Vastagbél biopsziás minták mrns expressziós vizsgálata és klasszifikációja oligonukleotid és cdns microarray technika segítségével

Átírás

1 Vastagbél biopsziás minták mrns expressziós vizsgálata és klasszifikációja oligonukleotid és cdns microarray technika segítségével Ph.D. értekezés tézisei Galamb Orsolya Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Témavezető: Dr. Molnár Béla Ph.D. Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Opponensek: Dr. Garami Miklós Ph.D. Dr. Ponyi Tamás Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Falus András Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Oláh Edit Dr. Sebestyén Anna Ph.D. Dr. Patócs Attila Ph.D. Budapest

2 BEVEZETÉS A vastagbélrák az egyik leggyakoribb ráktípus a világon, és az általa okozott mortalitás is jelentős. Magyarországon a colorectális rák mindkét nemben a második leggyakrabban halált okozó daganatos betegség. Hazánkban évente közel 8000 új vastag- és végbélrákos beteget regisztrálnak, és évi közel 5000 a colorectális rák miatti halálesetek száma. Emiatt válik szükségessé a korai felismerés, a genetikailag és génexpressziós szempontból eltérő daganatok elkülönítése és ennek ismeretében a terápiás eljárások javítása. A vastagbélrák korai felismerésének fontosságára világítanak rá az 5 éves túlélési adatok is. A korai stádiumban 80-90%-os, nyirokcsomó áttétek esetén 60%-os, míg előrehaladott, távoli szervi áttéttel rendelkező vastagbélráknál 10% alatti az 5 éves túlélési arány. A korábbi években elérhető és alkalmazott kutatási módszerek segítségével a betegség okainak egy kiválasztott génjére, géncsoportjára koncentrálhattunk, a teljes molekuláris biológiai háttér vizsgálata nem volt lehetséges. Erre csak az elmúlt években megjelent microarray technikák adtak lehetőséget. Az mrns expressziós microarray-k segítségével lehetővé vált nagyszámú gén expressziójának összehasonlítása különböző sejtekben, szövetekben, ugyanazon típusú sejtek/szövetek eltérő állapotaiban (pl. fiziológiás és patológiás állapot; adott drog adagolásával, illetve anélkül). Az mrns expressziós microarray technika lényege az, hogy a vizsgálatban szereplő génekkel komplementer ún. target oligonukleotidokat szilárd hordozóhoz kötik. Ezekhez hibridizáltatják az adott sejttípusból származó RNS-ről készített jelölt egyszálú cdns vagy crns molekulákat, a próbákat. A hibridizáció mértékéből következtetnek a vizsgált gének expressziós szintjére. A microarray technikák azonban nemcsak új információt adhatnak a betegség okaira vonatkozóan, hanem új diagnosztikus, differenciál-diagnosztikus lehetőséget jelentenek. PhD munkám során ezért a vastagbéldaganatok kialakulásának biomarker vizsgálatát, molekuláris biológiai hátterének további tisztázását tűztem ki célul az új teljes genom mrns expressziós microarray technikák segítségével. 2

3 CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálataim célja a vastagbél biopsziás minták microarray vizsgálatra való alkalmazhatóságának igazolása, az oligonukleotid és cdns microarray rendszerek összevetése, előnyeik, hátrányaik, felhasználhatóságuk és korlátaik vizsgálata, a microarray vizsgálatok eredményeit igazoló (validációs) assay rendszer kifejlesztése és tesztelése, a vastagbél adenoma dysplasia - carcinoma szekvencia génexpressziós hátterének kutatása: azon gének meghatározása, amelyek megváltozott expressziója indikátora lehet a colorectális karcinogenezisnek, a génexpressziós eredmények alapján a vastagbélbetegségek patomechanizmusával összefüggő károsodott biológiai útvonalak keresése, valamint a vastagbélbetegségek fő diagnosztikus csoportjainak megkülönböztetését lehetővé tevő elkülönítő gének azonosítása, génexpressziós alapú kapcsolat keresése volt a vastagbél különböző szövettani elváltozásai között. VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS MÓDSZEREK 1. Minták Összesen 182 beteg (33 egészséges, 12 colitis ulcerosás (UC), 8 Crohn-beteg (CD), 31 korai vastagbélrákos (Dukes A és B stádiumú), 37 előrehaladott vastagbélrákos (Dukes C és D stádiumú), 31 dysplasia nélküli villózus adenomás és 30 dysplasztikus adenomás) 456 biopsziás mintáját elemeztem. Az RNS izolálás céljából vett mintákat azonnal RNAlater stabilizáló reagensbe helyeztem és -80 C-on tároltam felhasználásukig. A fehérjeszintű vizsgálatra a szövettani diagnosztika céljából készült paraffinos blokkokból készített metszeteket használtam fel. Szöveti microarray (Tissue MicroArray = TMA) elemzésre 16 olyan beteg paraffinos mintáját alkalmaztam, akiknek az RNS mintáját Affymetrix microarray-n vizsgáltam, valamint 113 független betegmintát is teszteltem. 3

4 2. Microarray elemzések A friss fagyasztott biopsziás mintákból teljes RNS izolálása történt. A teljes RNS minták amplifikációja és fluoreszcens jelölése után 22 pár biopszás mintából (6 IBD, 6 vastagbélrák, 10 adenoma és az ép colon területről vett párhuzamos biopsziás mintákból) Atlas cdns microarray, illetve 52 biopsziás mintából (8 ép, 9 UC, 5 CD, 7 korai vastagbélrák, 8 előrehaladott vastagbélrák, 6 dysplasia nélküli adenoma, 9 dysplasztikus adenoma) Affymetrix teljes genom oligonukleotid microarray elemzést végeztem. 3. Statisztikai kiértékelés a. A cdns microarray adatok kiértékelése. A leolvasott array-ket GenePix Pro 4.1 szoftverrel értékeltem ki. A pontok (spotok) és a helyi háttér automatikus leolvasása után meghatároztam a mediánok és az átlagok hányadosát (Cy3/Cy5). Egyutas (csoport) ANOVA-t és többváltozós módszereket (diszkriminancia analízist, faktorelemzést és hierarchikus cluster analízist) SAS 6.12 statisztikai programmal, a hierarchikus cluster analízist Ward módszerrel végeztem (euklidészi távolságok). A funkcionális elemzést és az érintett biológiai útvonalakat Pathway Assist 2.53 programmal jelenítettem meg. b. Az Affymetrix oligonukleotid microarray adatok kiértékelése A minőségi elemzést követően két független normalizációs módszert alkalmaztam: a MAS5.0-t és az RMA-t. Az eltérő expressziójú gének kiválogatására (feature selection) PAM módszert ( Prediction Analysis for Microarrays módszert) alkalmaztam. Az elkülönítő génexpressziós mintázatok szemléltetésére hierarchikus cluster elemzést végeztem Genesis szoftver segítségével. A redukált változók diszkriminancia elemzésére az SPSS 15.0 programot használtam. Az adenoma-dysplasia-carcinoma szekvenciára jellemző gének meghatározása céljából a microarray adatok előfeldolgozására RMA háttérkorrekciót, quantile normalizációt és ún. median polish summarizationt -t alkalmaztam. Az előfeldolgozott microarray adatokból meghatároztam az egyes betegségcsoportokra (ép, dysplasia nélküli adenoma, dysplastikus adenoma, korai és késői vastagbélrák) jellemző mrns expressziós értékeket minden egyes transzkriptum esetében. Az expressziós értékek és a betegség stádium közötti összefüggést Kendall rangkorrelációs módszerrel határoztam meg. 4

5 4. RT-PCR validáció A microarray adatokat valós idejű RT-PCR-rel erősítettem meg. A cdns microarray eredmények megerősítésére EGFR (epidermális növekedési faktor receptor) és TOP1 (DNS topoizomeráz 1) egy lépéses real-time RT-PCR elemzést használtam (Roche LightCycler). Az eredmények kiértékelése RelQuant programmal történt. A teljes genom oligonukleotid microarray eredmények igazolására 52 kiválasztott gén expresszióját TaqMan valós idejű PCR-rel mértem meg, Applied Biosystems Mikrofolyadék Kártyarendszer felhasználásával. Az adatelemzés SDS 2.2 szoftverrel történt. A delta Ct értékeket (amelyek a riboszomális 18S RNS expresszióhoz normalizált expressziót jelentik) a szövettani csoportoknak megfelelően csoportosítottam, majd Student t-tesztet végeztem az expressziós értékek csoportok közötti összehasonlítására. 5. Fehérjeszintű vizsgálat A potenciális markermolekulák fehérjeszintű vizsgálat céljából hagyományos EGFR immunhisztokémiát végeztem, valamint 119 betegből származó összesen 289 mintából oszteopontin és oszteonektin szöveti microarray vizsgálat történt. A fehérje markerek expressziója és a betegség stádiuma közötti összefüggés statisztikai elemzésére Pearson khitesztet és Fischer exact tesztet használtam. EREDMÉNYEK 1. A vastagbélbetegségekben csökkenten vagy fokozottan működő gének azonosítása A vastagbélrákra a DNS replikációban, a sejtciklusban, az extracelluláris mátrix átépítésében, az átírás szabályozásában, az onkogenezisben és a növekedési faktor irányította sejtproliferációban szerepet játszó gének fokozott működése, valamint a DNS javításban, a tumor szuppresszióban és az apoptózisban szerepet játszó gének csökkent működése a jellemző. A sejtadhézióval, illetve transzport folyamatokkal kapcsolatos számos gén expressziója is eltért az ép nyálkahártyához viszonyítva. Ezekhez az mrns expressziós változásokhoz társul több, az immunszabályozáshoz, valamint az érképződéshez kapcsolódó gén károsodott kifejeződése. Adenomában az ép nyálkahártyától eltérő, károsodott génexpressziót igazoltam a transzport- (ABCA8, TRPM6, akvaporin-8), a sejtadhézió- (CXCL12, CD44, ADAMszerű decizin 1, klaudin-1, α6-integrin), a metabolizmus- (karbon-anhidráz I, foszfodiészteráz-3a), a sejtproliferáció (MET, CXCL2, CXCL3 onkogének, tumor- 5

6 asszociált kalcium jelátvivő 2) és az apoptózis funkcionális csoportokhoz tartozó génekben. IBD-ben elsősorban az immunszabályozással, a sejtproliferációval, a transzport folyamatokkal és a metabolizmussal kapcsolatos gének mrns szintjének változását tapasztaltam. Szintén észleltem az extracelluláris mátrix átépülésben, és a sejten belüli jelátviteli utakban szerepet játszó gének károsodott működését. 2. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génexpressziós markerei A vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladásával párhuzamosan 918 gén folyamatosan fokozódó (p<0,002), míg 392 gén folyamatosan csökkenő (p<0,002) működését tapasztaltam. 17 potenciális markert valós idejű PCR-rel is megerősítettem. A validált mrns expressziós markerek közül 15 az adenoma-dysplasia-carcinoma szekvenciát követve szignifikánsan fokozódó expressziót mutat. Ebből tíz, a colorectális adenomadysplasia-carcinoma átmenettel párhuzamosan fokozódó mrns expressziójú, valós idejű PCR-rel is megerősített szöveti marker, amelyet még nem írtak le az irodalomban. Ezek a következők: szöveti metalloproteináz gátló-1 és -3, von Willebrand faktor, interleukin-8, melanoma sejtadhéziós molekula, trombospondin-2, kollagén-4a1, mátrix GLA fehérje, interleukin-1 receptor antagonista és a kalumenin. Szignifikánsan csökkent expressziójúnak 2 gén bizonyult (p<0,05). A prosztaglandin D2 receptor és az amnionless homológ a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia fokozatosan csökkenő mrns expressziójú, validált, eddig még le nem írt markerei. Két marker (oszteopontin és oszteonektin) expresszióját szöveti microarray technológiával fehérjeszinten is megvizsgáltam. Erős korrelációt találtam mindkét fehérje fokozatosan emelkedő expressziója és a vastagbél adenoma-dysplasiacarcinoma szekvencia között. 3. A vastagbélbetegségek altípusainak megkülönböztetése Azonosítottam a korai és előrehaladott vastagbélrákok molekuláris alapú megkülönböztetésére alkalmas, 100 leginkább eltérő mrns expressziójú gént. A vastagbélrák két alcsoportja között leginkább a metabolikus- és transzport folyamatokkal összefüggő gének expressziója tért el. Előrehaladott vastagbélrákban 6

7 az apoptózissal és az immunválasszal kapcsolatos gének működése csökkent. A szénhidrát- és zsírsav anyagcseréért, valamint az energiaháztartásért felelős gének mrns expressziója a vastagbélrák progressziójával szignifikánsan fokozódott. Adenomában a dysplasztikus átalakulás során a sejtproliferáció, a DNS replikáció és a transzkripció fokozódott, míg az immunválaszban szerepet játszó gének működése csökkent. Crohn-betegségre egyes szénhidrátanyagcsere gének, colitis ulcerosára pedig számos sejtproliferációhoz, apoptózishoz, immunszabályozáshoz, transzport- és katabolikus folyamathoz kapcsolódó gén fokozott működése jellemző. 4. Az elkülönítő mrns expressziós markercsoportok leszűkítése a. A Clontech cdns microarray rendszer esetén A 3 kórisme (adenoma, CRC, IBD) között a szűrt ANOVA módszerrel 17 gén esetén találtam szignifikánsan eltérő expressziót (p<0,05). A 22 vastagbél biopsziás mintát a hagyományos szövettani diagnózisnak megfelelően csoportosítottam az ANOVA géneken alapuló cluster elemzés során. A faktorelemzést során két funkcionális géncsoport (két jelentős exploratív varianciájú faktor) különült el, amelyek expressziós szintje alapján a vizsgált betegségcsoportok megkülönböztethetőek egymástól. A diszkriminancia analízissel kiválogatott gének expressziós szintje alapján a 3 diagnózis csoport egyértelműen elkülöníthető. Ezek a gének a következők: a HSF1, a bisztinszerű molekula, a kalgranulin A és a TNFR szupercsalád 10c tagja. b. Az Affymetrix oligonukleotid microarray rendszer esetén Minden diagnózis esetén meghatároztam az elkülönítéshez leginkább segítséget nyújtó 100 gént, és azonosítottam a két különböző normalizációs módszer alkalmazása után előállított génlistákban egyaránt szereplő géneket (átfedő diszkriminátor gének). Vizsgálataim során 27, 13, illetve 10 ilyen gént azonosítottam, melyek mrns expressziós mintázata a vastagbél adenomával, a colorectális carcinomával, illetve a gyulladásos bélbetegségekkel asszociálódik. A mintákat a lépésenkénti diszkriminancia elemzéssel nyert 7 elkülönítő gén (indolamin-pyrrol-2,3-dioxigenáz, ektodermális-neurális kortex, TIMP3, fukoziltranszferáz-8, kollektin alcsalád 12. tagja, karboxipeptidáz D és 7

8 transzglutamináz 2) expressziója alapján 96.2%-os pontossággal tudtam a diagnosztikus csoportba besorolni. 5. A microarray eredmények megerősítése A cdns microarray vizsgálat eredményeivel összhangban a vastagbélrákos minták EGFR és TOP1 mrns szintje nagyobb, mint az ép párjuké (relatív hányados: 3,008, p=0,0487, illetve relatív hányados: 2,800, p=0,0492). A vastagbélrákos mintákban az ép mintákhoz képest megfigyelt fokozott EGFR fehérje expressziós szintek korrelálnak mind a microarray vizsgálatokban, mind a RT-PCR során kapott EGFR mrns expressziós adatokkal. A validáció céljából kiválasztott 52 vizsgált génből 46 expressziója szignifikánsan összefüggött az Affymetrix microarray-ken mért expresszióval (p<0,05). KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeimet összefoglalva arra következtethetünk, hogy az mrns expressziós markerpanelek vizsgálata lehetőséget nyújt a vastagbél minták osztályozására, még kisméretű biopsziás minták esetén is. A kis beavatkozással nyerhető biopsziás minták génexpressziós elemzésével az ép, az adenoma, a CRC és az IBD mintákon kívül a vastagbélrák különböző stádiumai is osztályozhatók. Munkámban a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia jellemző progressziós markereit is azonosítottam. Az oszteopontin és az oszteonektin a legfontosabb progressziós markerek, amelyeket RT-PCR-rel és szöveti microarray vizsgálattal is megerősítettem, mind az eredeti, mind független mintaszeten. Az oszteopontin daganatképzésben, az érátrendeződésben és immunszabályozásban való szerepe, és az oszteonektin sejtadhézióra és proliferációra tett hatása e két molekulát a jövőben új rákellenes gyógyszerek kifejlesztésének célpontjává teheti. A szövettani diagnózisokhoz génexpressziós elemzéssel jellemző molekuláris mintázat rendelésének hosszútávú előnye az, hogy betegség-specifikus génmintázatok segítségével megteremthető a pontosabb diagnosztika lehetősége: a szövettanilag korlátozottan értékelhető minták felhasználásával biztosabb diagnózis felállítása, a szövettani vizsgálattal bizonytalan kórisme, illetve a mélységi invázió, áttét vitatható jelenléte esetén a szövettani szerkezet megismerésének támogatása. Az elkülönítő gének listája még pontosabbá tehető az egyes összehasonlításokban alkalmazott nagyobb mintaszámú vizsgálatokkal. Az mrns expressziós mintázat alapú diagnosztika kifejlesztésének fontos feladatai közül alapvető a 8

9 független mintahalmazon való tesztelés. A diagnosztikus lehetőséget nyújtó elkülönítő géneket tartalmazó miniarray-k kereskedelmi forgalomba kerülésével a jövőben könnyebbé és gyorsabbá válhat a pontos kórisme megállapítása. LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK - A biopsziás minták teljes genom oligonukleotid microarray vizsgálati módszere az Affymetrix oligonukleotid microarray minőségi kritériumoknak messzemenően megfelelőnek, standardizáltnak és jól reprodukálhatónak bizonyult. - A Taqman Mikrofolyadék Kártyarendszer, amellyel párhuzamosan akár 96 gén expresszióját lehet vizsgálni mintán különösen alkalmas a chipen mért génexpressziós változások nagy teljesítményű, gyors és költséghatékony valós idejű PCR-es megerősítésére. - Az oszteopontin és az oszteonektin fokozatosan emelkedő mrns és fehérje expressziója erősen korrelál a vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladásával. - Tíz, a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma átmenettel párhuzamosan fokozódó mrns expressziójú, valós idejű PCR-rel is megerősített szöveti markert azonosítottam, amelyet még nem írtak le az irodalomban. Ezek a következők: szöveti metalloproteináz gátló-1 és -3, von Willebrand faktor, interleukin-8, melanoma sejtadhéziós molekula, trombospondin-2, kollagén-4a1, mátrix GLA fehérje, interleukin-1 receptor antagonista és a kalumenin. - A prosztaglandin D2 receptor és az amnionless homológ a colorectális adenoma-dysplasiacarcinoma szekvencia fokozatosan csökkenő mrns expressziójú, validált, eddig még le nem írt markerei. - Vizsgálataim során 27, 13, illetve 10 top gént azonosítottam, melyek mrns expressziós mintázata a vastagbél adenomával, a colorectális carcinomával, illetve a gyulladásos bélbetegségekkel asszociálódik. - Azonosítottam a korai (Dukes A és B stádiumú) és előrehaladott (Dukes C és D stádiumú) vastagbélrákok molekuláris alapú megkülönböztetésére alkalmas, 100 leginkább eltérő mrns expressziójú gént. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOS KÖZLEMÉNYEK Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Tulassay Z, Dinya E, Molnár B. Inflammation, adenoma and cancer: objective classification of colon biopsy specimens with gene expression signature. Dis Markers (nyomtatásban) IF:

10 Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Dinya E, Krenács T, Berczi L, Szőke D, Spisák S, Solymosi N, Németh AM, Juhász M, Molnár B, Tulassay Z. Helicobacter pylori and antrum erosion specific gene expression patterns: the discriminative role of CXCL13 and VCAM1 transcripts. Helicobacter Apr;13(2): IF: 2,477 Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Somorácz A, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbélbiopszia funkcionális mrns-expressziós vizsgálata és osztályozása általános cdns microarray technikával. Orv Hetil Feb 3;149(5): Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Dinya E, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél-adenoma, vastagbélrák és IBD-specifikus génexpressziós mintázatok meghatározása teljes genomszintű oligonukleotid microarray-rendszerrel. Orv Hetil Nov 4;148(44): Galamb O, Sipos F, Molnár B, Szőke D, Spisák S, Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mrna expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom Sep;72(5): IF: 2,065 Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Tulassay Z, Molnár B. mrna expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy specimen by cdna overall glass microarray. World J Gastroenterol Nov 21;12(43): Galamb O, Sipos F, Fischer K, Tulassay Z, Molnár B. The results of the expression array studies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorectal cancer. Cytometry B Clin Cytom Nov;68(1):1-17. IF: 1,742 Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. DNS chipek génexpressziós mintázatok vizsgálatára és alkalmazásuk a diagnosztikában. Orv Hetil. 2003;144(1):21-7. Herszényi L, Sipos F, Galamb O, Solymosi N, Hritz I, Miheller P, Berczi L, Molnár B, Tulassay Z. Matrix metalloproteinase-9 expression in the normal mucosa-adenoma-dysplasiaadenocarcinoma sequence of the colon. Pathol Oncol Res Mar 18 IF:

11 Sipos F, Galamb O, Herszényi L, Molnar B, Solymosi N, Zagoni T, Berczi L, Tulassay Z. Elevated insulin-like growth factor 1 receptor, hepatocyte growth factor receptor and telomerase protein expression in mildly active ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol. 2008; 43(3): IF: 1,869 Tóth K, Galamb O, Hevér-Pálfy T, Solymosi N, Miheller P, Müllner K, Spisák S, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél betegségben szenvedők perifériás vérének mrns expressziós vizsgálata. Magy Belorv Arch. 2007; 60: Spisák S, Molnár B, Galamb O, Sipos F, Tulassay Z. Fehérje chipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetőségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv Hetil. 2007; 148(32): Hagymási K, Molnár B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. A colorectalis rák kialakulásának ôssejtelmélete és összefüggése a molekuláris biológiai adatokkal. Orv Hetil. 2007;148(17): Model F, Osborn N, Ahlquist D, Gruetzmann R, Molnár B, Sipos F, Galamb O, Pilarsky C, Saeger HD, Tulassay Z, Hale K, Mooney S, Lograsso J, Adorjan P, Lesche R, Dessauer A, Kleiber J, Porstmann B, Sledziewski A, Lofton-Day C. Identification and validation of colorectal neoplasia-specific methylation markers for accurate classification of disease. Mol Cancer Res Feb;5(2): IF: 4,759 Nagy GR, Győrffy B, Galamb O, Molnár B, Nagy B, Papp Z. Use of routinely collected amniotic fluid for whole-genome expression analysis of polygenic disorders. Clin Chem Nov;52(11): IF: 5,454 Ladányi A, Sipos F, Szőke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. Laser microdissection in translational and clinical research. Cytometry A Sep 1;69(9): IF: 3,293 Miheller P, Müzes G, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A gyulladásos bélbetegségek molekuláris háttere. Orv Hetil Jul 30;147(30):

12 Sipos F, Szőke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A lézer-mikrodisszekció jelentősége és gyakorlati alkalmazása a klinikai kutatásban és a diagnosztikai módszerfejlesztésben. Orv Hetil Jun 27;145(26): Sipos F, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. Chiptechnikák alkalmazása vastagbélrákban. Orv Hetil, 2004; 145(19): Molnár B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. Molecular detection of circulating cancer cells. Dig Dis. 2003;21: IF: 1,151 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOS KÖZÖLT ABSZTRAKTOK Galamb O, Galamb B, Solymosi N, Sipos F, Spisák S, Molnár B, Tulassay Z. New gene expression markers of colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma sequence. Gut, 56(Suppl III): A312-A312 Oct 2007 Galamb O, Solymosi N, Sipos F, Spisák S, Molnár B, Tulassay Z.Differential diagnostic mrna expression patterns of colorectal biopsy specimens. Gut, 56(Suppl III): A315-A315 Oct 2007, best abstracts award Spisák S, Galamb O, Solymosi N, Galamb B, Nemes B, Sipos F, Valcz G, Molnár B, Tulassay Z. Determination of progression markers of early and late stage colorectal cancer by antibody microarrays. Gut, 56(Suppl III): A317-A317 Oct 2007 Molnár J, Molnár B, Galamb O, Németh A, Zágoni T, Miheller P, Galamb B, Tulassay Z. Selenoprotein W, selenoprotein P and glutathione peroxidase mrna expression in human colonic mucosa cells. Gut, 56(Suppl III): A248-A248 Oct 2007 Sipos F, Spisák S, Krenács T, Galamb O, Galamb B, Valcz G, Solymosi N, Molnár B, Tulassay Z. Tissue microarray based classification of early and late stage colorectal cancer using optical and virtual microscopy. Gut, 56(Suppl III): A66-A66 Oct 2007 Molnár B, Galamb O, Solymosi N, Zágoni T, Németh A, Miheller P, Juhász M, Tóth K, Spisák S, Tulassay Z. Highly sensitive and specific detection of colorectal cancer (CRC) and 12

13 adenoma in peripheral blood by mrna expression chip technology- correlation to local biopsy expression data. Gut, 56(Suppl III): A66-A67 Oct 2007 Molnar B, Galamb O, Galamb B, Solymosi N, Sipos F, Spisák S, Tóth K, Miheller P, Herszényi L, Tulassay Z. Peripheral blood gene expression markers of local and progressive colorectal diseases determined by whole genome mrna array analysis. Annals Oncol, 18:VII83-VII83 Suppl Molnar B, Galamb O, Galamb B, Solymosi N, Sipos F, Spisák S, Tóth K, Miheller P, Zágoni T, Németh A, Tulassay Z. Peripheral blood gene expression markers of local and progressive colorectal diseases determined by whole genome mrna array analysis. Gastroenterology, 132(4):A295-A296 Suppl. 2 Apr 2007 Galamb O, Galamb B, Solymosi N, Sipos F, Spisák S, Tulassay Z, Molnár B. Gene expression aspects of adenoma-dysplasia-carcinoma sequence - Results of a whole genomic expression profiling study. Gastroenterology, 132(4):A297-A297 Suppl. 2 Apr 2007 Spisák S, Galamb O, Solymosi N, Galamb B, Nemes B, Sipos F, Zágoni T, Tóth K, Molnár B, Tulassay Z. Progression markers of early and late stage colorectal cancer determined by protein arrays. Gastroenterology, 132(4):A297-A297 Suppl. 2 Apr 2007 Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Spisák S, Herszényi L, Miheller P, Tulassay Z, Molnár B. Inflammation, adenoma and cancer: objective classification of colon biopsy specimen by whole genomic mrna expression analysis. Gut, 55(Suppl V) Oct 2006 best abstracts award Győrffy B, Galamb O, Molnár B, Szőke D, Győrffy A, Tulassay Z. NF-kappa-B transcription factor represents a key element in a putative transcription regulatory network responsible for the transition between adenoma and carcinoma. Gut, 55(Suppl V) Oct 2006 Molnár B, Galamb O, Kozlovszky M, Dinya E, Győrffy B, Tulassay Z. Automated classification of colon biopsy specimen mrna expression profiles using linear discriminant analysis and neural networks in combination with PAM. Gut, 55(Suppl V) Oct

14 Spisák S, Galamb O, Győrffy B, Nemes B, Molnár B, Tulassay Z. Correlation between mrna expression and protein array results in colorectal cancer. Gut, 55(Suppl V) ct 2006 Herszenyi L, Sipos F, Galamb O, és mtsai. Correlation between matrix metalloproteinase-9 immunohistochemistry and mrna expression array results in colorectal cancer. Annals Oncol, 17:40-41 Suppl Herszényi L, Sipos F, Galamb O, Győrffy B, Hritz I, Pregun I, Molnár B, Tulassay Z. Alterations of matrix metalloproteinase-9, hepatocyte growth factor receptor and insulin-like growth factor receptor-1 expressions in ulcerative colitis. Gastroenterology, 130(4):A488- A488 Suppl. 2 Apr 2006 Győrffy B, Galamb O, Molnar B, Tulassay Z. Comparative promoter analysis suggests the role of the NF kappa B transcription factor in the transition between adenoma and carcinoma. Gastroenterology, 130(4):A532-A532 Suppl. 2 Apr 2006 Galamb O, Sipos F, Győrffy B, Fischer K, Molnár B, Tulassay Z. Discrimination of inflammatory bowel disease subtypes using whole genomic mrna expression microarray technology in colon biopsy specimen. Gut, 54(Suppl VII): A166-A166 Oct 2005 Molnár B, Galamb O, Sipos F, Győrffy B, Spisák S, Fischer K, Tulassay Z. Whole genomic mrna expression profiling of early and advanced staged colorectal cancer and precancerous adenoma biopsy samples: searching for candidate genes and pathways involved the carcinogenesis and pathomechanism. Gut, 54(Suppl VII): A138-A138 Oct 2005 Spisák S, Galamb O, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. expression microarray data. Gut, 54(Suppl VII): A242-A242 Oct 2005 Genetic pathway analysis of Galamb O, Sipos F, Molnar B, és mtsai. Gene expression profiling in colon biopsy specimens from inflammatory bowel diseases using cdna microarray technology. Tissue Antigens, 64(4): Oct 2004 Galamb O, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Diagnosis of malignancy in colon biopsy specimen by mrna expression profiling. Gut, 53(Suppl VI) Oct

15 Galamb O, Sipos F, Molnár B, Kopper L, Dinya E, Tulassay Z. Diagnosis of malignancy in colon biopsy specimen by mrna expression profiling. Gastroenterology, 126(4): A244- A244 Suppl. 2 Apr 2004 Galamb O, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Evaluation of gene expression pattern from gastric and colonic biopsy specimens. Z Gastroenterol, 2003;41:437. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették PhD munkám elkészítését: - programvezetőmnek, Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, és témavezetőmnek, Dr. Molnár Béla tudományos főmunkatársnak, hogy lehetővé tették és támogatták PhD munkám elkészítését a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján; - Dr. Garami Miklós és Dr. Ponyi Tamás opponenseknek, valamint Dr. Molnár Jeannette és Dr. Müllner Katalin házi opponenseknek PhD dolgozatom alapos áttekintéséért; - Dr. Krenács Tibornak szakmai és a szöveti microarray vizsgálatokban nyújtott elengedhetetlen segítségéért; - Dr. Berczi Lajos egyetemi adjunktusnak a személyes konzultációk során nyújtott értékes és hasznos tanácsaiért; - Dr. Solymosi Norbertnek, Dr. Győrffy Balázsnak és Dr. Dinya Eleknek a bioinformatikai elemzések professzionális kivitelezéséért; - Csorba Gézáné Marica és Kónyáné Farkas Gabriella szakasszisztenseknek a gyakorlati munkámban nyújtott segítségükért; - a Sejtanalitika Laboratórium összes dolgozójának támogatásukért; - Dr. Sipos Ferencnek szakmai támogatásáért és barátságáért. Végül, de nem utolsósorban köszönöm Férjemnek és Családomnak, hogy mindenben mellettem álltak és állnak. 15