DOKTORI ÉRTEKEZÉS DR. MOLNÁR BÉLA, MTA MUNKATÁRS, PH.D.

Átírás

1 K ERINGŐ DAGANATSEJT K IMUTATÁS S ZOLID T UMOROS B ETEGEK P ERIFÉRIÁS V ÉRMINTÁIBÓL DOKTORI ÉRTEKEZÉS KÉSZÍTETTE: TÉMAVEZETŐ: DR. LADÁNYI ANDRÁS, DR. TULASSAY ZSOLT, EGYETEMI TANÁR, PH.D. DR. MOLNÁR BÉLA, MTA MUNKATÁRS, PH.D. SEMMELWEIS EGYETEM, KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA, BUDAPEST, BÍRÁLÓK: DR. SCHAFF ZSUZSANNA, EGYETEMI TANÁR, PH.D. DR. ABONYI MARGIT, EGYETEMI DOCENS, PH.D. DR. BANAI JÁNOS, EGYETEMI TANÁR, PH.D. DR. SZÉKELY GYÖRGY, OSZTÁLYVEZETŐ FŐORVOS, PH.D. SZIGORLATI BIZOTTSÁG: ELNÖK: TAGOK: DR. SZALAY FERENC, EGYTEMI TANÁR, PH.D. DR. KOVALSZKY ILONA, AZ MTA DOKTORA, PH.D. DR. HERSZÉNYI LÁSZLÓ, EGYETEMI DOCENS, PH.D. DR. PATÓCS ATTILA, MTA MUNKATÁRS, PH.D.

2 1. BEVEZETÉS Jelentős mennyiségű bizonyíték áll rendelkezésünkre arról, hogy tumorsejtek már a malignus progresszió kezdeti fázisában is leválhatnak a primer tumorról. A leváló sejtek a véráram útján a primer tumortól távoli helyekre is eljuthatnak, és áttétet képezhetnek. Az így szóródott sejtek a keringésben ritkák, hagyományos vizsgáló módszerekkel kimutatásuk nem lehetséges. Mivel ezek a szóródott tumorsejtek a későbbi a daganatos halálozásban döntő szerepet játszó áttétek kialakulásának forrásai lehetnek, megbízható kimutatásuk és jellemzésük fontos tényezője a daganat-ellenes küzdelemnek. A keringő daganatsejt kimutatás mind a tumorok korai diagnosztikájában, mind a daganatos betegség kezelésének tervezésében és irányításában is segítségünkre lehet. Többféle szolid tumor típuson végzett vizsgálat is egyöntetűen arra a következtetésre jutott, hogy daganatsejtek jelenléte a keringésben összefüggést mutat a betegségmentes és a teljes túléléssel. Ezekkel a vizsgálatokkal ellentétben néhány más tanulmány szerint a perifériás vérből végzett keringő daganatsejt kimutatásnak nincsen prognosztikai jelentősége. Az eltérő következtetések legvalószínűbb magyarázata az, hogy még az előrehaladott állapotú áttétes betegek esetében is, a keringésben lévő daganatsejtek száma rendkívül alacsony (becsült értékek szerint 1-10 tumor sejt/ml vér nagyságrendben lehet). Feltételezzük, hogy a keringő daganatsejt kimutatás pontos jelentőségének meghatározásában a legfőbb akadályt a ritka sejtek kimutatásából adódó technikai nehézségek képezik. Az irodalomban a keringő daganatsejtek kimutatására többféle módszer is leírásra került. Közös bennük, hogy a tumorsejtek és a normál hemopoetikus sejtek közötti fehérje vagy genetikai összetételbeli különbségeket használják ki. Jelenleg a legelfogadottabb és leggyakrabban használt módszerek a keringő daganatsejtek detektálására a sejt-alapú kimutatás 2

3 immuncitokémiai módszerrel és a molekuláris-alapú kimutatás reverz-transzkripciós PCR (RT-PCR) módszerével. A sejt-alapú kimutatás legfőbb korlátja a hatékony és nagy teljesítményű detektáló módszer hiánya. Ezért a sejt-alapú detektálás előtt, a megfelelő érzékenység és vizsgálati sebesség eléréséhez, különféle dúsító módszereket szükséges használni. Sajnálatos módon ezek a dúsító módszerek meglehetősen komplikáltak és a tumorsejtek elvesztéséhez vezethetnek. Az utóbbi években egyre népszerűbbé vált az RT-PCR módszerével végzett keringő daganatsejt kimutatás, mely a tumorsejtekben jelenlévő, de a normál sejtekben nem expresszálódó transzkriptok kimutatásán alapszik. Elméletileg az RT-PCR módszerével végzett tumorvagy szövet -specifikus szekvenciák amplifikációja egy ideális módszer lehetne a keringő daganatsejtek érzékeny kimutatására, azonban a kérdéses sejtre vonatkozó morfológiai információ hiánya, az alacsony mennyiségben jelenlévő transzkriptok nehézkes kvantifikációja, illetve a felhasznált markerek normál sejtekben való illegitim transzkripciója jelentősen korlátozza felhasználhatóságát. Összefoglalva, a rendelkezésünkre álló keringő daganatsejt kimutatatásra és jellemzésre szolgáló technológiák mindegyike súlyos problémákkal küszködik. Ahhoz, hogy a keringő daganatsejt kimutatás beépülhessen a jelenlegi tumor klasszifikációs rendszerekbe és/vagy kezelési protokollokba, a fennálló technikai nehézségeken túl kell lépni. E nélkül nem várható, hogy a keringő daganatsejt kimutatás valódi klinikai jelentősége meghatározásra kerülhessen. 2. CÉLKITŰZÉSEK A. Általános célok Vizsgálataink legfőbb célja az volt, hogy a keringő daganatsejt kimutatásra használt módszereket érdemben fejlesszük, illetve új módszereket dolgozzunk ki a már meglévők mellé. Célunk volt továbbá, hogy a kidolgozott technológiákkal a keringő daganatsejtek gyakoriságát és jellemzőit vizsgáljuk szolid tumoros betegek vérmintáiból. Célul tűztük ki, hogy a 3

4 kifejlesztett módszerek nem csak érzékenységükben és specificitásukban legyenek jobbak, hanem klinikai felhasználhatóságukban is. Vizsgálatainkba mind sejt-, mind molekuláris -alapú keringő daganatsejt kimutatásra szolgáló módszereket bevontunk. Vizsgáltuk továbbá azokat a preanalitikus és analitikus tényezőket is, melyek az eredmények pontosságát befolyásolhatják. A kifejlesztett módszereket és minta-előkészítési eljárásokat felhasználva ritka sejtek, úgymint keringő tumorsejtek és Citomegalovírus (CMV) fertőzött fehérvérsejtek, gyakoriságát határoztuk meg perifériás vérmintákból. Mindezeken kívül négy európai laborral együttműködve egy kísérletsorozatot végeztünk el a célból, hogy egy standardizált kvantitatív keringő daganatsejt kimutatásra használt protokoll alapjait fektessük le. B. Specifikus célok Jelen tézis alapjául öt különböző vizsgálat szolgált: 1-es számú vizsgálat céljai 1. Különböző minta előkészítési eljárások hatásának vizsgálata a valós idejű kvantitatív RT-PCR (qrt-pcr) alapú keringő daganatsejt kimutatásra. 2. Különböző minta előkészítési eljárások hatásának vizsgálata a valós idejű qrt-pcr alapú keringő daganatsejt kvantifikációra. 2-es számú vizsgálat céljai 1. A hagyományos RT-PCR és a valós idejű qrt-pcr érzékenységi határainak feltérképezése. 2. A hagyományos PCR kontrollok és az áttörési pontok (Crossing Point, CP) felhasználhatóságának összehasonlítása a fals-negatív eredmények azonosításában. 3. A valós idejű qrt-pcr módszer érzékenységének validálása az érzékenységi tartomány legalján. 4

5 3-as számú vizsgálat céljai 1. Valós idejű kvantitatív RT-PCR módszerével végzett keringő daganatsejt kimutatás reproducibilitása különböző laboratóriumokban standardizált protokoll szerint. 2. A minta-előkészítés, RNS izolálás, cdna szintézis és PCR amplifikáció vizsgálata különböző laboratóriumokban standardizált protokoll szerint. 3. A keringő daganatsejt kimutatás kvalitatív és kvantitatív eredményeinek összehasonlítása különböző laboratóriumok között valós idejű qrt-pcr módszerével. 4. A pre-analitikus és analitikus módszerek standardizálásának kivitelezhetősége különböző laboratóriumok között. 4-es számú vizsgálat céljai 1. REIS (Rare Event Imaging System)-el végzett keringő dagantsejt kimutatás kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérmintában. 2. A keringő daganatsejtek több markeres immunfluoreszcens technikával végzett jellemzése. 5-ös számú vizsgálat céljai 1. Fluoreszcensen jelölt ritka sejtek kimutatásának megvalósíthatósága automata mikroszkópos rendszerrel és mesterséges intelligencián alapuló képfeldolgozással. 2. Az automata fluoreszcens mikroszkópián alapuló citometria eredményeinek javítása az adatok mesterséges intelligencián alapuló osztályozásával. 3. Az újonnan kifejlesztett metodika pontosságának ellenőrzése CMV fertőzött fehérvérsejtek kimutatásra. 3. MÓDSZEREK Az 1-3-as számú vizsgálatokban egy nemrégiben kifejlesztett hibridizációs próbán alapuló valós idejű kvanitatív RT-PCR módszert alkalmaztunk (LightCycler-CK20 Quantification Kit, Roche Diagnostics), mellyel Citokeratin (CK) 20, egy vélhetően gastrointestinális specifikus marker, kimutatását végeztük. Mintáink egészséges donorok perifériás vérmintái voltak, 5

6 melyekhez különböző koncentrációban HT29 (vastagbélrák sejtvonal) tumorsejteket adtunk. Az 1,000 és a 100 HT29 sejt/ml perifériás vérminta sorozatot hígítással, míg a 10 és az 1 HT29 sejt/ml perifériás vérminta sorozatot mikromanipulációval készítettük el. A 2-es számú vizsgálatban hígítással több mintasorozatot készítettünk, melyek 10,000, 1,000, 100, 10 és 1 plazmid DNS kópiát, valamint 20,000, 2,000, 200, 20, és 2 pg SK29-Mel-1 (melanoma sejtvonal) RNS-t tartalmzatak. Vizsgálatainkban háromféle sejtdúsítási technikát alkalmaztunk: sűrűséggradiens centrifugálást (Histopaque-1077, Sigma) és két eltérő immunomágneses sejtszeparálási technikát (Epithelial Enrich, Dynal Biotech, és CellSearch Epithelial Cell Enrichment, Immunicon). A 4-es és 5-ös vizsgálatokban egy általunk kifejlesztett automata mikroszkóp rendszert, a REIS-t, használatuk keringő daganatsejtek és CMV-vel fertőzött fehérvérsejtek kimutatására perifériás vérmintákban. A REIS főbb részeit egy automata epifluoreszcens mikroszkóp (Nikon Eclipse 1000, Nikon), egy számítógép vezérelt tárgyasztal (Ludl), egy automata objektív és fluoreszcens szűrő mozgató rendszer, valamint egy nagy felbontású fekete-fehér hűtött CCD kamera (Sensicam, Cooke) és személyi számítógép alkotja. A REIS a fluoreszcensen jelölt ritka sejtek kimutatását egy általunk fejlesztett szoftver segítségével végzi, mely a jelölt sejtek gyors és rendkívül érzékeny lokalizálását és morfometriai analízisét teszi lehetővé. A perifériás vérmintákat vizsgálat előtt ammónium-klorid alapú vörösvértest lízisnek vetettük alá. A kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérmintáiban a keringő daganatsejtek jelölésére egy dupla markeres indirekt immunfluoreszcens festési eljárást állítottunk be, mellyel egyrészt a citokeratainokat, a hámsejtek intermedier filamentjét, másrészt a kissejtes tüdőrák sejtek jellemző sejtfelszíni diszialogangliozidját, a GD2-t jelöltük. A CMV fertőzött fehérvérsejtek kimutatására egy, a fertőzött sejtekben nagy mennyisében jelenlévő, a vírus replikációban szerepet játszó fehérje (pp65) ellenes antitest koktélt használtunk. Az 5-ös számú vizsgálat során a fluoreszcensen jelölt sejteket egy kétlépcsős 6

7 módszerrel mutattuk ki. Az első lépcsőben hagyományos képfeldolgozás módszerével a mikroszkópos képeken a sejtszerű képleteket szeparáltuk az egyértelműen műterméknek tűnő képletektől. Majd a második lépcsőben a lehetségesen pozitív sejteken részletes citomorfometriai analízist végeztünk döntési fa (decision tree) módszerével. A sejteket a döntési fa kimenete osztályozta valós- és fals -pozitív csoportokra. 4. EREDMÉNYEK Az 1-es számú vizsgálat eredményeiből azt a következtetést vontuk le, hogy a minta előkészítési módszernek nincsen számottevő hatása az alsó kimutathatósági határra, mivel mindegyik módszerrel sikerült még az 1 tumor sejt/ml-es mintában is jelet kapnunk. Azonban eredményeink szerint az alacsony (10 és 1 tumorsejt/ml) koncentrációjú minták legalább háromszor ismételt vizsgálata szükséges ahhoz, hogy 100%-os valószínűséggel pozitív eredményt kapjunk. A minta előkészítés PCR kvantifikációra gyakorolt hatását csak a nagyobb (1,000 és 100 tumorsejt/ml) koncentrációjú mintákon vizsgáltuk, elkerülve ezzel a kevés kópiát tartalmazó minták kvantitatív reprodukálhatóságából adódó nehézségeket. A kvantitatív eredmények elemzése során két eltérő mintázatot kaptunk. A nem dúsított valamint a sűrűséggradienssel dúsított minták esetében a relatív CK20 arány a hozzáadott tumorsejtek számával arányosan csökkent arra utalva, hogy az ily módon készített mintákkal a tumoros terhelés mértékére vonatkozó értékes információt nyerhetünk. Ezzel ellentétben az immunomágneses sejtszeprációval készített minták esetében a relatív CK20 arány a tumorsejt koncentrációtól függetlenül a kalibrátorral megegyező értékeket mutatott. Mivel mind a hozzáadott sejtek, mind a kalibrátorként használt tumorsejtek ugyanabból a sejtvonalból származtak, ezért az immunomágneses szeparációval készített minták hasznosak lehetnek a keringő tumorsejt identitásának meghatározására. Ezen vizsgálat egy fontos tanulsága volt, hogy inkább a ritka sejtek és/vagy kópiák elfogásának/elvesztésének statisztikai valószínűsége, mint a minta előkészítés folyamata 7

8 befolyásolja a vizsgálat érzékenységét. A 2-es számú vizsgálatban különböző koncentrációjú DNS és RNS mintákon vizsgáltuk a lehetséges kópia vesztés hatásait. Korábbi vizsgálatunkkal megegyezően azt találtuk, hogy alacsony koncentrációknál a kimutatás inkonzisztens és alacsony a CP-ok reproducibilitása. Továbbá, szélsőségesen alacsony koncentrációknál, melyekről eddig kísérleti adatokkal nem rendelkezünk, azt találtuk, hogy a koncentráció és a CP-k közötti loglineáris összefüggés is elveszik. Eredményeink azt mutatták, hogy a CP reproducibilitás csökkenése, a koncentráció és CP közötti loglineáris összefüggés elvesztése, valamint az inkonzisztens kimutatás a CP értékek specifikus tartományaihoz köthetőek. Feltételeztük tehát, hogy a CP értékek pontosabb és megbízhatóbb kontrolljai lehetnének az analízisnek, mint a hagyományos PCR kontrollok, mivel természetükből adódóan jellemző gén szintekhez köthetőek, kvantitatívak. Mindezek alapján felállítottunk egy modellt, mely szerint a kimutatási biztonság jellemzői a PCR specifikus zónáihoz köthetőek, és melyben a CP-k alkotják a különböző zónák határait. Egy második modellben azt foglaltuk össze, hogy a CP-k hogyan lennének hasznosíthatóak egy bizonyos gén kimutatási biztonságának megítélésre, különösen azokban az esetekben, ha a kimutatás inkonzisztens vagy nem is várható. Mintáinkon tesztelve a felállított modellek bizonyították helytállóságukat. Az 1-es és 2-es vizsgálat eredményeire alapozva terveztük és hajtottuk végre a 3-as vizsgálatot, melyben laborok közötti együttműködés keretében a pre-analitikus folyamatoknak, úgymint a vérminta feldolgozásnak, RNS izolálásnak és a cdns szintetizálásnak, a hatásait vizsgáltuk a valós idejű qrt-pcr alapú keringő daganatsejt kimutatásra. Négy európai laboratórium vett részt ebben a vizsgálatban, egy standardizált protokollt használva az RNS izolálásra és a valós idejű qrt- PCR-re. Az eredmények azt mutatták, hogy a standardizált protokoll használatával az egyes laborok közötti eredmények elfogadható egyezést mutattak, még a legalacsonyabb hozzáadott tumorsejt koncentrációkban is sikerült CK20 jelet kimutatni, 8

9 illetve a CK20 jel nagysága jól korrelált a tumorsejt koncentrációval. Mindamellett, amint a minta-előkészítési eljárás későbbi fázisában történt a tumorsejtek hozzáadása az eltérések a laborok között megnőttek és a CK20 jel nagysága és a hozzáadott tumorsejt koncentráció közötti arányosság is elveszett. Mégis, hét szériából három esetében a kimutatott CK20 arány a 100 tumorsejt/ml koncentrációnál magasabb volt, mint a 10 tumorsejt/ml koncentrációnál és a 10 tumorsejt/ml koncentrációnál magasabb volt, mint az 1 tumorsejt/ml koncentrációnál. A 4-es vizsgálat eredményei szerint a REIS-szel végzett automata mikroszkópia egy érzékeny és megbízható módszer a keringő daganatsejtek számlálására és jellemzésére. Kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérmintáit a REIS-szel vizsgálva azt találatuk, hogy CK-val és GD2-vel jelölt egyes sejtek és sejtcsoportok is kimutathatóak. Közel egyenlő arányban találtuk keringő daganatsejt pozitívnak a limitált és a kiterjedt stádiumú (35% vs. 37%, sorrendben) betegek mintáit. A kiterjedt stádiumú betegekben azonban a GD2 pozitív sejtek gyakrabban fordultak elő, mint a limitált stádiumúakban (20% vs. 10%, sorrendben). A vizsgálat során észleltük, hogy ahhoz hogy az összes heterogénen és/vagy halványan jelölt sejtet és sejtcsoportot is kimutassuk a REIS sejtazonosító paramétereit jelentősen ki kellett terjeszteni. Ez a nagy érzékenységű beállítás azonban ahhoz vezetett, hogy egyéb, nem sejteredetű fluoreszkáló törmelékek is azonosításra kerültek, jelentősen meghosszabbítva az analízishez szükséges időt. Az 5-ös vizsgálatban a REIS teljesítményének javítását és a fals-pozitív detekciók csökkentését tűztük ki célul. Az új, általunk kidolgozott módszert, mely a klasszikus képfeldolgozást kombinálja költségérzékeny döntési fa algoritmussal, CMV fertőzött fehérvérsejtek kimutatásán teszteltük. Az adatok szerint a döntési fa felhasználásával nagymértékben (64,11%) csökkenthetőek a fals-pozitív detekciók anélkül, hogy a vizsgálat érzékenysége számottevően csökkenne (94,3% 10-szeres keresztvalidálással, 91,64% külső validálással). 9

10 5. KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálataink célja volt a meglévő molekuláris- és sejt -alapú keringő daganatsejt kimutatási módszerek javítása és újabbak kifejlesztése, és ezáltal a keringő daganatsejtek jentőségének pontosabb megismerése. Első vizsgálatunk (1-es vizsgálat) eredményei szerint a minta-előkészítési eljárás módja, mind a specificitást, mind a kvantifikációt befolyásolja. A vizsgálat érzékenységét alapvetően azonban nem az előkészítési eljárás módja, hanem a sejt/transzkriptok elfogásának/elvesztésének valószínűsége befolyásolja. Úgy hisszük, hogy az eddig publikált, egymástól nagyban eltérő eredmények oka lehet a jelen vizsgálatban is tapasztalt alacsony koncentrációknál lévő inkonzisztens kimutatás és az ismétlések hiánya. A reproducibilitás elégtelensége és a molekuláris vizsgálatok standardizálásának elmaradása komoly akadályai a keringő daganatsejt kimutatás klinikai rutinba való beépülésének. A második vizsgálatunkban (2-es vizsgálat) egy válogatott mintaszérián keresztül mutattuk be azt a koncepciót, mely szerint a CP értékek pontosabb és megbízhatóbb kontrolljai lehetnének a PCR vizsgálatnak, mint a hagyományosan használt kontrollok. A vizsgálat megfigyeléseiből összeállítottunk egy ajánlási rendszert, mellyel az alacsony koncentrációjú minták PCR alapú kimutatásának megbízhatósága és kvantifikációjának pontossága megítélhető. A vizsgálatban megfogalmazott ajánlások és modellek felhasználásával a minták analízisének eredményei pontosabban értelmezhetőek és ezért a háttérben zajló biológiai folyamotokról is precízebb képet kaphatunk. Az itt felvázolt modellek helytállóságát a következő, laborok közötti vizsgálatban (3-as vizsgálat) is sikerült bebizonyítani. Igazoltuk továbbá, hogy valós idejű qrt-pcr technikával különböző laborok között jól összehasonlítható kvalitatív és kvantitatív keringő daganatsejt kimutatási eredmények nyerhetőek. Annak ellenére, hogy a laborok a mintavételtől a PCR analízisig terjedően egy standardizált protokollt használtak, az eredmények a pre-analitikus lépések számával arányosán tértek el egymástól. Tudomásunk szerint ez volt az egyik első vizsgálat, melyben a 10

11 keringő daganatsejt kimutatásra használt valós idejű qrt-pcr protokoll standardizálhatóságának kérdését több labor közötti együttműködés keretében vizsgálták. Végkövetkeztetésünk szerint a pre-analitikus folyamatok magas szintű standardizálásával jól összehasonlítható eredmények születhetnek a laborok között. Jelen vizsgálat eredményei kihangsúlyozzák további, a pre-analitikus folyamatok területén végzendő összehasonlító tanulmányok szükségességét. Az általunk végzett következő két vizsgálatban a sejt-alapú keringő daganatsejt kimutatási módszereket tanulmányoztuk. A 4-es vizsgálatban egy ritka sejt kimutatásra épített automata fluoreszcens mikroszkóp rendszer (a REIS) fejlesztéséről, teszteléséről és tökéletesítéséről adtunk leírást. Bemutattuk, hogy a manuálisan végzett ritka sejt azonosításhoz képest egy érzékenyebb módszert dolgoztunk ki, mely alkalmas a fluoreszcensen jelölt ritka sejtek kompozíciójának elemzésére is. Az újonnan kifejlesztett módszerrel modell kísérletekben és kissejtes tüdőrákos betegek perifériás vérmintáiban próbáltunk meg keringő daganatsejteket találni. A bemutatott metodika nemcsak önmagában a keringő daganatsejtek kimutatására lehet hasznos, hanem lehetővé teheti a daganatos betegség pontosabb stádium besorolását és prognózisának megítélését. A vizsgálattal azonban a REIS legfontosabb hiányosságára is fényderült, mely a nagy érzékenységű beállításból adódó csökkent specificitás volt. Ezért következő vizsgálatunkban (5-ös vizsgálat) a ritka sejtek kimutatására szolgáló, a REIS analízissel kompatibilis, de az előzőeknél jobb módszer kidolgozásán fáradoztunk. Ezt, klasszikus képfeldolgozás és eddig ritka sejtek kimutatásra nem használt, mesterséges intelligencián alapuló módszer ötvözésével értük el. Eredményeink szerint a sejtek digitálisan mért morfometriai jellemzőinek költségérzékeny döntési fa algoritmussal végzett osztályozása jelentősen javíthatja a ritka sejt citometria eredményeit. A ritka sejtek precízebb és korábbi kimutatásával talán javítható lehet a betegségek prognosztikája, morbiditása és mortalitása is. 11

12 Összefoglalva, a megbízható és standardizált keringő daganatsejt kimutatási metodikák hiánya nagymértékben akadályozza a keringő daganatsejt kimutatás klinikai felhasználását. Fontos tehát, hogy további, az eddigieknél jobban használható és standardizálható metodikák kerüljenek kifejlesztésre. Reményeink szerint vizsgálataink hozzájárultak a molekuláris- és a sejt -alapú keringő daganatsejt kimutatási módszerek javításához, valamint eredményeink felhasználhatóak lesznek egy klinikailag is használható keringő daganatsejt kimutatási teszt kidolgozásához. 6. ÖSSZEFOGLALÁS Több tanulmány egyöntetű véleménye szerint a keringő daganatsejtek kimutatása szolid tumorok esetében fontos prognosztikai tényező lehet, mely a betegségmentes és a teljes túléléssel is összefüggést mutat. Ezzel ellentétben, néhány egyéb vizsgálat egyáltalán nem talált összefüggést a perifériás vérből végzett keringő daganatsejtek kimutatás és a betegség prognózisa között. Az eltérő eredmények oka az lehet, hogy a keringő daganatsejtek frekvenciája nagyon alacsony (körülbelül 1-10 tumorsejt/ml perifériás vér), még az áttéttel rendelkező betegek esetében is. Feltételezzük, hogy az egymásnak ellentmondó eredmények hátterében a ritka sejtek megbízható kimutatásából adódó technikai nehézségek állnak. Munkánk legfőbb célja az volt, hogy keringő daganatsejt kimutatásra szolgáló módszereket fejlesszünk és tökéletesítsünk, illetve, hogy a kifejlesztett technikákkal a keringő daganatsejtek gyakoriságát és jellemzőit határozzuk meg tumoros betegek perifériás vérmintáiban. A cél az volt, hogy a rutin klinikai laborvizsgálat követelményeinek megfelelő, de a jelenlegieknél érzékenyebb és specifikusabb módszereket hozzunk létre. Vizsgálatainkban mind a sejt-, mind a molekuláris -alapú keringő daganatsejt kimutatást bevontuk. Elemeztük továbbá a preanalitikus és analitikus folyamatokat a lehetséges pontatlanság 12

13 okainak feltárása miatt. A kifejlesztett eszközökkel és módszerekkel a perifériás vérben esetlegesen jelenlévő ritka sejteket vizsgáltunk, úgymint keringő daganatsejteket és citomegalovirus fertőzött fehérvérsejteket. Ezen kívül négy európai laboratóriummal együttműködve egy kísérletsorozatot végeztünk, mellyel a kvantitatív keringő daganatsejt kimutatatás standardizálhatóságának alapjait fektettük le. Vizsgálatunk eredményeivel a ritka sejtek sejt- és molekuláris - alapú kimutatásának és kvantifikációjának új aspektusai tárultak fel. Úgy hisszük, hogy a tézisben ismertetett eljárások és módszerek alkalmazásával a ritka sejtek gyakorisága és jellemzői is pontosabban mérhetőek. Ez pedig elősegítheti a daganatok korábbi kimutatását, és a daganat-ellenes terápia pontosabb kivitelezését. 7. KÖZLEMÉNYEK ÉS ABSZTRAKTOK A. Tézishez kapcsolodó közlemények 1. Kraeft SK, Ladanyi A, Galiger K, Herlitz A, Sher AC, Bergsrud DE, Even G, Brunelle S, Harris L, Salgia R, Dahl T, Kesterson J, Chen LB. Reliable and sensitive identification of occult tumor cells using the improved rare event imaging system. Clin Cancer Res May 1;10(9): IF: Ladanyi A, Sher AC, Herlitz A, Bergsrud DE, Kraeft SK, Kepros J, McDaid G, Ferguson D, Landry ML, Chen LB. Automated detection of immunofluorescently labeled cytomegalovirus-infected cells in isolated peripheral blood leukocytes using decision tree analysis. Cytometry A Apr;58(2): IF:

14 3. Soong R, Ladanyi A. Improved indicators for assessing the reliability of detection and quantification by kinetic PCR. Clin Chem Jun;49(6 Pt 1): IF: Ma PC, Blaszkowsky L, Bharti A, Ladanyi A, Kraeft SK, Bruno A, Skarin AT, Chen LB, Salgia R. Circulating tumor cells and serum tumor biomarkers in small cell lung cancer. Anticancer Res Jan-Feb;23(1A): IF: Vlems FA, Ladanyi A, Gertler R, Rosenberg R, Diepstra JH, Roder C, Nekarda H, Molnar B, Tulassay Z, van Muijen GN, Vogel I. Reliability of quantitative reverse-transcriptase-pcrbased detection of tumour cells in the blood between different laboratories using a standardised protocol. Eur J Cancer Feb;39(3): IF: Molnar B, Ladanyi A, Tanko L, Sreter L, Tulassay Z. Circulating tumor cell clusters in the peripheral blood of colorectal cancer patients. Clin Cancer Res Dec;7(12): IF: Ladanyi A, Soong R, Tabiti K, Molnar B, Tulassay Z. Quantitative reverse transcription-pcr comparison of tumor cell enrichment methods. Clin Chem Oct;47(10): IF:

15 B. Tézishez kapcsolodó absztraktok 1. Ladanyi A, Sher A, Kraeft SK, Herlitz A, Bergsrud D, Jafri N, Salgia R, Chen LB. Detection of Occult Tumor Cells in the Peripheral Blood of Small Cell Lung Cancer Patients with the Rare Event Imaging System. 2003: American Society of Clinical Oncology meeting, Chicago, IL, USA, 2. Molnar B, Vlems FA, Ladanyi A, Gertler R, Rosenberg R, Diepstra HS, Röder C, Nekarda H, Tulassay Z, Muijen van GNP, Vogel I. Reliability of quantitative RT-PCR-based detection of tumor cells in blood between different laboratories using a standardized protocol. 2003: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, Orlando, FL, USA 3. Ladanyi A, Lechner S, Ballhorn W, Molnar B, Tulassay Z, Kullmann F. Molecular Comparison of Circulating Tumor Cells and Primary Tumors with cdna Chip Analysis and Differential Display in Colorectal Cancer Patients: A Feasibility Study. 2002: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, San Francico, CA, USA, Poster of Distinction Award 4. Molnar B, Floro L, Ruzsovics A, Ladanyi A, Tulassay Z. Quantitative CK20 RT-PCR is in correlation with progression and CA19-9, but not with CEA and CA 72-A immunoassays in the follow-up of Dukes D stage colorectal cancer patients under chemotherapy. 2002: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, San Francisco, CA, USA 5. Soong R, Ladanyi A. Detecting low-level expression reliably by real-time RT-PCR. 2002: American Association of Cancer Research meeting, San Francisco, CA, USA 15

16 6. Ladanyi A, Kraeft SK, Brunelle S, Even G, Herlitz A, Harris L, Salgia R, Chen LB. Rare Event Imaging System: Identification and Characterization of Occult Solid Tumor Cells 2002: American Association of Cancer Research meeting, San Francisco, CA, USA, Late Breaking Abstract 7. Kraeft SK, Ladanyi A, Brunelle S, Even G, Helritz A, Harris L, Salgia R, Dahl T, Chen LB. Rare Event Imaging System: Identification and Characterization of Occult Tumor Cells. 2002: 2nd National Cancer Institute-EORTC International Meeting on Cancer Diagnostics, Washington DC, USA, Oral Presentation 8. Molnar B, Ladanyi A, Bocsi J, Floro L, Sreter L, Tulassay Z. Multifluorescent labeling of immunomagnetic enriched circulating tumor cells and cellclusters. 2001: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, Atlanta, GA, USA 9. Ladanyi A, Molnar B, Floro L, Sreter L, Tulassay Z. Comparison of Cytokeratin 20 RT-PCR and immuncytochemistry for the detection of circulating tumor cells in the peripheral blood of colorectal cancer patinets. 2001: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, Atlanta, GA, USA 10. Ladanyi A, Soong R, Tabiti K, Molnar B, Tulassay Zs. Quantitative RT-PCR comparison of tumor cell enrichment methods. 2001: 3rd International Symposium on Minimal Residual Cancer, Hamburg, Germany 11. Ladanyi A, Molnar B, Tanko LM, Sreter L, Tulassay Z. Detection of circulating tumor cell clusters in the peripheral blood of colorectal cancer patients. 2000: Digestive Disease Week meeting of the American Gastroenterological Association, San Diego, CA, USA 16

17 12. Ladanyi A, Molnar B, Floro L, Sreter L, Tulassay Z. Reproducibilty of immunomagnetic based tumor cell detection from peripheral blood of advanced stage colorectal cancer patients. 2000: Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, Hungary C. Egyéb közlemények 1. Marrinucci D, Bethel K, Bruce RH, Curry DN, Hsieh B, Humphrey M, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Ladanyi A, Lazarus NH, Nieva J, Kuhn P. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Hum Pathol Mar;38(3): IF: Ladanyi A, Sipos F, Szoke D, Galamb O, Molnar B, Tulassay Z. Laser microdissection in translational and clinical research. Cytometry A Sep 1;69(9): IF: Hsieh HB, Marrinucci D, Bethel K, Curry DN, Humphrey M, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Ladanyi A, Lazarus N, Kuhn P, Bruce RH, Nieva J. High speed detection of circulating tumor cells. Biosens Bioelectron Apr 15;21(10): IF: Krivacic RT, Ladanyi A, Curry DN, Hsieh HB, Kuhn P, Bergsrud DE, Kepros JF, Barbera T, Ho MY, Chen LB, Lerner RA, Bruce RH. A rare-cell detector for cancer. Proc Natl Acad Sci U S A Jul 20;101(29): IF:

18 D. Egyéb absztraktok 1. Nieva J, Ladanyi A, Bethel K, Curry DN, Hsieh B, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Kuhn P, Lazarus N, Marrinucci D, Bruce RH. Fast and sensitive detection of occult tumor cells in peripheral blood. 2005: American Association of Cancer Research meeting, Anaheim, CA, USA 2. Seiwert TY, Tretiakova M, Patrick MC, Khaleque M, Husain NA, Ladanyi A, Chen LB, Bharti A, Salgia R. Heat shock protein (HSP) overexpression in lung cancer and potential as a therapeutic target. 2005: American Association of Cancer Research meeting, Anaheim, CA, USA 3. Curry DN, Ladanyi A, Krivacic RT, Hsieh HB, Kuhn P, Ho MY, Chen LB, Bruce RH. Detection of Occult Tumor Cells with Fiber Array Scanning Technology (FAST) at Ultra-high Scan Rates. 2004: AACR-NCI-EORTC International Conference on "Molecular Targets and Cancer Therapeutics", Brussels, Belgium 4. Curry DN, Krivacic RT, Hsieh HB, Ladanyi A, Bergsrud DE, Ho MY, Chen LB, Kuhn P, Bruce RH. High-Speed Detection of Occult Tumor Cells in Peripheral Blood. 2004: Proceed. 26th Ann Intl Conf of IEEE Eng Med Bio Sci 18