Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP 2011.02.15.

Emlékeztető: fluoreszcencia spektrumok Definíció! a. Emissziós spektrum b. Gerjesztési spektrum (ld. abszorpciós sp.)

Stokes-féle eltolódási törvény Az emissziós spektrum maximuma eltolódik a nagyobb hullámhosszak irányába (energiaveszteség!).

Térjünk vissza a foszforeszcenciára A foto-lumineszcencia egy típusa. Időtartam (élettartam): ~10-3 10-1 s (~ms - s) Triplett - szingulett átmenettel jár Spinátfordulás tiltott átmenet!

Jablonski diagram; hol lesz az emissziós spektruma? Gerjesztett-állapot Vibrációs relaxáció (10-12 s) S 1 S 1 T 1 : rendszerek közötti átmenet (10-10 10-8 s) T 1 gerjesztés (10-15 s) S 0 S 1 T 1 S 0 (10-3 10-1 s ) h S 0 Alap-állapot 5 4 3 2 1 0 vibrációs szintek

Foszforeszcencia

Fluoreszcens folyamatok időtartama átmenet elnevezés sebességi állandó jele időtartam (s) S (0) S (1) (S n ) gerjesztés - 10-15 S (n) S (1) belső átalakulás k (ic) 10-14 - 10-10 S (1) S (1) vibrációs relaxáció k (vibr.) 10-12 - 10-10 S (1) S (0) fluoreszcencia k (f) 10-9 - 10-7 S (1) T (1) S (1) S (0) rendszerek közötti átmenet sugárzásmentes átmenet k (intersys.crossing) 10-10 - 10-8 k (q) 10-7 - 10-5 T (1) S (0) foszforeszcencia k (p) 10-3 - 1 T (1) S (0) sugárzásmentes átmenet k (qp) 10-3 - 1

Hogyan mérünk fluoreszcenciát? ( steady-state eset) fényforrás hullámh. választás minta hullámh. választás detektor Nem lineáris elrendezés!!!

SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F M S 90 o M D Nem lineáris elrendezés!!!

A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre

A fluoreszcencia alapvető paraméterei Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció

Kvantumhatásfok (Q) Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra. Q emittált fotonok száma abszorbeált fotonok száma

Fluoreszcencia élettartam ( ) A gerjesztett állapot élettartama: Időtartam, mely alatt a gerjesztett molekulák száma e-ad részére csökken. 1.2 F 0 1 0.8 0.6 F ( kt k nr ) t F0e 0 F e t F 0 0.4 e 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 t

Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) idő-függő mérés ( time domain measurement )

Polarizált fény, polarizáció Megjelenés fotózáskor! Miért van ilyen hatása?

Elektromágneses hullámok

Polarizáció fogalma Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli irányultság!). Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció) A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek. A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak).

A polarizált fény

Síkban polarizált fény

A polarizátor Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.

Polarizátor működésének elve

Hol találkoztunk már polarizátorral?

Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Optikai aktivitás: poláros fény síkját elforgatják Fényforrás t lc Polarizátor Mintatartó királis molekulák nem kell gerjeszteni! Analizátor Megfigyelő Polariméter

Polarizáció, intenzitások Intenzitás egy adott irányban: polarizátor 2 max cos Párhuzamos állás: Θ = 0, I = I max Merőleges állás: Θ = 90, I = 0

Az abszorpciós vektor fogalma z A M A = abszorpciós vektor E y gerjesztés x abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét.

Fotoszelekció Nincs abszorpció ( = 90 o ) Maximális abszorpció ( = 0 o ) A Abszorpció ~ cos 2 A (max=1)

A fotoszelekció eredménye E

Mi történik a fotoszelekciót követően? E Mozgás: - transzláció; - rotáció. Minderre idő van!

Hogyan jellemezhető ez a rotációs mozgás?

Az emissziós vektor z M E = emissziós vektor I Z E gerjesztés E I X I Y y Detektor x emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét.

Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a z komponens! z I X I Z E I Y y I Z vs. I sum = I Z + I X + I Y x (A teljes intenzitáshoz tudjuk viszonyítani.)

SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F M P S Vagy vertikálisan, vagy horizontálisan helyezzük el a polarizátorokat: I VV I VH 90 o P M I HV I HH D Polarizátorokat alkalmazunk!!!

Így a teljes intenzitás: z I sum = I Z + I X + I Y I X I Z E I Y y I sum = I VV + I VH + I VH I sum = I VV + 2I VH x

Fluoreszcencia polarizáció

Fluoreszcencia polarizáció p = (I VV - GI VH ) / (I VV + GI VH ) dimenzió nélküli G = I HV / I HH nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig változhat (ld. következő dia).

p = (I VV - GI VH ) / (I VV + GI VH ) Ha = 0 lenne: I VV max., I VH = 0, tehát p = 1. Ha nagyon hosszú lenne: I VV = I VH, tehát p = 0. De nem additív!!!

Emissziós anizotrópia

Emissziós anizotrópia r = (I VV - GI VH ) / (I VV + 2GI VH ) dimenzió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától G = I HV / I HH a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja additív!!! Emlékezzünk! I sum = I Z + I X + I Y I sum = I VV + I VH + I VH I sum = I VV + 2I VH

Az anizotrópia jelentése és alkalmazásai

Mint láttuk, rotációs mozgást ír le! z z Polarizált fény I Z E τ I Z E I Y y I Y y I X I X x x Részben polarizált fény Rotációs diffúzió

Az anizotrópia időfüggése I(t) = I 0 exp -t/ r r( t) r a exp( t / ) 0 i t Mire emlékeztet az időfüggés?

Alkalmazások Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról

Példa alkalmazásra

Az aktin de novo polimerizációja Actin monomer Actin filament Depolymerisation Dimer Elongation Nucleation Trimer T. D. Pollard: Cell, 112, 453-465, 2003.

A forminok domén szerkezete GBD FH3 FH1 FH2 DAD Mammalian Diaphanous-related formins Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3 Rho-GTPase binding domain (GBD): Diaphanous Autoregulatory domén (DAD): Autoregulation

Kutatási kérdés Hogyan változik meg az aktin filamentumok szerkezete a forminok kötődésének hatására?

Alkalmazott módszerek Fehérjék (formin, miozin, aktin, tropomiozin) preparálása. Mérések fluoreszcencia anizotrópia lecsengés módszerével.

A mérések alapelve twisting bending monomer rotation segmental motion

Az anizotrópia időfüggésének mérése longer rotational correlation time (ns) 800 600 400 200 0 shorter rotational correlation time (ns) 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 [mdia1-fh2] ( M) A 0 1 2 3 4 5 [mdia1-fh2] ( M) flexibility (arb. units) 3,0 T = 30 o C 2,5 2,0 1,5 1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [mdia1-fh2+linker] : [actin] A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását.

Hogyan értelmezhetjük az eredményeket? flexibility (arb. units) Side - binding 3,0 T = 30 o C 2,5 2,0 1,5 End - binding 1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [mdia1-fh2+linker] : [actin]

További fogalmak, összefüggések

Határérték anizotrópia (r 0 ) A teljes mozdulatlan, fagyott fluorofór anizotrópiája. r 0 2 5 2 3cos 1 2 z Abszorpciós vektor Emissziós vektor : az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög. y r 0 0 0.4 45 0.1 54.7 0 90-0.2 x

Mitől függ az anizotrópia értéke? - A rotációs mozgás gyorsaságától; rotációs diffúzió; - A rendelkezésre álló időtől; fluoreszcencia élettartam!

Francis Perrin - 1926 ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ flureszcencia depolarizáció Perrin egyenlet: határérték anizotrópia r r 0 r 0 1 1 6D diffúziós állandó Rotációs korrelációs idő V RT

Perrin egyenlet r r 0 1 1 r 0 6D r ~ r 0 1/ 1/D

FRAP ( Fluorescence Recovery After Photobleaching ) cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának (DL) vizsgálata Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral Fényforrás: lézer Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására Photobleaching = fotohalványodás (kifehéredés)

A Photobleaching fogalma fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát elkerülése: anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz kataláz merkaptoetanol) expoziciós idő csökkentése pulzusszerű gerjesztés alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa) használata: háttér eliminálása autoquenching FLIP, FRAP www.microscopyu.com

Relativ fluoreszcencia (%) Módszer 1. Fluoreszcens minta 2. Meghatározott terület kiégetése (pl. lézerrel) Photobleach Lippincott-Schwartz, 2003 3. Fluoreszcencia helyreállás 4. Egyensúly beállta (általában: y < x) I 0 I0 2 x y 0 t 1/2 Idő

Alkalmazás Membránkomponensek laterális diffúziója Monomer turnover / beépülés Fehérje motilitás Diffúziós konstans meghatározás D 2 4t 1/2

Összefoglalás

A polarizátorok típusai Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen. Típusai: Prizmás (Nicol; Glan-Thomson; Glan- Taylor) Film-polarizátor (kinyújtott polimer háló nagy tűrőképesség lézerekben gyakran előfordul)

A polarizátorok működése

Snellius Descart törvény 1 n 1 sin sin 1 2 n2 n 1 c c 1 2 2 n 2

Refrakció és teljes visszaverődés v 2 levegő Snellius-Descartes törvény β α v 1 n 2 n 1 sin sin v v 1 2 n 21 víz v 2 levegő n 2 Teljes visszaverődés sin h n 21 α h v 1 n 1 víz

Teljes visszaverődés sin sin 1 2 n n 2 1 sin sin 90 1 sin 1 1 n n n n n 1 arcsin n 2 1 2 1 2 1 1 2 n 1 n 2 1 arcsin 1.55 1.658 69.2 1 1 arcsin 1.55 1.486 1!?!

1. komponens 68 CaCO 3 22 76.94 90 90 13.06 22 90 sin 2 sin n 2 1 n 1 n levegő =1.00028 n Nicol1 =1.658 n Nicol2 =1.486 n Kanada-balzsam =1.555

2. komponens 68 CaCO 3 22 75.4 90 22.37 67.63 90 14.6 67.63 75.4 22 90 sin 2 sin n 2 1 n 1 n levegő =1.00028 n Nicol1 =1.658 n Nicol2 =1.486 n Kanada-balzsam =1.555

Nicol-prizma Kettős törés!! Határszög!! ordinárius sugár 68 extra ordinárius sugár CaCO 3 CaCO 3 Kanada-balzsam William Nicol (1768 1851) Skót fizikus, geológus, a Nicol prizma megalkotója (1828).

Glan-Thomson prizma extra ordinárius sugár ordinárius sugár kötőanyag

Glan-Taylor prizma extra ordinárius sugár ordinárius sugár levegő

Összefoglalás -Polarizált fény; -Fotoszelekció; -Fluoreszcencia polarizáció és anizotrópia; -FRAP Segédanyagok: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/index.html http://chemistry.rutgers.edu http://calvino.polito.it http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence

A mérőrendszer további komponensei

Fényforrások: lámpák, lézerek

Optikai szűrők Felüláteresztő szűrők Aluláteresztő szűrők

Optikai szűrők Sáv szűrők

Monokromátorok, polarizátorok, küvetták, detektorok

A reakció sémája

A fluoreszcencia koncentráció-függése Lineáris függést várnánk, de! A belső-szűrő hatás (inner-filter effect) jelentkezik.

Fluoreszcens festékek: natív vagy intrinsic fluorofórok (definíció) Triptofán, tirozin, fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.

Fluoreszcens festékek: külső vagy extrinsic fluorofórok - e.g., denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, lantanidak

A fehérjék fluoreszcens jelölése - a jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - a fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.

Teljes visszaverődés Mila Zinkova: Minta (víz) Tárgylemez (üveg) Teljes belső visszaverődés mikroszkópia (TIRF)