ulcerosában szignifikánsan pozitív korrelációt mutatott a gyulladás szövettani aktivitásával. Hasonló pozitív korreláció sem Crohncolitisben, sem aspecifikus colitisben nem mutatkozott. - A gyulladásos folyamattal negatívan korreláló EGFR immunreaktivitás jellemzi a vastagbélhámot. - Colitis ulcerosában található a legszorosabb összefüggést az EGFR pozitivitás csökkenése és a gyulladás súlyossági foka között. - A hámregeneráció szempontjából fontos jelátviteli út (EGFR-EGF rendszer) receptorának expresszió csökkenése elősegíti aktív gyulladásban a vastagbélhám barrier funkciójának felbomlását, és a fekélyképződést. - A gyulladás aktivitásának növekedésével párhuzamosan növekvő számban, a hámfelszín közeli lamina propriát EGFR pozitív sejtek (plazmasejtek és leukocyták egyaránt) infiltrálják. - Multifluorescens jelölési technikák alkalamzása alapján ezek a sejtek EGFR/CD45 leukocyta marker dupla pozitívak. Egyik sem mutatott CD68 makrofág-, ill. CD 83 dendritikus sejt marker pozitivitást

10 - A plazmasejt morfológia alapján felvetődik annak a lehetősége, hogy a subepitheliális rétegben anti-egfr jellegű autoimmun folyamatok zajlanak az aktív gyulladás folyamán - Colitis ulcerosában a gyulladásos folyamattal kezdetben párhuzamosan fokozódó, majd súlyos fokú gyulladásban hirtelen csökkenő IGFR fehérje expresszió jellemző. Ennek a regenerációs szignálnak a csökkenése, akárcsak az EGFR esetében, aktív gyulladásban hozzájárulhat a hámréteg barrier funkciójának csökkenéséhez és a fekélyképződéshez. - A C-met fehérje expressziója enyhe gyulladásban szignifikánsabban nagyobb, mint ép, egészséges vastagbél nyálkahártyában, valamint mérsékelt és súlyos fokú gyulladásban. - Colitis ulcerosában a lamina propriában p53 és C-met pozitív sejteket tartalmazó lymphoid aggregátumok vannak jelen. - A p53 és C-met pozitív szubepitheliális folliculusok jelenléte a gyulladásos miliőnek ellenálló regeneratív pool létezésének lehetőségét vetik fel, amelyből az elpusztult hámrétegbe hámsejt-prekurzorként működni képes sejtek vándorolhatnak a crypták proliferatív zónájába, elősegítve ezzel a regeneráció mechanizmusát. - Enyhén gyulladt vastagbél nyálkahártyában kiugróan magas a TERT/TP-1 fehérje expressziója ép nyálkahártyához, valamint mérsékelt és súlyos fokú gyulladáshoz hasonlítva. - A telomeráz fehérje expresszió enyhe fokú gyulladásban való megnövekedése elősegíti a hosszan fennálló krónikus gyulladásban a genetikailag károsodott hámsejtek immortalizációját, megteremtve ezzel a későbbi kóros sejtosztódás lehetőségét. - A gyulladásos folyamat súlyosságával fordított arányban változó proliferatív szignál expresszió, és az egyenes arányban fokozódó hámsejt proliferáció látszólag egymásnak ellent mondó tények. Az ellentmondás feloldására javasolnám a Reg fehérje expressziójának vizsgálatát hasonló mintacsoportokban. - Enyhe gyulladásban az EGFR fehérje expresszió az ép nyálkahártyában tapasztalthoz hasonlóan magas szintű. Az IGFR, C-met és TERT/TP1 fehérjék enyhe gyulladásban kiugróan nagymértékben fejeződnek ki. Enyhe gyulladásban a hámot nagy mértékű regeneratív hatás éri. - Az aktív gyulladásos epizódok során a hámot számos genetikai károsodást okozó hatás éri, melyek közvetlen DNS károsító hatással rendelkeznek, és p53 mutációt okoznak

11 Az aktív gyulladásos epizódok során a vastagbélhám proliferatív zónája begyűjti a p53-at érő genetikai ártalmakat. Később, a betegség hosszan fennálló, enyhe gyulladással kisért kiégett szakaszában a genetikailag károsodott sejtek, elvesztvén apoptosissal szembeni érzékenységüket, és a folyamatosan jelenlévő, túlélést biztosító mitogén faktorok hatására (EGFR, IGFR, C-met), valamint az immortalizációban nélkülözhetetlen telomeráz aktivitás fokozódásának segítségével kórosan osztódnak, és így malignus folyamat kialakulásának kedvezhetnek

12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkámhoz nyújtott segítségükért szeretnék köszönetet mondani: - programvezetőmnek, Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, a II. sz. Belgyógyászati Klinika Igazgatójának, aki munkám során végig segített és támogatott; - témavezetőmnek, Dr. Molnár Béla tudományos munkatársnak, a Sejtanalitikai Laboratórium Vezetőjének, aki iránymutatásával, áldozatos segítőkészségével és támogatásával vitt előre munkám során; - klinikai konzulensemnek, Dr. Zágoni Tamás egyetemi adjunktusnak, aki szakmai és személyes segítségnyújtásával támogatott munkám során; - Dr. Berczi Lajos pathológus szakorvosnak, a személyes konzultációk során nyújtott értékes és hasznos tanácsaiért; - Kónyáné Farkas Gabriella és Albert Karola szakasszisztenseknek, hogy a gyakorlati munkám során értékes segítséget nyújtottak; - a Sejtanalitikai Laboratóriumban dolgozó összes munkatársamnak támogatásukért; - és végül, de legkevésbé sem utolsó sorban Édesanyámnak és Édesapámnak, akik szeretete, önfeláldozása és hite nélkül nem tartanék ott, ahol jelenleg vagyok

13 KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA A dolgozat témájához kapcsolódó publikációk jegyzéke: Sipos F, Molnár B, Zágoni T, Miheller P, Tulassay Z.: Inzulinszerű növekedési faktor receptor, hepatocytaeredetű növekedési faktor receptor és telomeráz fehérje expresszió colitis ulcerosában [Insulin-like growth factor receptor, hepatocyte-derived growth factor receptor and telomerase expression in ulcerative colitis] Orv Hetil Sep 24; 147(38): Sipos F, Molnar B, Zagoni T, Berczi L, Tulassay Z.: Growth in epithelial cell proliferation and apoptosis correlates specifically to the inflammation activity of inflammatory bowel diseases: ulcerative colitis shows specific p53- and EGFR expression alterations. Dis Colon Rectum Apr;48(4): Sipos F, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z.: Chiptechnikák alkalmazása vastagbélrákban [Use of DNA-chips technology in colorectal cancer] Orv Hetil May 9;145(19): Sipos F, Zágoni T, Molnár B, Tulassay Z.: A bélhámsejtek osztódásának és apoptózisának változása colitis ulcerosa szöveti aktivitásának függvényében [Changes in the proliferation and apoptosis of colonic epithelial cells in correlation with histologic activity of ulcerative colitis] Orv Hetil Nov 3;143(44): Sipos F, Molnár B, Zágoni T, Tulassay Z.: Sejtkinetikai változások és a klinikai kép összefüggése gyulladásos bélbetegségekben [Changes in cell kinetics and clinical course in inflammatory bowel diseases] Orv Hetil May 26;143(21): Galamb O, Sipos F, Fischer K, Tulassay Z, Molnar B.: The results of the expression array studies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorectal cancer. Cytometry B Clin Cytom Nov;68(1):

14 Szőke D, Sipos F, Spisák S, Molnár B, Tulassay Z.: A p53 gén és fehérje 2005-ben: új eredmények, ígéretes lehetőségek [The p53 gene and protein in 2005: new results, promising opportunities] Orv Hetil Jul 24;146(30): Egyéb közlemények: Sipos F, Tihanyi E, Molnár B, Tulassay Z.: Humán szöveti őssejtek izolálása és terápiás alkalmazása [Isolation and therapeutic use of human stem cells] Orv Hetil Jun 19;146(25): Sipos F, Szőke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z.: A lézer-mikrodisszekció jelentősége és gyakorlati alkalmazása a klinikai kutatásban és a diagnosztikai módszerfejlesztésben [The importance and use of laser microdissection in clinical research and diagnostic method development] Orv Hetil Jun 27;145(26): Zagoni T, Peter Z, Sipos F, Dichazi C, Tarjan Z, Dobo I, Kaszas I, Tulassay Z.: Carcinoma arising in enterocutan fistulae of Crohn's disease patients: description of two cases. Int J Colorectal Dis Jul;21(5): Zagoni T, Sipos F, Tarjan Z, Peter Z.: The half-and-half nail: a new sign of Crohn's disease? Report of four cases. Dis Colon Rectum Jul;49(7): Nagy GR, Ban Z, Sipos F, Beke A, Papp C, Papp Z.: Isolation of epsilon-haemoglobinchain positive fetal cells with micromanipulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn May;25(5): Nagy GR, Bán Z, Sipos F, Fent J, Oroszné Nagy J, Beke A, Fűrész J, Papp Z.: Első lépéseink a magzati sejtek anyai keringésből történő kimutatásában [First attempts of detecting fetal cells in the maternal circulation] Orv Hetil Oct 31;145(44):

15 Bocsi J, Varga VS, Molnar B, Sipos F, Tulassay Z, Tarnok A.: Scanning fluorescent microscopy analysis is applicable for absolute and relative cell frequency determinations. Cytometry A Sep;61(1):1-8. Varga VS, Bocsi J, Sipos F, Csendes G, Tulassay Z, Molnar B.: Scanning fluorescent microscopy is an alternative for quantitative fluorescent cell analysis. Cytometry A Jul;60(1): Galamb O, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z.: Chiptechnikák alkalmazásának szükségessége gyomortumorokban [Necessity of chip technology in stomach cancer] Orv Hetil May 2;145(18): Molnar B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z.: Molecular detection of circulating cancer cells. Role in diagnosis, prognosis and follow-up of colon cancer patients. Dig Dis. 2003;21(4): Galamb O, Molnár B, Sipos F, Tulassay Z.: A humán szöveti (felnőtt) őssejtek kutatása és klinikai alkalmazási lehetőségei [Possibilities of investigation and clinical application of adult human stem cells] Orv Hetil Nov 16;144(46): Sipos F, Zágoni T: Irritábilis Bél Szindróma. Családorvosi Fórum 2002 Okt; Kiadvány: Sipos F: Történeti áttekintés a gyulladásos bélbetegségek patogenezisének és diagnosztikai módszereinek fejlődéséről. FalckPharma